CN115725793A - 烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的rt-lamp检测引物、检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT‑LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒，RT‑LAMP检测引物为CH‑CP‑3或CH‑CP‑4。本申请提供了针对南美红辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）的RT‑LAMP检测引物对，采用该引物对能有效避免产生假阳性结果，提高检测准确性，同时还能有效缩短检测所需时间至50min。且RT‑LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果）且灵敏度是RT‑PCR的100倍，较RT‑PCR简单容易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要。

Description

烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物、检测方 法及其试剂盒

技术领域

本申请涉及烟草检测技术领域，特别是一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒。

背景技术

南美红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），其基因组由一条正单链RNA组成，全长约9700bp，主要依靠各种蚜虫以非持久性传播。

1979年在马来半岛的辣椒上首次发现了ChiVMV，我国于2003年首次在陕西省的辣椒上发现ChiVMV，随后2010年在云南省大理市巍山县的烟田里发现烟草受ChiVMV侵害，其侵染烟草后主要症状为褪绿黄化、花叶、疱斑和叶缘下卷，并造成严重经济损失。病毒检测是监测、预报、防控病毒病的重要环节。目前检测ChiVMV的方法主要有电子显微镜技术、免疫血清学技术（ELISA）、指示植物检测技术以及分子生物学技术（RT-PCR）等。

指示植物方法首先需培养指示植物，并在指示植物上接种病毒；这导致该检测方法耗时较长可长达半个月以上，且其只能进行初步检测。

RT-PCR检测方法则需提取植物组织里的病毒RNA，以RNA为模板进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板借用PCR仪器进行扩增反应，再用扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；该检测方法所需步骤复杂，耗时较长约5~6h。

ELISA检测方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行，包括一抗二抗的包被等操作；该方法需要获得与检测病毒特异性结合的单克隆抗体，所需时间长，且所得抗体也存在与其它病毒产生交叉反应导致假阳性检测结果出现的情况。

这些检测方法因技术复杂、费时费力、所需资金大等原因难以在基层田间推广。

2000年日本学者Notomi等人发明的环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）属于分子生物学研究领域中一种极为重要的手段，该检测技术针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，为加快实验进程再加设一对环引物，利用一种DNA链置换聚合酶（BstDNApolymerase）只需一个水浴锅在恒温条件（65℃左右）保温70~90分钟完成核酸扩增反应，通过荧光染色等方法在数分钟内即可观察结果。该方法相对上述现有方法检测效率大大提高。

但LAMP检测方法只针对DNA模板进行扩增，为实现用该方法以RNA模板进行扩增，需在LAMP反应体系中加入反转录酶，可以在某等温条件下一步进行RNA逆转录和核酸扩增，即为反转录-环介导等温扩增技术（ReverseTranscriptionLoop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP）。该技术成本低、灵敏度极高、操作简单，不需要昂贵的仪器和分析手段，适用于田间基层进行病毒检测。

CN201510527415.9中公开了一种检测辣椒脉斑驳病毒（PVMV）的RT-LAMP引物及试剂盒，其中公共了能用于检测PVMV的RT-LAMP引物，PVMV与本发明中涉及的ChiVMV虽中文名称相似，实际上是两种不同的病毒，其中公开的引物无法用于南美红辣椒脉斑驳病毒的检测，也无法解决RT-LAMP检测ChiVMV时，结果中阳性率偏高的问题。

陈恩发,李其义,邓宽平,卢扬,彭慧元.反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒[J].贵州农业科学,2015,43(03):74-77.中公开了将(LAMP)运用于检测马铃薯病毒对应的引物，其中马铃薯病毒包括：马铃薯X病毒(Pota-tovirusX，PVX)、马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potatoleafrollvirus,PLRV)。但该文献中公开的引物仅适用于上述马铃薯属病毒检测，无法用于南美红辣椒脉斑驳病毒的检测中，也无法解决RT-LAMP检测ChiVMV时，结果中假阳性率偏高，检测时间偏长的问题。

发明内容

本申请提供了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物、检测方法及其试剂盒，用于解决现有技术中存在的缺乏针对感染ChiVMV病毒烟草植株的RT-LAMP检测用引物；现有RT-LAMP检测用引物无法准确检测感染ChiVMV病毒烟草植株且假阳性比例高；RT-LAMP检测烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒检测时间长的技术问题。

本申请提供了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物，RT-LAMP检测引物为CH-CP-3或CH-CP-4；其中

上表中外引物为CH-CP-F3-n、CH-CP-B3-n；

内引物为CH-CP-FIP-n、 CH-CP-BIP-n；

环引物为CH-CP-LF-n、 CH-CP-LB-n；其中n=3或4。

上述引物能有效降低RT-LAMP检测干扰南美红辣椒脉斑驳病毒的烟草植株时产生的假阳性情况，有效提高检测结果准确性。

优选的，烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物为CH-CP-3。采用该引物对感染感南美红辣椒脉斑驳病毒烟草植株进行RT-LAMP检测，结果特异性强，扩增条带产物颜色清晰明亮，能更准确的指示检测结果。

优选地，烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物为CH-CP-3时，RT-LAMP检测灵敏度为原RNA浓度的10^-7。此处的原RNA浓度为1.74ug/ul。本申请提供引物能准确检出烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒，且RT-LAMP比现有RT-PCR的灵敏度高出100倍。

具体地，烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物与ChiVMV具有特异性。根据实验结果可知，本申请提供引物能实现对ChiVMV的特异检测，且不能用于马铃薯Y病毒的检测中。

本申请的另一方面还提供了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测方法，以待测样品的RNA为模板，采用上述的RT-LAMP引物进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阳性结果；若反应液显橙黄色，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果。

优选地，将RT-LAMP扩增反应溶液置于紫外灯下，若反应液发出白色荧光，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为为阳性结果；若反应液不发出白色荧光，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果。可采用多种方式进行检测结果识别，有利于提高检测结果识别准确性。

优选地，RT-LAMP扩增反应温度为59~69℃，更优选地，RT-LAMP扩增反应温度为63℃；具体还可以为59、61、63、65、67、69℃。在该温度下进行RT-LAMP扩增反应，能准确检测出待检测样品的感染南美红辣椒脉斑驳病毒感染结果，检测准确性高，尤其是在63℃下进行反应时，结果特异性强，电泳条带更清晰、明亮便于识别。

优选地，RT-LAMP扩增反应时间为30~80min，更优选地，RT-LAMP扩增反应时间为50~60min，更优选地，RT-LAMP扩增反应时间为50min；在该反应时间内所得结果显示清晰便，便于识别有利于节约检测时间。说明本申请提供的引物能有效缩短检测所需时间，可用于田间实地进行检测。具体RT-LAMP扩增反应时间还可以为50、60、70、80min。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中甜菜碱溶液浓度为0 ~1.6mmol/μl；更优选地，RT-LAMP扩增反应中甜菜碱溶液浓度为1.0~1.4mmol/μl；更优选地，RT-LAMP扩增反应中甜菜碱溶液浓度为1.0mmol/μl。选用该浓度的甜菜碱溶液能准确实现对烟草易感ChiVMV的检测，降低试剂盒成本。具体甜菜碱溶液浓度还可以为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中dNTPs溶液浓度为0~2.2mmol/μl；更优选地，RT-LAMP扩增反应体系中dNTPs溶液浓度为0.2mmol/μl，该浓度下能有效降低制成试剂盒的成本，并获得较准确可识别的检测结果。更具体地还可以为0.2、0.6、1.0、1.4、1.8mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中Mg²⁺溶液浓度为2~8mmol/μl；更优选地，RT-LAMP扩增反应中Mg²⁺溶液浓度为4mmol/μl，此时扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮，便于现场对检测结果的识别，提高检测效率。更具体地还可以为2、4、6、8mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中内外引物浓度比为1:1~8:1，采用该比例能获得可准确识别的结果，更优选地，RT-LAMP扩增反应中内外引物浓度比为4：1；更具体地还可以为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1。

本申请的另一方面还提供了一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测试剂盒，包括如上述的引物，检测试剂盒内以待测样品的RNA为模板，利用所述引物进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阳性结果；若反应液显橙黄色，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果；

该试剂盒中所进行RT-LAMP扩增反应参数按上述选取。

优选地，RT-LAMP扩增反应温度为59~69℃，更优选地，RT-LAMP扩增反应温度为63℃。

优选地，RT-LAMP扩增反应时间为30~80min，更优选RT-LAMP扩增反应时间为50min。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中甜菜碱溶液浓度为0 ~1.6mmol/μl；更优选地，RT-LAMP扩增反应中甜菜碱溶液浓度为1.0mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中dNTPs溶液浓度为0~2.2mmol/μl，更优选地为0.2mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中Mg²⁺溶液浓度为2~8mmol/μl，RT-LAMP扩增反应中Mg²⁺溶液浓度为4mmol/μl。

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中内外引物浓度比为1:1~8:1；更优选地，RT-LAMP扩增反应中内外引物浓度比为4：1。

本申请能产生的有益效果包括：

1）本申请所提供的烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物，提供了针对南美红辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）的RT-LAMP检测引物对，采用该引物对能有效避免产生假阳性结果，提高检测准确性，同时还能有效缩短检测所需时间至50min。且RT-LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果）且灵敏度是RT-PCR的100倍，较RT-PCR简单容易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要。

2）本申请所提供的烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测方法，该检测方法中采用优化后的反应时间、dNTP浓度、Mg²⁺浓度和内外引物浓度比，能进一步提高采用RT-LAMP检测南美红辣椒脉斑驳病毒所得结果的准确性，避免出现误检的情况。

3）本申请所提供的烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测试剂盒，按本申请提供方法和引物采用RT-LAMP对南美红辣椒脉斑驳病毒进行检测，RT-PCR标准检测方法和荧光检测方法结果一致，所得试剂盒可分别采用RT-PCR标准检测方法和荧光检测方法进行检测。

附图说明

图1为本申请实施例中提供的ChiVMV不同RT-LAMP引物扩增结果；其中A为：凝胶电泳结果图：其中泳道1、2对应表1中的引物CH-CP-1，泳道3、4对应表1中的引物CH-CP-2，泳道5、6对应表1中的引物CH-CP-3，泳道7、8对应表1中的引物CH-CP-4，泳道9、10对应表1中的引物CH-CP-5，泳道1、3、5、7、9为在对应引物检测体系中添加ChiVMV RNA后所得结果；泳道2、4、6、8、10为未在对应引物检测体系中添加ChiVMV RNA后所得结果；M:2000；

B为：荧光可视化结果图：各编号对应表1中引物与凝胶电泳结果图相同。

图2为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP反应温度优化结果图；其中A）为凝胶电泳结果图，其中泳道1检测体系中未添加ChiVMV RNA，处理温度为65℃，结果为阴性；泳道2-7分别对应的6个反应温度：59、61、63、65、67、69℃；M:2000；B）为荧光可视化结果图，各编号对应样本情况与凝胶电泳结果图相同。

图3为本申请实施例中提供的ChiVMVRT-LAMP反应时间的优化结果图，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1为未添加ChiVMV RNA、泳道2-7分别对应的6个反应时间：30、40、50、60、70、80min；M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2-7：6个反应时间梯度30、40、50、60、70、80min。

图4为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP甜菜碱反应浓度的优化结果，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性、泳道2-8：7个反应浓度梯度0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl.M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2-8：0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl；

图5为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMPdNTPs反应浓度的优化结果，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性；泳道2-8：7个反应浓度梯度0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/μl；M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2-8：7个反应浓度梯度0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/μl；

图6为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP Mg²⁺反应浓度的优化结果图；其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性、泳道2-7：6个浓度梯度2、4、6、8、10、12mmol/μl；M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2-7：6个浓度梯度2、4、6、8、10、12mmol/μl。

图7为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP内外引物浓度比的优化结果，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性、泳道2-9：8个引物比梯度1:1~8:1；M:2000；B）为编号1：阴性、编号2-9：8个引物比梯度1:1~8:1；

图8为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP灵敏度检测结果，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性、泳道2~10对应9个RNA的浓度分别一一对应为1.74ug/ul×10⁰~10^-8；M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2~10对应9个RNA的浓度分别一一对应为1.74ug/ul×10⁰~10^-8；C）为RT-PCR检测结果：泳道1~9：9个RNA的浓度1.74ug/ul×10⁰~10^-8，泳道10：阴性；M:2000。

图9为本申请实施例中提供的ChiVMV RT-LAMP特异性检测结果，其中A）为凝胶电泳结果图：泳道1：阴性、泳道2-10：ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV、PVY的RNA；M:2000；B）为荧光可视化结果图：编号1：阴性、编号2-10：ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV、PVY的RNA。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

本申请中未详述的且并不用于解决本申请技术问题的技术手段，均按本领域公知常识进行设置，且多种公知常识设置方式均可实现。

实施例

以下实施例中所用设备、病毒株、化学试剂，如无特殊说明均为商业渠道获取。以下实施例中所用方法如无特殊说明，均按本领域相关操作进行，在此不累述。

以下实施例中所用材料和方法：

1.1 材料

1.1.1 生物材料

本实验所用的ChiVMV、马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、番茄褐色皱纹果病毒(Tomato brown rugose fruit virus，ToBRFV)、番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spotvirus，TZSV)、烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、朱顶红褪绿环斑病(Hippeastrum chloroticringspot virus，HCRV)的阳性样品由本课题组纯化并保存于实验室内，经过基因测序，均为对应病毒株。

待检测样本为已知侵染南美红辣椒脉斑驳病毒的烟草组织；以同一批次烟草植株，其健康且检测未感染南美红辣椒脉斑驳病毒的烟草植株作为实验对照。

试剂

TRNzolUniversal总RNA提取试剂购自北京天根公司，MgSO₄(100mM)、WarmStart®通用LAMP/RT-LAMP2×预混液（含UDG）、Bst2.0WarmStart^®DNAPolymerase购自美国NewEnglandBiolabs公司，Uracil-DNAGlycosylase购自上海碧云天生物试剂公司，M-MLVReverseTranscriptase购自Promege公司，Betaine、1000×SYBRGreenⅠ购自北京索莱宝科技有限公司，ΜltraPuredNTPMix(10mMeach)购自上海CWBIO公司，HiScript®II1ststrandcDNASynthesisKit反转录试剂购自江苏Vazyme公司等。

仪器

梯度PCR仪、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、涡旋振荡器、高速台式微量冷冻离心机、琼脂糖凝胶电泳仪、凝胶成像系统、电子天平，均为商业渠道获取

1.2 方法

1.2.1 引物设计

依据GenBank中已登录的ChiVMV基因组(GenBank序列登录号:MT974520)的CP蛋白基因保守区域，在PrimerExplorer5.0（http://primerexplorer.jp/e/）上设计5组引物，每组包含F3/B3（外引物）、FIP/BIP（内引物）、LF/LB（环引物），引物由成都生物公司合成（表1）。

表1RT-LAMP和RT-PCR特异性检测ChiVMV引物

1.2.2 RNA的提取

参照TRNzolUniversal总RNA提取试剂说明书提取病毒总RNA，提取完成取2μlRNA提取液进行琼脂糖凝胶电泳检测，随后于-80℃冰箱保存备用。

相关参数

参照Bst2.0WarmStart®DNAPolymerase说明书即：10×ThermopolBuffer2.5μl、MgSO4(100mM)1.5μ、dNTP(10mM)1.5μl、FIP/BIPPrimers(25×)1μl、F3/B3Primers(25×)1μl、LoopF/BPrimers(25×)1μl、Bst2.0WarmStart®DNAPolymerase1μl、M-MLVReverseTranscriptase（1000）0.125μl、20×SYBRGreenⅠ0.5-2.0μl、TotalRNA1ng-1μg、Nuclease-freeWater补足至总体积25μl。上述体系65℃控温60min。

相关参数

参照HiScript®II1ststrandcDNASynthesisKit反转录试剂说明书RNase-freeddH₂O5μl、Randomhexamers1μl、TotalRNA2μl上述体系65℃5min立即冰上2min随即反应液中加入2×RTMix10μl、HiScriptⅡEnzymeMix2μl，25℃5min、50℃45min、85℃2min将RNA反转为cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增反应：2×TaqPCRMasterMIX12.5μl、F/RPrimers(10×)1μl、cDNA1μl、ddH₂O补足总体积25μl。反应程序95℃3min，95℃30s、57℃45s、72℃1min（30循环），72℃5min。反应结束后取出产物5μl进行凝胶电泳检测。

引物筛选

设计出的5组RT-LAMP引物（见表1）扩增ChiVMV，体系参考WarmStart®通用LAMP/RT-LAMP2×预混液（含UDG）说明书：WarmStartLAMP2×Mix12.5μl、10μmol/LF3/B30.5μl、10μmol/LFIP/BIP4μl、RNA2μl加水补足至25μl。

65℃扩增60min，每组引物均设置一个阴性对照，以防因多条引物间发生相互作用产生假阳性，影响后续实验。

最终筛选出1组不存在假阳性且特异性强的引物。

检测体系优化

以ChiVMVRNA为模板，采用单一变量法，对反应引物、温度、时间、反应体系中Mg²⁺、dNTPs、甜菜碱浓度和内外引物浓度比进行优化，其反应体系参照RT-LAMP基本体系（表2）。

表2RT-LAMP的基本体系

其中，反应温度设置6个反应温度梯度59℃、61℃、63℃、65℃、67℃、69℃进行优化，同时设置健康烟草作为阴性对照，恒温反应60min，反应结束后，加入1μl的1000×SYBRGreenⅠ荧光染料进行可视化检测，随后取6μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析。

反应时间以10min为梯度在30min~80min范围内进行优化。

甜菜碱的浓度分别为0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl7个梯度。

dNTPs的浓度分别为0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/μl7个梯度。

Mg²⁺的浓度分别为2、4、6、8、10、12mmol/μl6个梯度。

外内引的浓度比分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8mmol/μl8个梯度，分别设置阴性对照。

以下各项优化实验的基础实验参数及操作为：

在100ul的离心管中依次加入10×恒温扩增缓冲液 2.5 ul、MgSO₄(100mM) 1.5ul、dNTP(10mM) 1 ul、

内引物(100×) 2 ul、外引物(100×) 0.5 ul、环引物(100×) 1.5 ul、甜菜碱（5mol/L）4 ul、Bst2.0WarmStart®DNA聚合酶 0.5 ul、M-MLV逆转录（1000）0.125 ul、RNA总量 1ng-1μg、无酶水定容到25μL，离心后石蜡油封层，置于PCR仪里65℃控温60min。（实验操作全程在冰块上完成。）

以下各优化实验中，每个优化实验时，在上一个参数优化结果的基础上，均只改变该项优化参数进行优化实验。

体系的验证

RT-LAMP的反应结果判定方法：

（1）电泳检测。取反应产物5μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，成像仪内观察到条带呈现梯形，则为阳性。

（2）荧光检测。25μlRT-LAMP扩增产物中加入0.5μl1000×SYBRGreenI荧光染料后，阳性样品内荧光染料为荧光绿，而阴性为橙黄色。

结果与分析

2.1 引物筛选

在基础实验中选用表1中CH-CP-1~5引物进行实验。其他参数与基础实验相同。

依据RT-LAMP的基本体系，从五对引物中筛选出ChiVMV特异性强的引物。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示（图1A），表1中系列引物CH-CP-3~5均能扩增出条带，但表1中CH-CP-5系列引物对应的泳道9、10均为阳性结果，而泳道10中所用检测物中未添加ChiVMVRNA，因而提示CH-CP-5引物对在ChiVMVRNA检测中存在假阳性结果，无法准确检出ChiVMV病毒。CH-CP-3~4均可准确检测出ChiVMV病毒。而CH-CP-3系列引物的扩增产物形成的梯状电泳条带比其它引物扩增的更清晰、明亮且无假阳性；

将荧光染色剂加入反应产物中，所得结果一致与图1A中结果一致，具体参见图1B。

图1B中没有扩增条带的产物为橙黄色，有扩增条带的产物则为绿色，将其置于紫外灯下观察，没有条带的产物不能发出白色荧光，而有条带的产物可以发出白色荧光，表明CH-CP-3系列引物的特异性最强，故选用CH-CP-3系列引物作为ChiVMV病毒优化的引物。

以下各项优化实验中所用引物均为CH-CP-3系列引物。

反应温度优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，处理温度为65℃；

样本2~7中均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应温度分别为：59、61、63、65、67、69℃。各处理样本中其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~7进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图2中。

反应温度优化筛选结果表明：在CH-CP-3系列引物扩增下，63℃条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮，具体参见图2A；同时，图2A中荧光检测结果与图2B中凝胶电泳检测结果一致，具体参见图2B，在6个温度下产物都呈现绿色，但其颜色深浅不同，且在紫外灯下看到白色荧光。优选反应温度为63~69℃，更优选为63℃。

以下各项优化实验中反应温度为63℃。

2.3反应时间优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，反应时间为60min；

样本2~7中均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应时间分别为：30、40、50、60、70、80min。各样本其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~7进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图3中。

反应时间结果表明在50min条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带比30、40min更清晰明亮，其与60~80min相差不大（图3A）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图3B），在6个时间下产物都呈现绿色，且在紫外灯下看到白色荧光。为节省实验时间，最佳反应时间为50min。

以下各项优化实验中反应时间为50min。

2.4甜菜碱浓度优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，甜菜碱浓度为0.8mmol/μl；

样本2~8中均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应中甜菜碱的浓度分别为：0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mmol/μl。各样本其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~8进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图4中。

甜菜碱反应浓度结果表明7个浓度下均能扩增出条带，但在1.0~1.4mmol/μl条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图4A）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图4B），在7个浓度下产物都呈现绿色，在紫外灯下看到白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择甜菜碱的反应浓度为1.0mmol/μl。

以下各项优化实验中甜菜碱的反应浓度为1.0mmol/μl。

2.5dNTPs浓度优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，dNTPs浓度为0.4mmol/μl；

样本2~8均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应中dNTPs浓度分别为：0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2mmol/μl。各样本除上述优化参数外，其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~8进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图5中。

dNTPs反应浓度结果表明0.2~1.8mmol/μl7个浓度下均能扩增出条带，但在0.2~1.8mmol/μl条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带都相差不大（图5A）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图5B），在0.2~1.8mmol/μl条件下产物都呈现绿色，且在紫外灯下看到白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择0.2mmol/μl。

以下各项优化实验中反应中dNTPs浓度0.2mmol/μl 。

2.6Mg²⁺浓度优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，Mg²⁺浓度为6mmol/μl；样本2~7均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应中Mg²⁺浓度分别为：2、4、6、8、10、12mmol/μl，各样本除上述优化参数外，其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~7进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图6中。

Mg²⁺浓度优化结果表明2~8mmol/μl浓度下均能扩增出条带，但在4mmol/μl条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图6A）；荧光检测结果与凝胶电泳检测结果一致（图6B），在2~8mmol/μl浓度下产物都呈现绿色，且在紫外灯下看到白色荧光。结合实际应用及后期集成，选择4mmol/μl。

以下各项优化实验中反应中Mg²⁺浓度为4mmol/μl。

2.7 内外引物浓度比优化

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA，CH-CP-3系列引物的内外引物浓度比为4:1；样本2~9均添加1微升的ChiVMVRNARNA，各样本的区别在于反应中内外引物浓度比分别为：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1。各样本除上述优化参数外，其余未说明参数与基础实验中相同。各样本中环引物按(100×) 1.5 ul添加。

分别对样本1~9进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图7中。

内外引物浓度比优化结果表明8个内外引物浓度比均能扩增出条带，但在4:1条件下的扩增产物形成的梯状电泳条带更清晰、明亮（图7B）；其荧光结果与凝胶电泳检测结果一致（图7B），在8个引物比之下产物都呈现绿色，且在紫外灯下看到白色荧光。结合实际应用，选择内外引物浓度比为4:1。

以下各项优化实验中反应中CH-CP-3系列引物的内外引物浓度比为4:1。

2.8 RT-LAMP灵敏度试验

本优化实验中样本1中未添加ChiVMVRNA仅添加健康烟草植株的RNA；样本2~10的区别在于ChiVMVRNA的添加浓度分别为：1.74ug/ul×10⁰、1.74ug/ul×10^-1、1.74ug/ul×10^-2、1.74ug/ul×10^-3、1.74ug/ul×10^-4、1.74ug/ul×10^-5、1.74ug/ul×10^-6、1.74ug/ul×10^-7、1.74ug/ul×10^-8。各样本除上述优化参数外，其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~10进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图8中。

RT-LAMP与RT-PCR检测方法的比对实验表明，RT-LAMP的检测灵敏度可达到原RNA浓度（1.74ug/ul）的10^-7（1.74ug/ul×10^-7）（图8A），而RT-PCR仅可达到原RNA浓度（1.74ug/ul）的10^-5（1.74ug/ul×10^-5）（（图8C），且RT-LAMP比现有RT-PCR的灵敏度高出100倍。

特异性试验

样本1中未添加ChiVMVRNA；样本2~10中分别添加ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV、PVY的RNA。各样本其余未说明参数与基础实验中相同。

分别对样本1~10进行凝胶电泳、荧光可视化检测，所得结果列于图9中。

以分别含有ChiVMV、HCRV、TZSV、TSWV、TVBMV、ToBRFV、TMV、CMV及PVY病毒烟叶的RNA为模板，利用优化的RT-LAMP进行扩增。

凝胶电泳结果表明，只能在携带ChiVMV的烟叶样品中扩增出条带，而其它样品中没有扩增条带（图9A）；其荧光结果与凝胶电泳结果一致，仅携带ChiVMV的样品显绿色，在紫外灯下显白色荧光（图9B）。表明建立的ChiVMVRT-LAMP检测体系具有很好的特异性。

结论与讨论

本研究基于ChiVMVCP基因序列，设置了5组RT-LAMP引物，筛选出最佳引物组CH-CP-3，采用单因素实验对ChiVMV病毒检测的反应条件及反应物组分进行优化。

优化条件包括：反应时间、反应温度、甜菜碱、dNTP、Mg²⁺浓度和内外引物浓度比，综合上述结果显示反应时间、dNTP浓度、Mg²⁺浓度和内外引物浓度比对RT-LAMP体系的影响比较明显；反应温度和甜菜碱浓度的影响比较小。

上述实验结果表明：最佳反应引物组为CH-CP-3，在25μl的反应体系中各组分最佳加入量：10x等温扩增缓冲液2.5μl、MgSO₄(100mM)0.5μl终浓度2mM(4mMtotal)、dNTP混合物(10mM)0.5μl终浓度0.2mM、内引物(10x)2μl终浓度0.8mM、外引物(10x)0.5μl终浓度0.2mM、环引物(10x)1.5μl终浓度0.6mM、甜菜碱(5mM)5μl终浓度1.0mM、Bst2.0等温扩增DNA聚合酶(8000u/ml)0.5μl终浓度0.16u/μl、尿嘧啶-DNA糖基化酶(1000u/ml)0.5μl终浓度0.02u/μl、M-MLV逆转录酶(10000u/ml)0.125μl终浓度0.05u/μl、RNA1μl、无酶水补足至总体积25μl。最佳反应温度为63℃，最佳反应时间为50min，且其灵敏度是RT-PCR的100倍。由此可见，RT-LAMP是在比RT-PCR反应时间更短和反应温度更低的条件下，达到比RT-PCR灵敏度强100倍的一种检测方法。

本申请提供了针对南美红辣椒脉斑驳病毒（ChiVMV）的RT-LAMP检测方法及其试剂盒，对优化检测方法采用了RT-PCR标准检测方法和荧光检测方法进行平行比对验证，二者检测结果一致。

而且，RT-LAMP检测可通过肉眼观察直接判断结果（可视化判读结果）且灵敏度是RT-PCR的100倍，较RT-PCR简单容易，可满足科研、基层单位和简陋现场等对该病毒检测的需要。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物，其特征在于，RT-LAMP检测引物为CH-CP-3或CH-CP-4；其中

上表中外引物为CH-CP-F3-n、CH-CP-B3-n；

内引物为CH-CP-FIP-n、 CH-CP-BIP-n；

环引物为CH-CP-LF-n、 CH-CP-LB-n；其中n=3或4。

2.根据权利要求1所述的RT-LAMP检测引物，其特征在于，烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物为CH-CP-3。

3.根据权利要求1所述的RT-LAMP检测引物，其特征在于，烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测引物为CH-CP-3时，RT-LAMP检测灵敏度为原RNA浓度的10^-7。

4.一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于，以待测样品的RNA为模板，采用如权利要求1~3中任一项所述的RT-LAMP引物进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阳性结果；若反应液显橙黄色，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果；

优选地，将RT-LAMP扩增反应溶液置于紫外灯下，若反应液发出白色荧光，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阳性结果；若反应液不发出白色荧光，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增反应温度为59~69℃；

更优选地，RT-LAMP扩增反应温度为63℃。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增反应时间为30~80min；

更优选地，RT-LAMP扩增反应时间为50~60min；

更优选地，RT-LAMP扩增反应时间为50min。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增反应体系中甜菜碱溶液浓度为0~1.6mmol/μl；

更优选地，RT-LAMP扩增反应中甜菜碱溶液浓度为1.0~1.4mmol/μl；

更优选地，RT-LAMP扩增反应中甜菜碱溶液浓度为1.0mmol/μl。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增反应体系中dNTPs溶液浓度为0~2.2mmol/μl；

更优选地，RT-LAMP扩增反应体系中dNTPs溶液浓度为0.2mmol/μl。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，RT-LAMP扩增反应体系中Mg²⁺溶液浓度为2~8mmol/μl；

更优选地，RT-LAMP扩增反应中Mg²⁺溶液浓度为4mmol/μl；

优选地，RT-LAMP扩增反应体系中内外引物浓度比为1:1~8:1；

更优选地，RT-LAMP扩增反应体系中内外引物浓度比为4:1。

10.一种烟草易感南美红辣椒脉斑驳病毒的RT-LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括如上述的引物，检测试剂盒内以待测样品的RNA为模板，利用所述引物进行RT-LAMP扩增反应；反应结束后观察RT-LAMP扩增反应溶液颜色变化，若反应液显绿色，则判断待测样品感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阳性结果；若反应液显橙黄色，则判断待测样品未感染南美红辣椒脉斑驳病毒为阴性结果；

该试剂盒中RT-LAMP扩增反应参数按权利要求4~9中任一项选取。

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