CN105238876B

CN105238876B - 用于烟草青枯病菌检测的lamp引物组及其使用方法

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Publication number: CN105238876B
Application number: CN201510830057.9A
Authority: CN
Inventors: 黄俊丽; 秦钟梁; 丁伟; 李常军
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2018-08-17
Anticipated expiration: 2035-11-25
Also published as: CN105238876A

Abstract

本发明属于植物病害检测技术领域，提供了用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组。所述用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组，包括上下游外引物、上下游内引物和一对环引物。本发明的LAMP引物组和检测方法，能够在短时间内准确的检测出烟草植株是否含有烟草青枯病菌，而且无需昂贵的仪器设备，并且检测结果可以直接通过肉眼判断，该发明适用于在田间基层快速检测。

Description

用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组及其使用方法

技术领域

本发明属于植物病害检测技术领域，提供了用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组。

背景技术

烟草青枯病是一种由烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种烟草细菌性病害，是一种典型的维管束病害，一旦发病即可造成全株死亡，对烟草的产量和质量影响极大，是烟草上一大毁灭性病害，特别在苗期，此病常致幼苗成片枯死，造成大量缺苗。

早期的分子生物学技术还很落后，所以细菌性病害的鉴定主要依靠一些传统的方法。传统的细菌鉴定主要以致病性测定和细菌学性状测定等为主，前者包括过敏性反应和植株活体接种；后者包括细菌形态特征观察和细菌的染色及生理生化试验。随着生物技术的发展，分子生物学技术在细菌性病害检测上的运用逐渐频繁，PCR技术的发明使检测技术发生了革命性的变化，经典的PCR在病原菌的检测应用已经非常广泛,并延伸出许多以PCR为基础的方法，这些方法使得病原菌的检测更加方便、快捷、灵敏。但是这些方法都需要昂贵的仪器设备，并且只能在实验室进行，耗费时间较长，很难在田间基层推广应用。

环介导等温扩增技术(LAMP，loop-mediated isothermal amplification)是2000年由日本研究人员Notomi等发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术，由于其具有特异性强、等温灵敏、操作简单、产物易检测等优点。该技术已经被广泛应用于生命科学等相关领域，随着LAMP的优点逐渐为研究者所熟知，研究者将该技术应用于检测各种病原体的同时，也对该技术提出了很多的改进，使得该技术逐步完善，能够成功地应用于病毒病原体、细菌病原体、真菌病原体、寄生虫、肿瘤等的检测。在植物病原菌检测的应用上，已经报道的有苜蓿疫霉根腐病菌、马铃薯环腐病菌、柑橘溃疡病菌、橡树疫霉病菌等相关LAMP检测方法。

发明内容

本发明的目的为快速检测烟草青枯病菌提供一种新选择。

本发明的技术方案是用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组，包括上下游外引物、上下游内引物和一对环引物；所述引物的序列如下：

上游外引物(F3)：5’-GCAGATCCGGAAGCTCAAG-3’；

下游外引物(B3)：5’-GATGTGGGCCCTGGTCA-3’；

上游内引物(FIP)：5’-TGCGTGAACCCTTGTCCTGTCCAGGAGAGCCTGA GCGAA-3’；

上游内引物(BIP)：5’-CGACATCTGCCGGATCAGCCGCCAACTCCGGGTA GTTCC-3’；

环引物(LF)：5’-AGGTGGTGTGATACTTCGC-3’；

环引物(LB)：5’-CAGACGGCAGTCGCTC-3’。

本发明还提供了采用所述引物组检测烟草青枯病菌的方法，包括如下步骤：

(1)待检测样品DNA模板的制备：通过挤压待检测烟草植株的茎部和叶柄，获得维管束汁液，对汁液进行煮沸处理后作为检测样品DNA模板；

(2)LAMP扩增：所使用酶为Bst DNA polymerase，其用量以8U/25μL体系；上下游外引物、上下游内引物和一对环引物之间的摩尔比为1：8：2；63℃40min，终止反应；

(3)LAMP检测结果：在LAMP扩增产物中加入钙黄绿素，若扩增产物变为亮绿色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若为扩增产物为棕黄色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌；或者LAMP扩增产物中加入羟基萘酚蓝，若扩增产物变为天蓝色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若为扩增产物为紫色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌；或者在LAMP扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料，若扩增产物变为绿色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若为扩增产物为橙色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌。

具体的，步骤(3)中的LAMP扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料。

具体的，步骤(3)中LAMP扩增产物离心后，再加入染料进行染色判断。

具体的，步骤(1)中植株下部的茎和叶柄的维管束汁液；下部叶柄为最下部2-3片真叶的叶柄；下部茎为最下部2-3片真叶的茎的位置及以下区域。

根据NCBI上已知的青枯菌属的序列，对烟草青枯菌与青枯菌属另外3个近缘种进行全基因组序列比对后，得到独有序列(unique sequence)RipTALI-9 gene序列。开始是挑选了三条特异性最好的保守序列，针对这三条序列分别设计了三组LAMP引物，分别用这些引物组进行LAMP预实验，通过比较每组引物的特异性和稳定性，最终筛选出来自这个特异保守序列的引物作为检测引物组。

LAMP引物的设计是个相对复杂的过程，也是LAMP技术的核心，虽然有专门用于设计LAMP引物的在线软件Primer Exploer，根据LAMP引物设计的要求，用该软件可以很容易的设计出针对一段保守序列的多套引物，但并不是设计出的所有引物都符合最终的要求，引物的实际稳定性和特异性还需要经过实际的试验检验才能确定。前期分别针对三段特异的保守序列各设计了三套引物，然后对这九套引物进行了筛选，最终筛选出一套稳定性和特异性相对最好的引物。

本发明的LAMP引物组和检测方法，能够在短时间内准确的检测出烟草植株是否含有烟草青枯病菌，而且无需昂贵的仪器设备，并且检测结果可以直接通过肉眼判断，该发明适用于在田间基层快速检测。

附图说明

图1为LAMP扩增结果图

A为电泳检测结果，可以看出，阳性出现特殊的梯状条带，空白对照未出现；B为焦磷酸镁沉淀的观察，阳性的扩增产物底部有白色沉淀(箭头所示)，空白对照底部澄清；C为在扩增产物中加入SYBR Green I，阳性的扩增产物变为绿色，空白对照显示为橙色。

图2为LAMP检测烟草青枯病菌的特异性

M为100bp ladder marker；1为空白对照；2为烟草青枯菌；3为泛菌属；4为猕猴桃溃疡病菌；5为大肠杆菌；6为枯草芽孢杆菌；7为番茄溃疡病菌；8为柑橘溃疡病菌；9为水稻细条病菌；10为水稻白叶枯病菌。电泳检测结果显示：只有烟草青枯菌扩增出梯状条带，其它对照菌和空白对照未扩增出条带。

图3为LAMP检测烟草青枯病菌的灵敏性

A为LAMP检测的电泳图，B为SYBR Green I染色后肉眼观察结果，C为常规PCR检测的电泳图。其中M为DL5000 DNA Marker；1为空白对照；2为10ng/μL；3为1ng/μL；4为100pg/μL；5为10pg/μL；6为1pg/μL；7为100fg/μL；8为10fg/μL；9为1fg/μL；10为0.1fg/μL；结果显示：LAMP对烟草青枯菌DNA的检测下限为1fg/μL，而常规PCR对烟草青枯菌DNA的检测下限为100fg/μL。

图4引物筛选图

M表示Marker，1泳道代表空白对照，2泳道代表烟草青枯病菌，3～10分别代表以泛菌属、猕猴桃溃疡病菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄溃疡病菌、柑橘溃疡病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌的DNA为模板进行的扩增。

A为针对保守序列endoglucanase precursor(egl)gene的第1套引物扩增；B为针对保守序列endoglucanase precursor(egl)gene的第2套引物扩增；C为针对针对保守序列endoglucanase precursor(egl)gene的第3套引物扩增；D为针对保守序列RipTALI-9 gene的第1套引物扩增；E为针对保守序列RipTALI-9 gene的第2套引物扩增；I为针对保守序列RipTALI-9 gene的第3套引物扩增；F为针对保守序列popP2 gene的第1套引物扩增；G为针对保守序列popP2 gene的第1套引物扩增；H为针对保守序列popP2 gene的第1套引物扩增。

图5维管束

图6侵染5天后的烟草植株挤压汁液常规PCR检测凝胶电泳图

M:DL5000 DNA Marker；1:空白对照；2:阳性对照；3:上部的茎；4:上部的叶柄；5:下部的茎；6:下部的叶柄。

图7侵染10天后的烟草植株挤压汁液常规PCR检测凝胶电泳图

图8侵染5天后的烟草植株挤压汁液LAMP检测凝胶电泳图

M:DL5000 DNA Marker；1:空白对照；2:阳性对照；3:下部的茎；4:下部的叶柄；5:上部的茎；6:上部的叶柄。

图9侵染5天后的烟草植株挤压汁液LAMP扩增产物的SYBR GreenⅠ染色

1:空白对照；2:阳性对照；3:下部的茎；4:下部的叶柄；5:上部的茎；6:上部的叶柄。图10侵染10天后的烟草植株挤压汁液LAMP检测凝胶电泳图

图11侵染10天后的烟草植株挤压汁液LAMP扩增产物的SYBR GreenⅠ染色

1:空白对照；2:阳性对照；3:下部的茎；4:下部的叶柄；5:上部的茎；6:上部的叶柄。

具体实施方式

下述实施例中使用的主要试剂和培养基：

1主要试剂

母液配制

1)100mmol/L EDTA pH9.0：称取7.44g Na2EDTA·2H2O，加水使固体溶解，调pH值至8.0，补水定容至200ml，高压灭菌(120℃，20min)。

2)1mol/L Tris·HCl pH9.0：称取12.1g Tris碱，加水溶解，浓盐酸调至pH为8.0，补水定容至100mL，高压灭菌(120℃，20min)。

3)20％SDS：称取20g SDS，加水，置于68℃助溶，再补加水至100mL，高压灭菌(120℃，20min)。

4)NaCl 5mol/L：称取58.4g NaCl，加水溶解，补水定容至200mL，高压灭菌(120℃，20min)。

5)CTAB/NaCl溶液(5％w/v)：5g CTAB溶于100mL 0.5mol/L NaCl溶液中，65℃助溶，室温保存。

TAE电泳缓冲液

1)50×贮存液：称取242g Tris碱，37.2g Na2EDTA·2H2O，量取27.1mL冰醋酸,加少量水使固体溶解,补水至1L。

2)TAE电泳缓冲液(1×工作液)：40mmol/L Tris·Ac，2mmol/L EDTA。

3)TE缓冲液：Tris·HCl 10mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，pH8.0，定容至500mL。

2培养基

1)NA液体培养基(g/L)：牛肉浸膏3g，酵母粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，调PH6.8—7.0，定容到1000mL，然后115℃高压灭菌25min。

2)NA固体培养基(g/L)：牛肉浸膏3g，酵母粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂15g，调PH6.8—7.0，定容到1000mL，然后115℃高压灭菌25min。

3)液体LB培养基：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，调pH约7.0，定容至1000mL，然后115℃压灭菌25min。

3其它主要试剂

Bst DNA聚合酶(NEB，USA)，10×ThermoPol Reaction Buffer(NEB，USA)，核酸染料SYBR GreenⅠ(北京鼎国)，dNTP溶液(TaKaRa，Japan)，MgCl2溶液(TaKaRa，Japan)，甜菜碱(Sigma，USA)，2×Taq PCR Mix(TaKaRa，Japan)，PCR缓冲液(TaKaRa，Japan)，常规引物(华大基因)，LAMP引物(华大基因)。

主要仪器：

Air Tech超净工作台(苏净集团安泰公司)、微量移液器(Eppendorf,Germany)、海尔冰箱BCD-215SJV(海尔集团)、DU 640紫外分光光度计(德国BECKMAN公司)、COCI光学显微镜(重庆光学仪器厂)、pH计(Jenway,England)、凝胶成像系统(Bio-Rad,USA)、台式离心机(Eppendorf,Germany)、WTL-4K掌上离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、F303电热恒温培养箱(上海怡株电器有限公司)、恒温摇床(Thermo Savant,USA)、PCR仪(Bio-Rad)、PowerPac电泳仪(Bio-Rad)、恒温水浴锅(中国长风)、PB303-N电子精密天平(梅特勒一托利多仪器有限公司)、高压蒸汽灭菌器(日本三洋SANYO)、Mini Q Biocel超级纯水仪(MINIPORE,France)、XW-80A微型漩涡混合仪(上海楚定分析仪器有限公司)、MM721NG1-PW微波炉(美的集团有限公司)。

实施例1 引物筛选

1.引物的设计与合成

通过对烟草青枯菌的DNA序列在NCBI数据库进行同源性比对，初步筛选出特异性好的三段保守序列，根据LAMP引物设计原则，使用LAMP引物设计软件Primer Explorer V4针对三段序列的不同靶序列设计LAMP引物，每个特异序列设计三组引物，分别用这些引物组进行LAMP预实验，通过比较每组引物的特异性和稳定性，最终筛选出针对RipTALI-9gene序列设计的一组引物，引物的序列为：

上游外引物(F3)：5’-GCAGATCCGGAAGCTCAAG-3’

下游外引物(B3)：5’-GATGTGGGCCCTGGTCA-3’

上游内引物(FIP)：

5’-TGCGTGAACCCTTGTCCTGTCCAGGAGAGCCTGAGCGAA-3’

上游内引物(BIP)：

5’-CGACATCTGCCGGATCAGCCGCCAACTCCGGGTAGTTCC-3’

环引物(LF)：5’-AGGTGGTGTGATACTTCGC-3’

环引物(LB)：5’-CAGACGGCAGTCGCTC-3’

2.细菌基因组DNA的制备(CTAB法)

(1)培养5mL的细菌培养物至饱和状态，取1.5mL的培养物10000r/min，离心2min；

(2)沉淀物加入567μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL 10％SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h；

(3)加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min；

(4)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，8000r/min离心5min，将上清液转入一个新管中；

(5)加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，8000r/min离心5min，将上清移入一只新管中；

(6)加入0.6体积的异丙醇，轻轻混合，室温放置30min，直到DNA沉淀下来，12000r/min离心10min；

(7)弃上清，加入1mL 70％的乙醇洗涤，12000r/min离心15min；

(8)弃上清，干燥，重溶于100μL灭菌水中。

(9)用紫外分光光度计测定DNA样品的OD₂₆₀和OD₂₈₀，根据OD₂₆₀/OD₂₈₀比值来评价DNA样品的纯度，根据下列公式估算DNA含量：

dsDNA浓度(μg/μl)＝OD₂₆₀×稀释倍数×50/1000

3.LAMP引物的筛选

用上述2的方法分别得到泛菌属、猕猴桃溃疡病菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄溃疡病菌、柑橘溃疡病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌(泳道3-10)的DNA作为模板，用针对三段保守序列(见表1)各设计的三套引物(共3x3＝9套引物，具体见表1)为LAMP引物，进行LAMP预实验，在25μL体系中，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μL、Bst DNApolymerase 1μL、25mM MgCl₂ 3μL、10mM dNTPs 3μL、20μM FIP和BIP各1μL、5μM F3和B3各1μL、10μM LF和LB各1μL、DNA模板1μL、灭菌去离子水8.5μL。依次加入上述组分于PCR管中混匀，置于水浴锅中63℃温育60min，然后80℃灭活10min终止反应。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图4)。结果显示：只有I图中对应的LAMP引物对烟草青枯菌特异性扩增，而对其它菌没有发生扩增，在其它图中，都发生了以其它菌DNA为模板的扩增，说明这些的引物的特异性较差，只有I图所用的引物具有很好特异性，因此，选择该引物作为最终的引物。

表1初筛引物信息表

实施例2 待测样品DNA模板的制备

烟草青枯病为典型的维管束病害，烟草青枯菌通过根部侵染进入烟草植株，然后通过维管束运输到烟草植株的各个组织中，导致整株烟草发病，最终死亡。

因此，在感染了烟草青枯病菌的烟草植株的维管束中富含有烟草青枯菌，取待测样品烟草植株的茎部和叶柄，用手术刀轻轻削去表皮，露出维管束部位，挤压维管束，将挤压出的汁液加入EP管中，如果汁液较少，可以用灭菌的去离子水冲洗维管束，冲洗后加入EP管，将EP管密封放入沸水浴中煮沸5分钟，使病菌破裂释放出DNA，获得的液体作为LAMP的检测模板。

实施例3 LAMP检测体系的建立

所述的LAMP体系为25μL，体系中10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μL、BstDNA polymerase 1μL、25mM MgCl₂ 2μL、10mM dNTPs 2μL、20μM FIP和BIP各2μL、5μM F3和B3各1μL、10μM LF和LB各1μL、DNA模板1μL、灭菌去离子水8.5μL，依次加入上述组分于PCR管中混匀，置于水浴锅中63℃温育40min。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测，对照管没有扩增，而阳性样品出现Ladder(图1A)；离心后阳性样品(以提取的烟草青枯菌DNA)有白色沉淀物(图1B)；加入SYBR Green I核酸染料，阳性样品的反应产物变为绿色，而阴性样品(阴性样品就是以灭菌去离子水为模板，作为空白对照的)的反应产物为橙色(图1C)。

实施例4 LAMP特异性检测

用上述2的方法分别得到泛菌属、猕猴桃溃疡病菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、番茄溃疡病菌、柑橘溃疡病菌、水稻细条病菌、水稻白叶枯病菌的DNA作为模板，按照上述4中的反应体系和反应条件进行LAMP反应，其中烟草青枯菌DNA为模板作为阳性对照，灭菌去离子水为空白对照。反应结束后进行凝胶电泳检测，检测结果显示：只有以烟草青枯菌DNA为模板出现了特殊的梯状条带，空白对照和其它病菌DNA为模板均未出现条带(图2)。

实施例5 LAMP灵敏性检测

将上述2的方法得到的烟草青枯菌DNA按十倍梯度稀释，得到浓度分别为10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL,0.1fg/μL的DNA作为模板，按照上述方法4的最佳反应体系和反应条件进行LAMP检测和用常规PCR进行检测。

检测结果如图3所示：A图为LAMP检测的电泳图，B图为SYBR Green I染色后肉眼观察结果，C图为常规PCR检测的电泳图。其中M为DL5000 DNA Marker；1为空白对照；2为10ng/μL；3为1ng/μL；4为100pg/μL；5为10pg/μL；6为1pg/μL；7为100fg/μL；8为10fg/μL；9为1fg/μL；10为0.1fg/μL；可以看出，LAMP对烟草青枯菌DNA的检测下限为1fg/μL，而常规PCR对烟草青枯菌DNA的检测下限为100fg/μL。从结果可以看出，本发明的LAMP引物和检测方法的检测灵敏性是常规PCR检测灵敏性的100倍。

实施例6 LAMP对实际样品检测

用灌根法侵染在温室培育生长1个月的烟草植株(菌的浓度10⁷cfu/ml，每株灌30ml)，侵染5天和10天后，分别取烟草植株上、下部的茎和叶柄(本实验中下部叶柄为最下部2-3片真叶的叶柄；下部茎为最上部2-3片真叶的茎的位置及以下区域。本实验中上部叶柄为最下部2-3片真叶的叶柄；上部茎为最上部2-3片真叶的叶柄的茎的位置及以上区域。)，通过上述方法获得茎和叶柄维管束汁液，将维管束汁液加入EP管中，沸水锅中煮沸5-10分钟，以获得的维管束汁液为模板，分别用常规引物RSol(R)/RSol(F)和LAMP引物进行PCR扩增和LAMP扩增，扩增产物进行电泳检测。

取样方法：取发病不同程度的烟草植株，截取烟草植株的茎和叶柄，用手术刀轻轻削去表皮，露出维管束(图5)部位，挤压维管束，将挤压出的汁液加入EP管中，如果汁液较少，可以用灭菌的去离子水冲洗维管束，冲洗后加入EP管，将EP管密封放入沸水浴中煮沸5分钟，使病菌破裂释放出DNA，获得的液体作为LAMP的检测模板。

(1)常规PCR检测

以侵染5天后的烟草植株上、下部的茎和叶柄的维管束汁液为模板进行PCR扩增，引物序列为：R.sol(R)：5’-GCGGACGGATAGATGTAGTTGC-3’，R.sol(F)：5’-CCGACACCACGACCCTGAA-3’。电泳检测结果显示：只有下部茎的汁液作为模板可以扩增出目的条带，而在其它三个部位的组织汁液中没有扩增出目的条带，这说明可能是由于青枯菌还未侵染到这些部位或者是这些部位的烟草青枯菌含量较低，所以未能扩增出目的条带(见图6)。

以侵染10天后的烟草植株上、下部的茎和叶柄的维管束汁液为模板进行PCR扩增，电泳检测结果显示：只有下部茎和叶柄的汁液作为模板可以扩增出目的条带，而上部茎和叶柄的汁液未能扩增出目的条带，这说明可能是烟草青枯菌还未侵染到烟草植株的上部，也可能是上部组织中的烟草青枯菌浓度太低，常规PCR无法检测(见图7)。

(2)LAMP检测

以侵染5天后的烟草植株上、下部的茎和叶柄的维管束汁液为模板进行LAMP扩增，电泳检测结果显示：上、下部的茎和叶柄的维管束汁液均可扩增出特殊的梯状条带，但上部的茎和叶柄扩增出的条带亮度较暗，这说明上部组织中的烟草青枯菌浓度较低(见图8)。

用核酸染料SYBR Green Ⅰ对扩增产物染色观察，染色结果显示与凝胶电泳结果一致(见图9)。

以侵染10天后的烟草植株上、下部的茎和叶柄的维管束汁液为模板进行LAMP扩增，电泳检测结果显示(图10)：上、下部的茎和叶柄的维管束汁液均可扩增出特殊的梯状条带，且亮度没有差别。

用核酸染料SYBR Green Ⅰ对扩增产物染色观察(图11)，染色结果显示与凝胶电泳结果一致。

同时也对LAMP检测方法的检测效率进行了统计，具体见表2和表3。从中可以看出，检测部位以植株下部的茎和叶柄的维管束汁液灵敏性更高。到感染10天后，检出率达到97％以上。

从前述图6～11的结果也可以看出，本发明方法通过染色即可达到PCR电泳检测效果的准确率，十分可信，具有广阔的应用前景。

表2侵染5天后LAMP产物的SYBR GreenI染色

检测部位	检测样品数	检测为阳性数量	检测为阴性数量	阳性检测率(％)
					下部的茎	38	38	0	100
下部的叶柄	45	44	1	98
					上部的茎	38	25	13	66
上部的叶柄	48	27	11	57

表3侵染10天后LAMP产物的SYBR GreenI染色

检测部位	检测样品数	检测为阳性数量	检测为阴性数量	阳性检测率(％)
					下部的茎	29	29	0	100
下部的叶柄	42	42	0	100
					上部的茎	29	27	2	97
上部的叶柄	45	42	3	93

Claims

1.用于烟草青枯病菌检测的LAMP引物组，其特征在于：包括上下游外引物、上下游内引物和一对环引物；所述引物的序列如下：

上游外引物F3：5’-GCAGATCCGGAAGCTCAAG-3’；

下游外引物B3：5’-GATGTGGGCCCTGGTCA-3’；

上游内引物FIP：5’-TGCGTGAACCCTTGTCCTGTCCAGGAGAGCCTGA GCGAA-3’；

上游内引物BIP：5’-CGACATCTGCCGGATCAGCCGCCAACTCCGGGTA GTTCC-3’；

环引物LF：5’-AGGTGGTGTGATACTTCGC-3’；

环引物LB：5’-CAGACGGCAGTCGCTC-3’。

2.采用如权利要求1所述的LAMP引物组检测烟草青枯病菌的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)待检测样品DNA 模板的制备：通过挤压待检测烟草植株的茎部和叶柄，获得维管束汁液，对汁液进行煮沸处理后作为检测样品DNA模板；

(3)LAMP检测结果：在LAMP扩增产物中加入钙黄绿素，若扩增产物变为亮绿色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若扩增产物为棕黄色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌；或者LAMP扩增产物中加入羟基萘酚蓝，若扩增产物变为天蓝色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若扩增产物为紫色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌；或者在LAMP扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料，若扩增产物变为绿色，则待测样品中含有烟草青枯病菌，若扩增产物为橙色，则待测产物中不含有烟草青枯病菌。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中的LAMP扩增产物中加入SYBRGreen I核酸染料。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中LAMP扩增产物离心后，再加入染料进行染色判断。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中植株下部的茎和叶柄的维管束汁液；下部叶柄为最下部2-3片真叶的叶柄；下部茎为最下部2-3片真叶的茎的位置及以下区域。