CN104498633B - 检测桃潜隐花叶类病毒的nasba引物、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法，上游引物、下游引物的序列分别为 SEQ ID NO:1～2；NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：（1）NASBA扩增反应液A；（2）NASBA扩增反应液B；检测方法如下：1）样品RNA的提取；2）进行PLMVd的NASBA扩增；3）电泳检测。本发明适用于对桃潜隐花叶类病毒进行快速检测确证，可广泛应用于农业生产及环境中的疫情监控及进出口贸易中该类病毒的监测及检测，操作极为简便，所需样品量小且对于模板RNA的质量要求较低。

Description

检测桃潜隐花叶类病毒的 NASBA 引物、试剂盒和方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法，属于植物病原的检测技术领域。
背景技术：
桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)属于Avsunviroidae科，通常含338个左右核苷酸，无中央保守区。其在世界各地的桃栽培区均有发生，主要侵染桃、梨、李、杏等核果类果树：PLMVd在许多的桃树（Prunus persica）品种上为潜伏侵染，潜隐期可达5～7年，通常没有明显得叶部症状，但带毒桃树生长缓慢，树势衰退，抗性降低。感病品种染病后，在叶片上形成白色或黄色奶油状的花叶（Peach calico）或印花状病斑，褪绿斑驳（Peach blotch），或者是在小叶上形成边缘坏死的花叶症状（Peach mosaic）。病害发生于桃树生长第二年，症状包括延迟4-6天长叶、开花、成熟；高温时，花瓣出现紫色裂纹；果实不规则、扁状、色泽暗淡，裂果；芽坏死；桃树易早衰；有些强毒株系使叶片产生花叶、块斑、杂色和坏死；还有的能导致茎痘斑和卷叶。可经嫁接和桃蚜传染，随无性繁殖材料远距离传播。据报道，在我国有的果园桃树PLMVd发生较普遍，其造成的经济损失相当严重。目前尚未有桃潜隐花叶类病毒的恒温扩增方面的检测技术的发明报道。因此，建立简单实用的桃潜隐花叶类病毒新型检测鉴定方法，对于提高桃潜隐花叶类病毒的检疫检验效率、防止桃潜隐花叶类病毒的传入、传出，保护我国农业的安全生产，促进我国农产品的顺利出口，具有十分重要的意义。植物类病毒由于不显性侵染比较普遍，症状表现受环境温度的影响较大，而且几种鉴别植物对不同类病毒的反应症状相似，故难于应用生物测定的方法。由于类病毒不能产生任何蛋白质，所以也不能使用检测病毒的电镜、血清学方法。因此，选用分子生物学方法对桃潜隐花叶类病毒进行检测。
NASBA（Nuleic and sequence based amplipicain,NASBA）即“核酸序列依赖性扩增”检测技术是一种经典的恒温扩增技术，适用于单链核糖核酸RNA一步扩增及检测，已广泛应用于人类及动植物病原的检测与诊断。NASBA是由一对引物引导的,在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增。
由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高要求。同时由于多糖等物质对于Taq聚合酶的抑制作用，限制了RT-PCR技术在葡萄、草莓、粮谷类等多酚含量较高的植物病毒RNA检测中的应用。由于NASBA技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此NASBA具备了适合于病原RNA的扩增、检测的特点，最适合各种RNA样品的分析，符合植物病毒检疫的要求，鉴于桃潜隐花叶类病毒危害的严重性，加强环境中的的监控，提高检测效率，对于有效控制桃潜隐花叶类病毒的传播在现阶段具有重要的实际意义。
发明内容：
本发明要解决的技术问题是提供一种用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物，试剂盒和方法。其主要原理是利用一对引物引导,在含有T7 RNA聚合酶、RNAseH、反转录酶AMV、NTP、dNTP及需要使用的各种反应缓冲液所组成的标准反应体系中，通过连续均一的体外特异性酶促反应实现核苷酸序列的等温扩增NASBA。经过循环反复，使RNA不断扩增，对样品中的桃潜隐花叶类病毒进行准确的检测。
本发明的实现，首先依据桃潜隐花叶类病毒全基因组序列设计特异性引物；再提取待测样品的核糖核酸（RNA），然后分别以特异性引物进行NASBA扩增；用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，最后根据NASBA扩增结果来判定样品中是否含有桃潜隐花叶类病毒。
本发明用于检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物，其引物序列分别为 SEQ ID NO:1～2。
SEQ ID NO:1：
NA-P1:5’-aattctaatacgactcactatagggagGAGTGATGACCTCTCAGCCC-3’
SEQ ID NO:2：
NA-P2:5’-aattctaatacgactcactatagggagTTCTACGGCGGTACCTGGAT-3’
本发明提供的检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：
（1）NASBA扩增反应液A:
每25 μL包括10×AMV buffer 2.5 μl，6.25mmol /L NTPs 3 μL，10 mmol /L dNTPs 1.5 μL，10 μmol /L引物NA-P1、NA-P2各0.5 μL，.双蒸水9 μL。
其中缓冲液为含40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL，70 mmol /L KCL，12 mmol /L MgCL2，5 mmol /L DTT缓冲液。
（2）NASBA扩增反应液B:
0.5 U RNaseH，32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反转录酶，2 μL DMSO，0.1 μL1 mol /L 二硫苏糖醇，0.25 μL 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制剂。
（3）NASBA扩增程序：
将待检样品RNA 3 μL加入14 μL反应液A，在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，迅速加入4 μL反应液B，41℃温育2 h，4 ℃终止反应；
（4）NASBA扩增产物鉴定
反应产物用5%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果并进行判定。
本发明还提供了一种检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA的方法，按如下的步骤进行：
1）样品RNA的提取
A、取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。
B、取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。
C、吸取600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。
D、去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。
E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。
2）进行桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增
A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA，
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
3）电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。如果扩增片段为163 bp，说明待检病毒是桃潜隐花叶类病毒，如果没有出现163 bp扩增片段，则说明待检病毒不是桃潜隐花叶类病毒。
本发明根据桃潜隐花叶类病毒的序列高度保守区的设计了两个特异性内引物，该保守基因序列为具有桃潜隐花叶类病毒的不同株系所共有，以保证从株系的水平上检测不同来源的桃潜隐花叶类病毒的可靠性。本发明适用于对桃潜隐花叶类病毒进行快速检测确证，可广泛应用于生产和环境中的病害监控、进出口贸易中该病毒的确证。
与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
第一，便捷性。该发明在进行恒温扩增时，不需要昂贵的核酸扩增反应装置，整个过程始终在42 ℃进行，无需热循环仪，仅1个普通的恒温水浴锅就可完成。
第二，精确度高。该发明酶循环反应的循环数少，不需高温变性步骤，相对于RT-PCR错配率较低，更适于检测和定量特异RNA。
第三，灵敏度高。该发明比起PCR技术，能用较少的循环便扩增出大量的目的基因，保证了检测的高敏感性，是PCR技术灵敏度的10倍。
第四，缩短周期。由于反转录过程被直接合并到扩增反应中， PCR大约需要20轮循环才能扩增106倍，而NASBA只需循环4~5轮即可达到106倍。
第五，降低了对植物RNA模板的质量要求。由于细胞壁中富含大量的多糖、酚类物质，植物病毒RNA的提取存在着稳定性差、重复性低、效率低等问题，加之在提取过程中RNA本身的自降解现象，病毒RNA的含量往往较低，对检测方法的灵敏度和稳定性提出了较高要求。由于该发明针对的模板是RNA，反应的产物也是RNA，反应的结果不受环境中DNA的影响。即使存在外来的双链DNA污染，但由于其不具备T7启动子序列，不可能被扩增，其次，该反应只在42 ℃恒温条件下进行，不需高温变性步骤，所以NASBA反应流程不会受到外来双链DNA 的污染，因此对于模板纯度和质量要求较低。
附图说明：
图1为本发明对病株样品中NASBA扩增图谱。其中M:ssRNA Ladder marker；1：健康葡萄；2：桃潜隐花叶类病毒感病材料。
图2为本发明的特异性结果图。其中M:ssRNA Ladder marker；1：桃潜隐花叶类病毒；2：啤酒花矮化类病毒；3：梨泡状溃疡类病毒；4：苹果绣果类病毒；5：苹果茎痘病毒。
图3为本发明的敏感性结果图。其中M: ssRNA Ladder marker；1~7： 1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6 、1×10-7ng/μL，桃潜隐花叶类病毒感病材料总RNA。
图4为本发明实施例4的实际样品检测图。其中M: ssRNA Ladder marker；1~20：实际样品；其中 1、2、3：雨花露桃（S1、S2、S3）；4、5、6：南水梨（S4、S5、S6）；8、9、10、11、12、13：大久保桃（S8、S9、S10、S11、S12、S13）：雪花梨S10、S14、S16、S19；7、9、14：黄金梨（S7、S9、S14）。
具体实施方式
为了更充分地解释本发明的实施方法，提供了用于检测桃潜隐花叶类病毒NASBA试剂盒的实施实例。这些实施实例仅仅是解释，而不是限制本发明的范围。其中反转录聚合酶AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均购于NEW ENGLAND BIOLAB公司；PCR扩增试剂、DNA marker及等均购于北京天根公司。
实施例 1
1 材料
1.1 病毒
桃潜隐花叶类病毒为中国检科院提供，桃潜隐花叶类病毒(Peach latent mosaic viroid，PLMVd)、啤酒花矮化类病毒（Hop stunt vroid，HSVd）、苹果绣果类病毒(Apple scar skid viroid, ASSVd)、梨泡状溃疡类病毒（Pear Blister Canker Viroid，PBCVd)、、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus，ASPV）由本实验室保存。
1.2 试剂
反转录聚合酶AMV、RNaseH、RNase inhibitor、T7 RNA 聚合酶、dNTP、ssRNA marker、rNTP 均购于NEW ENGLAND BIOLAB公司; PCR扩增试剂、DNA marker及等均购于北京天根公司;
1.3 引物
根据NCBI核酸序列数据库中桃潜隐花叶类病毒的基因全长序列（登录号AY685181.1 ），在保证扩增的兼并性和通用性的前提下通过比较分析桃潜隐花叶类病毒高度保守区，设计5'端带有T7 启动子序列NASBA 反应引物(NA-P1、NA-P2)，设计完成后将引物在数据库的Primer-Blast模块下进行比对验证。
2 方法
2.1病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取为600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。
2.2 NASBA扩增体系
A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA，
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
2.3 电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。预期产物大小为163 bp。见图1。
实施例 2 特异性实验
1、提取桃潜隐花叶类病毒、啤酒花矮化类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒的RNA,使用NASBA方法进行检测。
2、病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取为600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。
3、扩增反应
A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA，
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
4、NASBA产物电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。电泳结果显示，同时使用NASBA方法进行检测苹果绣果类病毒、啤酒花矮化类病毒、梨泡状溃疡类病毒、桃潜隐花叶病毒、苹果茎痘病毒的RNA,只有桃潜隐花叶类病毒得到预期163 bp的扩增产物（见图2）。
实施例 3 敏感性实验
1、用DEPC水将桃潜隐花叶类病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀释，依次为1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7ng/μL，各取2 μL为模板分别进行NASBA扩增反应。。
2、病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min。取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min。小心吸取为600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min。2℃~8℃，12000 g，离心10min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。
3、扩增反应
A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA，
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
4、NASBA产物电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。NASBA产物鉴定：电泳结果显示，桃潜隐花叶类病毒使用NASBA方法能够得到10-4稀释倍数的模板（见图3）。
实施例 4 实际样品检测及对比实验
将从湖北、山东采集的具有典型花叶症状或没有症状的叶片样品及实验室留样（出口台湾梨接穗）14份，雨花露桃（S1、S2、S3）、南水梨（S4、S5、S6）、大久保桃（S8、S9、S10、S11、S12、S13）、黄金梨（S7、S9、S14）分别采用NASBA、RT-PCR进行检测，比较两种方法的效果，以进一步评估NASBA方法的可靠性。
1、实际样品NASBA检测
1）病毒RNA的提取
取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10 min。取上清，15℃~30℃，放置5 min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡（勿涡旋振荡），15s。15℃~30℃，放置2 min~3 min；2℃~8℃，12000 g，离心15 min。小心吸取为600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10 min。2℃~8℃，12000 g，离心10 min。去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5 min。去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA。
2）扩增反应
A、 在装有14 μL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA，
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min，；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
3）NASBA产物鉴定
紫外检测仪下观察电泳结果并记录，电泳结果显示，在14份样品中7份样品为阳性，其他样品为阴性（见图4）。
2、PCR扩增
1）方法：普通RT-PCR反应条件为50 ℃反转录30 min；94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环反应35次；65 ℃延伸10 min。
2）琼脂糖凝胶电泳结果：在14份样品中，7份为阳性，其余7份样品为阴性。
结论：利用上述NASBA和PCR方法同时检测实际样品，两种方法的符合率100%，但NASBA对设备要求更低，便捷性更高。
目前，桃潜隐花叶类病毒是我国较为普遍、危害最为严重的桃类病毒病，引起的病害往往与病毒病易混淆。本发明的应用将有助于在诸多形态相近的病原症状中实现桃潜隐花叶类病毒的快速鉴别。本发明可应用于桃、梨幼苗的培育过程中，通过对类病毒的快速高效检测，可以确保脱毒梨的质量和增产效果。本发明可对桃潜隐花叶类病毒进行特异性鉴定，可应用于桃、梨种苗的进出口检疫、国内地区间调运以及病害调查。
核苷酸序列表
<110> 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA引物、试剂盒和方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 47
<212> DNA
<213> 桃潜隐花叶类病毒
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<223> 用于扩增桃潜隐花叶类病毒的上游引物
<400> 1
aattctaatacgactcactatagggagGAGTGATGACCTCTCAGCCC 47
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 桃潜隐花叶类病毒
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<223> 用于扩增桃潜隐花叶类病毒的下游引物
<400> 2
aattctaatacgactcactatagggagTTCTACGGCGGTACCTGGAT 47

Claims (2)

1.一种检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA扩增试剂盒，包括如下组分：
（1）NASBA扩增反应液A:
每25 μL包括10×AMV 缓冲液2.5 μl，6.25mmol /L NTPs 3 μL，10 mmol /L dNTPs 1.5 μL，10 μmol /L引物NA-P1、NA-P2各0.5 μL，双蒸水9μL；
其中缓冲液为含40 mmol /L PH8.5 Tris-HCL，70 mmol /LKCL，12 mmol /L MgCL2，5 mmol /L DTT缓冲液；
（2）NASBA扩增反应液B:
0.5 U RNaseH，32 U T7RNA 聚合酶，6.4 U AMV 反转录酶，2 μL DMSO，0.1 μL1 mol /L 二硫苏糖醇，0.25 μL 10 mg /mL BSA，20 U RNA 酶抑制剂；
引物NA-P1、NA-P2的序列分别为 SEQ ID NO:1～2。
2.利用权利要求1所述的试剂盒检测桃潜隐花叶类病毒的NASBA方法，包括下列步骤：
1）样品RNA的提取
A、取0.1 g样品，加液氮研磨成粉末状，将研磨物迅速移入1.5 mL离心管中，加入1 mL Trizol Reagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000 g，离心10min；
B、取上清，15℃~30℃，放置5min；加入0.2 mL氯仿，用手剧烈震荡，不要涡旋振荡，15s；15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000 g，离心15min；
C、吸取600 µL的上层水相，勿扰动中间相和下层相，加500 μL异丙醇混合上清液，15℃~30℃，放置10min，2℃~8℃，12000 g，离心10min；
D、去除上清液，沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤；2℃~8℃，7500 g，离心5min；
E、去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30 μL ~50 μL无RNase的水中，即为待检模板RNA；
2）进行PLMVd的NASBA扩增
A、 在装有14 μL NASBA扩增反应液A的反应管中加入3μL 待检模板RNA；
B、在DNA扩增仪或水浴锅上65℃温浴5 min，立即转入41℃温浴5 min；
C. 在反应管中迅速加入4 μL反应液B；
D. 于41℃温育2 h；
E. 将金属浴调到4 ℃中止反应，3 min后取出；
3）电泳检测
取3 g琼脂糖，于100 mL 电泳缓冲液中加热，充分溶化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5 mg/mL，制胶，在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶；将3 mL～6 mL PCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样；9 V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部；紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
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