CN104561270B - 两种水稻纵卷叶螟幼虫的分子生物学区分方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻生产上的两种水稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis)幼虫的分子生物学区分方法，分别以两种水稻纵卷叶螟幼虫基因组DNA为模板，用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序，利用基因分析软件GENEDOC对二者进行分析，获得具有明显差异的一对序列，分别定义为检验序列A和检验序列B；将待检测水稻纵卷叶螟幼虫样本的基因组DNA扩增产物序列分别与已知检验序列A与检验序列B比较，与检验序列A一致的为Cnaphalocrocis medinalis，与检验序列B一致的为Marsamia patnalis。该方法稳定性高、灵敏度高，专用于两种水稻纵卷叶螟幼虫的高灵敏度准确检测区分。

Description

两种水稻纵卷叶螟幼虫的分子生物学区分方法
技术领域
本发明涉及水稻生产上两种水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis幼虫的分子生物学区分方法，属于生物技术领域。
背景技术
水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis是水稻生产上的两种重要害虫，均取食为害水稻叶片并纵向形成卷叶，影响叶片光合作用，造成水稻减产。
两种水稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis)的幼虫形态和危害方式相似，幼虫均先在水稻叶尖危害，后往水稻叶片中部危害，吐丝将叶片纵卷，并取食。对水稻造成的危害状态也相似，都会形成白叶。根据田间危害状况很难判断是哪种水稻纵卷叶螟。这两种水稻纵卷叶螟幼虫均呈黄绿色，两者的细微差别肉眼很难分辨。再者，当虫体受到微生物感染，虫体会完全丧失原有的形态特征，导致无法判断是何种水稻纵卷叶螟。
目前，对于这两种水稻纵卷叶螟幼虫的鉴定，通常借助形态学特征来区分，因其形态极为相似而很容易混淆。区分时还必须保证待测样本的关键形态特征保存完整，但当形态特征丧失或变形后，则无法准确区分这两种水稻纵卷叶螟，这极大地限制了两种水稻纵卷叶螟的相关研究工作。例如，若要研究某地使用微生物药剂后水稻纵卷叶螟的微生物感染状况，但由于无法准确区分受感染样本是哪一种水稻纵卷叶螟，所以这一领域的相关研究会受到极大的限制。为了解决这一难题，我们发明了这一分子生物学区分方法。
发明内容
提供一种准确区分两种水稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis和Marsamiapatnalis)幼虫的分子生物学方法，为非传统分类学教育背景的相关人员提供一种可靠的区分Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis幼虫的方法。
一方面，本发明提供一种利用分子生物学方法准确区分两种水稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis)幼虫的方法，其中，该方法包括：
提取待检测水稻纵卷叶螟幼虫样本的基因组DNA作为PCR的模板，利用所设计的引物对模板DNA分别进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，并把获得的序列与分别与检验序列A和检验序列B进行分析，与检验序列A吻合的是Cnaphalocrocis medinalis，与检验序列B吻合的是Marsamia patnalis；其中，检验序列A为图1中TEST-A所示的序列，检验序列B为图1中TEST-B所示的序列。优选的，检验序列A为SEQ ID NO:1所示的序列，检验序列B为SEQ IDNO:2所示的序列。
优选的，用于水稻纵卷叶螟幼虫检测样本基因组DNA扩增的特异性引物为上游引物F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，和下游引物R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3'。
优选的，所述的PCR扩增产物的系统为：25μl的PCR反应体系，其包括：2.5μl的10×PCR Buffer(Mg2+Free)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μl的MgCl2(25mmol/L)、上游和下游引物、样品基因组DNA1μl、0.125μl的Taq DNA Polymerase，再加灭菌水补足25μl。
另一方面，本发明提供一种把序列A和序列B在制作从分子水平上区分两种水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis之间差异的试剂上的用途，其中，所述的序列A为图1中TEST-A所示的序列，序列B为图1中TEST-B所示的序列。优选的，检验序列A为SEQ ID NO:1所示的序列，检验序列B为SEQ ID NO:2所示的序列。
优选的，还包括用于扩增两种水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和Marsamia patnalis的特异引物序列对，该特异引物为：F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3'。
提取这两种纵卷叶螟幼虫样本的基因组DNA作为PCR的模板，利用所设计的特异性引物F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3'进行PCR扩增。扩增产物进行测序，利用基因分析软件GENEDOC对获得的二者序列进行分析，得到两者之间具有明显差异的一段序列，分别被定义为检验序列A和B。
利用我们所设计的引物将待检测纵卷叶螟幼虫样本的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物序列与检验序列A和检验序列B比较，与检验序列A吻合的是Cnaphalocrocismedinalis，与检验序列B吻合的是Marsamia patnalis。
具体序列见附图1。基因组DNA提取方法与具体实施方式中“样本基因组DNA的提取”相同，PCR体系及扩增程序与具体实施方式中“PCR体系的配制”“PCR扩增程序”相同。
有益效果
本发明与传统方法相比，主要优点有：(1)准确性高：传统方法会由于不同的鉴定人对分类特征的把握的不准确性而导致鉴定结果出现误差。而本发明的方法是基于PCR的分子生物学检测鉴定技术，而目前PCR技术已经发展的相当成熟，拥有标准化和傻瓜化的实验流程，保证了结果的高准确性。(2)：灵敏性高：传统形态学分类方法对于丧失形态学特征的样本无法进行区分。而基于本发明的方法，只要能从样本提取微量的基因组DNA，就能扩增到目标PCR片段，从而完成对待测样本的检测鉴定。
附图说明
图1检测两种水稻纵卷叶螟的检验序列A和检验序列B，其中，“TEST-A”和“TEST-B”为检验序列，
图2田间水稻纵卷叶螟的样本检验结果；其中，图2中“SAM-1”、“SAM-2”、“SAM-3”和“SAM-4”为我们田间采集的样品。图2中“SAM-1”、“SAM-2”和“SAM-3”与“TEST-A”相吻合，为Cnaphalocrocis medinalis，“SAM-4”与“TEST-B”相吻合，为Marsamia patnalis
具体实施方式
实施例子1：检验序列A和B的获得
1、样本基因组DNA的提取
采用杭州爱思进的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取样本基因组DNA，具体操作如下：
(1)将已经过形态学特征鉴定的两种水稻纵卷叶螟幼虫A和B(其中A为Cnaphalocrocis medinalis，B为Marsamia patnalis)分别放入1.5ml离心管中，加入液氮研磨成粉，加入350μl Buffer PBS和0.9μl RNase A后温和地研磨30s。
(2)收集350μl研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl。加入150μl Buffer C-L和20μl蛋白酶K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后,将离心管置56℃水浴10min。
(3)加入350μl Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min。
(4)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤3中的混合液移至制备管中，12,000×g离心1min。
(5)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min。
(6)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，以同样的方法，用700μl Buffer W2再洗涤一次。
(7)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12,000×g离心1min。
(8)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。离心管中液体即为基因组DNA。
2、PCR体系的配制
使用25μl的PCR反应体系，包括：2.5μl的10×PCR Buffer(Mg2+Free)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μl的MgCl2(25mmol/L)、上游和下游引物(10μmol/L)各1μl(F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCT3')、样品基因组DNA1μl、0.125μl的Taq DNA Polymerase，再加灭菌水补足25μl。
3、PCR扩增程序
94℃4min；95℃40s、64℃20s、72℃ 40s(35个循环)；72℃ 2min 40s。
4、扩增产物测序
将扩增产物纯化后加入ABI3730XL测序仪中进行序列测定。
5、序列分析
将样品序列导入GENEDOC软件中去掉多余序列后，分别得到序列A和序列B。其中序列A为如下序列(SEQ ID NO:1)：
GCTGCATAAAAACAATGACCACATTGCGCGCGTTACGCGCGCTGATGACGGTTCTTGATGATTATGATATTAACTTATCGTTGTCGTCTGGTCCGTTCAAATATTATTATGATCGTTTCACGCTCGTACGCACACAGTACGACGTGCACGATTGTGACGTCGCCTCACACTACGTTAACAGTAGCGCGCGACTCTTCGACTTACACCAAAGTCTATAGAGAGAGCGGCATAATCTGTTTTAAATGTATGTGCGAAGCGCTGACGTCACGTTTAATATCGTGCACGTTTAGTACGTGTGTAAACAACGTTGTGTGTCTAAACGATGATTAAAAAAAAGGCGGACTCCTCGACCGACGAGGAGGATCAACGCCGCCGCCGCCGCCTCCTATGATGGTGACTACGTCGTAGCACTGACGAATATCATGTCTGCCTCTCCTTTTATCAT
序列B为如下序列(SEQ ID NO:2)：
GCTGCATAAAAACAATGACCACATTGCGCGCGCGGCGCGCTTATGACGGTTCTTGATGATTATGTATATAATCGTCTGGTCCGTTCAAATATTATTATGATCGTTTCACGCGCGTACGCACAGTACGACGTGCACGATTGTGACGTCGCTCACCACTACGTCAATAGTAGCGCGACTCTTCGACTTACTCCAAAGTCTATAGAGAGAGCAGCATATCTATTGCACGTACGTGTGCGAGCGACGCTCGCTTTTAATGTCGTGAACGTTTTGTACGTGTGTCAAACGTTGTGTGTTCAAACGACGATCGAACAAAATATAAAAGTAGGCGGACTCGACGTCCGAAGAGGCGCATCGACGCCGTCGCCGCCGTCTCGTATGGTGGTTACGTCGTCGTAGCGCTGACGGATATCGTGTCTGCCTCTCATTTTATCGT。
经过分析发现序列A和序列B之间的同源性为81％，它们之间具有明显的差异性，如图1所示，在图1中序列上方数字80位处序列B较序列A缺少一段10bp序列，在序列上方数字340位前，序列B较序列A增加一段9bp的序列，序列A和序列B具有明显的特征差异。分别定义序列A和序列B为检验序列A和检验序列B。
实施例子2：利用本发明提供的检验序列A和B对待检测样本是Cnaphalocrocismedinalis还是Marsamia patnalis进行验证
2014年我们在田间采集到4份被微生物侵染的水稻纵卷叶螟幼虫样本，非传统分类学教育背景的人通过形态学观察无法确定是Cnaphalocrocis medinalis还是Marsamiapatnalis，则利用本发明方法进行鉴定。
1.样本基因组DNA的提取
采用杭州爱思进的AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取样本基因组DNA，具体操作如下：
(1)将待检测样本(SAM-1、SAM-2、SAM-3和SAM-4)分别放入1.5ml离心管中，加入液氮研磨成粉，加入350μl Buffer PBS和0.9μl RNase A后温和地研磨30s。
(2)收集350μl研磨好的组织匀浆并转入2ml离心管。如匀浆体积不足350μl，补充PBS至350μl。加入150μl Buffer C-L和20μl蛋白酶K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后,将离心管置56℃水浴10min。
(3)加入350μl Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12,000×g离心10min。
(4)将DNA制备管置于2ml离心管中，将步骤3中的混合液移至制备管中，12,000×g离心1min。
(5)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入500μl Buffer W1，12,000×g离心1min。
(6)弃滤液，将制备管置回到原来的2ml离心管中，加入700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，以同样的方法，用700μl Buffer W2再洗涤一次。
(7)弃滤液，将制备管置回原来的2ml离心管中，12,000×g离心1min。
(8)将DNA制备管置于另一洁净的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加100-200μlEluent或去离子水，室温静置1min，12,000×g离心1min洗脱DNA。离心管中液体即为基因组DNA。
2、PCR体系的配制
使用25μl的PCR反应体系，包括：2.5μl的10×PCR Buffer(Mg2+Free)、2μl的dNTPs(2.5mmol/L)、1.5μl的MgCl2(25mmol/L)、上游和下游引物(10μmol/L)各1μl(F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCT3')、样品基因组DNA1μl、0.125μl的Taq DNA Polymerase，再加灭菌水补足25μl。
3、PCR扩增程序
94℃4min；95℃40s、64℃20s、72℃ 40s(35个循环)；72℃ 2min 40s。
4、扩增产物测序
将扩增产物纯化后加入ABI3730XL测序仪中进行序列测定。
5、序列分析
将样品序列导入GENEDOC软件中去掉多余序列后，得到序列SAM-1、SAM-2、SAM-3和SAM-4，将它们与检验序列A和检验序列B比较，发现SAM-1、SAM-2、SAM-3与检验序列A吻合，SAM-4与检验序列B吻合。
结果显示，四份样品中有三份是Cnaphalocrocis medinalis，一份是Marsamiapatnalis。检测结果见说明书附图2。
同时，对于通过基因水平区分的两种不同幼虫由分类学专业人员通过形态学区分进行比较，发现通过形态学区别的结果于本发明检验的结果是一样的，这进一步说明采用检测序列A和B可以完全进行两种不用害虫的区分。
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<110> OrganizationName : 浙江省农业科学院
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<213> OrganismName : Cnaphalocrocis medinalis
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Claims (5)

1.一种利用分子生物学方法检测水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis幼虫的方法，其中，该方法包括：
提取待检测的水稻纵卷叶螟幼虫样本的基因组DNA作为PCR的模板，利用所设计的引物对模板DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，并把获得的序列与检验序列A进行分析，与检验序列A吻合的是Cnaphalocrocis medinalis，与检验序列A不吻合的就不是Cnaphalocrocis medinalis；其中，检验序列A为SEQ ID NO:1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，用于水稻纵卷叶螟幼虫待检测样本基因组DNA扩增的特异性引物为上游引物F：5’-
ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’和下游引物R：5'
TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3'。
3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR扩增产物的系统为：25μl的PCR反应体系，其包括：2.5μl的不含镁离子的10×PCR Buffer、2μl的dNTPs，其浓度为2.5mmol/L、1.5μl的MgCl2，其浓度为25mmol/L、所述的上游和下游引物、样品基因组DNA1μl、0.125μl的Taq DNAPolymerase，再加灭菌水补足25μl。
4.一种把序列A在制作从分子水平上检测水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis的试剂上的用途，其中，所述的序列A为SEQ ID NO:1所示的序列。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的试剂还包括用于扩增水稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis的特异引物序列对，该特异引物为上游引物：F：5’-ATGAACATCGACATTTCGAACGCACAT-3’，和下游引物R：5'TTCTTTTCCTCCGCTTAGTAATATGCTTAA-3'。
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