CN102796825B - 特异性检测旱稻孢囊线虫的pcr方法 - Google Patents

Abstract

一种特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，是以旱稻孢囊线虫特异性引物He-F/He-R对待测样品进行PCR扩增，再电泳鉴定，该特异性引物可在旱稻孢囊线虫群体特异性扩增出281bp的片段，其灵敏度达1/256条2龄幼虫。还可在PCR体系中加入通用引物D2A/D3B作内标，同时扩增出780bp的片段。本发明方法不仅可用于单个旱稻孢囊线虫种孢囊和单条旱稻孢囊线虫的2龄幼虫的鉴定和检测，还适用于土壤和水稻根样中旱稻孢囊线虫的检测，本方法特异性强，灵敏度高，耗时短，操作简单，在旱稻孢囊线虫的检测和旱稻孢囊线虫病的早期诊断方面具有很高的应用价值。

Description

特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法

技术领域

本发明涉及植物寄生线虫检测领域，具体涉及以旱稻孢囊线虫特异性引物检测旱稻孢囊线虫的PCR方法。

背景技术

旱稻孢囊线虫（Heterodera elachista ohshima,1974）又称日本孢囊线虫（Japanese cyst nematode），最早由冈田1953年在日本枥木县山地稻田中发现。该病害在湖南省多个县市的丘陵地带稻田均有发生。该病害危害隐蔽，同缺肥、缺水症状相似，不造成特异性症状。该线虫一般寄生在水稻根部，具有主动侵染寄生和自行转移危害等特点，对水稻的危害，除吸取寄主的营养和对植物的根部造成损伤外，还能显著降低水稻对水的利用效率，从而破坏植物的正常代谢和机能，影响生长和发育，致使植物的产量减少，品质下降。据报道，该线虫在水稻上可造成7%-19%的损失。建立简单快速检测旱稻孢囊线虫的方法有助于有效地进行旱稻孢囊线虫的监测与防控。

在孢囊线虫的鉴定与检测方面，目前主要以传统形态学鉴定为主，不仅需要丰富的知识经验，而且往往会出现误诊的问题，同时形态鉴定耗时费力，需要专业人士操作，并且还需要从土壤中分离大量孢囊线虫样品，却达不到快速从土壤分离的线虫混合样品或水稻根系中直接检测出线虫的水平。

随着分子生物学的发展，线虫检测鉴定技术取得了重大突破，线虫的系统分类不再仅仅依靠形态学特征等传统的方法，已探索出许多线虫种群分类鉴定的分子诊断方法，利用分子技术探索不同种群rDNA的内转录间隔区（internaltranscribed spacer,ITS）和rDNA28S的D2／D3区的序列特征已成为近年来线虫分子诊断的研究热点。ITS序列是一个多用途的遗传标记，位于18S和28S核糖体DNA基因的重复簇之间，中间被5.8S核糖体DNA基因分开。研究ITS区域有很多优势,尤其是在样品较少而其它方法不能正确地鉴定线虫时，分析rDNA-ITS区域的序列，可以更有效地鉴定和分辨更多的农业重要线虫种或近缘种（Subbotin,et a1,2001）。

目前，国内外尚无基于旱稻孢囊线虫的rDNA的ITS序列设计特异性引物检测旱稻孢囊线虫的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，该方法是以旱稻孢囊线虫特异性引物He-F/He-R对待测样品进行PCR扩增，再电泳鉴定，该特异性引物为：

He-F：5'-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3'，

He-R：5'-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3'。

采用上述特异性引物进行PCR扩增，能扩增出旱稻孢囊线虫281bp的片段。

基于上述特异性引物，还可采用一步双重PCR扩增进行检测，即在PCR反应体系中加入通用引物D2A/D3B作内标：

D2A：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'，

D3B：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'；

可同时扩增出780bp和281bp的片段。

对本发明方法详细叙述如下：

一、特异性引物的设计：

本发明人将旱稻孢囊线虫的ITS序列及从NCBI基因库下载的隶属孢囊属的6个近缘种（见下表1）的ITS序列进行比对分析，设计筛选出一对旱稻孢囊线虫特异性引物He-F/He-R。此对特异性引物的上游引物（He-F）位于ITS序列的第48bp至第72bp，下游引物（He-R）位于ITS序列的第304bp至328bp，扩增得特异性片段长度为281bp，该特异性引物序列如下：

He-F：5'-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3'（如SEQ ID NO：1所示），

He-R：5'-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3'（如SEQ ID NO：2所示）。

表1  6种孢囊线虫及登录号

线虫	学名	登录号
			拟水稻孢囊线虫	H.oryzicola	AF274387
大豆孢囊线虫	H.glycines	HM560782
			禾谷孢囊线虫	H.avenae	HM560737
菲利普孢囊线虫	H.Filipjevi	HM147947
			豌豆孢囊线虫	H.goettingiana	AF498374
甘蔗孢囊线虫	H.sacchari	AF274403

将该特异性引物He-F/He-R分别经BLAST检索，见表2和表3，结果表明，引物He-F/He-R的序列与检索出现的旱稻孢囊线虫的核苷酸序列均100%覆盖。

表2  引物He-F的BLAST结果

表3  引物He-R的BLAST结果

二、PCR过程：

以上述特异性引物对旱稻孢囊线虫的2龄幼虫、单个旱稻孢囊线虫种孢囊及从水稻田土壤分离的线虫混合样品、水稻根组织进行PCR检测，PCR反应体系如下：

10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)5μl，dNTP Mixtue(10mmol/L)4μl，引物(10μmol/L)各2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.4μl，DNA模板2μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。

反应条件：95℃预变性5min，94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再次延伸7min，4℃保存。

PCR扩增结束后，取5μl扩增产物加1μl 6×Loading Buffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，120V下电泳40min，EB染色后用凝胶成像系统分析，能扩增出281bp的片段。

基于上述特异性引物，还可采用一步双重PCR扩增进行检测。双重PCR扩增反应体系中同时置有上述旱稻孢囊线虫特异性引物对He-F/He-R与通用引物对D2A/D3B，是以通用引物对D2A/D3B作为内标，该通用引物对序列如下：

D2A：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'（如SEQ ID NO：3所示），

D3B：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'（如SEQ ID NO：4所示）；

并采用如下PCR反应体系：

10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)5μl，dNTP Mixtue(10mmol/L)4μl，引物(10μmol/L)各2μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.4μl，DNA模板2μl，灭菌ddH₂O补足至50μl。

上述双重PCR检测采用如下PCR反应条件：

95℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再次延伸7min，4℃保存。

PCR扩增结束后，取5μl扩增产物加1μl 6×Loading Buffer在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用1×TAE作为电泳缓冲液，120V下电泳40min，EB染色后用凝胶成像系统分析，同时扩增出780bp和281bp的片段。

本发明的有益效果是：采用普通PCR扩增仪就能使用本发明设计的特异性引物及方法，能快速准确地检测单个旱稻孢囊线虫种孢囊、单条旱稻孢囊线虫的2龄幼虫、土壤或水稻根组织的旱稻孢囊线虫，对其他种线虫没有扩增能力，并且灵敏度达到单条旱稻孢囊线虫2龄幼虫DNA量的1/256，达到检测单条旱稻孢囊线虫2龄幼虫的水平。

附图说明：

图1是本发明的特异性引物的灵敏度检测电泳结果图。

图中的电泳带分别为：M：Marker DL2000；1-4：分别为15,10,5,1条旱稻孢囊线虫；5-12：分别为单条旱稻孢囊线虫的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128和1/256；13：阴性对照。

图2是用本发明的特异性引物对旱稻孢囊线虫与水稻根组织的混合样品作PCR检测的电泳结果图。

图中的电泳带分别为：M：Marker DL2000；1-5：分别为100mg水稻根组织中加入15、10、5、3、1条旱稻孢囊线虫；6：水稻根组织。

图3是用本发明的特异性引物扩增检测田间水稻根组织的电泳结果图。

图中的电泳带分别为：M：Marker DL2000；1-3：旱稻孢囊线虫侵染的水稻根组织；5-6：无旱稻孢囊线虫侵染的水稻根组织。

图4是采用双重PCR扩增旱稻孢囊线虫及其他常见孢囊线虫的电泳结果图。

图中的电泳带分别为：M：Marker DL2000；1：湖南长沙县采集的旱稻孢囊线虫(HE-1)；2：湖南省桃江县采集的旱稻孢囊线虫(HE-2)；3：湖南省衡东县采集的旱稻孢囊线虫(HE-3)；4：湖南省永州市采集的旱稻孢囊线虫(HE-4)；5：菲利普孢囊线虫；6：禾谷孢囊线虫；7：豌豆孢囊线虫；8：大豆孢囊线虫；9：阴性对照。

图5是采用双重PCR扩增多种线虫混合DNA的电泳结果图。

图中的电泳带分别为：M：Marker DL2000；1-6：6个无旱稻孢囊线虫危害的稻田采集分离的线虫混合样品；7-12：加入旱稻孢囊线虫2龄幼虫的混合样品；13-16：旱稻孢囊线虫危害的稻田采集分离的线虫混合样品；17：阴性对照。

具体实施方式

下面将结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

实验材料：禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫和大豆孢囊线虫由中国农业科学院植物保护研究所彭德良研究员惠赠，豌豆孢囊线虫、湖南省四个不同地市的旱稻孢囊线虫、10份线虫混合样品、及6份田间供试水稻根组织由本实验室自行采集（见下表4）。

主要试剂：植物基因组DNA抽提试剂盒购自天根公司，Marker DL2000、6×Loading Buffer、10×PCR buffer、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶等均购自TaKaRa公司，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

表4  供试样品来源

线虫	学名	来源地
			旱稻孢囊线虫（HE-1）	H.elachista	湖南省长沙县干杉镇
旱稻孢囊线虫(HE-2)	H.elachista	湖南省桃江县浮邱山乡
			旱稻孢囊线虫(HE-3)	H.elachista	湖南省衡东县新塘镇
旱稻孢囊线虫(HE-4)	H.elachista	湖南省永州市接履桥镇
			豌豆孢囊线虫	H.goettingiana	湖南华容
多种线虫混合样品	-	湖南长沙
			田间供试水稻根组织	-	湖南长沙

实施例1，特异性引物的一步PCR灵敏度检测

采用水稻土浸液孵化从湖南省四个地方采集的旱稻孢囊线虫的2龄幼虫，对获得的2龄幼虫采用如下方法提取DNA：

挑取单条至15条线虫分别置于具10μl ddH₂O的200μl PCR管中，液氮中反复冻融五次，加入5μl的ddH₂O，2μl的10×PCR buffer，和3μl的蛋白酶K溶液（600μg/ml），将PCR管放入-20℃冰箱中冷冻至少2h。将冷冻后的PCR管置于65℃温育1h以降解核糖核酸，95℃加热10min使蛋白酶K变性，最后12000r/min离心1min，取上清于-20℃保存备用。

取15、10、5、1条旱稻孢囊线虫二龄幼虫的DNA，以及以单条2龄幼虫的DNA以2倍法梯度稀释后得到8个不同浓度的DNA (1/2×、1/4×、1/8×、1/16×、1/32×、1/64×、1/128×、1/256×)。以不同数量旱稻孢囊线虫的DNA及稀释后的DNA做模板，用特异性引物He-F/He-R进行PCR扩增，以检验引物He-F/He-R的灵敏度，结果如图1所示，以无旱稻孢囊线虫DNA模板为阴性对照。

结果显示：15、10、5、1条旱稻孢囊线虫DNA扩增出的特异性281bp的条带非常清晰明亮，所用模板为单条旱稻孢囊线虫DNA量的1/32时都能扩增出较清晰的特异性条带，所用模板为单头旱稻孢囊线虫DNA量的1/256时也能检测到特异性条带，阴性对照中无任何条带出现。这说明特异性引物He-F/He-R检测旱稻孢囊线虫的灵敏度非常高，研究出的PCR检测方法可靠，可用于旱稻孢囊线虫的快速检测。

实施例2，特异性引物扩增旱稻孢囊线虫与水稻根组织（无旱稻孢囊线虫侵染）的混合样品

对于旱稻孢囊线虫与水稻根组织（无旱稻孢囊线虫侵染）的混合样品的DNA的提取，采用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒。

在灭菌的2ml离心管中加入0.1g的水稻根组织，再分别加入15条、10条、5条、3条、和1条旱稻孢囊线虫2龄幼虫。放入液氮中充分研磨后用植物基因组DNA提取试剂盒提取水稻根组织和旱稻孢囊线虫的混合样品的DNA，采用没加入旱稻孢囊线虫的水稻根DNA模板为阴性对照，用设计的特异性引物He-F/He-R进行PCR扩增，结果如图2所示。

结果显示：在0.1g的水稻根组织中，分别加入15条、10条、5条、3条、和1条旱稻孢囊线虫，用设计的特异引物He-F/He-R扩增提取的水稻根组织和旱稻孢囊线虫的混合DNA模板中，均扩增出281bp的特异性条带，无旱稻孢囊线虫侵染的水稻根DNA中无任何条带。结果表明，采用本发明设计的特异性引物He-F/He-R以及采用的DNA提取方法和PCR体系可以稳定地从水稻根组织中检测出旱稻孢囊线虫，且灵敏度高。

实施例3，特异性引物扩增检测田间水稻根组织

分别从湖南省长沙县干杉镇旱稻孢囊线虫危害的3个不同水稻田地块以及无旱稻孢囊线虫危害的3个不同水稻田地块采集水稻根剪取水稻白色根组织约1g至研钵，加入液氮充分研磨后采用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取所有样品的DNA，用设计的特异性引物进行PCR扩增，结果如图3所示，以无线虫DNA模板为阴性对照。

结果显示：采集的旱稻孢囊线虫侵染的水稻根DNA模板能扩增出281bp的特异性条带，而无旱稻孢囊线虫侵染的水稻根没有任何条带。结果表明，采用本发明设计的特异性引物He-F/He-R以及DNA提取方法和PCR体系可以稳定地从水稻根组织中检测出旱稻孢囊线虫，且稳定性高。

实施例4，特异性引物与通用引物（D2A/D3B）结合对孢囊的一步双重PCR的扩增

DNA的提取方法：挑取一个饱满的孢囊放入灭菌的PCR管中，加入10μl的ddH₂O，7μl的10×PCR buffer，和3μl的蛋白酶K溶液（600μg/ml），液氮中反复冻融3次，并用灭菌的玻璃棒研磨孢囊，最后一次冻结后，将PCR管放入-20℃冰箱中冷冻至少2h。将冷冻后的PCR管置于65℃温育90min以降解核糖核酸，95℃加热10min使蛋白酶K变性，最后12000r/min离心1min，取上清于-20℃保存备用。

照上述方法分别提取四个地方的旱稻孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豌豆孢囊线虫、及大豆孢囊线虫孢囊的DNA。将设计的旱稻孢囊线虫特异性引物对He-F/He-R与通用引物对D2A/D3B置于同一PCR反应体系中，采用特异性引物He-F/He-R以及通用引物D2A/D3B进行一步双重PCR扩增，采用无线虫DNA模板为阴性对照，结果如图4所示，其中引物对He-F/He-R扩增旱稻孢囊线虫ITS区域内281bp的片段，引物对D2A/D3B扩增rDNA基因D2D3区域约780bp的片段。

结果显示：在旱稻孢囊线虫的一步双重特异性检测中，4个不同地市采集的旱稻孢囊均扩增出2条稳定的条带，其中281bp条带是由旱稻孢囊线虫的特异性引物He-F/He-R扩增产生，780bp的条带是由引物D2A/D3B扩增产生，而菲利普孢囊线虫、禾谷孢囊线虫、豌豆孢囊线虫及大豆孢囊线虫均只有引物D2A/D3B扩增产生的780bp的条带，阴性对照中无任何条带出现。

实施例5，特异性引物与通用引物（D2A/D3B）结合对田间土壤总线虫的的一步双重PCR扩增

DNA的提取方法：采集水稻根际土壤500ml，采用浅盘法在30℃恒温箱中分离土壤样品中的线虫，将分离得到的线虫离心弃上清后得到线虫悬浮液。取20～30μl线虫悬浮液于PCR管中，液氮中冷冻后用灭菌的玻璃棒研磨至冰融化，反复5次，加入10μl的ddH₂O，4μl的10×PCR buffer，和6μl的蛋白酶K溶液（600μg/ml），将PCR管放入-20℃冰箱中冷冻至少2h。将冷冻后的PCR管置于65℃温育90min以降解核糖核酸，95℃加热10min使蛋白酶K变性，最后12000r/min离心2min，取上清于-20℃保存备用。

从不同地块采集6个无旱稻孢囊线虫的线虫混合样品，做成两份，一份均加入3条旱稻孢囊线虫。并从旱稻孢囊线虫危害的4个水稻田地块采集土样分离得到4个线虫混合样品，提取所有样品的DNA。采用特异性引物He-F/He-R以及通用引物D2A/D3B进行一步双重PCR扩增，以无线虫DNA模板为阴性对照，结果如图5所示，其中引物对He-F/He-R扩增旱稻孢囊线虫ITS区域内281bp的片段，引物对D2A/D3B扩增rDNA基因D2D3区域约780bp的片段。

结果显示：对田间多种线虫混合样品的检测中，6个无旱稻孢囊线虫的线虫混合样品只有引物D2A/D3B扩增产生的780bp的条带，加入旱稻孢囊线虫后能扩增出2条稳定的条带，同时采集的旱稻孢囊线虫危害的水稻田土壤混合线虫样品也能扩增出两条稳定的条带，阴性对照中无任何条带。说明该对引物特异性高，能特异性检测到旱稻孢囊线虫。

Claims (4)

1.一种特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，其特征在于：该方法是以旱稻孢囊线虫特异性引物He-F/He-R对待测样品进行PCR扩增，再电泳鉴定，该特异性引物为：

He-F：5'-ATTCACCACCTACCCTCGCTGCCTA-3'，

He-R：5'-TTGGAGCAGCAAACCGACCAGCGAT-3'。

2.如权利要求1所述的特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，其特征在于：采用所述特异性引物进行PCR扩增，产生281bp的片段。

3.如权利要求1或2所述的特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，其特征在于：所述PCR扩增采用的反应体系中还包括以下通用引物：

D2A：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'，

D3B：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'。

4.如权利要求3所述的特异性检测旱稻孢囊线虫的PCR方法，其特征在于：所述PCR扩增同时产生780bp和281bp的片段。

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