CN112195261B

CN112195261B - 一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒

Info

Publication number: CN112195261B
Application number: CN202011097678.8A
Authority: CN
Inventors: 刘二龙; 左然玲; 卢丽; 牟桂萍; 李志勇; 王毅谦; 高秀洁; 郑冠津; 华展义
Original assignee: Huangpu Customs Technical Center
Current assignee: Huangpu Customs Technical Center
Priority date: 2020-10-14
Filing date: 2020-10-14
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2040-10-14
Also published as: CN112195261A

Abstract

本发明公开了一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。本发明针对恰特草叶绿体特异性序列设计引物和探针，建立恰特草特异性实时荧光PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高、可重复性良好等优点，最低检测下限为0.02％。有效的解决恰特草特异性快速检测技术的问题，该方法可应用于进出境口岸检验检疫监管的恰特草及其产品的检测。

Description

一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

背景技术

恰特草(Catha134 edulis)，又名：巧茶、也门茶、阿拉伯茶、埃塞俄比亚茶等，属卫矛科(Celastraceae)巧茶属(Catha134)植物，产于东非和阿拉伯半岛等地区。其含兴奋化学物质卡西酮，对人体中枢神经具有刺激作用，长期嚼食会染癖成瘾，又被称为“东非罂粟”，具有严重的社会危害性。世界卫生组织将恰特草归类为Ⅱ类软性毒品。很多国家已将其列为兴奋剂或受管制药物，严禁旅客携带或邮寄入境。2014年，恰特草已列入《精神药品品种目录(2013版)》，被视为第一类精神药品，属毒品范畴，严禁携带入境。

恰特草作为一种新型的毒品原植物，外形似茶叶等植物。其经烘炒后的枝叶，外形酷似茶叶，形态上具有很高的伪装性，一些不法分子在高额利润的驱使下铤而走险进行非法走私与贸易。国内也陆续有查获的相关报道，如2016年青岛海关查获新型毒品恰特草，形似铁观音；原广州机场出入境检验检疫局于2012年查获干燥的“香椿叶”名义进口的恰特草一批。

目前口岸执法鉴定主要依靠传统的形态识别、质谱法和DNA条码法三类方法。

形态识别方法对于形态完整或新鲜的恰特草有一定的鉴别意义，但其鉴别需要形态学鉴别经验积累，技术推广较困难，不适合一线监管人员快速掌握，特别对于一些形态特征被破坏，外观不完整，或是加工混杂的产品，形态学的方法就难以适用这类情形，具有一定的局限性。

质谱方法主要检测恰特草中的卡西酮，新鲜的恰特草含有兴奋剂卡西酮和去甲麻黄碱，其中卡西酮结构不太稳定，采摘后72h内就会产生一定的分解，易分解成去甲伪麻黄碱和去甲麻黄碱，由于在干燥的恰特草中无法检出卡西酮，因此质谱方法存在一定的局限。郭海荣等建立了恰特草的质谱检测方法(郭海荣、郭鸣等，恰特草的气相色谱/质谱检测方法及成分变化[J].河北公安警察职业学院学报，2014,14(2):22-23)，该检测方法一般采用5.0g恰特草叶进行提取，提取过程包括用乙酸乙酯超声、浸泡过夜等，提取过程较复杂且时间较长，难以满足案件紧急时对检测周期的要求；所需样品用量较多，难以适应微量样品的情况，另外该方法需要质谱等大型检测仪器，价格昂贵。

DNA条码方法：申钰柯等采用DNA条形码进行恰特草的检测(申钰柯、刘栋业等，DNA条形码在新型毒品原植物恰特草种属鉴定中的应用研究[J].森林公安，2017,3:29-31)。其选择序列为卫茅科的通用保守基因rbcL的共有片段，(KX377451)，检测的步骤包括：通用引物的PCR扩增，电泳检测，外送测序公司进行测序，拟采用进化树方法进行比对分析遗传亲源关系，但目前该类保守基因可供分析比对的序列数据量少，该文中也未出示进化分析的数据。此外该类方法需经普通PCR、电泳、测序和进化树分析等过程，检测步骤繁琐，周期长，检测通量低，难以满足口岸监管部门对恰特草快速分类鉴定需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别毒品原植物恰特草及其制品特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒。

本发明的第一个目的是提供一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物，所述的检测引物如下所示：

Catha134-F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'(如SEQ ID NO.1所示)

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'(如SEQ ID NO.2所示)。

本发明的第二个目的是提供一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测探针，所述的检测探针如下所示：Catha134-P：5'-CTTTGACAAAAACCCTTAAA-3'(如SEQ ID NO.3所示)，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

优选地，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为MGB。

本发明的第三个目的是提供一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：

Catha134-F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'；

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'；

所述的检测探针如下所示：

Catha134-P：5'-CTTTGACAAAAACCCTTAAA-3'，探针的5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。

本发明的第四个目的是提供一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测方法，该检测方法包括以下步骤：

(1)提取样品的基因组DNA作为模板；

(2)加入权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；

(3)将扩增反应体系在荧光PCP仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为恰特草或其制品。

所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μL，包括Premix Ex Taq 12.5μL，ROXReference Dye II 0.3μL，10μmol/L检测引物Catha134-F和Catha134-R各0.25μL，10μmol/L检测探针Catha134-P 0.25μL，DNA模板2μL和ddH₂O 9.45μL。

所述的步骤(3)的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为恰特草或其制品的标准为：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果有典型荧光扩增曲线，Ct值≤38.0，则判定样品为恰特草或其制品；如果Ct值＞38.0或无Ct值，则判定样品不是恰特草或其制品。

本发明的第五个目的是提供上述的检测引物和检测探针在制备检测恰特草及其制品的试剂盒中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述的检测试剂盒在鉴别恰特草及其制品中的应用。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1)灵敏度高：检测限可达0.02％；2)特异性良好；3)检测时间短：整个检测从核酸提取到实时荧光PCR完成能控制在2个小时内，大大缩短检测时间；4)应用方便：相较于形态等鉴定方法，操作简便，检测难度较低，准确定高。本方法特异性强，灵敏度高，结果准确，可快速、方便、高效的进行恰特草苗木、材质和遗传物质的鉴定，对于打击走私恰特草及其制品等有重要意义。

附图说明

图1是恰特草检测灵敏度试验扩增图。从左至右1～6分别为提取的恰特草DNA溶液加TE缓冲液稀释的DNA样品：50％、8.33％、1.38％、0.23％、0.04％和0.02％。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

主要材料：大叶黄杨、小叶黄杨、女贞、桉树、南蛇藤、桃叶卫茅、五层龙、黑旦、绿茶、红茶、黄山毛峰、乌龙、大红袍、小叶女贞、木薯，为本实验室购置储备。

主要试剂：Primex Ex Taq(2×)for qPCR，大连宝生物；DNA提取试剂盒A1120，promega公司；引物和探针由闪晶生物公司合成，稀释为终浓度为10μM的工作液使用。

主要仪器与设备：

ABI7500，ABI7500FAST实时荧光定量PCR仪，美国应用生物系统公司；nanodrop2000c微量分光光度计，美国Thermo公司；研磨机，德国IKA，微滴数字PCR仪QX200，美国伯乐公司。

植物材料基因组DNA采用常规方法提取与纯化。

实施例1：实时荧光PCR检测方法的建立

筛选出的恰特草特异性序列(如SEQ ID NO.4所示)，应用Primer Primer 5.0软件设计引物和探针。设计了四组引物探针，经特异性筛选后选取Catha134-F/R/P进行测试，具体引物探针信息见表1。

表1实时荧光PCR的引物、探针

扩增反应体系为25μL：包括Premix Ex Taq^TM 12.5μL，ROX Reference Dye II 0.3μL，10μmol/L上游引物和下游引物各0.25μL，10μmol/L检测探针0.25μL，DNA模板2μL和ddH₂O 9.45μL；反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

实施例2：实时荧光PCR方法特异性测试

采用大叶黄杨、小叶黄杨、女贞、桉树、南蛇藤、桃叶卫茅、五层龙、黑黄旦、绿茶、红茶、黄山毛峰、乌龙、大红袍、小叶女贞、木薯基因组DNA为模板，阳性样品为恰特草DNA，阴性对照为玉米DNA，空白对照为不加DNA模板。对建立的恰特草实时荧光PCR检测方法的特异性进行测试。实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。

结果显示，采用恰特草特异性引物Catha134-F/R和探针Catha134-P对所有提取的样品的DNA进行实时荧光PCR时，只有阳性样品恰特草的DNA模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料DNA为模板的均无典型荧光扩增曲线(结果见表2)。表明本发明的检测方法特异性良好。

表2引物及探针特异性测试结果

注：+，阳性；-，阴性。

实施例3：灵敏度测试、可重复性测试

将提取的恰特草DNA溶液(采用数字PCR测定浓度为10000拷贝/μL)加TE缓冲液分别稀释至50％、8.33％、1.38％、0.23％、0.04％和0.02％作为DNA模板，进行恰特草实时荧光PCR检测，进行灵敏度测试及可重复性测试，每个样品进行9次重复实验，水为空白对照，实时荧光PCR检测反应体系和反应程序同实施例1。测试结果显示(表3)，在50％、8.33％、1.38％、0.23％、0.04％和0.02％范围内6个浓度梯度9个平行均能有典型扩增曲线，所以最低检测浓度(LOD)为0.02％(图1)；表3中6个浓度各9个平行所得Ct值的SD介于0.11～0.53，RSD介于0.42～1.49，均小于25％，显示重复性良好。

表3实时荧光PCR方法的灵敏度及可重复性测试

本发明针对恰特草叶绿体基因序列特异性片段设计引物和探针，建立的恰特草特异性实时荧光PCR检测方法，可对恰特草进行特异性快速、高通量的定性及定量检测，检测灵敏度可达0.02％，从恰特草DNA模板提取到实时荧光PCR完成，可约在2小时完成，本方法不受实验材料存活状态和形态的影响，样品用量少，可弥补形态学等鉴定方法的不足，可快速、方便、高效的进行恰特草苗木、材质和遗传物质的鉴定，对于打击走私恰特草及其制品等有重要意义。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黄埔海关技术中心

<120> 一种毒品原植物恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggtgtgata aaaatgagtc ccagta 26

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tttggcgagg gactgaataa tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctttgacaaa aacccttaaa 20

<210> 4

<211> 150

<212> DNA

<213> 恰特草(Catha edulis)

<400> 4

aaaaggtgtg ataaaaatga gtcccagtat aaaaaatcta tcaaattcac tatatttaga 60

tttagagttt ttttctttga caaaaaccct taaaagatta ttcagtccct cgccaaaact 120

aaaagaagtg ggatccttct ttttatttga 150

Claims

1.一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测引物组，其特征在于，包括检测引物和检测探针，所述的检测引物如下所示：

Catha134 -F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'；

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'；

所述的检测探针如下所示：

2.根据权利要求1所述的检测引物组，其特征在于，所述的荧光报告基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为MGB。

3.一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、耐热DNA聚合酶、检测引物和检测探针，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

Catha134 -F：5'-AGGTGTGATAAAAATGAGTCCCAGTA-3'；

Catha134-R：5'-TTTGGCGAGGGACTGAATAATC-3'；

所述的检测探针如下所示：

4.一种恰特草及其制品实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取样品的基因组DNA作为模板；

（2）加入权利要求1所述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量PCR反应液及耐热DNA聚合酶混合形成扩增反应体系；

（3）将扩增反应体系在荧光PCR仪上进行实时荧光PCR反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为恰特草或其制品。

5. 根据权利要求4所述的恰特草及其制品实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（2）的扩增反应体系为：25 μL，包括Premix Ex Taq 12.5 μL，ROX Reference Dye II0.3 μL，10 μmol/L 检测引物Catha134-F和Catha134-R各0.25 μL，10 μmol/L 检测探针Catha134-P 0.25 μL，DNA 模板2 μL和ddH₂O 9.45 μL。

6. 根据权利要求4所述的恰特草及其制品实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（3）的实时荧光PCR反应，其反应程序为95℃ 30 s；95℃ 5 s、60℃ 34 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。

7.根据权利要求4所述的恰特草及其制品实时荧光PCR检测方法，其特征在于，所述的步骤（3）的根据扩增曲线判断样品是否为恰特草或其制品的标准为：在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下，被检样品进行检测时：如果有典型荧光扩增曲线，Ct值≤38.0，则判定样品为恰特草或其制品；如果Ct值＞38.0或无Ct值，则判定样品不是恰特草或其制品。

8.权利要求1所述的检测引物组在制备检测恰特草及其制品的试剂盒中的应用。

9.权利要求3所述的检测试剂盒在鉴别恰特草及其制品中的应用。