CN113584231B

CN113584231B - 鉴定i群禽腺病毒血清8型的方法

Info

Publication number: CN113584231B
Application number: CN202111061712.0A
Authority: CN
Inventors: 谢芝勋; 张民秀; 张艳芳; 邓显文; 谢志勤; 谢丽基; 李孟; 罗思思; 范晴; 曾婷婷; 黄娇玲; 王盛; 刘加波; 李丹
Original assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Current assignee: Guangxi Veterinary Research Institute
Priority date: 2021-09-10
Filing date: 2021-09-10
Publication date: 2024-04-19
Anticipated expiration: 2041-09-10
Also published as: CN113584231A

Abstract

本申请公开了一种鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用，引物组包括终浓度比为1.6：0.2：0.8的内引物、外引物和环引物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID No.1‑6所示。试剂盒添加WarmStart LAMP变色预混液,64℃反应30分钟即可终止反应。本申请能够同时鉴定禽腺病毒血清8a型和禽腺病毒血清8b型，可在24min钟就开始进入指数增长期，敏感性更高，特异性强，检测速度快，反应结果肉眼可识别。

Description

鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及一种鉴定禽腺病毒的方法，尤其是一种LAMP可视化鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法。

背景技术

Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus groupⅠ,FAdV-Ⅰ)属于腺病毒科禽腺病毒属，Ⅱ亚群(火鸡出血性肠炎和相关病毒)和Ⅲ亚群(产蛋下降综合征)病毒和疾病的相关性明确。相比之下，大多数的Ⅰ亚群腺病毒对禽类的致病作用还未完全确定，不同的血清型,甚至相同血清型的不同毒株,在造成发病和死亡/或者引发呼吸道疾病的能力也有所不同。根据FAdV-Ⅰ的核酸序列特征和血清交叉中和试验结果，将FAdV-Ⅰ分为5个种群(FAdV-A、FAdV-B、FAdV-C、FAdV-D和FAdV-E)和12个血清型(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10和FAdV-11)。近年来国内多个研究报道显示，FAdV-Ⅰ广泛存在于鸡、鸭、鹅等多种禽类的呼吸道和消化道中，目前我国鸡群流行的优势毒株血清型为血清4型(FAdV-4)、血清8型(FAdV-8，包含禽腺病毒8a型(Fowl adenovirusgroup 8a,FAdV-8a)和禽腺病毒8b型(Fowl adenovirus group 8b,FAdV-8b))和FAdV-11。其中，禽腺病毒血清8型(FAdV-8)在鸡群较为流行,主要引起鸡的包涵体肝炎，常见于3～8周龄的鸡，主要感染肉仔鸡及育雏、育成阶段的蛋鸡或种鸡，总体死亡率通常在10％以下，有时可达到30％，近年来,这种疾病在我国的发病率呈上升趋势,对养鸡业造成了很大的经济损失。

目前针对FAdV-8的诊断检测方法常常采用2种方法：第一种是分子生物学方法，包括荧光定量PCR方法、DNA序列测定技术、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,但是需要依赖专门的仪器，成本较高；第二种是血清学诊断方法，如琼脂扩散试验实验，虽然不依赖于昂贵的仪器，但是耗时较长，不能快速、及时地对FAdV-8的检测结果作出判断。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,以下简称LAMP)技术是反应混合物在等温(60-65℃)条件下进行扩增，具有快速、简便和敏感的特性，但目前还没有关于LAMP快速鉴定FAdV-8的产品和方法的相关报道。

发明内容

本申请的发明人经过大量的研究(其中，设计了4套引物组，只筛选到本发明所述能特异性扩增阳性FAdV-8a和FAdV-8b DNA的LAMP的引物组，其余3套引物无论如何优化反应条件，均未出现扩增)后，出人意料地发现了特别适用于鉴定禽腺病毒血清8型的方法。基于此，本发明成功地建立了用于鉴定禽腺病毒血清8型的引物组、试剂盒以及鉴定方法平台，用于确定待测样品中是否含有禽腺病毒血清8型的方法，该方法重复性好，特异性强，灵敏度高。

本发明的目的在于提供一种鉴定I群禽腺病毒血清8型的LAMP的方法。

为达到上述目的，本发明要求保护一种用于鉴定I群禽腺病毒血清8型的引物组，包括外引物、内引物和环引物；

所述外引物包括FAdV-8-F3和FAdV-8-B3，其中

所述外引物FAdV-8-F3为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)SEQ ID No.1所示的序列；

(a2)与SEQ ID No.1所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.1具有相同功能的序列；

(a3)与SEQ ID No.1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.1具有相同功能的序列；以及

所述外引物FAdV-8-B3为如下(a4)或(a5)或(a6)：

(a4)SEQ ID No.2所示的序列；

(a5)与SEQ ID No.2所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.2具有相同功能的序列；

(a6)与SEQ ID No.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.2具有相同功能的序列；

所述内引物包括FAdV-8-FIP和FAdV-8-BIP，其中

所述内引物FAdV-8-FIP为如下(a7)或(a8)或(a9)：

(a7)SEQ ID No.3所示的序列；

(a8)与SEQ ID No.3所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.3具有相同功能的序列；

(a9)与SEQ ID No.3所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.3具有相同功能的序列；以及

所述内引物FAdV-8-BIP为如下(a10)或(a11)或(a12)：

(a10)SEQ ID No.4所示的序列；

(a11)与SEQ ID No.4所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.4具有相同功能的序列；

(a12)与SEQ ID No.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.4具有相同功能的序列；

所述环引物包括FAdV-8-LF和FAdV-8-LB；

所述环引物FAdV-8-LF为如下(a13)或(a14)或(a15)：

(a13)SEQ ID No.5所示的序列；

(a14)与SEQ ID No.5所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.5具有相同功能的序列；

(a15)与SEQ ID No.5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.5具有相同功能的序列；以及

所述环引物FAdV-8-LB为如下(a16)或(a17)或(a18)：

(a16)SEQ ID No.6所示的序列；

(a17)与SEQ ID No.6所示的序列相比具有不超过5个核苷酸的置换、缺失或添加且与SEQ ID No.6具有相同功能的序列；

(a18)与SEQ ID No.6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.99％的序列同一性，且与SEQ ID No.6具有相同功能的序列。

本发明要求保护的内引物、外引物和环引物的终浓度比为1.6：0.2：0.8。

本发明要求保护的外引物、内引物和环引物上可以是连接有标记基因或者探针的核苷酸序列。

本发明要求保护一种鉴定禽腺病毒血清8型的试剂盒，包含上述的引物组、WarmStart LAMP变色预混液、阳性对照和阴性对照。

本发明要求保护的试剂盒，进行了环介导等温扩增反应，但所述方法不直接用于疾病的诊断和治疗。

本发明要求保护一种鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其中，环介导等温扩增反应的反应过程包括64℃至少反应30分钟，还包括80℃至少灭活5min。

本发明要求保护的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，反应过程中还包括肉眼可见的颜色变化过程。

本发明要求保护的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其颜色变化过程中，包含阴性对照和阴性样本的反应管肉眼看不到颜色变化，还包含阳性对照和阳性样本的反应管肉眼可见颜色由原来的粉色变成黄色。

本发明要求保护一种如下(b1)或(b2)的应用：

(b1)上述引物组在制备鉴定禽腺病毒血清8型的试剂盒中的应用；

(b2)上述方法在制备鉴定或辅助鉴定待测样品中是否含有禽腺病毒血清8型的产品中的应用。

本发明的有益效果是:

本发明在引物设计时，根据FAdV-8的ORF11基因的保守区域设计出通用型的禽腺病毒血清8型的等温扩增引物组，能够同时鉴定FAdV-8a和FAdV-8b。本发明除了设计禽腺病毒血清8型等温扩增的外引物、内引物对以外，另外还设计了一对环引物，环引物的添加加快了等温扩增的反应速度，在最佳反应温度和引物浓度下，在24min钟就开始进入指数增长期，检测速度更快；本发明采用了商品化的LAMP变色预混液，其反应结束后根据反应产物的颜色变化通过肉眼即可判定结果，无需经过紫外线照射，检测方法更加便捷：该方法等温扩增反应结束后，反应产物颜色由原来的粉色变成黄色，说明结果为阳性，如反应产物未发生颜色变化，呈现原来的粉色，则判定结果为阴性。本发明的引物组、试剂盒及检测方法更方便在临床检测中运用。

本发明提供的鉴定禽腺病毒血清8型的环介导等温扩增引物组、试剂盒、检测方法和应用，利用实时浊度仪优化反应条件，建立了FAdV-8的LAMP反应体系，可特异性地鉴定禽腺病毒血清8型，而对其它血清型的禽腺病毒、H9亚型禽流感病毒、禽网状内皮增生症病毒、禽传染性支气管病毒、禽白血病病毒、鸡传染性贫血病毒等无交叉反应；针对禽腺病毒8a型(FAdV-8a)最少可以检测到1.35×10^-7ng/μL；针对禽腺病毒8b型(FAdV-8b)最少可以检测到6.79×10^-4ng/μL，环介导等温扩增方法对临床样品的检出率与常用PCR检测结果一致，因此，本方法特异性强、敏感性更高。

目前大多数学者建立LAMP检测方法的判定结果主要是根据反应产物直接凝胶电泳观察梯形条带和扩增产物加入荧光显色剂显色两种方式进行判断，这两种方式均需要将打开反应管盖子后进行后续的操作，这就导致反应产物易形成气溶胶，导致实验环境受到污染，结果易造成假阳性，这对于结果的判定是非常不利的。本发明采用实时浊度仪监测扩增过程，并使用商品化的LAMP变色预混液，扩增结束后不需要进行电泳和加入荧光剂，减少了反应产物对实验室的污染，实验结果可通过实时浊度仪和产物的颜色反应作出判定，大大缩短的检测的时间。

本研究首次成功建立了快速检测FAdV-8可视化LAMP方法。该FAdV-8LAMP方法具有特异性好、敏感性高、污染小、方便快捷等优点，并且检测结果可直接用肉眼观察，根据反应产物颜色判断结果，适用于FAdV-8的临床快速诊断；同时，所需仪器设备及操作简单、结果直观便于观察，尤其适合在基层兽医站、养殖场及边境口岸进行禽腺病毒血清8型的早期筛查。

附图说明

图1为鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法在不同LAMP反应温度下的实时浊度仪650nm监测副产物磷酸镁曲线图，其中，图A-D的反应温度分别为61℃,62℃,63℃和64℃，样品1为FAdV-8a DNA，2为阴性对照；

图2为鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法的LAMP特异性试验结果图，其中样品1为FAdV-8a DNA，2为FAdV-8b DNA，3为FAdV-1DNA，4为FAdV-2DNA，5为FAdV-3DNA，6为FAdV-4DNA，7为FAdV-6DNA，8为FAdV-7DNA，9为FAdV-10DNA，10为FAdV-11DNA，11为REV cDNA，12为H9亚型AIV cDNA，13为ALV-J cDNA，14为CIAV DNA，15为IBV cDNA，16为阴性对照；

图3为鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法中鉴定FAdV-8a的LAMP灵敏性试验结果图，其中图3A为实时浊度仪650nm监测的FAdV-8a副产物磷酸镁曲线图，图3B为FAdV-8a反应结束后反应产物颜色变化结果图，1-7的样品浓度为1.35×10^-2ng/μL～1.35×10^-8ng/μL，样品8为阴性对照；

图4为鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法中鉴定FAdV-8b的LAMP灵敏性试验结果图，其中图4A为实时浊度仪650nm监测的FAdV-8b副产物磷酸镁曲线图，图4B为FAdV-8b反应结束后反应产物颜色变化结果图，1-7的样品浓度为6.79ng/μL～6.79×10^-6ng/μL，样品8为阴性对照；

具体实施方式

下面结合实际应用详细描述本发明的示例性的实施例，在下面的详细描述中，为便于解释，阐述了许多具体的细节以提供对本披露实施例的全面理解。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。然而明显地，一个或多个实施例在没有这些具体细节的情况下也可以被实施。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中；

变色预混液购自New England Biolabs(NEB)公司；反转录试剂盒(目录号：6210A)、DNA/RNA共提试剂盒、PCR试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；Loopamp LA-32OC实时浊度仪均购自日本荣研公司；NanoDrop 2000核酸测定仪和NanoDrop ND-2000紫外分光光度计购自美国Thermo Fisher Scientific公司；引物委托华大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)H9亚型毒株(Duck/Guangxi/1/00)、禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)毒株2012001-1(登录号为KC453976)、禽传染性支气管病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)毒株GXIB/02、禽腺病毒4型(Fowl adenovirus group 4,FAdV-4)毒株FAdV-4-GX2018001、禽白血病病毒J亚群(Avian Leukosis virus group J,ALV-J)毒株2012004-C5(登录号为KC453974)、鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)毒株GXC060821、禽腺病毒8a型(Fowladenovirus group8a,FAdV-8a)毒株GX2019002和禽腺病毒10型(Fowl adenovirusgroup10,FAdV-10)毒株GX201801由广西壮族自治区兽医研究所保存；FAdV-8b、FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-11均购自中国兽医药品监察所；13份临床样品，来源于广西某规模化鸡场采集的咽喉拭子和泄殖腔拭子。临床样品已经过本实验室普通PCR鉴定和测序鉴定；按照购自北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Viral DNA/RNA Kit(产品目录号：ER201-01)中的说明书提取不同病毒和临床样品的RNA和DNA，RNA病毒反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-20℃保存备用。上述各病毒毒株，均为己知病毒，在符合生物安全操作的情况下，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明试验使用，不得他用。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

本发明提供了一种鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法，根据本发明的总体构思，提供了一种鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用，引物组包括终浓度比为1.6：0.2：0.8的内引物、外引物和环引物，其核苷酸序列依次为序列表中SEQ IDNo.1-6所示。试剂盒添加WarmStart LAMP变色预混液,64℃反应30分钟即可终止反应。

本发明内容仅仅涉及采自于鸡的咽喉拭子和泄殖腔拭子进行生物学信息的检测和鉴定，不是对有生命的动物体为直接实施对象，不包括将检测到的生物信息与基准数据进行比较的步骤，以及根据该生物检测信息得出具体诊断结论的步骤，因此，本发明不属于疾病的诊断方法，符合《专利法》对专利保护客体的基本要求。

本发明的具体实施方式中，所述待测样本具体为咽喉拭子或泄殖腔拭子，提取待测样本的核酸或待测病毒的核酸或待测病原微生物的核酸为使用RNA/DNA共提试剂盒提取得到的核酸，所述核酸均可为DNA、RNA、或DNA和RNA的混合物，当所述核酸中含有RNA时，先将RNA反转录为cDNA，制备好的cDNA/DNA模板于-20℃保存备用，以便再进行所述LAMP扩增反应。在进行所述LAMP扩增反应时，所述引物组包括外引物、内引物和环引物，所述外引物命名为FAdV-8-F3和FAdV-8-B3，所述内引物命名为FAdV-8-FIP和FAdV-8-BIP，所述环引物命名为FAdV-8-LF和FAdV-8-LB。

下面描述一下本发明鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法的具体实施例，具体内容如下：

实施例1、引物组的设计

根据GenBank中FAdV-8的ORF11基因的保守序列，利用MEGA 4.0和PrimerExplorer V4在线引物设计软件设计LAMP引物，外引物为FAdV-8-F3和FAdV-8-B3；内引物为FAdV-8-FIP和FAdV-8-BIP，其中，内引物FIP＝F1c+F2，BIP＝B1c+B2；环引物为FAdV-8-LF和FAdV-8-LB。引物如下表1所示，内引物和外引物序列由引物由华大基因生物科技(深圳)有限公司合成。

表1FAdV-8LAMP引物序列

实际研究中，从基于FAdV-8的ORF11的保守区域设计了4套LAMP引物组，从中只筛选得到表1所示的一套引物，能特异性同时扩增出阳性FAdV-8a和FAdV-8b DNA的LAMP引物组，其他3套引物(序列详见下表2所示)，均未出现任一FAdV-8的ORF11的保守区域的阳性扩增结果。因此，在发明人研发过程中，上表1所列出的针对ORF11基因的LAMP引物组在众多实验设计中，意外地获得的，只有这套引物组能够扩增出FAdV-8的ORF11的保守区域，可以用于本发明后序LAMP鉴定平台的研究。

表2FAdV-8的另外3套LAMP引物序列

实施例2、鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP检测平台的建立

2.1、模板的提取

按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit中的说明书提取15株不同的病毒毒株和13份临床样品的RNA和/或DNA,其中RNA病毒均先反转录成cDNA，将cDNA/DNA模板于-20℃保存备用。

2.2、反应体系

建立20μL的反应体系：2μL cDNA模板，WarmStart Colorimetric LAMP 2×MasterMix 10μL，内引物FAdV-8-FIP和FAdV-8-BIP混合液(工作浓度为16μmol/L)2μL，外引物FAdV-8-F3和FAdV-8-B3混合液(工作浓度为2μmol/L)2μL，环引物FAdV-8-LF和FAdV-8-LB混合液(工作浓度为8μmol/L)各2μL，加ddH2O补足20μL；同时设立阴性对照，以无RNAase水作为模板加入到反应管中。

实施例3、鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP反应条件的优化

3.1、反应温度优化

将上述准备好20μL的反应体系的反应管置Loopamp LA-320C实时浊度仪内，分别于61℃、62℃、63℃和64℃反应60℃min，80℃灭活5min，以确定最佳的反应温度。试验结束后肉眼观察反应产物颜色，反应产物的结果判定根据LAMP变色预混液试剂盒说明书进行判定，LAMP反应产物颜色由粉色反应液变成黄色，说明结果为阳性，如未发生颜色未发生变化，则判定结果为阴性。

目前大多数学者建立LAMP检测方法的判定结果主要是根据反应产物直接凝胶电泳观察梯形条带和扩增产物加入荧光显色剂显色两种方式进行判断，这两种方式均需要将打开反应管盖子后进行后续的操作，这就导致反应产物易形成气溶胶，导致实验环境受到污染，结果易造成假阳性，这对于结果的判定是非常不利的。CN109055613A和CN108929919A虽然在反应前加入了荧光试剂避免了开盖带来的污染，但是，其反应结果尚需在紫外灯下才能观察。本研究扩增结束后不需要进行电泳和加入荧光剂，减少了反应产物对实验室的污染，实验结果可通过产物的颜色反应作出判定，大大缩短的检测的时间。

结果如图1所示，由于当LAMP反应温度分别61℃、62℃、63℃和64℃，最早进入指数增长期的时间分别为28min、28min、26min、24min，因此，当温度在64℃时，浊度仪曲线图的阴性对照无起峰，并且最早进入指数增长期，因此，LAMP反应的最佳温度是64℃。

3.2、引物浓度优化

调整20μL的反应体系中引物浓度，按照内引物(FAdV-8-FIP/FAdV-8-BIP：外引物(FAdV-8-F3/FAdV-8-B3)：环引物(FAdV-8-LF/FAdV-8-LB)不同比例的终浓度进行引物浓度优化，不同比例的引物终浓度(μmol/L)分别调整为1.6:0.1:0.8，1.6:0.15:0.8，1.6:0.2:0.8，2:0.1:0.8，2:0.15:0.8，2.4:0.2:0.8和2.4:0.25:0.8,按照上述确定的最佳的反应温度64℃进行LAMP反应60min，80℃灭活5min后，从而确定引物的最佳浓度和比例。

结果内引物(FAdV-8-FIP/FAdV-8-BIP):外引物(FAdV-8-F3/FAdV-8-B3):环引物(FAdV-8-LF/FAdV-8-LB)最佳终浓度分别为1.6μmol/L、0.2μmol/L和0.8μmol/L时，浊度仪曲线图的阴性对照无起峰，并且最早进入指数增长期，为最佳的引物浓度。

3.3、反应时间的优化

使用确定的最佳反应温度64℃和最佳引物浓度，选择FAdV-8b DNA作为模板，利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度计测量FAdV-8b的DNA浓度，将DNA 10倍梯度稀释，分别获得DNA浓度为6.79ng/μL，6.79×10^-1ng/μL，6.79×10^-2ng/μL、6.79×10^-3ng/μL和6.79×10^- ⁴ng/μL，根据上述确定的最佳引物浓度配置20μL的反应体系，每个稀释度取1μL上述模板DNA分别加入到反应管中，同时设立阴性对照，以无RNAase水作为模板加入到反应管中。将反应管分别按照15min、30min、40min和60min的反应时间进行反应后，80℃灭活5min。肉眼观察反应产物颜色变化，结果显示反应混合物反应在15min时检测不到最低检测浓度，在反应30min时，检测到FAdV-8b DNA最低检测浓度6.79×10^-4ng/μL，说明该方法至少需要在最佳反应温度反应30min。

实施例4、鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP检测平台的性能研究

4.1、特异性

使用确定的最佳反应温度64℃和最佳引物浓度，按照上述确定的最佳引物浓度配置20μL的反应体系，取事先完成提取备用的15株病毒毒株(分别是FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-10、FAdV-11、REV、H9亚型AIV、ALV-J、CIAV、IBV)的cDNA或DNA为模板，以无RNAase水作为阴性对照分别加入反应体系中，反应结束后，验证反应体系的特异性。如图2所示结果，只有加入阳性FAdV-8a(图2中标号1)和FAdV-8b(图2中标号2)的反应管的反应产物有颜色变化，从原来的粉色变成黄色，即特异性检测结果为阳性；其他反应管(图2中标号3-16，代表了禽腺病毒血清8型以外的其他禽腺病毒血清型和其他禽类常见的病毒毒株)未发生颜色变化，仍然呈现为原来的粉色，即特异性检测结果为阴性。

此外，对于该特异性验证试验结果，还采用实时浊度仪650nm监测了所有16个标号反应管的副产物磷酸镁曲线图，结果也显示，只有加入阳性FAdV-8a(图2中标号1)和FAdV-8b(图2中标号2)的反应管形成的明显扩增曲线图，而代表了禽腺病毒血清8型以外的其他禽腺病毒血清型和其他禽类常见的病毒毒株，即图2中标号3-16的反应管在副产物磷酸镁曲线图中没有出现起峰，进一步验证了本发明鉴定禽腺病毒血清8型的方法能够特异性地检测FAdV-8a和FAdV-8b，而对禽腺病毒血清8型以外的禽腺病毒和常见的禽类病毒无交叉反应。

4.2、灵敏度

使用确定的最佳反应温度64℃和最佳引物浓度，先以FAdV-8a DNA作为模板，验证反应体系的灵敏度。利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度计测量FAdV-8a的DNA浓度，将DNA10倍梯度稀释，FAdV-8a的DNA浓度分别稀释为1.35×10^-2ng/μL、1.35×10^-3ng/μL、1.35×10^-4ng/μL、1.35×10^-5ng/μL、1.35×10^-6ng/μL、1.35×10^-7ng/μL和1.35×10^-8ng/μL；如图3所示结果，图3中标号1-6，即对应的FAdV-8a的DNA浓度为1.35×10^-2ng/μL、1.35×10^-3ng/μL、1.35×10^-4ng/μL、1.35×10^-5ng/μL、1.35×10^-6ng/μL、1.35×10^-7ng/μL的6个反应管的反应产物有颜色变化，从原来的粉色变成黄色，即特异性检测结果为阳性；图3中标号7-8，即对应的FAdV-8a的DNA浓度为1.35×10^-8ng/μL和阴性对照的反应管未发生颜色变化，仍然呈现为原来的粉色，即特异性检测结果为阴性，由此可见，本方法对FAdV-8a最低检出限度为1.35×10^-7ng/μL。

对于FAdV-8a的灵敏度验证试验结果，还采用实时浊度仪650nm监测了所有8个标号反应管的副产物磷酸镁曲线图，结果也显示，图3中标号1-6的反应管形成的明显扩增曲线图，并随着FAdV-8a DNA起始浓度的10倍递减，对应的扩增曲线开始进入指数增长期的起峰时间存在一定的延迟；同时图3中标号7-8的反应管在副产物磷酸镁曲线图中没有出现起峰，即实时浊度仪监测浊度结果显示FAdV-8a最低检出限度也是1.35×10^-7ng/μL，与肉眼观察的结果相符。

使用确定的最佳反应温度64℃和最佳引物浓度，再以FAdV-8b DNA作为模板，验证反应体系的灵敏度。利用NanoDrop ND-2000紫外分光光度计测量FAdV-8b的DNA浓度，将DNA10倍梯度稀释，FAdV-8b的DNA浓度分别稀释为6.79ng/μL，6.79×10^-1ng/μL，6.79×10^-2ng/μL、6.79×10^-3ng/μL，6.79×10^-4ng/μL，6.79×10^-5n/μL和6.79×10^-6ng/μL；如图4所示结果，图4中标号1-5，即对应的FAdV-8b的DNA浓度为6.79ng/μL，6.79×10^-1ng/μL，6.79×10^- ²ng/μL、6.79×10^-3ng/μL和6.79×10^-4ng/μL的5个反应管的反应产物有颜色变化，从原来的粉色变成黄色，即特异性检测结果为阳性；图4中标号6-8，即对应的FAdV-8b的DNA浓度为6.79×10^-5n/μL和6.79×10^-6ng/μL，以及阴性对照的3个反应管未发生颜色变化，仍然呈现为原来的粉色，即特异性检测结果为阴性，由此可见，本方法对FAdV-8b最低检出限度为6.79×10^-4ng/μL。

对于FAdV-8b的灵敏度验证试验结果，还采用实时浊度仪650nm监测了所有8个标号反应管的副产物磷酸镁曲线图，结果也显示，图4中标号1-5的反应管形成的明显扩增曲线图，并随着FAdV-8b DNA起始浓度的10倍递减，对应的扩增曲线开始进入指数增长期的起峰时间同样存在一定的延迟；同时图4中标号4-8的反应管在副产物磷酸镁曲线图中没有出现起峰，即实时浊度仪监测浊度结果显示对FAdV-8b最低检出限度也是6.79×10^-4ng/μL，与肉眼观察的结果相符。

4.3、临床样品一致性验证

取实施例2中事先制备好的13份临床样品，最佳引物浓度比，取13份临床样品作为模板，按照以上确定的最佳引物浓度比，分别配置20μL的反应体系，并按照确定的最佳反应温度64℃反应30min后进行实验验证，同时该13份临床样品采用PCR方法(PCR引物序列见下表3所示)，阳性PCR扩增的目的片段大小为728bp，从而与本发明所述鉴定禽腺病毒血清8型的LAMP检测结果进行比较，验证本方法的可靠性和结果一致性。

表3：FAdV-8临床样品PCR验证引物序列

结果如下表4所示，显示共有2份临床样品检测结果为阳性，分别是2号和9号临床样品，其余11份临床样品均为阴性，将LAMP鉴定结果与本实验室构建的FAdV-8的常用PCR扩增结果进行比较，发现采用本发明的FAdV-8LAMP检测结果与FAdV-8的常用PCR检测结果完全相符，阴阳性符合率都是100％，一致性结果较好。

表4FAdV-8的PCR测序结果与LAMP鉴定结果的比较

注：样品编号1-13分别代表13份临床样品；样品编号14代表FAdV-8阴性对照样品，样品编号15代表FAdV-8阳性对照样品；结果中：“+”表示FAdV-8阳性，“-”表示FAdV-8阴性。

本发明鉴定禽腺病毒血清8型的方法，已充分所公开了所用到的LAMP引物组、试剂盒及检测方法和应用，其中，引物组包括终浓度比为1.6：0.2：0.8的内引物、外引物和环引物，核苷酸序列依次为序列表中SEQ ID No.1-6所示，试剂盒添加WarmStart LAMP变色预混液,最近反应条件为64℃反应30分钟即可终止反应，反应结果肉眼可识别；本申请能够同时鉴定FAdV-8a和FAdV-8b，可在24min钟就开始进入指数增长期，检测速度快；本方法能够特异性地检测FAdV-8a和FAdV-8b，而对禽腺病毒血清8型以外的禽腺病毒和常见的禽类病毒无交叉反应，特异性强；本方法对FAdV-8a最低检出限度为1.35×10^-7ng/μL，对FAdV-8b最低检出限度是6.79×10^-4ng/μL，灵敏度高。此外，对13份临床样品的验证结果显示阳性和阴性符合率均为100％，一致性结果较好。

本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，使得本领域技术人员将会容易理解。但是根据已经公开的所有描述，可以对那些细节进行不同的修饰或替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110> 广西壮族自治区兽医研究所

<120> 鉴定I群禽腺病毒血清8型的方法

<130> 2021-08-30

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

tttttacctg accgcttcca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

tgctttgagg ttcctttggt 20

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

cacgagagga acgcgatggc cacaaggcgg cacwtgaa 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cctatgtctc acgcggaccg gtgcagagtg aggttrgag 39

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

atacggggcg cagcatg 17

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

cgcaacaggt cggtaagtcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

agaccgtttt tacctgaccg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

tgctttgagg ttcctttggt 20

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

gaggaacgcg atggcggata ccttccacgt acacaaggcg 40

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

cctatgtctc acgcggaccg ggtgcagagt gaggttgg 38

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

agcatggtgc tttcatgtgc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

cgcaacaggt cggtaagtcc 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

gcgcaacagg tcggtaag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

tgggacggag gtcaaaga 18

<210> 15

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

cctagccgcc actcttgctt ttcttacgac ccactccaac c 41

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

cgatgtggga gaaaggctac gggtgacact ggtctcgttc at 42

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

gtctgcgggt gcagagt 17

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

atacagctac ccgtcgggac c 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

cctcaaagca agagtggcg 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

cacctcttac gctgatggc 19

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

tcccgacggg tagctgtatc ctagggcgcg ataccaaga 39

<210> 22

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

tctttgacct ccgtcccaac gtattcactc tccgtgccgg 40

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

gcctttctcc cacatcgcaa 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

tctgctatac tgacttactt ctccg 25

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

gacatggggt cgacctattt cgacat 26

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

agtgatgacg ggacatcat 19

Claims

1.一种用于鉴定I群禽腺病毒血清8型的引物组，其特征在于：包括外引物、内引物和环引物；

所述外引物包括FAdV-8-F3和FAdV-8-B3，其中

所述外引物FAdV-8-F3的序列如SEQ ID No.1所示；以及

所述外引物FAdV-8-B3的序列如SEQ ID No.2所示；

所述内引物包括FAdV-8-FIP和FAdV-8-BIP，其中

所述内引物FAdV-8-FIP的序列如SEQ ID No.3所示；以及

所述内引物FAdV-8-BIP的序列如SEQ ID No.4所示；

所述环引物包括FAdV-8-LF和FAdV-8-LB；

所述环引物FAdV-8-LF的序列如SEQ ID No.5所示；以及

所述环引物FAdV-8-LB的序列如SEQ ID No.6所示；

所述引物组与LAMP变色预混液，共同用于特异性扩增阳性FAdV-8a和FAdV-8b DNA。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述内引物、外引物和环引物的终浓度比为1.6：0.2：0.8。

3.一种鉴定禽腺病毒血清8型的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1-2任一项所述的引物组、WarmStart LAMP变色预混液、阳性对照和阴性对照。

4.一种鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其特征在于：采用权利要求3所述的试剂盒进行环介导等温扩增反应，所述方法不用于疾病的诊断和治疗。

5.根据权利要求4所述的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的反应过程包括64℃至少反应30分钟。

6.根据权利要求5所述的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的反应过程还包括80℃至少灭活5min。

7.根据权利要求6所述的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应的反应过程还包括肉眼可见的颜色变化过程。

8.根据权利要求7所述的鉴定禽腺病毒血清8型的方法，其特征在于：所述颜色变化过程中，包含阴性对照和阴性样本的反应管肉眼看不到颜色变化，包含阳性对照和阳性样本的反应管肉眼可见颜色由原来的粉色变成黄色。

9.权利要求1-2任一项所述的引物组在制备鉴定禽腺病毒血清8型的试剂盒中的应用。