CN114410835A

CN114410835A - 一种用于快速检测新型冠状病毒的rpa-lfd试剂盒

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Publication number: CN114410835A
Application number: CN202111515945.3A
Authority: CN
Inventors: 任涛; 蔡琳琳; 向斌; 梁健鹏; 林秋燕; 陈礼斌
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2021-12-02
Filing date: 2021-12-02
Publication date: 2022-04-29

Abstract

本发明提供了一种用于快速检测新型冠状病毒的组合物、RPA‑LFD试剂盒和方法，本发明组合物、RPA‑LFD试剂盒和方法具有以下优点：(1)大幅度缩短检测时间：能够有效提高大规模筛查的速度，减轻医护负担。(2)双基因靶标的检测：加强SARS‑CoV‑2检测的准确性。(3)便捷性：RPA反应在恒温条件下进行，无需昂贵的专业仪器支撑，LFD检测方法简单易操作，无需专业人员的服务，能够实现现场快速诊断。(4)特异性好：能与其他动物冠状病毒区分，也能与多种亚型流感病毒区分，有比较良好的特异性。

Description

一种用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒。

背景技术

Lambda、Mu被认为是具有可预测性毒力增强、诊断逃逸或免疫逃逸的感兴趣变种(Variants of interest，VOI)，正受到进一步监测。我国将COVID-19纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，但因其对人、动物存在严重的危害性，对社会公共卫生破坏力强，引起的经济损失严重，故对其采取的预防、控制措施与甲类疫病标齐。

SARS-CoV-2基因组全长29.9～32kb，有11个开放阅读框(Open reading frame，ORF) 及4个结构蛋白基因以及一个必须蛋白RNA依赖性的RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)组成，结构蛋白包括编码刺突糖蛋白S(Spike)、囊膜蛋白E(Envelope)、膜蛋白M(Membrane)和核蛋白N(Nuclecapsid)。其中，蛋白M是一种糖基化的基质蛋，在病毒的组装和出芽过程中起重要作用，抗M蛋白抗体在补体存在时可中和病毒感染性。其为病毒囊膜的重要组成成分，通过与其他病毒蛋白的相互作用，在病毒的形态发生和组装中起核心作用。蛋白N的突变是导致病毒易感和致病的主要原因，在病毒粒子组装过程中起关键性作用，有N1和N2两个表位，其中N1可刺激宿主产生具有高亲和力的抗体，但没有中和活，其在病毒装配过程中通过与病毒基因组和膜蛋白M的相互作用而发挥功能，并且在提高病毒基因组转录效率以及病毒复制方面发挥重要作用。

重组酶聚合酶介导等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006 年由英国科学家开发的一种简单、快速、敏感性高及特异性强的核酸等温扩增技术，被公认是可能替代PCR的核酸检测技术。其原理是效仿了T4噬菌体核酸复制原理，运用源于T4 噬菌体的重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，在等温条件下，重组酶与引物结合形成核酸蛋白复合体，识别模板的互补配对核苷酸序列并发生链交换，此时，单链结合蛋白与被置换的单链结合，防止发生进一步替换，在DNA聚合酶的作用下完成子链的延伸，形成新的双链DNA，实现DNA的指数级扩增。RPA技术的最大特点是只需要1对引物在恒温条件下30min内即可实现模板核酸的有效扩增，不需要专业的仪器设备介导高低温度循环实现核酸解链和退火的过程。另外，RPA反应试剂可以以干粉颗粒形式提供，方便保存和运输。基于以上原理，另有重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase aidedamplification，RAA) 也被报道，二者最大的区别是RPA的重组酶来自T4噬菌体，而RAA的重组酶源于细菌或真菌，更倾向于细菌病的检测研究。RPA扩增产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量及侧流层析试纸条(Lateral flow dipstic，LFD)判定结果，其中RPA技术结合LFD，即RPA-LFD检测方法使用更加简单、方便、5min内即可肉眼判定结果。在RPA扩增体系中，用生物素标记的引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点，该位点可被外切酶nfo识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，与生物素配体和荧光基团标记抗体反应后即可形成具有颜色的检测线。RPA-LFD检测方法所需设备简单、操作简便、灵敏度高、特异性好、检测时间短，30min左右就能判定结果，并且未经任何训练的非专业人员肉眼即可判读，有利于现场快速诊断及在基层单位推广使用。

自RPA技术问世以来，已被广泛用于病原微生物的检测领域，包括登革热病毒、裂谷热病毒、马尔堡病毒、牛痘病毒、诺如病毒、埃博拉病毒、口蹄疫病毒、布鲁氏杆菌、人免疫缺陷病毒、H5N1及H7N9亚型禽流感病毒等。2014年，非洲暴发埃博拉疫情时，科学家开发了一种RT-RPA方法检测埃博拉病毒的便携式手提箱，临床效果与荧光定量PCR完全一致，该方法在非洲埃博拉病毒的早期诊断过程中发挥了重要作用。樊小旭等开发的塞尼卡谷病毒RPA-LFD检测方法，在40℃反应20min，即可检测浓度低至56拷贝/μL标准阳性质粒。基于RPA技术原理，中国农业科学院兰州兽医研究所(非洲猪瘟病毒实时荧光RAA检测试剂盒)和广州悦洋生物技术有限公司(非洲猪瘟病毒分子检测试剂RAA荧光法)均开发了相应检测试剂盒，为我国非洲猪瘟的现场快速诊断提供了有效的方法。刘立兵等人针对猪细小病毒建立的RPA方法在39℃扩增30min，其检测限与实时荧光定量PCR一致，为10²拷贝，但临床样本的检出率略差于后者。葛志毅等在探究布鲁氏菌的LFD-RPA检测方法时，试验确定的体系中，最佳反应条件是于38℃反应10min，其敏感性可达8copies/反应。藏雨轩等人将RPA技术应用于食源性致病菌的检测，结果显示RPA扩增金黄色葡萄球菌的最佳条件为 40℃扩增10min，敏感度可检出500fg DNA和12CFU/mL金色葡萄球菌纯菌液，以及在39℃扩增10min可检测出300fg DNA和15CFU/mL单增李斯特菌纯菌液。吴耀东等研究员将 LFD-RPA技术与寄生虫检测相结合，研究结果显示，在30～45℃的条件下，30min内最低可检测到0.5个隐孢子虫卵囊的DNA或0.1个弓形虫卵囊的DNA。

目前，荧光定量PCR是全球认定的SARA-CoV-2实验室主流检测方法，由于抗原抗体检测在一定程度上会受到窗口期的影响，WHO尚且还不推荐特定的商业快速抗原检测(rapid antigen detection，RAD)试剂盒用于SARA-CoV-2诊断。市面上SARA-CoV-2核酸检测产品众多，检测靶基因组合仍持续在探索，所支撑的检测方法也有一定偏向性特点，呈现的临床敏感性效果不一。DiaSorin Molecular LLC公司开发的Simplexa COVID-19 Direct是利用荧光定量PCR在1h内对OFR1ab、S基因进行检测，其灵敏度为500copies/mL。MesaBiotech Inc 公司开发了一种PCR与LFD相结合的SARS-CoV-2单基因检测方法，检测时间缩短至30min，且灵敏度为200copies/mL。

目前，我国境内COVID-19疫情得到了有效遏制，但境外的感染人数呈波动上升态势，持续的低流量境外输入病例，使得我国枢纽地区和口岸城市防止病例输入的压力在不断增加，局部地区出现社会活动性聚集感染，其源头多数与输入病例相关联，牵连而起的本土病例在寒冷季节里也频频出现。同时，病毒的适应性进化使得发现传染源和切断传播途径的任务变得更为棘手，诊断工具必然要确保对新的突变毒株仍有可检性。另外，当前使用的 SARA-CoV-2检测方法主要为荧光定量PCR，需要专业的设备和技术人员，短期内多次大规模的筛查对医疗行业和一线医护人员带来了巨大负担。为此，疫病防控措施容不得一丝松懈，改进现有诊断工具以控制传播是至关重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于快速检测新型冠状病毒的组合物、RPA-LFD试剂盒和方法。本发明旨在建立一种基于RPA与LFD相结合的技术，针对SARA-CoV-2核衣壳蛋白(N) 和跨膜蛋白(M)双靶标基因进行检测的方法，以期在10min内完成RPA反应和LFD检测，从而获得更高效快速、操作简单、灵敏，无需过多依赖专业仪器设备以及专业的技术人员，可适用于临床实验室、社区医院、畜牧养殖场和医疗覆盖弱的偏远地区快速筛查的可视化检测方法，为SARA-CoV-2的早期诊断提供技术支撑，具有广泛的应用前景。

为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于快速检测新型冠状病毒的组合物，所述组合物包括用于检测SARS-Cov-2的N基因的引物对和探针，和/或用于检测SARS-Cov-2的 M基因的引物对和探针；

所述用于检测SARS-Cov-2的N基因的引物对如下：

上游引物N-F4：5’-AAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATT-3’；

下游引物N-R4：5’-Biotin-AGCCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGT-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的N基因的探针的序列：

探针N-Probe：5’-AGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCC-THF-C ATCACGTAGTCGCA-C3Spacer-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的M基因的引物对如下：

上游引物M-F8:5’-CGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCT-3’；

下游引物M-R8:5’-Boitin-TATTGTCACTGCTACTGGAATGGTCTGTGT-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的M基因的探针的序列:

探针M-Probe：5’-CAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGG-THF-G ACTCAGGTTTTGCT-C3Spacer-3’；

所述探针N-Probe和探针M-Probe的5’端均标记有荧光基团。优选地，所述探针N-Probe 5’端的荧光基团为FAM，所述探针M-Probe 5’端的荧光基团为FAM。

本发明提供了一种用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒，所述RPA-LFD试剂盒包括上述所述的组合物。

优选地，所述RPA-LFD试剂盒还包括反应缓冲液和醋酸镁。

优选地，所述反应缓冲液为Rehydration Buffer。

优选地，所述RPA-LFD试剂盒还包括HybriDetect Assay Buffer和测流层析试纸条。

本发明提供了一种采用上述所述的组合物快速检测新型冠状病毒的方法，包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)采用上述所述的组合物对步骤(1)提取的样本核酸进行RPA扩增反应；

(3)将步骤(2)得到的反应产物与HybriDetect Assay Buffer混合后，使用测流层析试纸条检测并观察，判定试验结果。

所述判定试验结果的方法如下：

当C线和T线都出现色带，检测样品为新型冠状病毒阳性；

当C线显色，T线没有显色，检测样品为新型冠状病毒阴性；

当C线没有显色，无论T线是否显色，该次检测无效。

在进行鉴定时，单基因的核酸鉴定即可以进行判断检测样品是否为新型冠状病毒阳性，而双基因的核酸检测可以进一步提高可信度。

优选地，所述步骤(2)中反应温度为29℃或44℃，反应时间为5分钟。

本发明提供了上述所述的组合物在制备快速检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种用于快速检测新型冠状病毒的组合物、RPA-LFD试剂盒和方法。本发明组合物、RPA-LFD试剂盒和方法具有以下优点：

(1)大幅度缩短检测时间。RPA反应只需要5min，LFD测试只需要5min，该技术总共耗时10min，能够有效提高大规模筛查的速度，减轻医护负担。SARS-CoV-2的N基因RPA 反应在29℃条件下反应5min即可获得高浓度的扩增产物，M基因RPA反应在44℃条件下反应5min即可获得高浓度的扩增产物。

(2)双基因靶标的检测。加强SARS-CoV-2检测的准确性，严格按照《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》的要求进行双基因靶标的检测。

(3)便捷性。RPA反应在恒温条件下进行，无需昂贵的专业仪器支撑，LFD检测方法简单易操作，无需专业人员的服务，能够实现现场快速诊断。反应结束将反应产物后置于冰上终止反应。取10μL反应液进行10倍稀释，取80μL稀释液与Milenia Biotec公司的HybriDetect中的缓冲液20μL振荡混匀，室温下静置1min，将试纸条直立于混合液Ep管中静置2min后在3min内可判定试验结果。

(4)特异性好。能与其他动物冠状病毒区分，也能与多种亚型流感病毒区分，有比较良好的特异性。

附图说明

图1为本发明实施例1中构建的N基因的标准阳性样鉴定结果；M.Marker 2 000bp。

图2为本发明实施例1中构建的M基因的标准阳性样鉴定结果；M.Marker 5 000bp。

图3为本发明实施例1中筛选反应体系结果；M.Marker 2 000bp；1.体系25μL；2.体系50μL。

图4为本发明实施例1中N基因特异性引物的筛选结果；M.Marker 2 000bp；1.N-F1/R1； 2.N-F2/R2；3.N-F3/R3；4.N-F4/R4。

图5为本发明实施例1中M基因特异性引物的筛选结果；M.Marker 500bp；1.M-F5/R5； 2.M-F6/R6；3.M-F7/R7；4.M-F8/R8。

图6为本发明实施例1中筛选N基因引物反应终浓度的结果；M.Marker 2 000bp；1-3.5 pmol/μL；4-6.10pmol/μL；7-9.20pmol/μL；10-12.50pmol/μL；13-15.100pmol/μL。

图7为本发明实施例1中筛选M基因引物反应终浓度的结果；M.Marker 500bp；1.10pmol/μL；2.20pmol/μL；3.25pmol/μL；4.30pmol/μL；5.40pmol/μL；6.50pmol/μL。

图8为本发明实施例1中N基因筛选引物反应温度筛选结果；(A)RPA-LFD；(B) 灰度分析。

图9为本发明实施例1中M基因筛选引物反应温度筛选结果；(A)RPA-LFD；(B) 灰度分析。

图10为本发明实施例1中N基因筛选引物反应时间筛选结果；(A)RPA-LFD；(B) 灰度分析。

图11为本发明实施例1中M基因筛选引物反应时间筛选结果；(A)RPA-LFD；(B) 灰度分析。

图12为本发明实施例1中引物对N-F4、N-R4-B、M-F8、M-R8-B及探针N-Probe；M-Probe 的特异性试验结果；(A)RPA-LFD；(B)灰度分析。

图13为本发明实施例1中N基因敏感性试验结果；(A)RPA-LFD；(B)灰度分析。

图14为本发明实施例1中M基因敏感性试验结果；(A)RPA-LFD；(B)灰度分析。

图15为本发明实施例1中CDC推荐的引物和探针的敏感性试验结果。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

RPA的引物序列长度一般在30～35bp范围内。遵循4种碱基在引物中随机分配原则，一定要避免多个相同的碱基连续出现，尤其是避免连续出现4个或4个以上G；引物的GC比例与普通PCR引物要求一致，控制在40～60％之间，且正反向引物的GC含量不得相差太大。引物3`端的末尾碱基避免选择为A，或终止密码子第3位。不同的末尾碱基在错配的情况下，引发错误扩增的概率不同。当引物末尾碱基是A时，引发错误扩增的概率要高于其他三个碱基，当末尾碱基是T时，引发错误扩增的概率最小，而G，C则处于两者之间。引物5`端最初的3～5个核苷酸尽可能降低G的概率；在靠近3`端的3～5个核苷酸应有连续多个G、C出现为宜；与普通PCR引物设计原则相同，应避免引物自身形成发夹结构，特别是引物3`端，引物的延伸是从3`端开始的，应避免正反向引物互补形成引物二聚体。RPA技术中，扩增产物的长度一般低于500bp。

在RPA反应产物进行LFD测试中，是利用荧光基团FAM标记探针5`端，在距离5`端30bp以上，距离3`端15bp以上的位置插入一个四氢呋喃(THF)残基位点，同时，3`端用Space断隔，当探针识别模板的互补序列，酶NFO(内切酶IV)识别残基位点，切割THF 后产生新自由羟基端，从而有效解锁探针，启动核苷酸链延伸，使得5`端的荧光基团标签在扩增产物中出现。同时，对下游引物5`端进行生物素(Biotin)标记，当探针被切割后，便会形成既带有荧光基团标记物又带有引物特殊标记物的双标记扩增产物。

基于RPA反应体系，其反应扩增产物结果结合LFD进行判定。LFD检测方法具有较高的简便易携性，其主要组成有样品垫、结合垫、吸水垫、层析膜(硝酸纤维素膜)，样品垫近端是1条检测线T线，远端是1条质控线C线，通用型侧流层析试纸条的T线处包被了生物素(Biotin)抗体，C线处包被了抗FAM抗体。携带FAM标签的双标记扩增产物中的先与 FAM抗体发生结合，形成抗原抗体复合物，随后滴加在试纸条样品垫上，在毛细管层析扩散作用下，复合物通过层析膜扩散，C线处的抗FAM抗体与结合在双标记扩增产物上的FAM 抗体发生结合，使C线出现颜色带，呈紫黑色；T线处的Biotin抗体与双标记扩增产物中的 Biotin标签发生结合，形成双抗体夹心复合物，使T线出现颜色带，呈紫黑色，且C线会比 T线早出现。当T线和C线都显色，说明检测样品为阳性；当C线显色，T线没有显色，说明检测样品为阴性；当C线没有显色，无论T线是否显色，该次检测结果无效。

实施例1用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒和方法的建立

1、材料与方法

1.1病毒株及核酸

连接pcDNA3.1载体pSARS-CoV-2的N、M基因片段。禽流感(avian influenza，AIV)H3N8、H5N6、H5N8、H7N9和H9N2亚型，新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)，禽传染性支气管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)，乙型副流感病毒(Sendaivirus， SeV)，猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，猪肠道α冠状病毒(porcine enteric alphacoron virus，PEAV)

1.2主要仪器

BIOBASE生物安全柜、BIO-RAD梯度PCR扩增仪、BIO-RAD荧光定量PCR扩增仪、NanoDrop分光光度计、涡旋仪、瞬时离心机、Eppendorf离心机、BIO-RAD多用电泳仪。

1.3主要试剂

康体生命公司的DH-5α、TIANGEN公司的Golden Easy PCR System，OMEGA公司的Gel Extarction Kit、BioWest Agarose、TIANGEN公司的普通DNA产物纯化试剂盒、YeaRed核酸染料、TwistAmp公司的TwistDx Kit、Milenia Biotec公司的HybriDetect、广州真知生物有限公司的Superreal premix(Probe)。

1.4引物和探针设计

根据NCBI登陆的SARS-Cov-2基因序列NC_045512.2，通过比对α、β属冠状病毒在内的53条核苷酸序列(登录号见表1)，寻找SARS-Cov-2的N基因、M基因的特异性保守域，分别设计4对引物和1条探针，进一步对引物进行BLAST分析比较其与SARS-Cov-2核苷酸序列的匹配度。如表2所示，其中，引物用PAGE纯化。

表1比对序列登录号

表2N、M基因引物

1.5构建标准阳性样

将N和M目的基因片段从克隆载体pcDNA3.1⁺上剪切后进行扩增并回收，连接pEGM-T19载体后扩大培养，进行测序鉴定、成功构建出标准阳性质粒后，测定浓度并计算质粒拷贝数。根据公式拷贝数

N基因质粒浓度为106.0ng/μL，拷贝数为2.38ⅹ10¹⁰copies/μL，M基因质粒浓度为108.3ng/μL，拷贝数为2.38ⅹ10¹⁰copies/μL，两个质粒分别作10倍稀释，得到10⁹～10⁰共10个稀释度的样品，作为后续待检测材料。

1.6反应条件优化

1.6.1筛选反应体系

以盒内自带的阳性样品为反应模板，根据TwistDx Kit，制备50μL反应体系，在反应管中加入Rehydration Buffer 29.5μL，10μmol/L的上、下游引物各2μL，阳性样1μL，ddH₂O 13 μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，再加入MgOAc(醋酸镁)2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10 s，放置于39℃环境中反应4min，取出反应管，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在同一温度下继续反应26min，获得反应产物。另设置25μL的总体系，按照Rehydration Buffer14.75μL； 10μmol/L的上、下游引物各1μL，阳性样0.5μL，ddH₂O 6.5μL，MgOAc 1.25μL的体系，与上述操作一致，获得反应产物。对反应产物使用DNA产物纯化试剂盒进行纯化处理，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.2筛选特异性引物

N、M基因以拷贝数为2.38ⅹ10¹⁰copies/μL标准阳性样为核酸模板，制备50μL反应体系，先预混Rehydration Buffer 29.5μL，根据表1和表2中的引物对，分别加10μmol/L的上、下游引物各2μL，阳性样1μL，ddH₂O 13μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，再加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，放置于39℃环境中反应4min，取出反应管，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在同一温度下继续反应26min，获得反应产物。对反应产物使用DNA产物纯化试剂盒进行纯化处理，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

将筛选出的引物对带上Biotin标签，并和相应的探针一样使用HPLC纯化，如表3所示。

表3引物与探针

1.6.3筛选引物反应终浓度

针对N基因，设置引物终浓度为5、10、20、50、100pmol/μL共5组对照，针对M基因，设置引物终浓度为10、20、25、30、40、50pmol/μL共6组对照。制备50μL反应体系， RehydrationBuffer 29.5μL；上、下游引物各2μL；阳性样1μL；ddH₂O 13μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，分别加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在39℃反应4min，取出反应管，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在39℃继续反应26min。对反应产物使用DNA 产物纯化试剂盒进行纯化处理，最后用2％琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6.4筛选反应温度

以N、M基因拷贝数为2.38ⅹ10¹⁰copies/μL标准阳性样作核酸模板，先预混Rehydration Buffer 29.5μL，50μmol/L的上、下游引物各1μL，Probe 0.6μL，阳性样1μL，ddH₂O 14.4μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，把上述混合液转移到冻干粉反应管中，再向反应管盖加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，设置24℃、29℃、34℃、37℃、39℃、41℃、44℃、 49℃和52℃的温度梯度，反应4min后取出反应管，再次振荡混匀，瞬时离心8～10s，在同一温度下继续反应26min，随后置于冰上终止反应。取10μL反应液进行10倍稀释，取80μL 稀释液与HybriDetect中的缓冲液(HybriDetect Assay Buffer)20μL振荡混匀，室温下静置1 min，将试纸条直立于混合液Ep管中静置2min，判定试验结果。

1.6.5筛选反应时间

以N、M基因拷贝数为2.38ⅹ10¹⁰copies/μL标准阳性样作核酸模板，先预混Rehydration Buffer 29.5μL，50μmol/L的上、下游引物各1μL，Probe 0.6μL，阳性样1μL，ddH₂O 14.4μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，把上述混合液转移到冻干粉反应管中，再向反应管盖加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在39℃反应4min，取出反应管，振荡混匀，瞬时离心 8～10s，设置继续反应时间1、6、11及16min，即总反应时长达到5、10、15、20min时取出反应管，置于冰上终止反应。取10μL反应液进行10倍稀释，取80μL稀释液与HybriDetect 中的缓冲液20μL振荡混匀，室温下静置1min，将试纸条直立于混合液Ep管中静置2min，判定试验结果。

1.7特异性试验

选取最优反应条件，引物对N-F4、N-R4-B、M-F8、M-R8-B以及引物反应浓度50pmol/μL、温度39℃和总反应时间5min，进行特异性试验。制备50μL反应体系，RehydrationBuffer 29.5 μL，N、M基因的上、下游引物各1μL，Probe 0.6μL，阳性样1μL，ddH₂O 14.4μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在39℃反应4min，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在39℃反应1min。其中，对比的阳性样选择H3N8、H5N6、H5N8、H7N9、H9N2、SeV、NDV、IBV、PEDV和PEAV，以ddH₂O为阴性对照。反应5min 后置于冰上终止反应，对反应产物进行10倍稀释，取80μL稀释液与20μL的HybriDetect 中的缓冲液振荡混匀，室温下静置1min，将试纸条直立于反应管中静置2min，判定试验结果。

1.8敏感性试验

N、M基因选取2.38、23.8、238、2.38×10³、2.38×10⁴copies/μL共5个拷贝数作为试验阳性样，制备50μL反应体系，先预混Rehydration Buffer 29.5μL，50μmol/L的上、下游引物各1μL，Probe 0.6μL，阳性样1μL，ddH₂O 14.4μL，振荡混匀，瞬时离心8～10s，把上述混合液转移到冻干粉反应管中，再向反应管盖加入MgOAc 2.5μL，振荡混匀，瞬时离心8～10 s，在39℃反应4min，取出反应管，振荡混匀，瞬时离心8～10s，在同一温度下继续反应1min。随后置于冰上终止反应，对反应产物进行10倍稀释，取80μL稀释液与20μL的HybriDetect 中的缓冲液振荡混匀，室温下静置1min，将试纸条直立于反应管中静置2min，判定试验结果。

根据CDC发布的N基因的引物和探针序列合成，如表4所示，以HPLC方式进行纯化。

表4 CDC-N基因合成引物、探针

引物名称	碱基序列(5`-3`)
		CDC-N-F	GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
CDC-N-R	CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
		CDC-N-P	FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA

根据广州真知生物有限公司Superreal premix(Probe)试剂盒配置总体系50μL。2ⅹ SuperReal PreMix 25μL，10μmol/L的上、下游引物各1.5μL，样本2μL，10μmol/L的Prober 1μL，ddH₂O 19μL，振荡混匀，瞬时离心10s。扩增程序为95℃ 15min；1cycles；95℃3sec， 40cycles；60℃ 32sec，40cycles，在60℃检测荧光信号。

2、结果及分析

2.1构建标准阳性质粒

构建的N、M基因的标准阳性样鉴定如图1和图2所示。

2.2反应条件优化

2.2.1筛选反应体系

结果如图3所示，体系25μL的没有条带，50μL的有目的条带，目的片段大小为143bp。依据试验结果选取反应总体系50μL进行后续试验。推测反应体系与试剂盒中反应管的酶冻干粉剂量有关，故应选取固定的体系进行反应。

2.2.2筛选特异性引物

N基因特异性引物的筛选如图4所示，第4泳道(N-F4/R4引物对)的条带最为明亮，且未见杂带。因此选取N-F4、N-R4引物对进行后续试验。M基因特异性引物的筛选如图5 所示，第4泳道(M-F8/R8引物对)的条带较为明亮，且未见杂带，引物设计需要将探针的设计纳入考虑，因此选取M-F8、M-R8引物对进行后续试验。将筛选出的引物对带上Biotin 标签，并和相应的探针一样使用HPLC纯化，如表3所示。

2.2.3筛选引物反应终浓度

筛选引物反应终浓度的结果如图6所示，N基因引物终浓度在50pmol/μL时的电泳条带最明显，如图7所示，M基因引物终浓度在50pmol/μL时电泳条带较为明显，因此选取50pmol/μL引物反应终浓度进行后续试验。

2.2.4筛选反应温度

结果如图8和表5所示，肉眼可见24℃至41℃均有清晰的检测线，根据灰度分析，SARS-CoV-2的N基因RPA反应用试纸条法判定，29℃为反应温度时的条带颜色略优于41℃。在重复性试验中，反应温度29℃的灰度平均值为98.00±2.67，变异系数为2.72％，反应温度为41℃的灰度平均值为94.97±5.00，变异系数为5.26％。

表5 N基因筛选引物最佳反应温度重复性试验

SARS-CoV-2的M基因RPA反应用试纸条法判定，结果如图9和表6所示，肉眼可见 29℃至44℃均有清晰的检测线，根据灰度分析，44℃为反应温度时的条带较为明显，29℃次之。在重复性试验中，反应温度为44℃的灰度平均值为107.14±3.73，变异系数为3.48％，反应温度为29℃的灰度平均值为105.02±3.12，变异系数为2.97％。

表6 M基因筛选引物最佳反应温度重复性试验

2.2.5筛选反应时间

SARS-CoV-2的N基因RPA反应用试纸条法判定，结果如图10和表7所示，反应时间越长，出现检测线的速度越快，但不同总反应时间的检测线眼观上，的差异不明显。在重复性试验中，根据灰度分析，总反应时间为15min的灰度平均值为93.20±3.91，变异系数为4.20％，总反应时间最短为5min时，即可观测到反应结果。

表7 N基因筛选总反应时间重复性试验

SARS-CoV-2的M基因RPA反应用试纸条法判定，结果如图11和表8所示，反应时间越长，出现检测线的速度越快，但不同总反应时间的检测线眼观上的差异不明显。在重复性试验中，根据灰度分析，总反应时间为5min的灰度平均值为98.57±1.40，变异系数最小，为1.42％。即最短总反应时间为5min。

表8 M基因筛选总反应时间重复性试验

2.3特异性试验

用引物对N-F4、N-R4-B、M-F8、M-R8-B及探针N-Probe；M-Probe的RPA-LFD反应检测对SARS-CoV-2的特异性，如图12所示，试验结果显示对SARS-CoV-2有较好的特异性。

2.4敏感性试验

N基因敏感性试验结果如图13和表9所示，2.38ⅹ10³copies/μL组与阴性对照组差异显著，结合试验结果灰度分析，RPA反应用试纸条法判定，在总反应时间为5min时，该阳性样N基因的可检最低拷贝数为2.38ⅹ10³copies/μL。

表9筛选N基因最低可检拷贝数重复性试验

M基因敏感性试验结果如图14和表10所示，试验结果灰度分析显示，RPA反应用试纸条法判定，在总反应时间为5min时，该阳性样M基因的可检最低拷贝数为238copies/μL。

表10筛选M基因最低可检拷贝数重复性试验

结果如图15所示，使用CDC推荐的引物和探针，qRT-PCR方法检测本实验N基因的标准阳性样的可检最低拷贝数达23.8copies/μL，且与阴性比较，差异显著，提示可检最低拷贝数可能在23.8copies/μL以下。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

caaggcgttc caattaacac caatagcagt 30

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

tcaatctgtc aagcagcagc aagcaagag 29

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

tctgtctctg cggtaaggct tgagtttcat 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

tggtgacggt aaaatgaaag atctcagtcc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

aagttgtagc acgattgcag cattgttagc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

aaatgaaaga tctcagtcca agatggtatt 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

agcctcagca gcagatttct tagtgacagt 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

caaattggga gcttcgcagc gtgtagcagg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

tattgtcact gctactggaa tggtctgtgt 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

ctattaccgt tgaagagctt aaaaagctcc 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 12

tacaagacaa gccattgcga tagcaattcc 30

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 13

cttgtcttgt aggcttgatg tggctcagct 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 14

tattgtcact gctactggaa tggtctgtgt 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 15

cggtggaatt gctatcgcaa tggcttgtct 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 16

tattgtcact gctactggaa tggtctgtgt 30

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 17

agaggcggca gtcaagcctc ttctcgttcc catcacgtag tcgca 45

<210> 18

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 18

caaattggga gcttcgcagc gtgtagcagg gactcaggtt ttgct 45

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 19

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 20

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 21

ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims

1.一种用于快速检测新型冠状病毒的组合物，其特征在于，所述组合物包括用于检测SARS-Cov-2的N基因的引物对和探针，和/或用于检测SARS-Cov-2的M基因的引物对和探针；

所述用于检测SARS-Cov-2的N基因的引物对如下：

上游引物N-F4：5’-AAATGAAAGATCTCAGTCCAAGATGGTATT-3’；

下游引物N-R4：5’-Biotin-AGCCTCAGCAGCAGATTTCTTAGTGACAGT-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的N基因的探针的序列：

探针N-Probe：5’-AGAGGCGGCAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCC-THF-CATCACGTAGTCGCA-C3Spacer-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的M基因的引物对如下：

上游引物M-F8:5’-CGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCT-3’；

下游引物M-R8:5’-Boitin-TATTGTCACTGCTACTGGAATGGTCTGTGT-3’；

所述用于检测SARS-Cov-2的M基因的探针的序列:

探针M-Probe：5’-CAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGG-THF-GACTCAGGTTTTGCT-C3Spacer-3’；

所述探针N-Probe和探针M-Probe的5’端均标记有荧光基团。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述探针N-Probe 5’端的荧光基团为FAM，所述探针M-Probe 5’端的荧光基团为FAM。

3.一种用于快速检测新型冠状病毒的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒包括如权利要求1或2所述的组合物。

4.根据权利要求3所述的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒还包括反应缓冲液和醋酸镁。

5.根据权利要求4所述的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液为RehydrationBuffer。

6.根据权利要求3所述的RPA-LFD试剂盒，其特征在于，所述RPA-LFD试剂盒还包括HybriDetect Assay Buffer和测流层析试纸条。

7.一种采用如权利要求1或2所述的组合物快速检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)采用如权利要求1或2所述的组合物对步骤(1)提取的样本核酸进行RPA扩增反应；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述判定试验结果的方法如下：

当C线和T线都出现色带，检测样品为新型冠状病毒阳性；

当C线显色，T线没有显色，检测样品为新型冠状病毒阴性；

当C线没有显色，无论T线是否显色，该次检测无效。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中反应温度为29℃或44℃，反应时间为5分钟。

10.如权利要求1或2所述的组合物在制备快速检测新型冠状病毒的试剂盒中的应用。