CN104946795A - 用于现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于通过RPA-侧流层析技术检测口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明还公开了用于口蹄疫病毒检测的试剂盒。采用本发明的引物和探针进行检测，仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行口蹄疫病毒的检测。

Description

用于现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(RecombinasePloymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral Flow Assay)现场检测多种血清型口蹄疫病毒的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的发生在猪、牛、羊等偶蹄类动物上的急性、热性、高度接触性传染病，被世界动物卫生组织列为“A类烈性传染病”，一旦暴发，必须扑杀感染及接触感染的动物，造成巨大的直接经济损失，而且严重危害畜牧业的健康发展以及相关产品的对外贸易，对国家的政治、经济具有深远的影响。口蹄疫病毒有7个血清型和65个以上的血清亚型，血清型之间无交叉免疫现象，因而难以控制。我国为口蹄疫流行国家，主要流行O型、A型和Asia 1型口蹄疫。2005年我国大面积爆发了Asia 1型口蹄疫，2009年和2013年爆发了A型口蹄疫，近年来，均有O型口蹄疫的散发和流行，特别是随着我国养殖业集约化、规模化的迅猛发展，口蹄疫的传播风险也来越大。

目前，病毒的分离与鉴定、PCR及其相关的技术是口蹄疫病毒检测的主要方法，口蹄疫病毒的分离培养要求在生物安全三级以上实验室进行，并需要特殊的仪器设备和专业的技术人员，在分离过程中存在病毒扩散的危险，且耗时长。而PCR及其相关的技术可以检测口蹄疫病毒的核酸，但需要复杂的仪器设备，难以满足非实验室等现场环境下的检测要求。

重组酶等温扩增(recombinase ploymerase amplification,RPA)技术是不同于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA配对，并在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板分子得到大约10¹²扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余分钟即可得到扩增产物(Forget et al.,2012)。RPA可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5分钟左右就能目测结果，肉眼判读。

但目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，国内外还没有将RPA技术应用于FMDV检测的报道。本发明系首次采用RPA技术建立快速检测FMDV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为FMDV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

发明内容

针对RPA技术应用于FMDV检测领域的空白，本发明提供了一种准确、快速、简便的现场检测口蹄疫病毒的RPA检测方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于通过RPA-侧流层析技术检测多种血清型口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ IDNo.3所示。

正向引物2BF:5’-GTCTCGACGAGGCCAAGCCCTGGTACAAACT-3’；(SEQ ID No.1)

反向引物2BR：5’-【Biotin】CGAGGCGACCTTGACCAACCCGGCCAACAGG-3’；(SEQID No.2)

探针序列2BP：5’-【FAM】GTCTTGAGATTCTGGACAGCACTTTTGTCGTG【dSpacer】AAAAGATCTCCGACTCG【C3-spacer】3’；(SEQ ID No.3)。

需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

本发明还提供了一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒中包含有由用于通过RPA技术检测口蹄疫病毒的引物和探针组成的引物探针液。

所述引物探针液的组成为：正向引物2BF和反向引物2BR终浓度均为0.4μmol/L，检测探针2BP的终浓度为0.12μmol/L，扩增核苷酸序列片段为SEQ ID NO.4所示。

进一步的，该检测口蹄疫病毒的试剂盒中还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条；

所述阳性标准质粒为pEASY-T₃-2B，用于检测的阳性对照，以检验反应体系和反应条件能否正常反应。

用于构建阳性标准质粒的引物序列如下：

FMDV-F：5’-CACTCCCTTACACCGCTCCC-3’(SEQ ID No:5)；

FMDV-R：5’-ACTCTTTCCCTGGCCGGATT-3’(SEQ ID No:6)。

所述阳性标准质粒pEASY-T₃-2B是以FMDV基因组cDNA为模板，由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6PCR扩增的核苷酸序列片段(SEQ ID NO.7)与pEASY-T₃载体相连接后得到的重组质粒，连接方法为所属领域常规技术。

PCR扩增的反应体系为50μL：10×PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，10μmol/L的引物FMDV-F和FMDV-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL。

反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃20s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。

所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液、产物稀释液可于市场购买得到。

具体的，一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或阳性对照分别为1μL或空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。(上述阳性对照是指阳性标准质粒，空白对照指无菌双蒸水)

本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测FMDV的方法，步骤如下：

(1)提取待测样本的总RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA；

(2)设计用于多种血清型口蹄疫病毒检测的通用引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；

(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有口蹄疫病毒核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有口蹄疫病毒核酸。

本发明的有益效果：

(1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对FMDV进行检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

本发明选用的口蹄疫病毒2B基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与牛、猪的其他病毒包括牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、猪疱疹病毒、猪瘟病毒等病毒无交叉反应。

RPA能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，从单个模板分子得到大约10¹²扩增产物；本发明所建立检测方法可检测5TCID₅₀的FMDV病毒。

(2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测FMDV的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤适于基层实验室和现场的口蹄疫病毒快速筛查检测。

(3)检测速度快：与常规PCR相比，不必经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。

(4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，而且RPA不需复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1为RPA引物、探针组的筛选结果，其中1为引物2BF、2BR和探针2BP组，2为引物2CF、2CR和探针2CP1组，3为2CF、2CR和探针2CP2组，4为3AF、3AR和探针3AP组，5为3CF、3CR和探针3CP组，6为3DF1、3DR1和探针3DP1组，7为3DF1、3DR1和探针3DP2组，8为3DF2、3DR2和探针3DP3组；a为FMDV cDNA，b为阴性对照；

图2RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏性试验，其中1为1×10⁷TCID₅₀、2为1×10⁶TCID₅₀、3为1×10⁵TCID₅₀、4为1×10⁴TCID₅₀、5为1×10³TCID₅₀、6为1×10²TCID₅₀、7为10TCID₅₀、8为5TCID₅₀。。

图3为RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性试验，其中1为O型口蹄疫病毒；2为A型口蹄疫病毒；3为Asia 1型口蹄疫病毒；4为标准阳性质粒pEASY-T₃-2B；5为牛肠道病毒；6为牛流热病毒；7为牛病毒性腹泻病毒；8为水疱性口炎病毒；9为牛传染性鼻气管炎病毒；10为猪疱疹病毒；11为猪瘟病毒；12为ddH₂O。

图4为RPA侧流层析检测试剂盒的灵敏度和重复性试验，口蹄疫病毒滴度为5TCID₅₀。

图5为临床样本的RPA侧流层析检测试剂盒的检测结果，其中阳性样本1、4、9为气溶胶收集液，2、3、7为流涎，5、6为水疱液，8、10、11为血液，12、13为血清，14、17为奶样，15、18为鼻拭子样本，16为阳性质粒，19-22分别为阴性的气溶胶、血液、血清、奶样样本，23为ddH₂O。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TwistAmp nfo Kits购自TwistDX公司，Genline Hybridetect-1lateral flow strips购自Milenia GmbH(Germany)，反转录试剂盒(Code No.：D2639A)购自宝生物工程(大连)有限公司，磁珠法提取病毒DNA/RNA试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；通用检测引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1：阳性标准质粒的制备

1.引物的设计与合成

通过对GeneBank中口蹄疫病毒2B基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对通用引物，为序列表中的SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，可对口蹄疫病毒7个血清型检测，扩增出PCR片段，用于阳性标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。

2.口蹄疫病毒cDNA的制备

参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，分别提取O型、A型、Asia 1型口蹄疫病毒RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。

3.阳性质粒的制备

以上述方法制备的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物FMDV-F和FMDV-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃20s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

PCR扩增产物为1148bp，经1％琼脂糖凝胶电泳回收，克隆至pEAST-T3载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，用引物FMDV-F(SEQ ID No.5)和FMDV-R(SEQ ID No.6)进行菌落PCR验证。将阳性重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，送交上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确(SEQ ID No.7)的重组菌摇菌培养，试剂盒提取质粒DNA，获得阳性质粒，将其命名为pEASY-T₃-2B。

实施例2：口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的优化与建立

1.RPA引物与探针的设计

RPA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。有关RPA引物和探针设计相关数据少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。PCR引物并不适用于RPA，RPA引物比一般PCR引物长，约30-35个碱基。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而引物长度增加容易形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加。因此，用于RPA扩增的引物需要经过大量的实验进行筛选与优化。

一般情况下引物、探针的设计需参考以下因素：(1)GC含量在40％～60％；(2)尽量避免引物内部出现二级结构；(3)避免引物出现重复序列。

RPA探针的长度一般46～52个碱基，尽量避免与引物重叠、形成异二聚体。探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer修饰与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端C₃-spacer修饰。

本实施例针对口蹄疫病毒不同基因保守区设计了一系列的RPA引物与探针，具体见表1。

表1 针对口蹄疫病毒不同基因保守区设计的RPA引物与探针

备注：表示Biotin修饰；*表示FAM标记；阴影表示dSpacer，为THF替换碱基；&表示C3-spacer修饰。

2.利用RPA扩增反应筛选引物和探针

取10⁷TCID₅₀的口蹄疫病毒，试剂盒提取RNA，反转录cDNA，以cDNA为模板用于PRA方法扩增口蹄疫病毒的不同基因序列。具体步骤：

(1)于离心管管底中分别加入各检测基因的上下游引物各2.1μL(10μmol/L)，LF探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH₂O补足到体积47.5μL，吹打混匀；每对引物探针组均设立无菌双蒸水为阴性对照，模板cDNA为反转录的原液。

(2)将47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，经移液器反复吹打直至完全溶解。

(3)向每个反应管液体内加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)溶液，混匀后反应即刻发生。

(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min。

(5)反应4min后，取出反应管，再次混匀后继续放入38℃的恒温水浴锅中反应20min。

(6)取检测管，在其中加入扩增产物1μL和49μL的产物稀释液，混合均匀后，放入检测试纸条，3～5min后，通过试纸条的显色进行判读。

3.引物和探针的筛选结果

表1所示的引物探针组经RAP扩增后，经过试纸条检测，如图1所示，2B引物探针组的检测组的RPA产物为阳性，试纸条在检测区和质控区出现条带，而阴性对照RPA产物在检测区未出现条带，仅质控区出现条带。而其他引物探针组的检测组和阴性对照组RPA产物均在检测区出现条带，通过将下游引物与相应的探针混合后进行试纸条检测，发现在检测区出现阳性条带，表明这些引物探针组形成了引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现阳性反应，因此，这些引物探针组不能应用于RPA的检测。

4.RPA扩增反应体系的优化

首先，将2B的引物、探针组按表2所示，进行RPA反应的引物和探针使用量的优化，优化结果表明，2B的上下游引物各为2μL、探针为0.6μL，效果较好。另外，还针对醋酸镁溶液的使用量设置了7个浓度梯度。在50μL RPA反应体系中加入浓度为280mM/μL醋酸镁的量分别为0μL、0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL和3μL，结果显示，醋酸镁用量过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1μL及以上醋酸镁可以得到的扩增产物，并且产物随着醋酸镁量的增加而增加，但添加2.5μL和3μL的醋酸镁差别不明显。最终确定反应体系中加入2.5μL醋酸镁溶液。

经优化后的RPA反应体系为：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mLTwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)溶液启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。

表2RPA反应引物和探针使用量组合优化表

实施例3：口蹄疫病毒RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度、重复性、特异性检测

1.RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度分析及重复性检测

将滴度为10⁷TCID₅₀/100μL的口蹄疫病毒液用PBS进行10倍系列稀释后，应用试剂盒提取病毒的RNA，反转录cDNA；以优化的RPA条件，利用2B引物探针组进行RPA扩增：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。

每个梯度的模板浓度做三个重复，通过RPA侧流层析试纸条检测，验证RPA侧流层析试纸条方法的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证RPA侧流层析试纸条方法的批间重复性。所获得的RPA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，2B引物探针组可检测到的5TCID₅₀的cDNA，见图2。

2.RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性分析

参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取牛传染性鼻气管炎病毒和猪疱疹病毒的DNA；提取牛肠道病毒、牛流热病毒、牛病毒性腹泻病毒、水疱性口炎病毒、猪瘟病毒RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。

按照上述步骤建立的2B引物探针组的RPA方法进行特异性试验，分别以A型、O型、Asia1型口蹄疫病毒的cDNA、牛传染性鼻气管炎病毒DNA、牛肠道病毒cDNA、牛流热病毒cDNA、牛病毒性腹泻病毒cDNA、水疱性口炎病毒cDNA、猪瘟病毒cDNA、猪疱疹病毒的DNA为模板，以ddH₂O为阴性对照，进行RPA扩增，试验重复3次。

所有的RPA产物进行侧流层析试纸条检测，如图3所示，1：O型口蹄疫病毒；2：A型口蹄疫病毒；3：Asia 1型口蹄疫病毒；4：标准阳性质粒；5：牛肠道病毒；6：牛流热病毒；7：牛病毒性腹泻病毒；8：水疱性口炎病毒；9：猪瘟病毒；10：猪疱疹病毒；11：牛传染性鼻气管炎病毒；12：ddH₂O。从图中可以看出，1～4试纸条在检测区有阳性条带和质控条带，而5-12则无阳性检测条带，仅有质控条带，证实所优化的2B引物、探针组扩增口蹄疫病毒特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，经优选出的口蹄疫病毒通用引物2BF、2BR和探针2BP，用于建立检测口蹄疫病毒的RPA侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本是否存在口蹄疫病毒的核酸。

实施例4：RPA侧流层析检测试剂盒的组装与灵敏度、重复性试验

将引物2BF和2BR各200μL、探针2BP 60μL混合，分装50μL/管，作为引物探针液；然后与标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、侧流免疫层析试纸条、产物稀释液组装成RPA侧流层析检测试剂盒。

利用所组装的RPA侧流层析检测试剂盒，按实施例3中的5TCID₅₀口蹄疫病毒进行灵敏度检测，反应体系为：引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。做三个重复，取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。结果表明，所组装的RPA侧流层析检测试剂盒可检测到的5TCID₅₀口蹄疫病毒cDNA，试验重复3次，结果见图4。

实施例5：临床样本的检测

1.样本的处理

采集感染疑似口蹄疫病毒牛的流涎、水疱液等拭子样本及血液、血清、气溶胶等样本，拭子样本浸于500μL的含PBS溶液的离心管中，反复挤压、搅拌，取出上清液于新的离心管中，置于冰上备用。

2.磁珠法快速提取总RNA

(1)在1.5mL无核酸酶的离心管中加入20μL蛋白酶K、3μL Carrier RNA和15μL磁珠悬液G，加入300μL缓冲液RLCK，再加入200μL的处理后的样本上清液\血液\血清等，移液器混匀。

(2)室温孵育10min，期间每3min上下颠倒混匀，使磁珠与核酸充分混合。

(3)将离心管置于磁力架上1min，小心去除液体，加入500μL漂洗液PW I，混匀，磁力架上静置30sec，去除液体；再加入500μL漂洗液PW II，混匀，磁力架上静置30sec，去除液体；然后再重复用PW I和PW II各洗1次，磁力架静置30sec，尽量去除液体。

(4)将离心管置于磁力架，晾干5-10min。

(5)取下离心管，加入50μL无RNAase的双蒸水，震荡混匀，56℃孵育2min，磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新管中，置于冰上备用。

3.反转录制备cDNA

参照反转录试剂盒说明书进行反转录，5×RT buffer 2μL、随机引物1μL、AMV反转录酶1μL、粗提的RNA 6μL。30℃10min，42℃30min，95℃5min，将反应管置于冰上。

4.临床样本的检测

待测样本为经本实验室利用荧光定量方法检测过阳性流涎、鼻拭子等样本17份和4份阴性样本。利用磁珠法快速提取总RNA，反转录cDNA。以提取的21份样本的cDNA分别为模板，以阳性质粒为阳性对照、ddH₂O为阴性对照，利用实施例4组装的RPA侧流层析检测试剂盒进行检测。引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。若试纸条的检测区出现阳性检测条带，则待测样本中含有口蹄疫病毒；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有口蹄疫病毒。

经RPA侧流层析检测试剂盒检测，呈阳性的17份，呈阴性的样本4份，说明样品中有17份为口蹄疫病毒阳性，4份样品为口蹄疫病毒阴性，即不含有口蹄疫病毒，见图5。其中阳性样本1、4、9为气溶胶收集液，2、3、7为流涎，5、6为水疱液，8、10、11为血液，12、13为血清，14、17为奶样，15、18为鼻拭子样本，16为阳性质粒，19-22分别为阴性的气溶胶、血液、血清、奶样样本，23为ddH₂O。将此结果与本实验室的SYBR Green I荧光定量PCR检测结果对照，结果完全一致。

Claims (10)

1.一种用于通过RPA-侧流层析技术检测口蹄疫病毒的通用引物和探针组合，其特征在于，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备检测口蹄疫病毒的检测试剂中的应用。

3.一种检测口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由权利要求1所述的引物和探针组成的引物探针液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.12μmol/L。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准质粒是以FMDV基因组cDNA为模板，由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6扩增的核苷酸片段，与pEASY-T₃载体相连接后得到的重组质粒。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，扩增的核苷酸片段的序列如SEQ ID NO.7所示。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，扩增的反应体系为50μL：10×PCR BufferII 5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL、cDNA模板2μL，10μmol/L的引物FMDV-F和FMDV-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL。

9.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃20s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

10.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或阳性对照分别为1μL或空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。