CN108546779A

CN108546779A - 牛轮状病毒的rpa-侧流层析检测引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN108546779A
Application number: CN201810360516.5A
Authority: CN
Inventors: 何洪彬; 王洪梅; 贺文琦; 赵贵民; 侯佩莉
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2018-04-20
Publication date: 2018-09-18

Abstract

本发明公开了一种RPA‑侧流层析检测BRV的引物、探针及试剂盒，所述试剂盒中包含有由用于通过RPA技术检测BRV的引物探针液，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。本发明所使用的引物探针组RPA扩增效果好，条带特异性强，与其他病毒无交叉反应，在检测区的有强阳性反应，增加了检测的灵敏性。本发明系首次采用RPA‑侧流层析技术建立快速检测牛BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

Description

牛轮状病毒的RPA-侧流层析检测引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(LateralFlowAssay)检测牛轮状病毒的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

牛轮状病毒腹泻是由轮状病毒感染(Bovine rotavirus，BRV)引起的一种腹泻病，主要感染1～7日龄的犊牛，可引起犊牛消化道机能紊乱，以精神沉郁、厌食、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱为主要临床特征。由于轮状病毒引起的肠细胞损伤更有利于产毒素性大肠杆菌和沙门氏菌等病源微生物的附着和感染，这种混合感染和继发感染将导致更严重的腹泻和更高的死亡率。随着我国奶牛养殖集约化规模化程度的提高，犊牛腹泻常年散发甚至爆发，发病率为16.5～91.7％，死亡率为20～50％，由于治疗成本的增加和生长发育率的降低，造成了巨大的经济损失，严重影响了我国奶牛养殖业的健康持续发展。

目前该病的诊断方法主要有病原分离、PCR方法等技术，由于这些方法需要精密的仪器以及繁琐的试验程序，难以满足非实验室环境下现场检测的要求。因而亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为临床现场检测及疫情流行病学调查提供新一代的检测技术与手段。

重组酶聚合酶扩增(recombinase ploymerase amplification,RPA)技术是不同于PCR的核酸检测技术，RPA是在重组酶介导下模拟体内DNA的复制过程。重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物后，寻找到双链DNA同源序列，在单链DNA结合蛋白的作用下，模板DNA解链，引物与模板DNA配对，在链置换DNA聚合酶的作用下复制、扩增，单个DNA模板分子得到大约10¹²扩增产物。它与PCR不同，不需要退火反应过程，可在37℃～42℃等温条件下，反应20余min即可得到扩增产物(Forgetet al.,2012)。RPA可以与侧向流动免疫层析技术相结合，在RPA扩增体系中，需要生物素标记的反向引物和荧光基团标记的探针，在距荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被nfo核酶识别、切割，产生新的羟基末端，并在DNA聚合酶作用下延伸，形成带有生物素和荧光基团双标记的RPA产物，通过层析膜扩散，被生物素配体和荧光基团标记抗体捕获，形成具有颜色的检测线。该方法检测时间短，5min左右就能目测结果，肉眼判读。

本发明系首次采用RPA技术建立快速检测BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

发明内容

针对RPA-侧流层析技术应用于BRV检测领域的空白，本发明提供了一种检测BRV的RPA-侧流层析引物探针组合物、试剂盒及一种基于RPA-侧流层析检测BRV的方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明目的之一在于提供一种RPA-侧流层析检测BRV引物和探针组合物，其正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

正向引物BRV-F：5’-AAAGTTAGGACCAAGGGAGAACGTAGCAGT-3’，(SEQ ID No.1)；

反向引物BRV-R：5’-[Biotin]CACATCATACAATTCTAATCTAACATGCACCTAC-3’，(SEQID No.2)；

探针序列BRV-P：5’-[FAM]ACACGGTAGTGGATTACGTCAATCAGATAATT[dSpacer]AGACAATGTCCAAAAGA[C3-spacer]-3’；(SEQ ID No.3)。

需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

本发明相应的保护上述引物和探针组合在制备牛轮状病毒检测试剂中的应用。

本发明目的之二在于提供一种检测BRV的试剂盒，该试剂盒中包含上述引物和探针组成的引物探针液。

优选的，所述引物探针液的组成为：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，检测探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增BRV核苷酸序列片段为SEQ ID NO.4。

优选的，该试剂盒中还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析检测试剂。

优选的，所述标准阳性质粒为T₃-BRV-VP7，用于BRV检测的阳性对照，检验相应的反应体系和反应条件能否正常反应。

优选的，所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20)。

优选的，所述无菌双蒸水可作为阴性对照或补足反应体系用，其制备方法为双蒸水经高压灭菌后，分装到灭菌的小管中。

所述的缓冲液、酶扩增八联管、反应驱动液于市场购买得到。

具体的，一种检测BRV的试剂盒，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、BRV的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或以阳性标准质粒为阳性对照分别为1μL或以无菌双蒸水为空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。

本发明的目的之三在于提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BRV的方法，步骤如下：

(1)提取待测样本的总RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA；

(2)设计用于BRV检测的引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，上述扩增反应，反应体系为50μL：10×PCR Buffer II(Mg2+Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物VP7-F和VP7-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL；反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。优选的，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有BRV核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有BRV核酸。

本发明的有益效果：

(1)本发明系首次采用RPA-侧流层析技术建立快速检测牛BRV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BRV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

(2)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对BRV临床样本进行了检测，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

本发明选用的BRV VP7基因引物是经大量实验筛选获得的，特异性好，与引起犊牛腹泻的其它病原包括牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡糖球菌(S.aureus)无交叉反应。

RPA能够将痕量的核酸模板扩增到可以检出的水平，本发明筛选得到的探针在检测区能够形成高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应，从而增加检测的灵敏性，本发明所建立检测方法可检测3个拷贝的BRV粒子。

(2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测BRV的方法，既具有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简便的优点，还不需复杂仪器，尤其适于基层实验室和现场的BRV快速筛查检测。

(3)检测速度快：与常规PCR相比，不经过变性、退火、延伸三个步骤，RPA反应的最适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下20min左右即可完成反应。

(4)不需要复杂的仪器设备，适用于现场检测。本发明所建立检测方法可以在常温等温条件下扩增、试纸条可视化检测，不要PCR仪、荧光定量PCR仪、电泳仪、电泳槽等复杂的仪器设备，而且RPA不需复杂的样品处理，可以真正实现便携式的现场快速核酸检测。

附图说明

图1BRV的RPA引物、探针组的琼脂糖凝胶电泳结果图；

其中1为F1/R1/P1引物探针组，2为F1/R1/P2引物探针组，3为F1/R2/P1引物探针组，4为F1/R2/P2引物探针组，5为F2/R1/P1引物探针组，6为F2/R1/P2引物探针组，7为F2/R2/P1引物探针组，8为F2/R2/P2引物探针组，9为F3/R3/P3引物探针组，10为F4/R3/P3引物探针组，PC为阳性对照，NC为阴性对照，M为DNA Marker DL2000；

图2BRV的RPA引物、探针组的侧流层析试纸条结果图；

其中1为F1/R1/P1引物探针组，2为F1/R1/P2引物探针组，3为F1/R2/P1引物探针组，4为F1/R2/P2引物探针组，5为F2/R1/P1引物探针组，6为F2/R1/P2引物探针组，7为F2/R2/P1引物探针组，8为F2/R2/P2引物探针组，9为F3/R3/P3引物探针组，10为F4/R3/P3引物探针组，PC为阳性对照，NC为阴性对照

图3BRV的RPA反应温度的筛选结果图；

图4BRV的RPA反应时间的筛选结果图；

图5RPA灵敏的性琼脂糖凝胶电泳结果图；

图6RPA灵敏性的侧流层析试纸条检测结果图；

图7RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性试验，检测病原分别为牛轮状病毒(BRV)牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡糖球菌(S.aureus)；

图8部分临床样本的RPA侧流层析试纸条检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

TwistAmp nfo Kits购自TwistDX公司，Genline Hybridetect-1lateral flowstrips购自Milenia GmbH(Germany)，反转录试剂盒(Code No：D2639A)购自宝生物工程(大连)有限公司，临床样本的DNA/RNA提取使用Punch-it^TMNA-Sample Kit(Nanohelix,Daejeon,South Korea)；检测引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

一、阳性标准质粒的制备

1.引物的设计与合成

通过对GeneBank中BRV VP7基因进行序列比对，确定保守区域，设计1对引物VP7-F：5’-TCCGTCTGGCTAGCGGTTAG-3’(SEQ ID NO.5)；VP7-R：5’-ACATGCACCTACACTATAGTAG-3’(SEQ ID No.6)，扩增出PCR片段(序列表中的SEQ ID No.7)，用于阳性标准质粒的构建；所有引物由上海生工生物技术有限公司合成。

2.BRV cDNA的制备

参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取BRV RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。

3.阳性质粒的制备

以上述方法制备的cDNA为模板，进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×PCRBufferII(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物VP7-F和VP7-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

BRV的PCR扩增产物为1017bp(SEQ ID No.7)，经1％琼脂糖凝胶电泳，分别回收，克隆至pEAST-T₃载体连接，转化，蓝白斑筛选，挑取白色菌落，进行菌落PCR验证。将阳性重组菌在LB中培养过夜，试剂盒提取质粒DNA，送交上海生工生物工程有限公司测序，将测序正确的重组菌培养过夜，提取质粒DNA，获得阳性质粒，命名为T₃-BRV-VP7。

二、BRVRPA侧流层析试纸条检测方法的优化与建立

1.RPA引物与探针的设计

RPA扩增的关键在于扩增引物和探针的设计。有关RPA引物和探针设计相关数据少，目前尚无用于设计的软件或成熟的原则。PCR引物并不适用于RPA，RPA引物比一般PCR引物长约30-35bp。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度；而引物长度增加容易形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加。因此，用于RPA扩增的引物需要经过大量的实验进行筛选与优化。

一般情况下引物、探针的设计需参考以下因素：(1)GC含量在40％～60％；

(2)尽量避免引物内部出现二级结构；(3)避免引物出现重复序列。

RPA探针的长度一般46～52个碱基，尽量避免与引物重叠、形成异二聚体。探针5’端标记FAM基团，中间THF替代G或C(dSpacer)，且dSpacer两侧尽量避免G、C，dSpacer修饰与5’端至少30碱基，与3’端至少15碱基，3’端C₃-spacer修饰。

本实施例针对BRV VP7基因的保守区设计了一系列的RPA引物与探针，具体见表1。

表1针对BRV VP7基因保守区设计的RPA引物与探针

2.利用RPA扩增反应筛选引物和探针

以10⁷拷贝的T₃-BRV-VP7为模板，RPA方法扩增BRV的VP7基因。具体步骤：

(1)于离心管管底中分别加入引物探针组：其中上下游引物各2.1μL(10μmol/L)、LF探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，T₃-BRV-VP7载体1μL，用ddH₂O补足到体积47.5μL混匀；每个引物探针组均设立阴性对照。

(2)将47.5μL缓冲液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联管中，反复吹打至完全溶解。

(3)向每个反应管液体内加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)溶液，混匀后反应即刻发生。

(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min。

(5)反应4min后，取出反应管，再次混匀后继续放入38℃的恒温水浴锅中反应20min。

(6)取检测管，在其中加入扩增产物1μL和49μL的产物稀释液，混合均匀后，放入检测试纸条，3～5min后，通过试纸条的显色进行判读。

3.引物和探针的筛选结果

表1所示的BRV引物探针组经RPA扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，引物探针组9：F3/R3/P3的RPA扩增效果最好，条带特异性好，没有非特异性扩增；而其它探针引物对出现非特异性扩增、没有目的条带、探针和下游引物扩增效率低等问题经过试纸条检测(图1)；RPA扩增产物经侧流层析试纸条检测，质控区均出现条带，引物探针组9：F3/R3/P3的RPA产物在检测区的颜色最深，表明引物探针组9形成了较高浓度的引物-探针异二聚体，因而使试纸条呈现强阳性反应；而其它引物探针组虽然也能在试纸条的检测区出现阳性条带，但检测颜色较浅，表明所形成的引物-探针异二聚体效率低，且结合琼脂糖凝胶电泳数据有非特异性扩增，因而这些引物探针对不能应用于RPA的检测。因此，选用引物探针组9：F3/R3/P3进行后续的RPA反应条件优化、特异性和敏感性试验，并将引物探针分别命名为BRV-F、BRV-R、BRV-P。

4.RPA扩增反应体系的优化

按表2所示，进行BRV-F、BRV-R、BRV-P使用量的优化，优化结果表明，上下游引物各为2μL、探针为0.6μL，效果较好。另外，还针对醋酸镁的使用量设置了7个浓度梯度。在RPA反应体系中加入浓度为280mM/μL醋酸镁的量分别为0.5μL、1μL、1.5μL、2μL、2.5μL和3μL，结果显示，醋酸镁用量过少将导致扩增的失败，反应体系中加入1μL及以上醋酸镁可以得到的扩增产物，并且产物随着醋酸镁量的增加而增加，但添加2.5μL和3μL的醋酸镁差别不明显。最终确定反应体系中加入2.5μL醋酸镁。

经优化后的RPA反应体系为：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。

另外，还对RPA反应时间、反应温度进行优化，分别使用30℃、34℃、38℃、42℃、45℃和48℃进行RPA反应温度进行优化，反应温度38℃的RPA扩增效率最高(图3)；分别经5min、10min、15min、20min、25min、30min进行RPA反应时间进行优化，反应时间20min及以上时间，可以达到较好的扩增效率，优化的RPA反应时间为20min(图4)。

表2RPA反应引物和探针使用量组合优化表

三、BRV RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度、重复性、特异性检测

1.RPA侧流层析试纸条检测方法的灵敏度分析及重复性检测

将标准阳性质粒T₃-BRV-VP7经PBS进行10倍系列稀释3×10⁶～3拷贝和1个拷贝，应用试剂盒提取病毒的RNA，反转录cDNA；以优化的RPA条件进行RPA扩增，反应体系为：上下游引物各2.0μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，用ddH₂O12.4μL，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo八联反应管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的醋酸镁(280mmol/L)启动反应。38℃4min，混匀后，再38℃20min。

上述每个梯度的模板浓度做3个重复，通过RPA侧流层析试纸条检测，验证RPA侧流层析试纸条技术的批内重复性；另外，每间隔2d重复一次，共进行3次重复，验证RPA侧流层析试纸条技术的批间重复性。所获得的RPA产物分别进行侧流层析试纸条检测。结果表明，RPA-LFD的检测限为5个拷贝(图5)。

2.RPA侧流层析试纸条检测方法的特异性分析

参照细菌DNA提取试剂盒，提取大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(Salmonella)、金黄色葡糖球菌(S.aureus)的DNA；参照病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，分别提取IBRV的DNA和BRV、BVDV、BEV、BCov的RNA，参照反转录试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。

按照上述步骤建立RPA方法进行特异性试验，分别以IBRV的DNA，BVDV、BEFV、BCoV、VSV、BRSV的cDNA为模板，以ddH₂O为阴性对照，进行RPA扩增，试验重复3次。

所有的RPA产物进行侧流层析试纸条检测，如图7所示，从图中可以看出，RPA扩增BRV特异性好，与其它检测病毒无交叉反应。因此，引物探针组BRV-F、BRV-R、BRV-P，可以用于建立检测BRV的RPA侧流层析试纸条方法，适用于鉴定未知样本BRV的检测。

四、RPA侧流层析检测试剂盒的组装与灵敏度、重复性试验

将引物BRV-F、BRV-R各200μL、探针BRV-P 60μL混合，分装50μL/管，标准阳性质粒T₃-BRV-VP7分装，分装50μL/管，作为阳性对照；然后与缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、侧流免疫层析试纸条、产物稀释液组装成RPA侧流层析检测试剂盒。

利用所组装的RPA侧流层析检测试剂盒，按实施例3中T₃-BRV-VP7载体的5拷贝进行灵敏度检测，反应体系为：引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA1μL，ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，用移液器反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。做三个重复，取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。结果表明，所组装的RPA侧流层析检测试剂盒可检测到的5拷贝的T₃-BRV-VP7，试验重复3次。

五、临床样本的检测

1.临床样本的采集

采集犊牛腹泻的肛拭子样本，将其放于含有5mL PBS的离心管内保存用于检测。

2.利用现场提取试剂盒Punch-it^TM NA-Sample Kit快速提取临床样本的RNA

(1)在1.5mL的离心管中，加入50μL的裂解液，再加入10μL的样本，均匀混合；

(2)将上述裂解液加入到试剂盒的样本孔内，直到溶液完全被滤膜所吸收；

(3)在滤膜上加入200μL的洗涤液3-5min；

(4)从样本孔滤膜取下1mm大小的滤膜进行待检。

3.反转录制备cDNA

参照反转录试剂盒说明书进行反转录，5×RT buffer 2μL、随机引物1μL、AMV反转录酶1μL、ddH₂O 5μL、含有RNA的1mm大小滤膜。30℃10min，42℃30min，95℃5min，将反应管置于冰上。

4.临床样本的检测

待测样本为经本实验室利用荧光定量方法检测的犊牛腹泻肛拭子样本58份，其中BRV阳性样本42份，阴性样本16份。利用现场提取试剂盒Punch-it^TMNA-Sample Kit快速提取总RNA，反转录cDNA。以提取的58份样本的cDNA分别为模板，以阳性质粒为阳性对照、ddH₂O为阴性对照，利用实施例4组装的RPA侧流层析检测试剂盒进行BRV的检测。反应体系如下：引物探针液4.6μL，缓冲液29.5μL，模板cDNA 1μL，ddH₂O 12.4μL，将上述混合液加入到酶扩增八联管中，反复吹打直到完全溶解。最后加入2.5μL的反应驱动液启动反应。38℃4min，混匀后，38℃20min。取1μL的RPA扩增产物用49μL的产物稀释液稀释，侧流免疫层析试纸条进行检测。若试纸条的检测区出现阳性检测条带，则待测样本中含有BRV；若试纸条的检测区未出现阳性检测条带，待测样本中没有BRV病原体。

经RPA侧流层析检测试剂盒检测，呈BRV阳性的样本42份，呈阴性的样本16份(图8)，此结果与SYBR Green I荧光定量PCR检测结果对照，结果完全一致。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 牛轮状病毒的RPA-侧流层析检测引物、探针及试剂盒

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaagttagga ccaagggaga acgtagcagt 30

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacatcatac aattctaatc taacatgcac ctac 34

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acacggtagt ggattacgtc aatcagataa ttcagacaat gtccaaaaga 50

<210> 4

<211> 262

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaagttagga ccaagggaga acgtagcagt catacaggta ggcggcgcaa acattttaga 60

catcacagct gatccaacaa ctacaccaca gacagagaga atgatgcgaa taaattggaa 120

aaaatggtgg caagtgtttt acacggtagt ggattacgtc aatcagataa ttcagacaat 180

gtccaaaaga tctagatcgt ttaattcgtc ggcgttctac tatagagtgt aggtgcatgt 240

tagattagaa ttgtatgatg tg 262

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tccgtctggc tagcggttag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acatgcacct acactatagt ag 22

<210> 7

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccgtctggc tagcggttag ctcattttaa tgtatggtat tgaatatacc acaattctaa 60

tcttcttgac atcgattaca ttattgaatt atatgttaaa atcaataacg agaataatgg 120

actatataat ttacagattt ctgcttatag tagtgatctt ggccaccata ataaatgcgc 180

aaaactatgg agtaaatttg ccaattacag gttcaatgga tactgcgtat gcagactcta 240

cacaaagtga gccatttttg acatcaaccc tttgtttgta ttatcctgtt gaggcatcaa 300

acgaaatagc tgatactgaa tggaaagata ccttatcaca actgttctta acaaaaggat 360

ggccaacagg atcagtgtac cttaaagaat atgctgatat agcggccttt tcagtggaac 420

cacagttata ctgcgattat aatttagttt taatgaaata tgactctaca caagaactag 480

atatgtctga attggccgat cttatattga acgaatggct gtgcaatcca atggacataa 540

cgctatatta ttatcagcag actgatgaag caaataaatg gatatcaacg ggctcttctt 600

gcacggttaa agtgtgtcca ttaaatacac aaacacttgg tattggatgt ctaataacta 660

atccagacac gtttgaaaca gttgcgacaa cggagaagtt atgattacag atgttgtaga 720

tggtgtcaat cacaaattaa acgtcacaac ggcaacgtgc accatacgca actgtaaaaa 780

gttaggacca agggagaacg tagcagtcat acaggtaggc ggcgcaaaca ttttagacat 840

cacagctgat ccaacaacta caccacagac agagagaatg atgcgaataa attggaaaaa 900

atggtggcaa gtgttttaca cggtagtgga ttacgtcaat cagataattc agacaatgtc 960

caaaagatct agatcgttta attcgtcggc gttctactat agagtgtagg tgcatgt 1017

Claims

1.一种RPA-侧流层析检测BRV的引物和探针组合，其特征在于，正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的引物和探针组合在制备牛轮状病毒的检测试剂中的应用。

3.一种检测BRV的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含由权利要求1所述的引物和探针组成的引物探针液。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针液的组成：正向引物和反向引物终浓度均为0.4μmol/L，探针的终浓度为0.12μmol/L，扩增BRV核苷酸序列片段为SEQID NO.4。

5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括有：标准阳性质粒、缓冲液、酶扩增八联管、无菌双蒸水、反应驱动液、产物稀释液和侧流层析试纸条。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标准阳性质粒为T₃-BRV-VP7，由SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6扩增的核苷酸序列片段SEQ ID NO.7与pEASY-T₃载体相连接后得到的重组质粒。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，每50μL扩增体系中含有缓冲液29.5μL、BRV各种型相应的引物探针液4.6μL、无菌双蒸水12.4μL、待测样本cDNA或以标准阳性质粒为阳性对照分别为1μL或以无菌双蒸水为空白对照1μL、反应驱动液2.5μL。

8.一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BRV的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)提取待测样本的总RNA，反转录获得cDNA；

(2)设计用于BRV检测的引物和探针，以cDNA为模板，进行RPA扩增，扩增条件为：38℃水浴4min后，混匀，再38℃水浴20min；

其特征在于，所述引物的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ IDNo.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；

(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中RPA扩增，反应体系为50μL：10×PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、rTaq 0.5μL(5U/μL)、cDNA模板2μL，分别加入10μmol/L的引物VP7-F和VP7-R各2μL，灭菌超纯水加至50μL；反应程序为94℃预变性3min，然后94℃20s，55℃40s，72℃20s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)中应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，当试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有BRV核酸；当试纸条只有质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含有BRV核酸。