CN105018646B

CN105018646B - 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒

Info

Publication number: CN105018646B
Application number: CN201510458700.XA
Authority: CN
Inventors: 何洪彬; 侯佩莉; 王洪梅
Original assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Current assignee: Dairy Cattle Research Center Shandong Academy of Agricultural Science
Priority date: 2015-07-30
Filing date: 2015-07-30
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2035-07-30
Also published as: CN105018646A

Abstract

本发明涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术检测牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)所用的引物和探针组合及其试剂盒。本发明通过引物设计及筛选获得特异性的RPA引物和探针组合，利用RPA技术对BEFV进行检测，实现了较高的灵敏度、特异性和重复性；本发明只需对临床样本进行cDNA合成，且恒温扩增，不需要热循环反应，扩增阶段不需要特殊的仪器；结果可通过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短时间内即可完成BEFV的临床现场检测。

Description

一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Ploymerase Amplification，RPA)并结合侧流层析技术(Lateral FlowAssay)检测牛流行热病毒所用的引物和探针组合及其试剂盒。

背景技术

牛流行热是由牛流行热病毒(Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV)引起的牛的急性、热性传染病。该病来势猛、传播快、发病率高，常于开始发病后10天内引起大区域流行。发病奶牛产乳量和奶质下降，种公牛精液质量受损，部分怀孕母牛流产，有的病牛瘫痪甚至死亡，给养牛业造成严重的经济损失。近年来，该病在我国频繁发生，部分地区的阳性率高达81％，严重制约了养牛业的持续健康发展，在农业部2014年印发的《牛羊常见疫病防控技术指导意见》文件中将其列为牛重点防控的疫病。

目前检测BEFV的主要方法有病毒分离、免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、血清中和试验、电镜检查等，但这些方法不仅操作繁琐复杂、耗时耗力，而且难以用于BEFV的现场诊断。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的检测技术与手段。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是不同于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶参与。其原理是利用重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，形成新的DNA互补链，对模板上的目标区域进行指数式扩增。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要。在RPA扩增体系中加入一个生物素标记的反向引物和5’荧光标记的探针，探针标记的荧光基团30个碱基处有一个脱碱基位点(dSpacer)，该位点是DNA修复酶作用的底物，可被核酶nfo识别切割，产生新的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下进行复制延伸，从而使双标信号与扩增产物的累积同步，检测结果可在抗FAM金标结合和抗生物素捕获抗体的侧流层析试纸条上显示。

目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，将RPA技术应用于BEFV检测还未见报道。

发明内容

本发明首次采用RPA结合侧流层析技术建立快速检测BEFV的方法，并通过特异性和灵敏度评价，可用于临床现场检测，为BEFV的现场检测提供一种灵敏、可靠的新方法。

针对RPA侧流层析技术应用于BEFV临床现场快速检测领域的优点，本发明提供了一种准确、快速、简便检测BEFV的RPA检测方法。仅需通过对临床样品进行病毒RNA的提取，以及一步法反转录成cDNA后进行等温扩增，不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，结果可在侧流层析试纸条上清晰显示，具有灵敏度高、特异性强、反应程序简单、检测时间短等优点，适用于牛场快速、准确、简便的进行BEFV的诊治。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种用于通过RPA技术检测BEFV的引物和探针组合，其正向引物序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示。

正向引物：5’-AGGATGGAGAATGGTGGAGTATAGAAAACC-3’；(SEQ ID No.1)

反向引物：5’-【Biotin】CTCGTGGGAGCCAAGTAAGACATATCTAATGT-3’；(SEQ ID No.2)

探针序列：5’-【FAM】AGGATGCACACAGATAGAACAGAGTTTGAA【dSpacer】AATTAGATATTAAGGC【C3-spacer】-3’(探针5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断)。(SEQ ID No.3)

需要说明的是：与常规PCR反应不同，RPA反应所需引物的长度通常为30-35bp，探针序列的长度为46-52bp，引物设计时为了避免形成引物内部及之间的二级结构，其长度的增加也使引物设计及选择难度的增加，因此，引物的设计和选择对RPA的结果至关重要。RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。因此，本发明的引物和探针组合是需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化、筛选才能得到。

本发明还提供了一种检测BEFV的试剂盒，该试剂盒中包含有用于通过RPA技术检测BEFV的引物和探针组合。

进一步的，该检测试剂盒中还包括有：BEFV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。BEFV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水与引物和探针组合一起构成RPA扩增体系。

所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白(SSB)、280mM醋酸镁(MgAc)溶液。

所述RPA侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液(1×PBS+0.1％Tween20)。

所述BEFV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对的上游和下游设计引物:

上游引物:5’-ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTG-3’(SEQ ID No.4)；

下游引物:5’-TTAATGATCAAAGAACCTATCATCAC-3’(SEQ ID No.5)；

以BEFV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LA PCR Buffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为：94℃预变性3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃2min，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体(该载体为常规的载体，商业化购买到)，蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BEFV阳性对照模板。

具体的，一种检测BEFV的试剂盒，每50μL RPA扩增体系中含有正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，BEFV阳性对照模板2μL，Rehydration缓冲液29.5μL，去离子水11.2μL和醋酸镁溶液(280mM)2.5μL。

本发明还提供一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BEFV的方法，步骤如下：

(1)应用快速提取病毒RNA试剂盒提取样品中或样品病毒培养上清液的RNA，按照Fermentas RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RT-PCR反应，获得BEFV的cDNA模板；

(2)根据BEFV保守区域设计RPA特异性引物和探针，向RPA扩增试剂盒推荐反应的50μL扩增体系中加入正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，模板DNA 2μL，29.5μLRehydration缓冲液，11.2μL去离子水和2.5μL醋酸镁溶液(280mM)，于含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo反应管中，恒温水浴锅内38℃反应25分钟；

(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。

上述检测方法不仅可用于BEFV的现场检测，还包括非疾病的BEFV检测，包括环境气溶胶样本中BEFV的检测。

应用上述方法可以筛选出一套可快速有效检测出BEFV成分的引物及探针组合。

将已知病毒滴度为1.0×10⁵TCID₅₀/mL的BEFV用DEPC水进行10倍系列稀释后，提取RNA并进行反转录后进行检测，结果显示可以检测到1TCID₅₀的靶标分子，证明该方法具有较高的灵敏度。

以1.0×10²TCID₅₀BEFV样品的cDNA作为模板，利用上述的引物和探针进行RPA等温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，而以其它病毒的DNA或cDNA为模板扩增均仅显示对照带，表明该方法具有较好的特异性。

以合成的1TCID₅₀BEFV样品的cDNA作为模板，按照上述所述的引物和探针进行RPA等温扩增，每个模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果表明每组相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具有较好的重复性。

本发明的有益效果：

(1)采用本发明的引物和探针组合，通过RPA技术对BEFV进行检测的方法，具有较高的灵敏度、特异性和重复性。

(2)本发明的RPA技术并结合侧流层析技术检测BEFV的方法，既可用于临床血液、组织等临床常规样本的检测，也可对病毒微量样本进行检测。本发明只需对临床样本进行cDNA合成，且恒温扩增，不需要热循环反应，扩增阶段不需要特殊的仪器；结果可通过视觉直观检测，不需要检测仪，且反应速度快，敏感性高，可在非实验室环境下短时间内即可完成BEFV的临床现场检测。

附图说明

图1为BEFV RPA侧流层析方法的建立，其中，1：RPA试剂盒提供模板、引物及探针组合作阳性对照；2：BEFV阴性对照，模板为H₂O；3：BEFV cDNA扩增。

图2为BEFV灵敏度检测，其中，1：BEFV阳性对照；2：BEFV阴性对照；从3到9模板依次为BEFV病毒滴度为1.0×10⁵-1.0×10^-1TCID₅₀。

图3为BEFV特异性检测，其中，1：牛流行热病毒(BEFV)；2：牛肠道病毒(BEV)；3：牛冠状病毒(BcoV)；4：牛轮状病毒(BRV)；5：牛副流感3型病毒(BPIV-3)；6：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；7：牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)。

图4为BEFV重复性检测，模板为1TCID₅₀的BEFV cDNA。

图5为临床样本检测，其中，1：BEFV阳性对照；2：BEFV阴性对照；3-7：BEFV阳性样本；8-14：BEFV阴性样本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

下面实施例中所用一些材料和试剂如下：分子生物学试剂，TwistAmp nfo Kits购自TwistDX公司；Genline Hybridetect-1lateral flow strips购自Milenia GmbH(Germany)；LA Taq DNA Polymerase，病毒DNA/RNA提取试剂盒(Code No.：9766)购自宝生物工程(大连)有限公司；RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit(目录号：K1622)购自Fermentas公司；pEASY-T3Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司；其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。引物和探针由上海生工生物技术有限公司合成。

仪器包括：恒温水浴锅、离心机、涡旋仪、分光光度计和纯水仪等。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规的条件，例如Sambrook等的《分子克隆：实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001)中所述条件，或按照仪器或试剂制造厂商所建议的条件进行操作。

实施例1：引物和探针的设计与筛选

引物和探针的有效设计是决定实验成功的最关键环节。然而，RPA技术正处于起步研究阶段，尚无专门的引物、探针设计软件，也没有大量的数据为其引物设计原则提供依据。目前实验中需要从靶标序列两端设计多对引物进行优化，筛选，该技术引物设计要求极其严格，个别碱基的替换或增减都会对实验结果产生重要影响。设计时通常需要考虑以下几个因素：(1)引物长度要求为30-35bp，探针长度要求为46-52bp，GC含量在40％-60％，避免引物内部出现二级结构且避免引物出现重复序列。(2)检测扩增片段小于500bp。(3)避免引物和探针之间形成二聚体，影响结果的准确性。

本实验中依据GenBank中发表的BEFV G基因的保守序列设计了4条探针，在每条探针的两侧分别设计了多对上游引物和下游引物。以病毒RNA快速提取试剂盒提取细胞培养病毒的基因组RNA，反转录合成的cDNA为模板，对设计的不同引物、探针组合进行RPA扩增筛选，同时以去离子水为模板作阴性对照，以RPA扩增试剂盒提供的模板、引物和探针组合做阳性对照，最终选出一对扩增产物能在侧流层析试纸条中显示清晰的检测条带和对照条带(图1)，筛选出的引物和探针序列见SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3(表1)，设计的其它引物和探针组合对照组见表2。

表1 筛选得到的引物和探针序列

3’注：探针5’-端用FAM标记，距离5’端30个碱基左右的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断。

Biotin：生物素；FAM：发光基团；dSpacer：脱碱基位点；C3-spacer：聚合酶延伸阻断基团。

表2 设计的引物和探针序列对照组

实施例2：实验室BEFV RPA扩增检测方法的建立与考察

1.实验室BEFV RPA扩增检测方法的建立

1.1BEFV基因组cDNA的合成

取200μL细胞培养病毒上清液，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取病毒的RNA，溶解在50μL RNAase-free水中。按照Fermentas RevertAid^TM First Strand cDNASynthesis Kit说明书进行RT-PCR反应，获得BEFV cDNA。

1.2RPA扩增

本实施例中应用PRA方法扩增BEFV特异序列，具体步骤为：

(1)向离心管中加入实施例1设计的上下游引物各2.1μL(10μmol/L)，LF探针0.6μL(10μmol/L)，Rehydration缓冲液29.5μL，模板DNA 2μL，用ddH₂O补足到体积47.5μL，漩涡混匀后短暂离心；见表2。

表2 RPA扩增体系

(2)将47.5μL上述混合液转移到含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo反应管中，用移液器反复吹打直到整个冻干三种混合酶颗粒溶解；

(3)向每个反应管中加入2.5μL(280mmol/L)的醋酸镁溶液，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，反应立即发生；

(4)将反应管放入38℃的恒温水浴锅中，处理4min；

(5)反应4min后，取出反应管，用力上下颠倒漩涡混匀8-10次，短暂离心后放入38℃的恒温水浴锅中继续反应21min，得RPA反应产物。

1.3侧流层析试纸条进行扩增产物检测

取一定数量的侧流层析试纸条(dipstick，Milennia GenLine HybriDetectMGHD1)，针对不同检测样本号进行标记。每一个检测样本取98μL杂交检测缓冲液(HybriDetect Assay Buffer)，加入反应管中。取2μL杂交反应产物(RPA反应产物)在离心管中混匀，杂交反应液和杂交检测缓冲液共100μL。将试纸条的样品反应区加入反应液，孵育5分钟，孵育结束后，从反应液中取出试纸条，立即观察。如果试纸条反应区显示两条可见条带，则检测样本为阳性；如果试纸条反应区对照线显示清晰，检测线未见条带，则检测样本为阴性。

2.BEFV RPA扩增检测方法的考察

2.1BEFV RPA扩增检测方法的敏感性考察

将已知病毒滴度为1.0×10⁵TCID₅₀/mL的BEFV病毒液用DEPC水进行10倍系列稀释后，应用上述提供的方法合成BEFV cDNA，分别吸取2μL BEFV cDNA为模板，按“1.2引物扩增”操作方法进行扩增，取2μL杂交反应产物(RPA反应产物)在侧流层析试纸条上显示，结果表明，可以检测到1TCID₅₀的靶标分子(图2)，说明用本发明设计的引物检测BEFV具有较高的灵敏度和准确性，且操作简便。

2.2BEFV RPA扩增检测方法的特异性考察

取200μL牛副流感3型病毒(BPIV-3)滴度为6.23×10^5.6TCID₅₀/mL、牛肠道病毒(BEV)滴度为4.1×10^7.8TCID₅₀/mL、牛冠状病毒(BcoV)滴度为5.8×10^6.5TCID₅₀/mL、牛轮状病毒(BRV)滴度为2.3×10^7.0TCID₅₀/mL和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)滴度为2.0×10⁵TCID₅₀/mL的细胞培养毒，参照病毒RNA提取试剂盒说明书，提取RNA，溶解在50μL RNAase-free水中。按照Fermentas RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行RT-PCR反应，获得上述病毒的cDNA模板，同时取滴度为8.0×10⁷TCID₅₀/mL牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)200μL，参照病毒DNA提取试剂盒说明书，提取50μL IBRV基因组DNA。

以1.0×10²TCID₅₀BEFV样品的cDNA作为阳性对照模板，利用实施例1优化筛选的引物和探针对BEV、BcoV、BRV、BPIV-3、BVDV的cDNA和IBRV的DNA进行RPA等温扩增，扩增产物在侧流层析试纸条进行检测。结果证实BEFV扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出检测带和对照带，而以其它病毒检测样本试纸条反应区仅对照线显示清晰，检测线未见条带，均为阴性(图3)。说明本发明的BEFV RPA扩增检测方法具有较好的特异性。

2.3BEFV RPA扩增检测方法的重复性考察

以合成的1TCID₅₀BEFV样品的cDNA作为模板，按照实施例1优化筛选的引物和探针进行RPA等温扩增，对该模板进行3次重复，扩增产物分别在侧流层析试纸条进行检测。结果证实相同量模板的扩增产物在侧流层析试纸条反应区显现出亮度相同的检测带和对照带，具有较好的重复性(图4)。

实施例3：临床样本BEFV检测

1.BEFV基因组cDNA的合成

分别取本实验室已建立的BEFV荧光定量RT-PCR鉴定为BEFV阳性牛的肺组织和全血样本5份和阴性样本7份，利用实施例2中“1.1BEFV基因组cDNA的合成”的方法合成BEFV基因组cDNA，用于RPA模板扩增。

2.临床样本侧流层析RPA检测

以制备的临床肺组织和全血样本的基因组cDNA分别作为模板，按照实施例2中步骤1中所述的RPA检测方法进行扩增。经RPA扩增，杂交产物在侧流层析试纸条显示，5份样本试纸条反应区显示对照条带和检测条带，表明5份临床样本中含有BEFV，结果与本实验其它方法检测的符合率为100％，结果如图5所示。

实施例4：用于BEFV检测的试剂盒

1.BEFV阳性对照模板制备

分别在实施例1筛选获得的引物对的上游和下游设计引物(上游引物:5’-ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTG-3’；下游引物:5’-TTAATGATCAAAGAACCTATCATCAC-3’)，以实施例2中1.1得到的BEFV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：10×LA PCRBuffer II(Mg²⁺Plus)5μL、2.5mM dNTP Mixture 8μL、LA Taq 0.5μL(5U/μL)、模板2μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，灭菌超纯水加至50μL。反应程序为：94℃预变性3min，然后进入94℃30s，55℃30s，72℃2min，共进行31个循环；72℃延伸10min，最后停止于4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体，蓝白斑筛选重组质粒，送华大基因进行测序，将测序结果进行比对，正确的重组质粒为BEFV阳性对照模板。

2.试剂盒的组成：实施例1筛选的引物和探针组合，BEFV阳性对照模板，RPA扩增Rehydration缓冲液，含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp nfo反应管，醋酸镁(280mM)、去离子水和侧流层析试纸条。

3.扩增体系：扩增体系为50μL，向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo反应管中加入正向引物、反向引物各2.1μL(10μmol/L)，探针0.6μL(10μmol/L)，BEFV模板2μL，29.5μLRehydration缓冲液，11.2μL去离子水和2.5μL醋酸镁(280mM)。

4.检测步骤：

4.1病毒cDNA的合成

利用实施例2中“1.1BEFV基因组cDNA的合成”的方法合成BEFV基因组cDNA，用于RPA模板扩增。

4.2RPA扩增

按照实施例2中“1.2BEFV RPA扩增”的方法进行RPA扩增，38℃恒温水浴锅内共反应25min。

4.3侧流层析试纸条进行检测

取2μL扩增产物，应用实施例2中“1.3侧流层析试纸条进行扩增产物检测”的方法进行检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性。

上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims

1.一种用于通过RPA技术检测BEFV的引物和探针组合，包括正向引物、反向引物、探针，其特征在于，正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示，其中反向引物序列5’-端用生物素标记；探针序列5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断；所述探针序列具体如下：5’-FAM-AGGATGCACACAGATAGAACAGAGTTTGAA-dSpacer-AATTAGATATTAAGGC-C3-spacer-3’。

2.权利要求1所述引物和探针组合用于制备BEFV检测的试剂盒、芯片、扩增反应试剂的应用。

3.包括权利要求1所述引物和探针组合的检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，检测试剂盒还包括BEFV阳性对照模板、RPA扩增试剂、去离子水和侧流层析检测试剂。

5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述RPA扩增试剂包括Rehydration缓冲液、大肠杆菌来源的recA重组酶、链置换DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、醋酸镁溶液；所述侧流层析检测试剂包括侧流层析试纸条，杂交检测缓冲液。

6.根据权利要求4或5所述试剂盒，其特征在于，所述BEFV阳性对照模板的制备方法为：分别在SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对的上游和下游设计下述引物:上游引物:5’-ATGTTCAAGGTCCTCATAATTACCTTG-3’；下游引物:5’-TTAATGATCAAAGAACCTATCATCAC-3’；以BEFV基因组cDNA为模板进行PCR扩增，回收目的片断后克隆至pEAST-T3载体。

7.一种应用RPA技术并结合侧流层析技术检测BEFV的方法，其特征在于，

(1)提取样品中或病毒培养上清液的RNA，进行RT-PCR反应，获得病毒的cDNA模板；

(2)根据BEFV保守区域设计RPA特异性正、反向引物和探针，进行RPA等温扩增；正向引物序列如SEQ ID No.1所示，反向引物序列如SEQ ID No.2所示，其中反向引物序列5’-端用生物素标记；探针序列如SEQ ID No.3所示；探针序列5’-端用FAM标记，距离5’-端30个碱基的位置处用dSpacer替代一个碱基，3’端用C3-spacer阻断；所述探针序列具体如下：

5’-FAM-AGGATGCACACAGATAGAACAGAGTTTGAA-dSpacer-AATTAGATATTAAGGC-C3-spacer-3’；

(3)应用侧流层析试纸条进行扩增产物检测，若侧流层析试纸条上显现出检测带和对照带，则检测结果为阳性，若试纸条仅显示对照带，则结果为阴性；

所述方法为非疾病的诊断方法。