CN102719566A - 检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒，该检测牛流行热病毒的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：3所示，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别为检测牛流行热病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO：3为检测牛流行热病毒的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测牛流行热病毒的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好、不易污染的特点。

Description

检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒

技术领域

本发明涉及基于荧光定量RT-PCR采用MGB修饰的短探针检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒，尤指快速的基于MGB修饰的短探针荧光RT-PCR检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒，适用于牛流行热的快速分子生物学诊断和检测，可用于牛流行热病毒的检测，出入境检疫等，属于动物检疫领域。 

背景技术

牛流行热（Bovine ephemeral fever，BEF）又名牛暂时热，牛三日热，僵硬病等。感染牛表现为急性发热、呼吸道和消化道机能障碍以及跛行和肢体僵直。发病率高，但死亡率低，通常为1％～2％。该病在发病地区呈周期性流行，跳跃式传播。病牛一般在3日左右(故名三日热)恢复。临床上与流行性感冒相似，故曾被称为牛流行性感冒。本病流行于非洲、亚洲和大洋洲以及中东的许多国家和地区。在北、南美洲及欧洲未曾有过报道。据记载,我国自1938年就有本病流行，但直到1976年才得到证实，并分离到病毒。牛流行热造成比较严重的经济损失。种公牛感染本病后，精子畸形率可能高达70%以上。奶牛的产奶量降低，牛乳质量下降，并可能长期不能恢复正常。役用牛则因跛行或瘫痪而不能使役。护理和治疗不当时，死亡率可能上升。 

牛流行热病原为牛流行热病毒（Bovine ephemeral fever virus，BEFV），属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）暂时热病毒属（genus Ephemerovirus）。牛流行热病毒呈子弹状或圆锥形。成熟病毒粒子长130～220nm，宽60～90nm。病毒粒子有囊膜，囊膜厚约10～12nm，表面具有纤细的突起。粒子中央为电子密度较高的核心—由紧密盘缠的核衣壳组成。如将核衣壳拉直，长达2.2μm。除典型的子弹形病毒粒子外，还常可以看到T粒子，即截短的窝窝头样病毒粒子，特别是在以高浓度病毒传代的细胞培养物内。于超薄切片中可以看到以出芽方式从胞膜或胞浆空泡膜上向细胞外或胞浆空泡内释放的病毒粒子。宿主细胞胞浆中有毒浆结构。胞浆内的结构变化显著，出现大量微管和微纤结构。牛流行热病毒在结构上与哺乳动物其它弹状病毒相似。含有负股单链RNA，长11kb左右，占病毒粒子总重的2%。牛流行热病毒有RNA聚合酶蛋白(L，180KDa)、糖蛋白(G，181KDa)、核蛋白(N，52KDa)、基质蛋白1(M1，43KDa)、基质蛋白2(M2，129KDa)即磷酸蛋白(NS)等5种结构蛋白。 

本病为非接触性传染病，主要由吸血昆虫进行传播，按蚊和库蠓是牛流行热的媒 介昆虫。在非洲肯尼亚本病流行地区的库蠓体内曾经分离到过病毒，在澳大利亚证明班按蚊和短跗库蠓也能携带病毒。这两个地区的流行毒株有相近的血清学关系。本病一般流行于夏末秋初，并受当地气候、河流和降雨量的影响。多发于吸血昆虫大量孳生的季节，采取灭蠓、灭蚊措施的牛场,牛的发病率明显低于不采取灭蠓灭蚊措施的牛场。 

根据临床症状和流行病学资料，对于本病不难作出初步诊断。牛流行热发生于夏末秋初，短期内广泛传播，但只发生于牛，特别是黄牛和奶牛。病牛明显发热，跛行或卧地不起，并有严重的呼吸困难，皮下常见气肿。为了确诊，可采病牛急性期血液或血沉管内的白细胞层，脑内接种乳鼠、乳仓鼠，常能分离到病毒。连续传代常可使潜伏期不断缩短：第一代约6～10天；第二代5天左右；至第6～8代，仅2～3天即可使乳鼠全部发病死亡。分离到病毒以后，即可应用乳鼠或细胞培养物与已知标准免疫血清进行中和试验鉴定之。血清学检查应用以感染鼠脑或经BHK-21细胞传代的病毒制造的抗原，检测病畜急性期和恢复期的双份血清做中和试验或补体结合试验或间接免疫荧光试验。Zakrzewski等(1994年)建立的检测牛流行热病毒特异性抗体的阻断ELISA法，由于采用针对该病毒糖蛋白G1抗原位点的单克隆抗体，只对牛流行热病毒发生结合反应，而与相关病毒(如Berrimah,Kimberley病毒等)无交叉反应，因此与病毒中和试验相比，敏感性更高，操作更简单。是目前诊断及检测临床牛流行热的方法之一。分子生物学检测方法由于快速简便，已经开始应用于牛流行热的快速诊断和检测，特别是荧光RT-PCR检测技术更为快速和特异，在牛流行热的快速诊断方面具有独特优势。 

本研究为保证方法的通用性，保证探针的匹配性，我们在大量序列分析基础上，在国内首次设计MGB修饰的短探针用于检测牛流行热病毒，缩短了探针的核苷酸数量，并提高了方法的灵敏度。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测牛流行热病毒核苷酸序列，包括引物序列和基于MGB修饰的短探针序列。 

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的基于MGB修饰的检测牛流行热病毒的检测试剂盒。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 

选择牛流行热病毒G蛋白基因编码区特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基 础上，进行引物和探针设计。引物长度为23个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。探针的长度为16个简并碱基。 

一组检测牛流行热病毒的核苷酸序列，如下： 

1）5’-GAT CAA ATG TCC ACA ACG TTT RA-3'（SEQ ID NO：1） 

2）5’-TGT TCA TCC TTT GCA AGA TTA TGA-3’（SEQ ID NO：2） 

3）5’-[FAM]-TTR TCA CTT CAR GCC C-[MGB]-3’（SEQ ID NO：3） 

其中R代表A或G；序列1）和2）分别为检测牛流行热病毒G基因的正义引物和反义引物，序列3）为检测牛流行热病毒G基因的MGB修饰的荧光短探针,探针的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭基团MGB。 

我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了牛流行热病毒检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。 

检测牛流行热病毒检测试剂盒，由以下组分组成： 

1）裂解液：购自INVITROGEN公司； 

2）RT-PCR反应液，表1为反应液配方； 

表1反应液配方 

组分	终浓度
		5×RT-缓冲液	1×RT-缓冲液
25mM MgCl2	1.0mmol/L
		2.5mM dNTP	0.05mmol/L dNTP
正义引物	0.4μmol/L
		反义引物	0.4μmol/L
MGB探针	0.2μmol/L

5×RT-缓冲液，25mM MgCl₂购于Promega公司；2.5mM dNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托上海基康生物工程有限公司合成，其中5×RT-缓冲液组成为375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、50mmol/L DTT、250mmol/L Tris-HCl（pH8.3，25℃）。 

3）反转录酶M-MLV，购自Promega公司，200U/μL。 

4)RNA酶抑制剂，购自Promega公司，40U/μL。 

5）Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司。 

6）DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水,Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。 

7）阴性对照：牛流行热病毒阴性牛组织样品，用0.01mol/L pH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，15lbf/in2(1034×10⁵Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。 

8）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。回收牛流行热病毒HB-2010-1G基因RT-PCR扩增产物，长度为1872bp，与pGEM-T载体(购自Promega公司)进行连接，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-BEF-G。以纯化的质粒为模板，将质粒线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备牛流行热病毒阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。 

牛流行热病毒HB-2010-11872bp G基因片段序列如SEQ ID NO：4所示。 

对合成的引物和探针做HPLC分析，如得到单吸收峰图谱、而且用紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6－2.0之间，即视为合格引物。对含有10⁴拷贝数的RNA模板进行扩增，结果显示本发明提供的引物对与探针配合使用，扩增的Ct值相对较低，且升幅较高。 

将筛选好的引物浓度从0.1μmol/L至0.8μmol/L以0.1μmol/L为间距递增，探针浓度从0.025μmol/L至0.2μmol/L以0.025μmol/L递增。对引物和探针不同浓度的配比进行了比较，从多次重复试验中发现：采用表1所列引物浓度和探针浓度时荧光增幅相对较高。 

我们针对Roche Light Cycler2.0，Roche480以及ABI 7900HT荧光PCR检测仪，在42℃/30min，94℃/3min的逆转录后，对该实验中对变性温度和时间、退火和延伸温度及时间进行了优化实验。扩增时，采用循环次数分别为40、45和50，比较扩增结果的Ct值，进而确定扩增的循环次数为40。最终确定采用扩增效果较好的方案为RT-PCR反应参数：反应条件为：94℃/15s，55℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。 

研究表明，Mg²⁺浓度对荧光PCR扩增结果有一定，故应用筛选好的引物探针，将Mg²⁺的浓度从0.5mmol/L至5.0mmol/L以0.5mmol/L为间距递增，对不同Mg²⁺浓度条件下的扩增进行了比较。优化后的Mg²⁺浓度为见表1。 

我们选择Promega公司生产的Taq酶，一单位的定义：74℃作用30分钟，能将10nM的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求：具DNA聚合酶活性及5’→3’核酸外切酶活性，无3’→5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃ 1小时后仍保持50%活性。从多次重复试验结果中选定1.25U Taq酶作为使用的Taq酶量。 

本发明的优点是：本发明选择牛流行热病毒G基因编码区作为靶区域，设计简并引物和MGB探针建立并优化了牛流行热病毒荧光RT-PCR检测方法，取得了优异的技术效果： 

1）快速：该方法对PCR产物进行实时监控，RT-PCR结束即可获得结果。 

2）更为灵敏：比常规的PCR方法灵敏度高100倍；对已知拷贝数的体外转录RNA进行检测。结果显示，灵敏度均可达10拷贝/反应，重复性好。 

3）特异：由于不仅采用了特异性的引物，而且采用了特异性的探针，使该方法的特异性高于传统RT-PCR方法；建立的荧光RT-PCR检测方法在检测所收集的其他病毒以及相关弹状病毒时，结果为阴性，未发现交叉反应。方法研究过程中涉及的病毒核酸见表2。 

表2方法研究中用到的病毒核酸 

病毒	毒株名称	来源
			牛流行热病毒核酸	HB-2010-1	本实验室保存
牛疱疹病毒1型	EC11	本实验室保存
			牛病毒性腹泻病毒	（Oregon）C24V	本实验室保存
水泡性口炎病毒核酸	Indiana株	本实验室保存
			狂犬病病毒核酸	CVS11	本实验室保存
病毒性出血性败血症病毒	VHSV-2001	本实验室保存
			鲤春病病毒	SVCV-2004	本实验室保存

4）稳定：重复性试验结果显示所建立方法的稳定性良好；对不同浓度的已知拷贝数的cRNA进行重复性试验，结果见表3。 

表3重复性试验结果 

6）不易污染：全封闭反应，无需PCR后处理，操作安全。 

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。 

附图说明

图1为HB-2010-1G基因RT-PCR扩增结果。 

图2为牛流行热病毒荧光RT-PCR检测方法检测极限测定结果。 

图3为牛流行热病毒荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。 

具体实施方式

实施例1、试剂盒的配制和使用 

1、试剂盒的配制组成，见表4。 

表4试剂盒配制组成 

组成（48tests/盒）	数量
		裂解液	30mL×1瓶
荧光RT-PCR反应液	800μL×1管
		反转录酶M-MLV	30μL×1管
RNA酶抑制剂	15μL×1管
		Taq酶（5U/μL）	15μL×1管
DEPC水	1mL×1管
		阴性对照	1mL×1管
阳性对照	1mL×1管

2、试剂盒的使用方法 

2.1RNA提取： 

取n个1.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），作好标记。首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。 

12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。 

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。 

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。 

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。 

2.2扩增试剂准备与配制 

从试剂盒中取出RT-PCR反应液、M-MLV、RNA酶抑制剂和Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液，0.5μL M-MLV，0.25μL RNA酶抑制剂以及0.25μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 

反应参数设置：反应条件为：94℃/15s，55℃/5s，60℃/35s，40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。 

2.3结果判定 

结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如 阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无牛流行热病毒；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在牛流行热病毒。 

实施例2、试剂盒的灵敏度试验 

1、材料： 

方法研究过程中应用到的病毒核酸为本实验室保存的牛流行热病毒HB-2010-1核酸。 

2、方法 

1）将牛流行热病毒HB-2010-1 RNA反转录合成cDNA,应用特异性引物扩增含完整G ORF约1.8kb的DNA片段,将扩增片段回收后克隆于pGEM-T载体中。将提纯的质粒用限制性内切酶PvuII消化处理,对DNA片段纯化回收,之后将其作为模板按照Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNAProduction System-T7试剂盒进行体外转录。转录产物经无RNase的Dnase(1u/μg样品DNA,Promega)消化除去其中的DNA模板后,用TRIZOL重新提取RNA，以去除杂蛋白和各种离子。将RNA沉淀溶于1.0mL的无RNA酶的灭菌水中，分装，20μL/管，冻存于－80℃下，即得到制备好的cRNA片段。 

2）取制备的体外转录RNA用无RNA酶的灭菌水分别作200倍稀释，测定其A260吸收值并计算拷贝数。对上述制备的cRNA标准品以10倍梯度稀释后,按最佳条件进行荧光RT-PCR测定,并用去离子水作为阴性标准。在对不同稀释度标准品的检测中,确定荧光定量RT-PCR能检出的最低cRNA浓度,并由此得出该方法的检测极限。 

3、结果 

1）见图1所示，经RT-PCR扩增，获得牛流行热病毒HB-2010-1G ORF约1.8kb的DNA片段。经体外转录后将获得的cRNA纯品。 

2）结果显示，方法的灵敏度均可达10拷贝/反应，检测方法的灵敏度结果见图2。 

实施例3、试剂盒的特异性试验 

1、材料 

表5特异性试验研究过程中应用到的病毒核酸 

病毒	毒株名称	来源
			牛流行热病毒核酸	HB-2010-1	本实验室保存
牛疱疹病毒1型	EC11	本实验室保存

[0079] 

牛病毒性腹泻病毒	（Oregon）C24V	本实验室保存
			水泡性口炎病毒核酸	Indiana株	本实验室保存
狂犬病病毒核酸	CVS11	本实验室保存
			病毒性出血性败血症病毒	VHSV-2001	本实验室保存
鲤春病病毒	SVCV-2004	本实验室保存

2、方法 

用所建立的牛流行热病毒荧光RT-PCR检测方法（见实施例1）对上述病毒核酸进行检测，以验证方法的特异性。 

3、结果 

如图3所示，结果表明所建立的方法与其他动物病毒及相关弹状病毒无交叉反应，特异性良好。 

实施例4、试剂盒对临床样品检测的实验报告 

1、材料 

我国牛场病料和进口牛血样品共计337份。 

2、方法 

对337份样品分别用实施例1的方法和常规RT-PCR方法进行检测比较。在实际样品中验证方法的敏感性和特异性。 

3、结果 

检测结果见表6。 

表6临床样品的检测结果 

对337份已知样品进行检测。结果显示常规RT-PCR检测为阳性的样品经荧光RT-PCR检测全部为阳性，荧光RT-PCR检出率高于常规RT-PCR，结果见表6。 

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 

序列表

<110>  北京森康生物技术开发有限公司

<120>  检测牛流行热病毒的核苷酸序列和试剂盒

<130> 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工合成正义引物

 

<400>  1

gatcaaatgt ccacaacgtt tra                                             23

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工合成反义引物

 

<400>  2

tgttcatcct ttgcaagatt atga                                            24

 

<210>  3

<211>  16

<212>  DNA

<213>  人工合成探针

 

<400>  3

ttrtcacttc argccc                                                     16

 

<210>  4

<211>  1872

<212>  DNA

<213>  牛流行热病毒HB-2010-1 G基因

 

<400>  4

atgttcaagg tcctcataat taccttgcta gtcaataaga ttcatttgga gaaaatttac     60

aatgttccgg tgaattgtgg agagcttcat ccggtaaaag ctcatgagat caaatgtcca    120

caacgtttaa atgaattatc acttcaagcc catcataatc ttgcaaagga tgaacattat    180

aataagattt gtagaccaca gttgaaagat gacgctcatc tagaaggatt catttgtagg    240

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cagatattag aggtaatacc agaatattcc ggttgcacag atgcagttaa gaaattagat    360

cagggtgcat taattccccc ttattaccct cctgctggat gcttttggaa tactgaaatg    420

aatcaagaaa tagaattcta tgtcctaata caacataagc ctttcttaaa tccttatgat    480

aatttaattt atgattctcg atttttaact ccttgtacta ttaatgatag taaaacaaag    540

ggatgtcctc taaaagacat aaccggaaca tggataccag atgtaagagt cgaagaaata    600

agtgagcact gcaataataa acattgggaa tgcattacag ttaaatcatt taggagtgaa    660

ttaaatgata aagagagatt atgggaagct ccagatatcg ggctagtcca cgtaaataaa    720

ggatgtttgt cgacattttg tgggaaaaat ggcatcattt ttgaggatgg agaatggtgg    780

agtatagaaa accaaacaga atctgacttc caaaatttta aaattgaaaa atgcaagggt    840

aaaaaaccag gttttaggat gcacacagat agaacagagt ttgaagaatt agatattaag    900

gctgaattag aacatgaaag atgcttaaac actatcagta aaatacttaa taaagaaaat    960

ataaatacat tagatatgtc ttacttggct cccacgagac caggaaggga ttatgcatat   1020

ttatttgagc aaacaagttg gcaagaaaaa ctctgtttgt ccttaccaga ctcgggtaga   1080

gtttccaagg attgtaatat tgattggaga acatcaacaa gagggggaat ggtgaaaaag   1140

aatcattatg ggataggatc ctataaaaga gcttggtgtg aatacagacc ttttgttgac   1200

aagaacgaag atggctatat tgatatacaa gaattgaatg gacataacat gtctgggaat   1260

catgctatat tggaaacagc gccggcagga ggaagctccg gaaataggct gaatgtaact   1320

ctaaacggaa tgatcttcgt ggaaccaact aaattatatt tgcatacaaa atctctatat   1380

gaggggatag aggattatca aaaattgatc aaattcgagg taatggagta tgataatgtg   1440

gaagagaact tgattaggta tgaggaggat gagaaattta aaccagtaaa tttaaatcca   1500

catgaaaaaa gtcaaatcaa cagaactgat atcgtaagag aaattcaaaa aggagggaaa   1560

aaggttttat ctgctgttgt aggttggttt acaagcacgg caaaggcagt aagatggaca   1620

atttgggctg ttggtgcaat agtcaccaca tatgctatct acaaattgta taaaatggtc   1680

aagtccaact catctcacag taagcatagg gaagctgacc tagaaggact tcaatcaaca   1740

acaaaagaaa atatgagggt ggaaaagaat gacaagaatt atcaagattt agaattagga   1800

ttatatgaag agattagaag catcaaaggt ggaagtaaac aaactggtga tgataggttc   1860

tttgatcatt aa                                                       1872

 

Claims (4)

1.一组检测牛流行热病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测牛流行热病毒的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测牛流行热病毒的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测牛流行热病毒的核苷酸序列，其特征在于：所述荧光探针序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。

3.一种检测牛流行热病毒的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）裂解液；

2）RT-PCR反应液，其中包括：RT缓冲液、MgCL₂ 、 dNTP、正义引物 、反义引物和荧光探针；

3）反转录酶M-MLV；

4）RNA酶抑制剂；

5）Taq DNA聚合酶；

6）DEPC水；

7）阴性对照：牛流行热病毒阴性牛组织样品；

8）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

其中，正义引物为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团MGB。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应液包括：1×RT缓冲液、1.0mM MgCL₂、0.05mM dNTP、0.4μM正义引物、0.4μM反义引物和0.2μM荧光探针。

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