CN102719565A

CN102719565A - 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列和试剂盒

Info

Publication number: CN102719565A
Application number: CN2012102138708A
Authority: CN
Inventors: 李海花; 杨丙田; 张向东; 葛思娟; 杜小迪
Original assignee: BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
Current assignee: BEIJING SENKANG BIOTECHNOLOGY DEVELOPMENT CO LTD
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2012-10-10

Abstract

本发明公开了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列和试剂盒，该检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：3所示，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO：3为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的荧光探针。本发明进一步公开了含有上述引物的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的试剂盒。本发明所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好的特点。

Description

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(美洲型)的核苷酸序列和试剂盒

技术领域

本发明涉及基于TaqMan水解探针荧光RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于猪组织样本中猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的准确检测，还可适用于猪活体样本（主要为拭子样品）中猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的检测，可用于动物猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的筛查、出入境检疫等，属于检验检疫领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害当今养猪业的主要疫病之一，给世界养猪业造成巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征的控制一直是养猪生产国家所面临的艰巨任务，即使在养猪业发达的美国及西欧国家，也是一大难题。在我国，PRRS的危害也日益严重，自1995年传入至今，我国几乎所有的省市都时有PRRS的发生。历年来的流行病学和血清学调查结果表明，在我国猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的感染率非常高。PRRSV还是猪呼吸道疾病综合征（PRDC）的一个主要原发性病原。在饲养管理水平低、卫生条件差的猪场，常与PCV2、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪伪狂犬病毒、猪附红细胞体、链球菌等混合或继发感染，这样的猪群死亡率高，且多数猪场伴发母猪繁殖障碍。在PRRS暴发中或暴发后，不少猪场的种猪和成年猪继发弓形体病，呈暴发性、地方性流行或散发性发生。2006年，我国爆发的“猪高热综合症”给养殖业带来灾难性的打击，现已经查明主要病因是兰耳病高变异毒株。PRRSV在造成严重经济损失的同时也给疾病防疫带来巨大困难。

PRRSV感染后引起的病理及组织学变化往往不易与其他传染病区分，因此PRRS的确诊必须依赖于实验室手段。目前本病的检测方法主要包括病毒分离鉴定，血清学检测方法以及分子生物学检测方法。其中病毒分离方法需要时间长，对病料要求高，因此不利于大量临床样品的快速诊断。检测病毒的血清学方法有荧光抗体染色和免疫酶测定技术。这些检测方法技术性较强，操作烦琐，也不适用基层诊断和大规模的流行病学调查。随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于临床样品的诊断，检测的目标通常是针对PRRSV基因组的保守区ORF7，ORF6或ORF1b。PCR技术直接检测临床样品中PRRSV的基因组RNA，省去了细胞培养和病毒分离的过程，所以比病毒分离省时，且敏感性要高于病毒分离，特异性也非常高。可用于PCR检测的样品包括血清、精液、肺组织以及胎儿。PCR方法可以在较短时间内得到结果(24h～48h)。国内外很多学者都建立了检测PRRSV的RT-PCR方法或套式RT-PCR检测方法。PCR方法在PRRS诊断以及群体监测上可以发挥很大作用，比如用于后备种猪的筛选，持续性感染猪的诊断以及用于猪群的净化工作。

荧光定量PCR检测技术是近年来发展起来的一种新技术，与传统诊断方法比较具有很多突出的优点，引物与探针可以大量合成并长期保存，检测速度快（仅需2～4h），结果可靠，不易污染，避免散毒，而且敏感性要高于常规的PCR检测方法，通过探针设计还能区分不同的毒株亚型，因而具有广阔的应用前景。

在本研究中，我们采用TaqMan荧光RT-PCR方法建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的检测技术，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化。建立了灵敏、特异，能够应用于临床样品的诊断和检测的试剂盒。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列，包括引物序列和TaqMan水解探针序列。

本发明的另一个目的是提供快速、准确、使用方便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

选择美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因和3’端非编码区的特定序列作为靶区域,在多重序列比对的基础上，进行引物和探针设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50％-60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度（Tm值）相差小于5℃。探针的长度在25个碱基左右，采用TaqMan修饰，并标记荧光基团。

一组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列，如下：

1）5’-GCATGATGGGCTGGCATTC-3'（SEQ ID NO：1）

2）5’-CCCACACGGTCGCCCTAAT-3’（SEQ ID NO：2）

3）5’-[FAM]-ATGTGTGGTGAATGGCACTGATTGACA-[TAMRA或BHQ1]-3’（SEQ ID NO：3）

其中序列1）和2）分别为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的正义引物和反义引物，序列3）为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的TaqMan修饰的荧光探针,探针的5’端标记报告荧光基团FAM（6-carboxy-荧光素），3’端标记淬灭基团TAMRA或BHQ1。

我们采用TaqMan荧光RT-PCR检测技术建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）检测方法，对反应的各种条件进行了优化，其中包括引物探针的筛选，Mg²⁺使用浓度的优化，引物探针浓度的优化，得到以下试剂盒。由于使用RT-PCR固体酶颗粒体系与使用反转录酶M-MLV+Taq酶体系都能检测出猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型），所以两种体系均可以应用于检测。使用RT-PCR固体酶颗粒体系成本较高但操作简单，使用反转录酶M-MLV+Taq酶体系操作较复杂但成本比较低。可以根据需要，选择检测试剂盒的组成。

本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）检测试剂盒A，由以下组分组成：

1）裂解液：购自INVITROGEN公司；

2）RT-PCR反应液，表1为反应液配方；

表1反应液配方

组分	单份反应液终浓度
		5×RT缓冲液	0.5×RT缓冲液
10×PCR缓冲液	0.5×PCR缓冲液
		25mM MgCl₂	3.0mmol/L
2.5mM dNTP	0.2mmol/L
		猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）正义引物	0.2μmol/L
猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）反义引物	0.2μmol/L
		猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）TaqMan探针	0.1μmol/L

10×PCR缓冲液、25mM MgCl₂购于Promega公司；5×RT-缓冲液，2.5mM dNTP购自大连宝生物生物工程有限公司，引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成，其中10×PCR缓冲液的组成为：500mmol/L KCl、100mmol/L Tris-HCl(pH9.0，25℃)、1.0％Triton X-100。5×RT-缓冲液组成为375mmol/L KCl、15mmol/L MgCl₂、50mmol/L DTT、250mmol/L Tris-HCl（pH8.3，25℃）；

3）反转录酶M-MLV，200U/μl，购自Promega公司；

4）Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司；

5）DEPC水，用自来水两次蒸馏，经过Millipore MILLI-Q PF PLUS纯水仪纯化，收取电阻率≥18.0MΩ.cm的水,Millipore-Q纯化水加入DEPC至终浓度为0.1%，37℃搅拌处理12hr，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

6）阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）阴性猪组织样品，用0.01mol/LpH7.2PBS缓冲盐水制成20％悬液，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压蒸汽灭菌15分钟。

7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。将RT-PCR扩增获得的甲型猪繁殖与呼吸综合征病毒RespPRRS/Repro长度为1640bp ORF5~3’UTR基因克隆于pGEM-T载体，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-ORF5-3UTR。以纯化的质粒为模板，酶切线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）RespPRRS/Repro长度为1640bp ORF5~3’UTR基因序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）检测试剂盒B，由以下组分组成：

1）裂解液：购自INVITROGEN公司；

2）RT-PCR反应液，表2为反应液配方；

表2反应液配方

组分	单份反应终浓度
		25mM MgCl₂	3.0mM
正义引物	0.2μM
		反义引物	0.2μM
猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）TaqMan探针	0.1μM

25mM MgCl₂购于Promega公司；引物和探针均委托大连宝生物生物工程有限公司合成；

3）RT-PCR酶颗粒（RT-PCR Beads），购自Amersham公司；

4）Taq DNA聚合酶5U/μL，购自Promega公司；

7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段。将RT-PCR扩增获得的的甲型猪繁殖与呼吸综合征病毒RespPRRS/Repro长度为1640bp ORF5~3’UTR基因克隆于pGEM-T载体，转化TOP10感受态细胞，碱裂解法提取质粒DNA，经PCR和酶切鉴定后获得阳性重组质粒，命名为pGEM-PRRSV-ORF5-3UTR。以纯化的质粒为模板，酶切线性化之后，用Promega公司的Ribo MAXTM Large Scale RNA Production System-T7试剂盒进行体外转录；将体外转录产物用DNase除去其中的DNA模板后经TRIZOL提取后进行测定后，即得到制备猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）阳性对照品所需的RNA阳性对照品母液。

本发明的优点是：

本发明建立了特异性检测美洲型PRRSV的荧光RT-PCR快速检测技术，设计的引物探针保守性很高，能够检测到所有美洲型的PRRS毒株。本发明建立的美洲型PRRSV荧光RT-PCR快速检测技术特异性好，灵敏度高，能够快速、准确的检测临床样本中的PRRSV，在实际生产中可以对养殖场猪群进行疫情实时监测，及时淘汰和清除持续感染猪只，降低PRRS的感染率。当怀疑爆发PRRS时，能够迅速准确的进行诊断和病毒鉴定，有助于我国控制和净化PRRS。此外，该技术可以直接应用于引种和猪产品进出口贸易的检疫工作中，保证严格的检疫结果，及时通报疫情，具有重要的生产意义和社会意义。本发明中建立的PRRSV快速检测技术还可以检测病死猪肉中的微量PRRSV，能够保障猪肉的食品安全，在疫病防控和猪肉产品安全执法检验中具有重要意义。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1荧光RT-PCR对PRRSV VR-2332检测极限测定；

图2普通RT-PCR对PRRSV VR-2332检测极限测定；

图3PRRSVVR-2332细胞毒RNA相对定量试验和线性回归结果；

图4美洲型PRRSV荧光RT-PCR检测方法的特异性试验结果。

具体实施方式

表3方法研究过程中应用到的病毒株

实施例1、试剂盒的配制和使用

1、试剂盒A的配制组成，见表4。其中，所述RT-PCR反应液的配方见表1。

表4试剂盒配制组成

组成（48tests/盒）	数量
		裂解液	5.0mL×6管
RT-PCR反应液	900μL×1管
		Taq DNA聚合酶（5U/μL）	15μL×1管
反转录酶M-MLV（200U/μl）	30μL×1管
		DEPC水	1mL×3管
阴性对照	1mL×5管
		阳性对照	1mL×5管

2、试剂盒A的使用方法

1）样品处理：对于组织样品，用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加5mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中，编号备用；对于拭子样本，将采集的拭子放入盛有1.0mL PBS的Eppendorf管中，编号备用；对于血清或血浆样本，用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，须放置-70℃冰箱，但应避免反复冻融（最多冻融2次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。

2）RNA的提取：在样本处理区进行。

取n个1.5ml灭菌离心管（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），作好标记。首先加入600μL裂解液（裂解液有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干），然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200μL（一份样本换用一个吸头）；再加入200μL氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。

12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（－20℃预冷），作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

12,000g离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）；加入600μL 75%乙醇（－20℃预冷），颠倒洗涤。

12,000g离心10min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体。4,000g离心10sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面），室温干燥3min（不宜过于干燥，以免RNA不溶）。

加入11μL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2,000g离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的RNA最易受RNA酶降解，请在2小时内进行PCR扩增）。

3）RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、反转录酶M-MLV、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液，0.5μL反转录酶M-MLV和0.3μL Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

42℃/30min，92℃/3min，

92℃/10s，55℃/10s,72℃/30s,40个循环；每次循环的退火延伸时收集荧光。

4）结果的判定：结果分析条件设定，读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。质控标准，阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。阳性对照的Ct值应≤30.0，并出现特定的扩增曲线。如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次实验视为无效。结果描述及判定，阴性，无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）；阳性，Ct值≤30.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）。

3、试剂盒B的配制组成，见表5。其中，所述RT-PCR反应液的配方见表2。

表5试剂盒配制组成

组成（48tests/盒）	数量
		裂解液	5.0mL×6管
RT-PCR反应液	900μL×1管
		RT-PCR酶颗粒	32管/盒
Taq DNA聚合酶（5U/μL）	240μL×1管
		DEPC水	1mL×2管
阴性对照	1mL×5管
		阳性对照	1mL×5管

4、试剂盒B的使用方法

2）RNA的提取：在样本处理区进行。

12,000g离心15min（如有条件，于4℃进行离心）。取与上步中相同数量的1.5ml灭菌离心管，加入400μL异丙醇（-20℃预冷），作好标记。吸取步骤1.3.各管中的上清液相转移至相应的管中，颠倒混匀。

3）RT-PCR扩增：从试剂盒中取出RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2,000g离心5sec。设所需PCR管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管阳性对照），每个测试反应体系需要15μL RT-PCR反应液，0.5颗RT-PCR酶颗粒和0.2μl Taq酶。计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向每个PCR管中各分装15μL，转移至样本处理区。在各设定的PCR管中分别加入制备的RNA溶液各10μL，盖紧管盖，于800g离心5sec。将PCR管排好放入荧光PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

反应参数设置：

42℃/30min，92℃/3min，

实施例2、试剂盒检测方法的灵敏度、特异性、重复性试验

1.灵敏度试验

将灭活的PRRSV VR-2332细胞毒培养物（10－4.75TCID50/0.1ml）作10倍系列稀释，根据实施例1中使用方法所述条件分别用荧光和普通RT-PCR两种检测方法进行检测，试验结果显示对于美洲型PRRSV细胞毒，建立的检测方法检测极限可达10^-5，见图1，而普通RT-PCR检测方法仅可达到10^-3，见图2。即荧光RT-PCR方法的检测下限是不到1个TCID50，比普通RT-PCR的灵敏度高100倍。

为实现对临床样品中病毒RNA量的相对定量，我们进一步对连续10倍稀释的病毒RNA样品进行检测，采用荧光PCR仪软件Roche LightCycler Softwire Version3.5对Ct值和样品中病毒RNA的量进行线性回归分析，建立标准曲线，计算相关系数。结果显示，病毒RNA的量与试验测得的Ct值呈线性相关，R²=1，表明建立的方法可用于病毒RNA相对定量（见图3）。

2.特异性试验

用实施例1中所述方法对美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和几种猪常见的病毒细菌病（包括猪口蹄疫病毒，猪瘟病毒，猪圆环病毒2型，猪伪猪繁殖与呼吸综合征毒（欧洲型），猪弓形体，猪链球菌等）进行检测，结果表明所建立的方法与欧洲型PRRSV和其他细菌病毒均无交叉反应，特异性良好（图4）。

3.重复性试验

连续三次分别用猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法进行重复性试验，结果见表6。

表6重复性试验结果

上表数据表明建立的猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法重复性与稳定性良好。

实施例3本发明试剂盒检测方法与其他诊断方法的比较

采用实施例1中试剂盒A的荧光RT-PCR检测方法和普通RT-PCR检测方法对2006～2007年从发病猪场采集的50份猪血清和猪病料（包括肺，肾，肝，脾和猪肉等）进行检测，结果表明，50份病料中，荧光RT-PCR检测为阳性的病料有45份，而普通RT-PCR仅检测出30份为PRRSV阳性，见表7。

表7PRRSV荧光RT-PCR检测临床样本的结果统计

*：PRRSV阳性数量/样本总数

表8荧光RT-PCR，普通RT-PCR和病毒分离三种方法检测结果的比较

病料编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											荧光RT-PCR	＋	＋	＋	＋	-	＋	＋	-	＋	＋
普通RT-PCR	＋	＋	＋	-	-	＋	＋	-	＋	＋
											病毒分离	＋	＋	＋	＋	-	＋	＋	-	＋	＋
病料编号	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
											荧光RT-PCR	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	-	＋
普通RT-PCR	＋	＋	＋	＋	＋	-	-	-	-	＋
											病料编号	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
荧光RT-PCR	＋	＋	＋	-	＋	＋	＋	＋	＋	＋
											普通RT-PCR	＋	＋	＋	-	＋	-	＋	-	-	-
病料编号	31	32	33	34	35	36	37	38	39	40
											荧光RT-PCR	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋
普通RT-PCR	＋	-	-	＋	-	-	＋	-	-	＋
											病料编号	41	42	43	44	45	46	47	48	49	50
荧光RT-PCR	＋	＋	-	＋	＋	＋	＋	＋	＋	＋
											普通RT-PCR	＋	＋	-	＋	＋	＋	＋	＋	-	＋

表8比较了荧光RT-PCR，普通RT-PCR和病毒分离三种检测方法，结果表明荧光RT-PCR的检测结果与病毒分离的结果完全一致；与普通RT-PCR相比较，普通PCR检测为阳性的病料与荧光RT-PCR检测结果一致，但是部分病料用普通PCR检测为PRRSV阴性，而荧光RT-PCR检测为阳性。其中2份病料病毒分离的检测结果也是PRRSV阳性。原因可能在于有些病料中含毒量低，而且，病料直接提取的RNA成分复杂，导致部分弱阳性病料用普通PCR检测不出来。普通PCR检测为PRRSV阴性而荧光PCR检测为PRRSV阳性的病料有4份是猪肉，其中1份用病毒分离检测也为PRRSV阳性，而荧光RT-PCR对猪肉的检测结果Ct值相对较大，说明猪肉中的病毒含量相对较低。上述结果进一步说明荧光RT-PCR的敏感性要高于普通PCR，且荧光RT-PCR能够检测到猪肉中微量的PRRSV RNA病毒。

实施例4对临床样品的检测结果

1.对猪不同组织样品的检测

使用建立的PRRSV荧光RT-PCR方法同时检测某发病猪场6头病死猪不同的组织脏器，并对其中荧光RT-PCR的检测数据进行统计分析，结果见表9。

表9 PRRSV荧光RT-PCR检测同一头猪不同组织脏器的结果统计

我们建立的荧光RT-PCR检测方法可以对病毒RNA进行相对定量，根据标准曲线Y=-3.659X+35.08（X代表Ct值，Y代表病毒RNA的相对含量），可知Ct值越小，病毒含量相对越高。从表9可以看出感染PRRSV后，同一头猪的不同组织脏器中的含毒量不同。经过综合分析，发现各个组织中含毒量由高到低的排列顺序大致为肺，脾和肾，淋巴结和肝，猪肉。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 北京森康生物技术开发有限公司

<120> 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列和试剂盒

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成正义引物

<400> 1

gcatgatggg ctggcattc 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成反义引物

<400> 2

cccacacggt cgccctaat 19

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 3

atgtgtggtg aatggcactg attgaca 27

<210> 4

<211> 1640

<212> DNA

<213> RespPRRS/Repro ORF5-3'UTR基因

<400> 4

atgttggaga aatgcttgac cgcgggctgt tgctcgcaat tgctttcttt gtggtgtatc 60

gtgccgttct gttttgctgt gctcgccaac gccagcaacg acagcagctc ccatctacag 120

ctgatttaca acttgacgct atgtgagctg aatggcacag attggctagc taacaaattt 180

gattgggcag tggagagttt tgtcatcttt cccgttttga ctcacattgt ctcctatggt 240

gccctcacta ccagccattt ccttgacaca gtcgctttag tcactgtgtc taccgccggg 300

tttgttcacg ggcggtatgt cctaagtagc atctacgcgg tctgtgccct ggctgcgttg 360

acttgcttcg tcattaggtt tgcaaagaat tgcatgtcct ggcgctacgc gtgtaccaga 420

tataccaact ttcttctgga cactaagggc ggactctatc gttggcggtc gcctgtcatc 480

atagagaaaa ggggcaaagt tgaggtcgaa ggtcatctga tcgacctcaa aagagttgtg 540

cttgatggtt ccgtggcaac ccctataacc agagtttcag cggaacaatg gggtcgtcct 600

tagatgactt ctgtcatgat agcacggctc cagaaaaggt gcttttggcg ttttctatta 660

cctacacgcc agtgatgata tatgccctaa aggtgagtcg cggccgactg ctagggcttc 720

tgcacctttt gatcttcctg aattgtgctt tcaccttcgg gtacatgact ttcgcgcact 780

ttcagagtac aaataaggtc gcgctcacta tgggagcagt agttgcactc ctttgggggg 840

tgtactcagc catagaaacc tggaaattca tcacctccag atgccgtttg tgcttgctag 900

gccgcaagta cattctggcc cctgcccacc acgttgaaag tgccgcaggc tttcatccga 960

ttgcggcaaa tgataaccac gcatttgtcg tccggcgtcc cggctccact acggtcaacg 1020

gcacattggt gcccgggtta aaaagcctcg tgttgggtgg cagaaaagct gttaaacagg 1080

gagtggtaaa ccttgtcaaa tatgccaaat aacaacggca agcagcagaa gagaaagaag 1140

ggggatggcc agccagtcaa tcagctgtgc cagatgctgg gtaagatcat cgctcagcaa 1200

aaccagtcca gaggcaaggg accgggaaag aaaaataaga agaaaaaccc ggagaagccc 1260

cattttcctc tagcgactga agatgatgtc agacatcact ttacccctag tgagcggcaa 1320

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gattcaggga ggataagtta cactgtggag tttagtttgc ctacgcatca tactgtgcgc 1440

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aattaaaaaa aaaaaaaaaa 1640

Claims

1.一组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所示，其中序列SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的正义引物和反义引物，序列SEQ ID NO：3为检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的荧光探针。

2.根据权利要求1所述的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的核苷酸序列，其特征在于：所述探针序列SEQ ID NO：3的5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1。

3.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）裂解液；

2）RT-PCR反应液，包括：PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL₂、dNTP、正义引物、反义引物和荧光探针；

3）反转录酶M-MLV；

4）Taq DNA聚合酶；

5）DEPC水；

6）阴性对照：猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）阴性猪组织样品；

7）阳性对照：为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

其中，正义引物为序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，反义引物为序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，荧光探针为序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其5’端标记报告荧光基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA或BHQ1。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液中各成分使用终浓度为0.5×PCR缓冲液、0.5×RT缓冲液、3.0mM MgCL₂、0.2mM dNTP、0.2μM正义引物、0.2μM反义引物和0.1μM荧光探针。

5.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（美洲型）的试剂盒，其特征在于，由以下组分组成：

1）裂解液；

2）RT-PCR反应液，包括：MgCL₂、正义引物、反义引物和荧光探针；

3）RT-PCR酶颗粒；

4）Taq DNA聚合酶；

5）DEPC水；

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液中各成分使用终浓度为3.0 mM MgCl₂、0.2 μM正义引物、0.2 μM反义引物和0.1 μM荧光探针。