CN105506176A - 口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒 - Google Patents

口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂和RT-qPCR扩增试剂，RT-qPCR扩增试剂包括扩增反应液、酶系、阳性对照和阴性对照；扩增反应液为5×HS？One-step？RT-PCR？buffer、三对引物、三条TaqMan荧光探针和灭菌超纯水的混合物；酶系为Super？M-MLV？Reverse？Transcriptase、Hotstart？HiTaq？DNA？Polymerase和酶缓冲液混合物；阳性对照为含FMDV病毒O型、A型、AsiaⅠ型基因片段的T载体质粒混合物，阴性对照为灭菌超纯水。本发明根据口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的基因序列，设计3对特异性引物和3条探针，能在一次PCR扩增过程中实现对口蹄疫病毒不同基因型的监测。

Description

口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒
技术领域
本发明涉及兽用生物诊断制品技术领域，具体涉及口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
背景技术
口蹄疫（Footandmouthdisease，FMD）是由口蹄疫病毒（Footandmouthdiseasevirus，FMDV）引起的偶蹄动物发生的急性、热性和高度接触性传染病。口蹄疫在欧洲、亚洲、非洲、南北美洲及大洋洲历史上皆有过发生，欧洲、亚洲、拉丁美洲、非洲在近代史上从未间断发生。它破坏性很大，对生产、生活和经济等方面造成严重的危害，被世界动物卫生组织列为A类传染病之首。口蹄疫病毒具有多型性，共有7个血清型。不同血清型口蹄疫病毒之间，不能产生交互免疫，因此，快速准确地对口蹄疫病毒定型在口蹄疫的研究和防疫中至关重要。
我国周边国家和地区存在口蹄疫的流行，印度和中亚地区存在多种血清型病毒，印度素有“毒库”之称，中亚地区也被称为“病毒走廊”，我国有不同血清型病毒侵入的危险。当前对我国威胁较大的是O型、A型、AsiaI型3种血清型，O型、A型、AsiaI型3种血清型的RNA序列同源性为60％～70％。编码结构蛋白的Pl区比编码非结构蛋白的其他区域差异更大。用于设计分型引物的lD片断同源性约60％，而且同一血清型的病毒差异也比较大。这就给引物设计带来了困难。在引物设计时，要综合考虑方法的特异性和检出率，具有良好特异性的同时，叉要具有高检出率。本发明下载了49条O型FMDV序列、34条AsiaI型序列和57条A型序列，在充分比较同源性的基础上，选取了多个血清型之间同源性低、血清型内同源性高的基因区段。最后经过筛选，选取了比较理想的区段设计引物，在众多参考序列的基础上，提高了检出率。因此本发明建立的多重RT-PCR方法旨在用于区分这3种血清型病毒。
控制FMD的关键在于早发现、早隔离、早预防，因而快速、敏感、可靠的诊断方法受到人们的重视。目前，国内检疫、诊断该病常用的方法有病毒分离和酶联免疫吸附试验等，这些方法或需长时间才能获得检测结果，或检出率低。聚合酶链式反应（PCR）具有灵敏性高、特异性强、操作简便等特点，已被广泛用于分子生物学各个领域，在分子克隆、疾病诊断等方面发挥着重要作用。相对常规诊断方法。PCR检测准确、直接，对于口蹄疫病毒的快速定型具有重要意义。荧光PCR相较普通PCR操作更加方便快捷、灵敏度更高。因此，本发明利用荧光定量RT-PCR来区分O型、A型和AsiaⅠ型的FMDV，设计了3对引物和3条探针，并组建一种口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒。
本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂和RT-qPCR扩增试剂，其中RT-qPCR扩增试剂包括扩增反应液、酶系、阳性对照和阴性对照；
所述扩增反应液为5×HSOne-stepRT-PCRbuffer、三对引物、三条TaqMan荧光探针和灭菌超纯水的混合物；
用于检测口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的荧光定量RT-PCR引物和探针序列如下：
所述酶系为SuperM-MLVReverseTranscriptase、HotstartHiTaqDNAPolymerase和酶缓冲液混合物；
所述阳性对照为含FMDV病毒O型、A型、AsiaⅠ型基因片段的T载体质粒混合物，阴性对照为灭菌超纯水。
上述口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，所述病毒RNA提取试剂包括平衡液BL、缓冲液RG、缓冲液RD、缓冲液RW、RNA洗脱液、RNaseFree吸附柱和收集管、RNaseFree离心管以及实时荧光8联排管。
有益效果
本发明根据口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的基因序列，设计3对特异性引物和3条探针，能在一次PCR扩增过程中实现对口蹄疫病毒不同基因型的监测。本发明包含了病料提取RNA和RT-qPCR扩增所需的全部试剂，不需操作人员再另外准备，具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点，可最大限度的减少人为误差。
附图说明
图1是本发明试剂盒对口蹄疫病毒O型-A型-AsiaⅠ型混合物的三重检验结果；
图2是本发明试剂盒对O型口蹄疫病毒的敏感性试验结果；
图3是本发明试剂盒对A型口蹄疫病毒的敏感性试验结果；
图4是本发明试剂盒对AsiaⅠ型口蹄疫病毒的敏感性试验结果；
图5是本发明试剂盒对口蹄疫病毒的特异性试验结果。
具体实施例
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述，实施例中的方法，如无特殊说明均为常规方法：
一种口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，包括病毒RNA提取试剂（A盒）和RT-qPCR扩增试剂（B盒）两个部分。
A盒包括5瓶RNA提取试剂，分别是平衡液BL（室温密封保存）、缓冲液RG（室温密封保存）、缓冲液RD（室温密封保存）、缓冲液RW（室温密封保存）和RNA洗脱液（室温密封保存）；4份附属物，分别为RNaseFree吸附柱和收集管、RNaseFree离心管、实时荧光8联排管和说明书。
B盒包括4支试剂，分别是扩增反应液、酶系、阳性对照和阴性对照。扩增反应液含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、口蹄疫病毒A型上游引物和下游引物、探针(荧光报告集团为FAM)、口蹄疫病毒O型上游引物和下游引物、探针(荧光报告集团为VIC)、口蹄疫病毒AsiaⅠ型上游引物和下游引物、探针(荧光报告集团为NED)，950/支；酶系为SuperM-MLVReverseTranscriptase、HotstartHiTaqDNAPolymerase和酶缓冲液混合物，45/支；阳性对照为含FMDV病毒O型、A型、AsiaⅠ型基因片段的T载体质粒混合物，50/支，分装于可立离心管中；阴性对照为灭菌超纯水，50/支，分装于可立离心管中。其中，5×HSOne-stepRT-PCRbuffer购自深圳市菲鹏生物股份有限公司，引物由Invitrogen公司合成。引物序列如下：
所述引物序列和探针序列如下。其中，不同型的探针所选的荧光标记也不同，A型探针标记为FAM，O型为VIC，AsiaⅠ型为NED。
本发明试剂盒的使用方法如下：
一、病毒RNA提取
（1）组织提取：取新鲜病变组织，在液氮冷冻下迅速研磨成粉末，将粉末放入到1.5mL灭菌EP管中；
血液提取：取500新鲜血液，置于1.5mL灭菌EP管中；
细胞提取：收获病变细胞，将细胞培养瓶反复置于-80℃冰箱，和室温水浴中，快速冻融三次，收集病毒悬液，室温1200r/min，离心5min，收集沉淀。将细胞沉淀转移至1.5mL灭菌EP管中。
（2）吸附柱活化：向吸附柱中加入600平衡液BL，室温静置5min，室温12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（3）取已处理的样品，分别加入600缓冲液RG，温和的上下颠倒混匀6~8次，室温静置5min；2~8℃下5000rpm离心1~2min，取400上清转入新的RNase-free离心管。
（4）加入200的无水乙醇，立即的上下颠倒混匀，全部转入吸附柱，静置1~2min；2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（5）向吸附柱中加入600缓冲液RD，室温静置2min，2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（6）向吸附柱中加入800缓冲液RW，2~8℃下12000rpm离心30~60s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（7）将吸附柱重新放回收集管中，2~8℃下12000rpm离心2min，将吸附柱中残余的液体去除。
（8）将吸附柱置于一个干净的RNA-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60RNA洗脱液，室温放置2min。
（9）室温12000rpm离心1min，离心管中液体即为模板RNA，-20℃保存或直接进行下游实验。
二、病毒RNART-qPCR扩增
（1）配液（在试剂准备区进行）：取出扩增反应液，室温融化后充分混匀，短暂离心，并按反应个数分别取反应液和酶按照以下配比配制反应液：（注意应考虑有阳性对照和阴性对照甚至空白对照）
反应液配制时应充分混匀，短暂离心，按17.5/管分装到实时荧光8联排管中，转移至样本处理区；
（2）加样（在样本处理区进行）：分别加入2.5处理好的样本、阴性对照、阳性对照，盖好管盖，转移至核酸扩增区；
（3）RT-PCR扩增检测（在核酸扩增区进行）：将反应管置于PCR仪样品槽中，设置扩增反应条件为：50℃15min；94℃10min；94℃15s，60℃40s，40个循环；荧光通道选FAM、VIC和NED，在每个循环的60℃时收集荧光。如果使用ABI系列荧光PCR仪，设置扩增体积为20，同时要选择passivereference和quencher为none的模式。
三、结果分析
（1）综合分析软件收集和计算的各项数据，设定合理的阈值（Threshold）和基线（Baseline）。分析条件设置：一般基线调整为6-15个循环的荧光信号，阈值为3-15个循环荧光信号偏差的10倍，直观上也可设置为刚好超过阴性对照和空白对照的荧光曲线最高点。
（2）质量控制：阴性对照、空白对照的荧光信号均无明显增长，并无明显S型扩增曲线，结果显示为Undet（ABI系列荧光PCR仪）或Noct（Stratagen荧光PCR仪）或40（SLAN荧光PCR仪）；阳性对照的荧光信号有明显增长，呈典型的S型曲线，且CT值≤35；否则实验不成立。
（3）结果判断：待检样本荧光信号有指数型增加，且结果显示Ct值≤38.0，则该样本为阳性；待检样本荧光信号有指数型增加，但结果显示Ct值>38.0，建议重复检测该样本，结果Ct值≤38.0时为阳性，仍>38.0时为阴性；待检样本荧光信号没有指数型增加，不管Ct值如何都为阴性。
（4）结果分析后应保存当前的分析结果，记录好阈值和基线。敏感性试验
提取口蹄疫病毒质粒，分别进行10倍系列梯度稀释进行检测。
对该试剂盒的灵敏性实验表明：该试剂盒具有较高的灵敏性，猪口蹄疫病毒O型的最低检测浓度约为10copies/，A型的最低检测浓度约为30copies/，AsiaⅠ型的最低检测浓度约为20copies/，结果如图2-4所示。
特异性试验
用本发明试剂盒对本实验室保存的口蹄疫病毒A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型、AsiaⅠ型以及CSFV、PRRSV、TGEV、PEDV、PRV、PCV、PPV进行PCR检测（样本1、O型；样本2、A型；样本3、AsiaⅠ型；样本4、C型；样本5、SAT1型；样本6、SAT2型；样本7、SAT3型；样本8、CSFV；样本9、PRRSV；样本10、TGEV；样本11、PEDV；样本12、PRV；样本13、PCV；样本14、PPV；样本15、阴性对照；样本16、阳性对照）。对该试剂盒的特异性实验表明：该试剂盒具有很高的特异性。结果如图5所示。

Claims (2)

1.口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：包括病毒RNA提取试剂和RT-qPCR扩增试剂，其中RT-qPCR扩增试剂包括扩增反应液、酶系、阳性对照和阴性对照；
所述扩增反应液为5×HSOne-stepRT-PCRbuffer、三对引物、三条TaqMan荧光探针和灭菌超纯水的混合物；
用于检测口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型的荧光定量RT-PCR引物和探针序列如下：
所述酶系为SuperM-MLVReverseTranscriptase、HotstartHiTaqDNAPolymerase和酶缓冲液混合物；
所述阳性对照为含FMDV病毒O型、A型、AsiaⅠ型基因片段的T载体质粒混合物，阴性对照为灭菌超纯水。
2.如权利要求1所述口蹄疫病毒O型、A型、AsiaⅠ型三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述病毒RNA提取试剂包括平衡液BL、缓冲液RG、缓冲液RD、缓冲液RW、RNA洗脱液、RNaseFree吸附柱和收集管、RNaseFree离心管以及实时荧光8联排管。
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