CN101104867A - 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的巢式－定量PCR检测方法。具体检测步骤为：1)提取乙肝病毒DNA；2)设计、合成引物与探针：在HBV DNA负链缺口两侧选择保守区域设计内、外引物，Taqman荧光探针设计于负链缺口下游；3)Plasmid－Safe^TMATP－DependentDNase酶切纯化；4)巢式－实时定量PCR扩增，包括：普通PCR——用外引物扩增纯化的模板和实时定量PCR——用内引物和荧光探针对普通PCR产物进行实时荧光定量扩增。本发明可同时提高检测反应的特异性和灵敏度，使操作过程和结果分析更加准确、简便和省时。

Description

检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法

技术领域

本发明涉及乙型肝炎病毒的测定方法，尤其涉及乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(cccDNA)的巢式-定量PCR检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)严重危害人类的生命健康。它侵入肝细胞后，在胞质中脱去核壳，形成松驰环状DNA(rcDNA)，其两条链均不是闭合的。rcDNA进入肝细胞核中，依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口，进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA，并以之为模板转录成大小不同的mRNA，再翻译成各种病毒蛋白。其中3.5Kb的mRNA作为逆转录模板，利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA，再以负链DNA作为模板，通过病毒DNA聚合酶的作用，合成正链DNA，与负链DNA一起组成新的HBV rcDNA。新合成的HBV rcDNA一方面进入细胞核内，转化为新的cccDNA，补充细胞内的cccDNA库，使每个肝细胞中保持大约5～50个cccDNA分子；另一方面与病毒蛋白装配成新的完整的HBV，释放至细胞外，再感染健康的肝细胞。cccDNA与rcDNA在结构、理化特性等方面的差异见表1。

表1  cccDNA与rcDNA结构、理化特性的差异比较

	cccDNA	rcDNA
			核酸一级结构	完整的双链	两条链均不完整
核酸空间结构	闭合环状，超螺旋	松弛环状，非超螺旋
			碱变性的影响	可以再复性	不能再复性
与蛋白质结合能力	不能共价结合	能共价结合
			对核酸酶抗性	强，不容易被降解	弱，容易被降解

目前应用的抗HBV药物仅对HBV rcDNA有抑制作用，但不能阻断cccDNA的形成。因此，只要肝细胞中还存在cccDNA，HBV就会继续复制，致使停药后患者的病情经常反复发作。可见，正确测定乙肝患者cccDNA的水平，对于判断乙肝患者病毒携带状态、确定抗病毒疗程及停药时间等有重要的临床意义。根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同(表1)，国内外学者尝试建立了多种cccDNA的检测方法：

1.实时定量PCR检测方法  He等[He ML，Wu J，Chen Y，et al.A newand sensitive method for the quantification of HBV.cccDNA by real-timePCR.Biochem Biophys Rescommun，2002，295(5)：1102-1107]根据rcDNA双链缺口的存在及其不完整性，设计一对跨缺口的特异性扩增cccDNA的引物及一条杂交于负链缺口下游的Taqman荧光探针。cccDNA双链完整，引物可延伸至探针处，Taq DNA聚合酶将两个荧光基团剪切分离，释放出荧光信号。rcDNA由于负链缺口的存在，引物不能延伸到达探针，没有荧光释放。该方法在相当程度上减少了rcDNA的非特异扩增对结果的影响，操作简便、易分析，检测含HBV全序列质粒时敏感性可达10²～10⁷拷贝，但无临床标本应用的资料。

2.嵌合引物定量PCR方法  Shao等[Shao JB，Chen Z，Ni WQ，et al.Aquantitative method to detect HBV.cccDNA by chimeric primer and real-timepolymerase chain reaction.J Virol Metheds，2003，112：45-52]设计了一种嵌合引物，采用两步法对cccDNA进行实时荧光定量。该嵌合引物由28个碱基组成，其3′端的12个碱基与HBV正链互补，结合位点为负链缺口上游DR2区的下游；5′端的16个碱基与人类免疫缺陷病毒(HIV)的部分核苷酸序列一致而与HBV DNA序列无同源性。首先用此嵌合引物对抽提产物作单链延伸15个循环，在此过程中，只有cccDNA能产生单链延伸产物。然后取反应产物，用一对引物和荧光探针作定量PCR，其中上游引物(P1)与探针均位于DR2区上游，与相应位置的HBV正链序列相同，而下游引物(P2)则与嵌合引物中的与HBV非同源的B段序列一致。这样可以保证只能检测单链延伸反应的产物而不能直接检测HBV基因。该方法具有较高的特异性。检测肝组织标本cccDNA的阳性结果为10⁵～10⁶拷贝/mg，而检测血清标本cccDNA均为阴性。因此，可能存在敏感性差的问题，对低拷贝cccDNA的标本可能漏检。此外，第一轮扩增的产物如果不经过纯化直接充当模板，则会因为成分复杂而影响第二轮扩增的成败或效率；如果进行纯化则导致部分产物丢失，影响结果的准确性。

3.Light Cycler^TM实时定量PCR方法  Sigh等[Singh M，Dicaire A，Wakil AE，et al.Quantitation of hepatitisB virus(HBV)covalently closedcircular DNA(cccDNA)in the liver of HBV-infected patients byLightCyclerTM real-time PCR.J Virol Methods，2004，118：159-167]报道利用Light Cycler ^TM实时定量PCR仪检测HBV感染患者肝脏组织中cccDNA的方法。其引物设计思想与He等相同，Light Cycler实时定量系统为双探针体系。其特点是为了消除rcDNA非特异扩增对结果的干扰，除了设计特异性引物和探针外，还应用了Plasmid safe ATP-dependent DNase降解rcDNA。该方法同时检测了肝组织中β-Globin基因，从而使组织构成异质性较大的样本具有了良好的可比性。该方法特异性较好，加之使用了LightCycler^TM实时定量PCR体系，检测结果相对稳定可靠，其敏感性为10¹拷贝/mg。肝组织中除5.96×10³～1.22×10⁵拷贝/mg外，其余均为阴性。由于荧光定量PCR的敏感性受到扩增片段大小的制约，以100～150bp长度为最佳，而该方法扩增片段为367bp，使标本检测的阳性率低。此外，该方法的探针合成、仪器设备及耗才成本均较高，限制临床应用。

4.侵入式检测法  除了PCR技术，Wong等[Wong DK，Yuen MF，Yuan HJ，et al.Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNAin chronic hepatitis B patients.Hepatology，2004，40：727-737]建立了侵入式检测法(the invader assay)。该方法设计了2个寡核苷酸，分别称为原始探针和侵入式寡核苷酸，它们与cccDNA上的靶序列杂交后形成一个部分重叠的结构，该结构能被剪切酶剪切下来，产生一个5′-flap的寡核苷酸。在特定温度下，原始探针与靶DNA循环反应，不断产生5′-flap结构，从而将靶DNA的浓度成比例放大。荧光共振能量转移盒与5′-flap结构反应产生的荧光信号通过实时PCR仪进行测量。反应中共使用3对寡核苷酸：MSl检测HBVDNA负链，PS2检测完整的正链，hgDNA检测人胰岛素样生长因子1的基因作为内参。MS1和PS2信号均为阳性，为cccDNA，仅MS1阳性，则为rcDNA。该方法虽特异性较高，但反应体系成分较复杂，反应的效率难以控制。只有扩增反应呈线性，扩增产物的信号才能忠实地反映原始拷贝数，而且所需时间较长，除了变性、热启动处理，还需在64℃条件下循环反应240min。

由此可见，上述方法虽具有各自的优缺点，但在临床应用中尚存在敏感性和特异性不高、操作复杂、成本较高及限于肝组织标本检测等问题。为此，我们研究建立了一种具有较高特异性、敏感性及简便实用的HBVcccDNA检测方法。

发明内容

本发明的目的是针对以上不足，提供一种具有较高特异性、灵敏性及实用性的HBV cccDNA检测方法。

本发明建立的检测HBV cccDNA的巢式-实时定量PCR方法的具体步骤为：

1、提取乙肝病毒DNA；

2、设计、合成引物与探针：

在HBV DNA负链缺口两侧选择保守区域设计内、外引物，Taqman荧光探针设计于负链缺口下游，合成引物与探针；

3、Plasmid-Safe ^TM ATP-Dependent DNase酶切纯化；

4、巢式-实时定量PCR扩增：

1)普通PCR用步骤2)中合成的外引物扩增纯化的模板；

2)实时定量PCR用步骤2)中合成的内引物和荧光探针对普通PCR产物进行实时荧光定量扩增；

3)检测；

步骤1中乙肝病毒DNA的来源及提取方法为：

A.血清；B.外周血单个核细胞(PBMC)；C.肝组织。提取方法包括：相应的试剂盒，还可采用煮沸、酚氯仿抽提等常规方法。其中，质粒提取试剂盒提取PBMC中病毒DNA，可祛除rcDNA、ssDNA(单链DNA)，实现对cccDNA的初步纯化。提得的DNA溶于TE或去离子水中，冻存备用。

步骤2中引物与探针设计如图1所示：P1和P2为外引物，P3、P4为内引物。设计外引物时可选择的保守区域为：1513-1589、1951-1876；设计内引物时可选择的保守区域为：1741-1823、1835-1926。

优选引物及其对应的保守区域为：P15’GGGCGCACCTCTCTTTACG3’(1522-1540)，P25’GTAACTCCACAGAAGCTCCA3’(1946-1927)，P35’GCTGTAGGCATAAATTGGTCT(1780-1800)，P45’AGGCACAGCTTGGAGGCTTG 3’(1884-1865)；Taqman荧光探针为：5’-FAM-CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCAT-TAMRA-3’(1829-1853)。

为减少由于rcDNA导致的非特异性扩增，降低rcDNA背景含量，提高模板的特异性，步骤3采用Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase处理提取的DNA，该酶可以敏感、有效地降解含有缺口的rcDNA及ssDNA，对cccDNA无影响。酶切体系是：DNA产物10μl、10×Buffer 2μl、25mM ATP0.8μl、Plasmid-Safe ATP-DNase 5u、dd-H2O补足20μl，37℃温育30分钟降解rcDNA，70℃温育30分钟，灭活Plasmid-Safe DNase。

步骤41)中反应体系为：纯化产物5μl，10μM外引物P1、、P2各0.5μl，2×TaqPCRMasterMixl2.5μl，反应总体积25μl；循环条件：94℃预热5min，93℃45s、58℃45s、72℃ 1min，15～25个循环，72℃延伸10min。步骤42)中反应体系为：普通PCR产物2μl，2×Taq PCRMasterMixl 2.5μl，25mMMgcl₂4μl，10μM内引物P3、P4各0.5μl，10μM荧光探针0.5μl，反应总体积25μl；循环条件：93℃预热3min，93℃20s、55℃30s，40个循环。步骤43)中的检测仪器为Real-time定量仪。

本发明的有益效果为：

巢式PCR可同时提高反应的特异性和灵敏度，与实时定量PCR结合应用，实现了定量，使操作过程和结果分析更准确、简便、省时。

(1)方法的特异性：对病人标本扩增产物进行测序，结果经软件分析，未见碱基缺失突变。与我国主流B、C基因型同源性为95.3％～99.1％。证实该方法有很好特异性。

(2)方法的敏感性：检测倍比稀释为10¹～10⁷copies/ml的pBR425阳参定量标准品，得到该方法的检测低限可达10²copies/ml，标准曲线的相关系数r＝-1.00，P＝0.000。见图2。

(3)方法的实用性：该方法适用于乙肝患者血清、PBMC、肝组织标本的检测，解决了仅可检测肝组织标本的局限性，有更广泛的应用范围，为探究HBV cccDNA在各种标本中的消长提供了有力措施。

附图说明

下面结合实施例附图对本发明做进一步说明。

图1巢式实时定量PCR检测HBVcccDNA的引物设计图；

图2巢式实时定量PCR检测HBV cccDNA的敏感性，10²～10⁷copies/ml阳参扩增曲线图。

标准曲线相关方程为：Y＝-3.61X+34.15，r＝-1.00，Y：Cycle number(Ct)，X：log concentration

具体实施方式

下面通过实例，对本发明做进一步的解释。

1、标本采集：抽取乙肝患者新鲜全血3ml，分离血清；抽取乙肝患者新鲜全血5ml，密度梯度离心法分离PBMC，计数细胞；收集慢性乙肝、肝硬化、肝癌病人肝活检、肝切除标本，-70℃冻存。

2、DNA提取：

A.血清病毒DNA用QIAGEN公司QIAamp MinElute Virus Spin Kit提取；

B.质粒试剂盒提取PBMC中病毒DNA：用质粒提取试剂盒(北京天为时代公司)提取PBMC中病毒DNA。

C.肝组织中DNA用基因组DNA提取试剂(北京天为时代公司)提取。

提得DNA溶于50μl TE或去离子水中，冻存备用。

3、引物与探针的设计、合成：引物、探针由生物公司合成。实验筛选出最佳引物：P15’GGGCGCACCTCTCTTTACG 3’(1522-1540)，P25’GTAACTCCACAGAAGCTCCA3’(1946-1927)，P35’GCTGTAGGCATAAATTGGTCT(1780-1800)，P45’AGGCACAGCTTGGAGGCTTG 3’(1884-1865)；Taqman荧光探针5’-FAM-CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCAT-TAMRA-3’(1829-1853)。引物与探针设计如图1示：P1和P2为外引物，P3、P4为内引物，外引物扩增片段425bp，内引物扩增片段105bp。

4、Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase酶切纯化：酶切体系是：提取DNA产物10μl、10×Buffer 2μl、25mM ATP 0.8μl、Plasmid-SafeATP-DNase 5u、dd-H2O补足20μl，37℃温育30分钟降解rcDNA，70℃温育30分钟，灭活Plasmid-Safe DNase。

5、定量标准品的制备：由我室保存的含adr.HBV全序列的pl.2.II质粒，用外引物扩增出特异片段，回收、纯化，将产物克隆至pGEM-T Easy载体构建成pBR425质粒。转化、提取质粒，PCR电泳鉴定及测序鉴定克隆正确后，用紫外分光光度计测定质粒，计算出拷贝浓度，稀释为10¹～10¹⁰copies/ml不同梯度，用作检测HBV cccDNA的阳参定量标准品。

6、巢式实时定量PCR(nested real-time quantitative PCR)扩增：

A.普通PCR用外引物扩增纯化的模板，反应体系是：纯化产物5μl，10μM外引物P1、、P2各0.5μl，2×TaqPCRMasterMixl 2.5μl，反应总体积25μl；循环条件：94℃预热5min，93℃ 45s、58℃45s、72℃ 1min，15～25个循环，72℃延伸10min。

B.实时定量PCR用内引物和荧光探针对第一轮PCR产物进行实时荧光定量扩增，反应体系为：第一轮PCR产物2μl，2×Taq PCRMasterMixl 2.5μl，25mMMgcl₂ 4μl，10μM内引物P3、P4各0.5μl，10μM荧光探针0.5μl，反应总体积25μl；循环条件：93℃预热3min，93℃20s、55℃30s，40个循环。

C.实验中设置了阳参标准品4～6个梯度，阴性对照和空白对照各一个，与标本同步处理、扩增。扩增结束后，Real-time定量仪根据阳参标准品给出标本定量值。

实时定量是公知的一种技术，在国内外的文献及参考书中均可见此技术(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，et al.Real time quantitative PCR.GenomeRes，1996，6：986-994；J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，等译.分子克隆实验指南，第三版.科学出版社，2002)。本发明的特点主要是将巢式PCR与实时定量相结合，实现了定量，使操作过程和结果分析更准确、简便、省时。

Claims (8)

1.检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，包括以下检测步骤：

1)提取乙肝患者的乙肝病毒DNA；

2)设计合成引物与探针：在HBV DNA负链缺口两侧选择保守区域设计内、外引物，Taqman荧光探针设计于负链缺口下游，合成引物与探针；

3)Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase酶切纯化；

4)巢式-实时定量PCR扩增：

A.普通PCR用步骤2)中合成的外引物扩增纯化的模板；

B.实时定量PCR用步骤2)中合成的内引物和荧光探针对A的产物进行实时荧光定量扩增；

C.结果分析。

2.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤1)中乙肝病毒DNA提取自乙肝患者的血清、PBMC或肝组织。

3.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，，其中步骤2)中

设计外引物时选择的保守区域为：  1513-1589、1951-1876

设计内引物时选择的保守区域为：  1741-1823、1835-1926。

4.根据权利要求3所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤2)中

外引物序列及其位置：

5’GGGCGCACCTCTCTTTACG  3’    (1522-1540)

5’GTAACTCCACAGAAGCTCCA  3’    (1946-1927)

内引物序列及其位置：

5’GCTGTAGGCATAAATTGGTCT 3’    (1780-1800)

5’AGGCACAGCTTGGAGGCTTG  3’    (1884-1865)

Taqman荧光探针序列及其位置：

5’-FAM-CTCTGCCTAATCATCTCATGTTCAT-TAMRA-3’(1829-1853)。

5.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤3)中Plasmid-Safe^TM ATP-Dependent DNase酶切体系为：DNA产物10μl、10×Buffer2μl、25mM ATP 0.8μl、Plasmid-SafeATP-DNase 5u、dd-H₂O补足20μl，37℃温育30分钟，70℃温育30分钟，灭活Plasmid-Safe DNase。

6.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)A中反应体系为：纯化产物5μl，10μM外引物各0.5μl，2×TaqPCRMasterMix12.5μl，反应总体积25μl；循环条件：94℃预热5min，93℃45s、58℃45s、72℃1min，15～25个循环，72℃延伸10min。

7.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)B中反应体系为：普通PCR产物2μl，2×Taq PCRMasterMix12.5μl，25mMMgcl₂4μl，10μM内引物各0.5μl，10μM荧光探针0.5μl，反应总体积25μl；循环条件：93℃预热3min，93℃20s、55℃30s，40个循环。

8.根据权利要求1所述检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法，其中步骤4)C采用Real-time定量PCR仪对检测结果进行分析。

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