CN103088151B

CN103088151B - 用于乙型肝炎病毒四色荧光定量pcr检测的试剂盒及应用

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Publication number: CN103088151B
Application number: CN201210290468.XA
Authority: CN
Inventors: 陈智; 符芳芳; 朱海红
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-08-15
Filing date: 2012-08-15
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2032-08-15
Also published as: CN103088151A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种用于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒及应用。本发明针对病毒S区序列设计扩增引物和4条特异性探针：定量探针，对应A-H型的保守区，用来定量总DNA；C型探针，对应C型特有序列，用来检测HBV基因型C型；YVDD探针，对应YVDD（GTG）突变位点；YIDD探针，对应YIDD（ATT）突变位点。试剂盒反应体系包含由特异性引物和探针配制的检测混合液、Taq酶、阴性和阳性对照。本发明用于检测的整个过程小于3小时，效率高，成本低，灵敏度和准确度高，能有效监测乙肝患者病毒载量和服用核苷类药物的疗效。

Description

用于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒及应用

技术领域

发明涉及生物技术领域，具体涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测试剂盒及其应用方法。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）在全世界范围内的感染患者超过3亿5千万，是诱发慢性乙肝和肝癌的主要原因。我国更是病毒性肝炎的高发区，HBV感染率高达57.63%，其中，大约80％肝癌由乙肝引起，严重威胁着我国公众的生命健康，所以对肝炎的诊断产品的研究具有重要的社会意义。

对人血清样本中HBV 总DNA的定量检测，可用于乙型肝炎的临床辅助诊断，确定是否有HBV感染以及病毒载量；并可通过监测患者血清HBVDNA水平的变化，对抗病毒药物的疗效进行辅助观察和判断。

HBV根据基因组序列可分为A-H共8种基因型，其中中国较常见的是B型和C型。在长江以南地区，以基因型B型为主，占55%，长江以北C型为主，占81.6%。由于Orito等发现HBV 基本核心启动子（BCP）双突变在C型中明显比B型多见，也有研究认为C型HBV患者中DNA阳性率明显高于B型，且C型病毒感染者病毒低度也高于B型，B型感染者早与C型感染者10年发生HBeAg血清转阴，故C型感染者长期高水平的HBV DNA易导致病情加重。因此选取基因型C型为本试剂盒分型鉴定的指标，从而为治疗和预后提供帮助。

目前治疗乙型肝炎最常用的核苷类抗病毒药物包括拉米夫定、阿德福韦等，慢性乙肝患者长时间服用后容易发生病毒基因组特定位点变异，从而引发耐药。根据统计变异出现的概率大约为30%以上，大量样本的统计结果显示，常见的拉米夫定耐药突变位点如表1所示。最主要的耐药突变位点是M204，虽然也有173和180、181位点突变，但是这三个位点突变的拉米夫定耐药样本，基本上都同时联合有204位点的变异，因此，204位点是最主要的拉米夫定耐药突变监测位点。一旦检测到病毒变异，需要及时调整治疗策略。

表1

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种能同时检测乙型肝炎病毒DNA总量、C型基因型和YMDD位点耐药突变（YVDD/YIDD）的四色荧光定量PCR检测试剂盒及其应用方法，在单管反应中同时对HBV DNA进行定量、鉴别HBV C型基因型、以及监测204位点YVDD和YIDD两种耐药突变发生情况。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种用于乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测的试剂盒，该试剂盒含有两种引物及四种探针，各引物或探针的名称、DNA序列和荧光标记表2所示：

表2

所述各引物、探针与buffer、MgCl₂、含dUTP的 dNTPs装于一个容器内构成PCR检测混合液mix；该试剂盒还包括Taq酶、UDG酶，阴性对照样品和阳性对照样品(阴性对照为确认HBV DNA阴性血清；阳性对照为含1.0E+06 IU/ml HBV DNA目的基因片段的血清样本)；

在利用所述引物及探针建立的25μL PCR反应体系中，各组分的终浓度为：10倍反应缓冲液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U（U表示酶的活力单位）；UDG酶，0.1U；各条引物，各0.1μM；各条探针，各0.25μM；待测样品模板DNA（经核酸抽提方法处理过的待测血清或血浆样本，阳性样本中即含待测的HBV DNA）；5μL。

该试剂盒为32人份；试剂盒中的dNTPs中含有dUTP，和试剂盒中UDG酶共同构成防污染体系，防止PCR产物污染造成的假阳性结果。

应用上述试剂盒检测乙型肝炎病毒DNA总量、C型基因型和YMDD位点耐药突变（YVDD/YIDD）的方法，其过程包括利用所述引物、探针建立PCR反应体系，用煮沸法从待测标本中提取DNA，加入前述反应体系中，在荧光定量PCR仪上设定反应条件，进行PCR扩增和荧光型号检测；具体包括：

(1)利用所述引物、探针建立的25μL PCR反应体系如表3所示

表3

组分	终浓度
		10倍反应缓冲液	1×
MgCl₂	4.5mM
		dNTPs	各0.2mM
dUTP	0.2mM
		Taq酶	2.5U
UDG酶	0.1U
		上、下游引物	各0.1μM
各条探针	各0.25μM
		待测样品模板DNA	5μL

(2) 所述反应条件为：37℃ 2分钟UDG酶作用，消化污染的PCR产物片段；95℃ 2分钟热启动并灭活UDG酶；然后进入40个PCR扩增循环，循环温度控制为95℃ 10秒，60摄氏度退火70秒。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)采用四色荧光定量PCR，能在单管反应中同时对HBV DNA进行定量、鉴别HBV C型基因型、以及监测204位点YVDD和YIDD两种耐药突变发生情况。相比市面已有的单纯对乙型肝炎病毒DNA进行定量检测，以及单纯检测YMDD变异的试剂盒，本发明的试剂盒，可在一管反应中实现上述两种试剂的检测目的，并且还能够鉴定出病毒的基因型是否属于C型，有更高的临床应用价值。

(2)技术效果好，建立乙型肝炎病毒核酸定量、分型和YMDD耐药突变四色荧光定量PCR检测试剂盒，操作简单，检测速度快，节约样本量，污染少，可在3小时内快速、准确、特异、简便的对被测标本中乙型肝炎病毒核酸DNA进行定量，鉴别病毒基因组是否为C型，并检测常见拉米夫定YMDD耐药突变位点是否发生变异，以及发生何种变异（YIDD或YVDD），检测限可达到5.0E2 IU/mL。

(3)与市面上现有的YMDD突变检测试剂盒相比灵敏度更高，其它试剂是通过检测野生型序列是否存在，来间接判断标本中病毒是否发生变异。检测到野生型，认为病毒没有发生变异，而检测不到野生型，即标本中100%的毒株都变异为突变型，才认为病毒发生了变异。但是忽略了很多情况下仅有部分病毒发生变异的情况，这时也能检测到野生型，同时也已有部分变异毒株存在，但往往将标本判定为没有突变发生。而恰恰这种部分变异的情况在抗病毒核苷类药物耐药突变发生的早期是很常见的。本试剂的优势在于能够检测野生型和突变型的混合感染，而且对突变型病毒的检测下限也能达到5.0E2IU/m；病毒载量为5.0E5IU/mL的混合感染的标本，对其中突变株的检测灵敏度能够达到2.5%，而现有的测序技术仅能确认比例不低于10%的突变株的存在。

附图说明

图1为HBV 总DNA定量探针分别对YMDD、YVDD、YIDD各5.0E2-5.0E5IU/mL的扩增曲线；

图2为5.0E2-5.0E5IU/mLHBV 总DNA扩增标准曲线；

图3为YVDD特异性探针分别对YVDD 5.0E2-5.0E5/mL的扩增曲线；

图4为5.0E2-5.0E5/mL YVDD扩增标准曲线；

图5为HBV总DNA和YVDD双色曲线（ROX和VIC）；

图6为HBV总DNA扩增曲线（5.0E5IU/mL ROX）；

图7为2.5%-90%YVDD突变株扩增曲线（VIC）；

图8为2.5%-90%突变株扩增标准曲线；

图9为YIDD特异性探针分别对YIDD 5.0E2-5.0E5/mL的扩增曲线；

图10为5.0E2-5.0E5/mL YIDD扩增标准曲线；

图11为HBV总DNA和YIDD双色曲线（ROX和NED）；

图12为HBV总DNA扩增曲线（5.0E5IU/mL ROX）；

图13为2.5%-90%YIDD突变株扩增曲线（NED）；

图14为2.5%-90%突变株扩增标准曲线；

图15为C型YIDD突变样本扩增图；

图16为C型YVDD突变样本扩增图。

具体实施方式

以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述。

1、原理概述

采用不同的荧光集团标记四种探针，在通用引物PCR扩增时，利用多通道荧光定量PCR仪的多通道检测功能，同时对四种信号进行采集，扩增完成后进行分析。

2、实施详情

2.1材料和方法

2.1.1四色荧光定量PCR方法的建立

2.1.1.1 引物及探针的设计合成

引物由本发明人设计，并由上海生工公司合成；探针由本发明人设计，由ABI公司合成；荧光定量PCR仪是ABI公司的7500型。引物及探针序列如表2所示。

2.1.1.2 PCR反应模板的制备

分别含乙肝病毒野生型株的血清（C型）、YVDD变异和YIDD变异毒株血清，由浙江大学医学院**实验室收集保存，任何公众均可自行联系并获取。病毒核酸利用病毒裂解液，通过煮沸法提取；利用文献报道的方法扩增HBV基因组全长，得到的3kb片段琼脂糖电泳鉴定，割胶纯化回收，连接到PMD18-T载体做TA克隆，测序鉴定后，分别符合野生型毒株、C2亚型、YVDD和YIDD变异。提取质粒作为PCR方法建立和体系优化的模板。

2.1.1.3 PCR反应体系的优化

利用三种模板作为待测样品，对引物和探针浓度从0.05-0.8μM进行优化，对Taq酶（TakaRa Hotstart ExTaq）浓度从1U-5U进行优化，对MgCl2浓度从2mM-6mM进行优化，并对退火温度等反应条件做梯度实验进行优化，筛选出最佳的荧光定量PCR反应条件。

2.1.2 荧光定量PCR标准曲线分析及灵敏度实验

2.1.2.1 HBV总DNA检测灵敏度

检测的样本如下：

样本类型	样本浓度
		野生型YMDD	1.0E3-1.0E6IU/mL
突变型YVDD	1.0E3-1.0E6IU/mL
		突变型YIDD	1.0E3-1.0E6IU/mL

根据测得的Ct值做标准曲线

2.1.2.2 YVDD特异性探针检测灵敏度

将不同浓度的野生型和和YVDD突变型样本混合，检测试剂的灵敏度

总浓度IU/mL	野生型所占比例%	YVDD突变型所占比例%
			1.0E6	97.5	2.5
1.0E6	95	5
			1.0E6	90	10
1.0E6	70	30
			1.0E6	50	50
1.0E6	30	70
			1.0E6	10	90

2.1.2.3 YIDD特异性探针检测灵敏度

总浓度IU/mL	野生型所占比例%	YIDD突变型所占比例%
			1.0E6	97.5	2.5
1.0E6	95	5
			1.0E6	90	10
1.0E6	70	30
			1.0E6	50	50
1.0E6	30	70
			1.0E6	10	90

2.1.3 特异性检测

2.1.3.1取HCV、HIV、HDV、HEV的样本进行检测，分析引物和HBV总定量探针的特异性

2.1.3.2取国内常见的HBV B型、以及存在但不多见的A、D型样本，对C型探针的特异性进行检测；

2.1.3.3取HBV 204位点YMDD野生型、YVDD、YIDD模板分别检测YVDD和YIDD探针的特异性

2.1.4 重复性检测

用同一批配制的试剂检测10个标本，每个标本3个副孔，统计计算保准差（SD）和变异系数验（CV）证试剂的批内重复性；

用不同时间配制的3批试剂检测10个标本，每个标本3个副孔，统计计算保准差（SD）和变异系数验（CV）证试剂的批间重复性；

2.1.5 临床样本的采集和验证

2.1.5.1 样本收集和处理

人血清样本采集后-70℃保存备用。用病毒裂解液裂解后，99℃干浴10分钟，13000rpm离心10分钟，取上清5μL做PCR反应的模板。

2.1.5.2 PCR检测

利用所建立的PCR方法进行检测，和测序结果进行对比，验证该方法试剂的准确性、特异性和灵敏度。2.2 结果

2.2.1 制备的各标准模板的测序结果：

制备的模板通过blast方法与NCBI数据库比对，证明分别属于C2亚型（204位点野生型），204位点YVDD突变型和204位点YIDD突变型。

2.2.2 PCR反应体系和反应条件的确立

不同的引物和探针终浓度配比实验结果表明，25μL反应体系中上下游引物的最适终浓度为0.1μM，四条探针的最适终浓度为0.25μM，其余各成分终浓度如表3所示：

PCR最佳反应条件为：

第一阶段 37℃，2min，UDG酶作用消除可能存在的PCR产物污染；

第二阶段 94℃，2min，灭活UDG酶，Taq酶热启动，模板DNA预变性；

第三阶段 94℃，15s，60℃，70s，40个循环，并于60℃时同时采集4种不同通道的荧光信号

2.2.3 标准曲线和灵敏度分析

2.2.3.1 HBV 总DNA定量检测灵敏度（包括野生型YMDD，突变型YVDD和YIDD）：

三种不同的模板各4个浓度梯度进行检测（1.0E3-1.0E6 IU/mL）,绘制标准曲线（图1-2）。结果表明，HBV总DNA定量检测探针对三种模板4个浓度梯度的检测Ct值与LogIU呈线性关系，相关系数0.99。

2.2.3.2 YVDD突变型探针定量检测灵敏度：

2.2.3.2.1 YVDD纯突变株的检测灵敏度（图3-4）：

检测结果表明，上下游引物和YVDD特异性探针对1.0E3-1.0E6 IU/mLYVDD模板检测Ct值与Log IU呈线性关系，相关系数0.99，检测下限达到1.0E3IU/mL。

2.2.3.2.2 YVDD突变株和野生株不同比例混合情况下的检测（图5-8）：

检测结果表明，总HBV DNA为1.0E6 IU/mL的情况下，最低能够检测到2.5%的YVDD突变株的存在，且2.5%-90%的突变株检测Ct值与Log IU也有良好的线性关系

2.2.3.3 YIDD突变株检测灵敏度：

2.2.3.3.1 YIDD纯突变株的检测灵敏度（图9-10）：

检测结果表明，上下游引物和YIDD特异性探针对1.0E3-1.0E6 IU/mLYIDD模板检测Ct值与Log IU呈线性关系，相关系数0.99，检测下限达到1.0E3IU/mL。

2.2.3.3.2 YIDD突变株和野生株不同比例混合情况下的检测（图11-14）：

检测结果表明，总HBV DNA为1.0E6 IU/mL的情况下，最低能够检测到2.5%的YIDD突变株的存在，且2.5%-90%的突变株检测Ct值与Log IU也有良好的线性关系。

2.2.4 特异性检测结果

2.2.4.1 检测结果表明，该试剂对HCV、HIV、HDV、HEV等样本检测结果均为阴性，证明引物和探针有良好的特异性和抗干扰性；

2.2.4.2 对A、B、D型HBV阳性样本检测结果均为阴性，证明C型探针的特异性较好；

2.2.4.3 检测野生型样本只有ROX（总定量）有信号，证明YVDD和YIDD探针与野生型不反应，特异性强；检测YVDD样本，只有ROX和VIC有扩增信号，证明YIDD探针不与YVDD模板反应，特异性强；检测YIDD样本，只有ROX和NED有扩增信号，证明YVDD不与YIDD模板反应，特异性强；

2.2.5 批间和批内重复性

检测结果表明批内和批间重复性较好，CV（LogIU）≤50%。

2.2.6 临床样本验证结果

表4

通过对64例临床样本的检测结果与测序结果对照，能对样本进行总DNA定量，并同时检出C型、YVDD突变型（图15）或YIDD突变型（图16），符合率达到95%以上，如表4所示。

Claims

1.用于乙型肝炎病毒四色荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有两种引物及四种探针，各引物或探针的名称、DNA序列和荧光标记分别为：

上游引物：5’-GCACTTGTATTCCCATCCCATCAT-3’；nt645-662,18bp；

下游引物：5’-AGCAAAGCCCAAAAGACCCACAAT-3’；nt982-1005,24bp,antisense；

定量探针5’-ROX-TCTGTACAACATCTTGAGTCCCTT-BHQ2-3’；nt768-791,24bp；

C型探针5’-CY5-TRAACCCTAATAAAACCAAACGTTGG-BHQ2-3’；nt836-861,26bp；

YVDD探针5’-VIC-CATCATCCACATARC-MGB-3’；nt751-765,15bp,antisense；

YIDD探针5’-NED-CCACATCATCAATATA-MGB-3’；nt754-769,16bp,antisense；

所述各引物、探针与buffer、MgCl_2、含dUTP的dNTPs装于一个容器内构成PCR检测混合液mix；该试剂盒还包括Taq酶、UDG酶、阴性对照样品和阳性对照样品，其中阴性对照为确认HBV DNA阴性血清，阳性对照为含1.0E+06IU/ml HBV DNA目的基因片段的阳性样本；

在利用所述引物及探针建立的25μL PCR反应体系中，各组分的终浓度为：10倍反应缓冲液buffer，1×；MgCl₂，4.5mM；dNTPs，各0.2mM；dUTP，0.2mM；Taq酶，2.5U；UDG酶，0.1U；各条引物，各0.1μM；各条探针，各0.25μM；待测样品模板DNA,5μL。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒为32人份。