CN1292424A - 多种病毒同步检测的方法 - Google Patents

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张先恩
陶生策
刘虹
李天宪
张治平
胡勤学
梁布锋
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Abstract

本发明公开了一种同步检测六种病毒(HIV1,HCV,HBV,HCMV,HS－V1和EBV)多重PCR的方法,其特点是通过合理设计引物和采用均一设计法(U10 *(108)及其实验,优化引物浓度组合及PCR条件,在同一个反应管中和同一个热循环条件下,对六种病毒中的1—6种进行扩增,并通过凝胶电泳分离和检测。该发明除具有经典PCR的灵敏度、快速、简便等特点以外,主要是实现了血液中六种病毒的同步检测,成本更低,能用于开发相关试剂盒,用于血源质量控制、临床诊断和病毒流行病控制。

Description

多种病毒同步检测的方法
本发明涉及病毒的检测方法，更具体涉及一种多种人类病毒基因的同步检测PCR(聚合酶链式反应)方法。
所说的多种病毒基因同步检测是指采用一套统一的试剂和同一个热循环程序，在同一个反应管中进行PCR扩增，检测多至六种重要的人类病毒。这些病毒包括：乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，艾滋病毒一型(HIV1)，人类巨细胞病毒(HCMV)，单纯疱疹病毒一型(HSV1)和EB病毒(EBV)。它们对人类健康危害严重，导致各种恶性肿瘤或传染病。如HBV和HCV导致肝炎，HBV的感染率长期高达10％以上，大约90％的输血后肝炎由HCV引起。HIV1能导致爱滋病(AIDS)，AIDS是严重威胁人类生命的疾病之一，其病死率高于癌症，被认为是世纪超级癌症。HCMV是引起人类先天畸形的重要原因之一，它还可使细胞转化，可能与人的恶性肿瘤的发生有关。HSV能引起多种人类疾病，并被认为与宫颈癌的发生有关，其中单纯疱疹性脑炎(HSE)是一种死亡率很高的疾病。EBV感染十分普遍，与多种疾病相关，主要包括淋巴细胞增殖性疾病，非淋巴细胞的恶性肿瘤和自身免疫性疾病三大类，其中如鼻咽癌、Burkitt’s淋巴瘤、Hodgkin病和免疫缺陷相关淋巴瘤。所有这些病毒均可能通过血液传播。主要传播方式如输血和血液制品注射。因此，血源质量控制是阻止这类病毒及病毒病传播的重要环节。已经有许多方法用于检测血液中病毒，如细胞学方法，免疫学方法、基因诊断(基因探针、PCR)，等等。其中，以PCR法的灵敏度最高，如果能严格控制实验环境与条件，克服假阳性，PCR在临床上将被广泛使用。
然而，现有的PCR方法每次扩增只针对一种病毒，如果有一份血样，要检测是否含有上述病毒中的一种或多种，则需要分别进行多次PCR反应，因而费时费力，耗费药品试剂多，检测成本高。
随着卫生水平的提高，对血液质量的控制受到空前重视，对血液制品和血源的检测要求越来越高，指标也会增加，现有的PCR方法显然不能满足要求。学者们正在发展所谓多重PCR(Multiplex PCR)方法，即在一个试管中、在同一种反应条件下对两个或两个以上的不同靶基因进行同步扩增(Chamberlain，J．S_Gibbs，R．A_Rarier，J．E_Nguyen，P．N_and Caskey，C．T．(1988)Deletionscreening of the Dchennne muscular dystrophy locus via multiplex DNAamplification．Nucleic Acids Res．11141-11156)。这样能大大提高PCR的效率。该方法也被用于临床病毒的检测，相关的研究有：爱滋病毒I和II型同步扩增(Udaykumar，Heredia A_Soriano，V_Bravo，R_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1994)Enhanced diagnostic efficiency of the polymerase chain reaction by co-amplification of multiple regions of HIV-1 and HIV-2．J．Virol．Methods 49：37-46)，四种逆转录病毒的同步扩增(Heredia，A_Soriano，V_Weiss，S．H_Bravo，R_Vallejo，A_Denny，T．N_Epstein，J．S_and Hewlett，I．K．(1996)Development of amultiplex PCR assay for the simultaneous detection and discrimination of HIV-1，HIV-2，HTLV-I and HTLV-II．Clin．Diagn．Virol_7：85-92)，三种肝炎病毒(HCV、HBV-C／HGV)的同步扩增(Caudai，C_Padula，M．G_Bettini，V_and Valensin，P．E．(1998)Detection of HCV and GBV-C／HGV infection by multiplex PCR in plasmasamples oftransfused subjects．J．Virol．Methods，70：79-83)。这些方法显然具有重要的临床应用价值。然而，随着靶基因数目的增加，加入的PCR引物对就越多，影响因数越复杂。例如，引物越多，存在同源序列可能性就越大，不同引物之间或引物与非靶基因之间发生区域碱基配对的机会就越多，从而干扰PCR；不同引物具有不同的Tm值(变性温度)，给热循环程序设计带来困难，多重PCR假阳性率或假阴性率远高出经典PCR。因此，必须对多重PCR进行条件优化，而优化过程往往需要做大量的实验。
均匀设计是一种建立在均匀分布理论上的实验设计方法，比正交设计效率更高。例如，对于一个6因素、10水平的实验，所有可能性组合的实验次数为106，正交实验至少需要1000次，而均匀设计只要10次，而所获得的结果近似。(Fang K．T_and Wang，Y．(1993)Number-Theoretic Methods in Stastistics，Chapman and Hall，London；Tian G．L_and Fang，K．T．(1999)Uniform designs formixture-amount experiments and for mixture experiments under order restrictions．Sciences in China Ser．A．42：456-470；Wang，Y_and Fang，K．T．(1996)Uniformdesign of experiments with mixtures．Sciences in China Ser．A．39：264-275)。均匀设计表表示为U* x(Xy)，x为最大因子数，Y为水平数，*为新的均匀排布。每个均匀设计表附有一个应用表，指示从均匀分布表中选择哪一栏来设计实验。均匀设计由于效率高，已经成功地在药物设计和微生物发酵中获得应用(Zhang W_Yu X．J_and Yuan，Q．(1994)Uniform design：a new approach of design fermentationmedia．Bio／Techniques，7：379-384．)。
本发明的目的是提供了一种多种病毒同步检测的方法，该方法通过设计专用扩增引物，给出六种病毒的同步检测的多重PCR条件，该方法易行，能快速、简便地同步检测血液中六种病毒。
为达到上述目的，本发明采用以下技术措施：设计合适的引物，使引物之间不发生干扰，并具有相似的扩增条件；将目标集中PCR引物浓度上，它是影响多重PCR的关键因素，固定其它反应条件，采用均匀设计方案，用较少的实验次数优化引物浓度；利用优化的条件对所有6种病毒同时或单独地进行保守基因扩增，进而通过琼脂糖凝胶电泳分离和检测相应的病毒。其步骤是：
A．设计一套用于同步扩增六种病毒HIV1、HCV、HBV、HCMV、HSV和EBV的引物，各引物针对相应病毒高度保守基因，不同引物的退火温度近似，引物两两之间无三碱基以上之互补，PCR产物两两长度之差大于30-50bp，以利于琼脂糖凝胶分离；
B．优化多重PCR的引物浓度组合均匀设计，将扩增某一特定病毒靶基因的一对引物定义为一个因素，共6个因素，设每个因素的浓度范围为0．1μmol／L-0．6μmol／L，共10个水平，采用均匀设计表U10 *(108)及其附表(使用表)设计实验方案；
C．六种病毒的靶基因同步扩增，反应体系：反应体积30μl，Taq酶1．5U，缓冲液：1×，Mg++：2．5mmol／L，dNTPs 300μmol／L，按均匀设计方案加入引物，反应在PE480热循环仪上进行，采用同一个热循环条件；反应完毕以后通过琼脂糖凝胶电泳并在紫外灯下观察和记录结果。
D．优化条件的验证，由于在同一份血液样品中同时出现六种病毒的几率非常小，需要验证所建立的六重PCR条件是否能检测每种病毒单独或同时存在，因此，在优化条件下分别进行进行1-3重PCR扩增，并采用凝胶电泳分离检测结果。
图1为多重PCR条件优化实验结果。
用均匀设计组合的一组十个条件来优化六重PCR，其中3，4，5，6四个条件下有非特异性的产物，如白色箭头所示；在第8条件(第8泳道)下所有的预期产物均得到了很好的扩增，且没有非特异性的产物。凝胶电泳条件：1．7％琼脂糖凝胶，0．5×TBE缓冲液，0．5μg／μL溴化乙锭预染色，60V稳压电泳3-4小时，紫外灯下观察并照相记录结果。
图2为所建立的PCR条件的验证。
M，pUC19／Msp标记分子量；1，六种病毒同步扩增；2，HIV1；3，HCV；4．HBV；5，HCMV；6，HSV1；7，EBV；8，三重扩增：HIV1，HCV和HBV；9，两重扩增：HCMV和HSV1；10，两重扩增：HCV和HBV；11，阴性对照；12，HBV基因组；13，HCMV基因组；14，HSV1基因组。凝胶电泳条件：1．7％琼脂糖凝胶，0．5×TBE缓冲液，0．5μg／μL溴化乙锭预染色，60V稳压电泳3-4小时，紫外灯下观察并照相记录结果
下面结合附图对本发明作进一步详细描述：
1．PCR引物设计(表1)，共6对引物，各引物的靶基因为相应病毒高度保守区域基因，引物的退火温度为56℃-64℃，引物两两之间无三碱基以上之互补，PCR产物两两长度之差大于30-50bp，以利于琼脂糖凝胶分离，引物均委托商家合成；表1 PCR引物*
序号 靶基因 引物名称 引物长度(bp)     引物序列(5’→3’) 产物长度(bp)
1  HIV1Gag  SR71SR72     2222  GCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATCTTTCCCCCTGGCCTTAACCG  100
 2  HCVCore  LL11LL12     1820  GGGGGACAGGAGCCATCCCGCGCGACTAGGAAGACTTC  151
 3  HBVHBsAg  TY1TY2     2020  TCACCAACCTCTGTCCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGG  208
 4  HCMVPp71  CZ11CZ12     2020  TGACGTTGCTCCGTGGAAAGTGACGCGCATACATCCCGAG  316
 5  HSV1Po1  HP11HP12     2120  GGTGAACATCGACATGTACGGCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC  464
 6  EBVGp350  ZZ11ZZ12     2020  CGCCATCCTCCATAATACACCATCCAGAGCCTGATCCATC  617
*每对引物中的前一个为上游引物，后一个为下游引物。
2．模板DNA的制备，六种病毒靶基因分别克隆在质粒T载体上(表2)；质粒保存在TE缓冲液(Tris-EDTA)中，-20℃贮存，采用常规的酚-氯仿-蛋白酶K法从感染病毒的细胞培养液中提取HSV1和HCMV基因组，从乙型肝炎病人阳性血清中提取HBV基因组；表2．载体质粒及克隆的病毒靶基因或基因组
质粒编号 病毒及克隆的靶基因及基因组
PTZA9707  HIV1，基因组9707bp，gag(核心蛋白基因)
PTZYG3800  HBV，基因组3800bp，HbsAg(表面抗原基因)
PTZBG573  HCV，core(核心抗原基因)，573bp
PTZX1418  HCMV，pp71(磷酸蛋白基因)，1418bp
PTZPY625  HSV1，pol(RNA聚合酶基因)，625bp
PTZEB723  EBV，gp350(表面抗原基因)，723bp
3．多重PCR引物浓度的均匀设计，将扩增某一特定病毒保守基因的一对引物定义为一个因素，共6个因素，将因素的水平范围确定为0．1μmol／L-0．6μmol／L共10个水平，采用均匀设计表U10 *(108)设计实验方案(表3)，根据附表(使用表)中第6行指示的列号，从均匀设计表U10 *(108)中找出相应的列(1、2、3、5、6、8)，确定引物浓度组合(表4)；表3用于六重PCR的均匀设计表及附表
水平     因子     附表(使用表)
1  2  3  4  5  6  7  8 因子数 列号 偏差
 1  1  2  3  4  5  7  9  10  2  16  0．1125
 2  2  4  6  8  10  3  7  9  3  156  0．1681
 3  3  6  9  1  4  10  5  8  4  1345  0．2236
 4  4  8  1  5  9  6  3  7  5  13457  0．2414
 5  5  10  4  9  3  2  1  6  6*  123568  0．2994
 6  6  1  7  2  8  10  9  5  *六重PCR即根据使用表中的第6行所指示的列号来从均匀设计表U10 *(108)中找出相应的列来设计实验。
7  7  3  10  6  2  5  8  4
 8  8  5  2  10  7  1  6  3
 9  9  7  5  3  1  8  4  2
 10  10  9  8  7  6  4  2  1
表4六重PCR中的引物组合
试管编号                                  因子(umol／L)
    HIV-1     HCV     HBV  HCMV  HSV1  EBV
 SR71  SR72  LL11  LL12  TY1  TY2  CZ11  CZ12  HP11  HP12  ZZ11  ZZ12
 1  0．100  0．156  0．211  0．322  0．433  0．600
 2  0．156  0．267  0．378  0．600  0．211  0．544
 3  0．211  0．378  0．544  0．267  0．600  0．489
 4  0．264  0．489  0．100  0．544  0．378  0．433
 5  0．322  0．600  0．267  0．211  0．156  0．378
 6  0．378  0．100  0．433  0．489  0．544  0．322
 7  0．433  0．211  0．600  0．156  0．322  0．267
 8  0．489  0．322  0．156  0．343  0．100  0．211
 9  0．544  0．433  0．322  0．100  0．267  0．156
 10  0．600  0．544  0．489  0．378  0．489  0．100
4．多重PCR反应，反应体积为30μl，Taq酶1．5U，缓冲液1×，Mg++2．5mmol／L，dNTPs 300μmol／L，模板DNA为六种克隆有病毒基因的质粒，每一种质粒加入量为100ng，反应在PE480热循环仪上进行，热循环条件见表5，反应完毕后通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，电泳条件为：1．7％琼脂糖凝胶，0．5×TBE缓冲液，0．5μg／μL溴化乙锭预染色，60V稳压电泳3-4小时，然后在紫外灯下观察并照相记录结果，如图1所示，在第8泳道中，所有六种靶基因都得到相对均匀扩增，而且没有非特异性扩增带的出现，应视为最佳的引物浓度组合条件(表6)；表5：PCR热循环条件
温度 时间(分钟) 循环次数
94℃变性反应 3 1
94℃变性反应 1 30
50℃复性反应 1
72℃延伸反应 2
94℃变性反应 1 1
50℃复性反应 1
72℃延伸反应 7
表6：按照均匀设计实验所得到最优六重PCR引物浓度组合(浓度单位：μmol／L)
 HIV-1  HCV  HBV  HCMV  HSV1  EBV
 SR71  SR72  LL11  LL12  TY1  TY2  CZ11  CZ12  HP11  HP12  ZZ11  ZZ12
    0．489     0．322     0．156     0．343     0．100     0．211
4．优化条件的验证：将上述PCR条件及优化的引物浓度组合(表6)应用于病毒基因的扩增，共14个扩增管，分别为：第1管，六重扩增六种病毒基因的克隆质粒；第2-7管，DNA模板为各单一的病毒基因克隆质粒，顺序为PTZA9707、PTZBG573、PTZYG3800、PTZX1418、PTZPY625和PTZEB723；第8管，三重扩增(PTZA9707、PTZBG573和PTZYG3800)，分别对应于HIV1，HCV和HBV；第9管，两重扩增(PTZX1418和PTZPY625)，分别对应于HCMV和HSV1；第10管，两重扩增(PTZBG573和PTZYG3800)，分别对应于HCV和HBV；第11管，阴性对照(不含DNA模板)；第12管，HBV基因组；第13管，HCMV基因组；第14管，HSV1基因组，结果见图2，所有泳道的病毒靶基因扩增产物都清晰可见，没有出现任何非特异性扩增，证明，无论所列六种病毒是混合存在还是单独存在，均能在所优化的多重PCR条件下被检出。
本发明与现有技术相比，除具有经典PCR技术的灵敏度、快速、简便等特点以外，主要是实现了血液中六种重要病毒的同步检测，成本更低，适合于开发相关多重PCR试剂盒，用于血源质量控制、临床诊断和病毒流行病控制。

Claims (1)

1．一种多种病毒同步检测的方法，该方法包括以下步骤：
A．设计用于同步扩增六种病毒HIV1、HCV、HBV、HCMV、HSV和EBV的引物，各引物针对相应病毒高度保守基因，引物的退火温度为56℃-64℃，引物两两之间无三碱基以上之互补，PCR产物两两长度之差大于30-50bp；
B．多重PCR引物浓度的均匀设计，将扩增病毒每个靶基因的一对引物定义为一个因素，设因素的水平范围为0．1μmol／L-0．6μmol／L，共10个水平，均匀设计表为U10 *(108)，通过凝胶电泳分离检测多重PCR结果；
C．六种病毒HIV1，HCV，HBV，HCMV，HSV1和EBV基因同步检测的PCR，反应体积30μl，Taq酶1．5U，缓冲液：1×，Mg++：2．5mmol／L，dNTPs300μmol／L，引物微摩尔浓度组合为；  HIV-1     HCV     HBV     HCMV     HSV1     EBV  SR71  SR72  LL11  LL12  TY1  TY2  CZ11  CZ12  HP11  HP12  ZZ11  ZZ12     0．489     0．322     0．156     0．343     0．00     0．211
反应在PE480热循环仪上进行，热循环条件：94℃、3分钟，1个循环；94℃、1分钟，50℃、1分钟，72℃、2分钟，30个循环；94℃、1分钟，50℃、1分钟，72℃、7分钟，1个循环。
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