CN102363818A

CN102363818A - 同时检测人ebv、bkv和 cmv的三重实时荧光定量pcr方法及试剂盒

Info

Publication number: CN102363818A
Application number: CN2011101771046A
Authority: CN
Inventors: 李全; 焦守恕
Original assignee: Tarcine BioMed Inc
Current assignee: Tarcine BioMed Inc
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: CN102363818B

Abstract

本发明“同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒”，属于医学分子生物检测技术。采用自己设计的三种病毒的三套引物和探针同时检测待测样本，试验证明，三套探针引物同时扩增待测模板或人工配置的验证标准品，都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量，且互不干扰。

Description

同时检测人EBV、BKV和 CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学分子生物检测技术。特别是一种可同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法及试剂盒。可应用于移植后病人或其他免疫抑制状态下病人血清或其他样品中三种病毒载量的同时监测。

技术背景

器官移植是现代医学的标志性学科之一。自1959年首例肾移植成功以来目前世界上已有70多万尿毒症患者接受了器官移植而获得新生，而且这个数字还在以每年近5万的速度增加。截至2003年，我国累计完成肾脏移植5万多例，现在每年完成超过5000例，数量仅次于美国位居世界第二位。中国约有100多万尿毒症患者，每年还有近12万的新增病人。对这些患者，肾脏移植是目前最重要的治疗手段。然而移植肾脏的长期存活，始终是肾移植成功与否的主要问题。

感染是器官移植手术后重要的并发症之一，也是造成器官移植失败的重要原因。在移植早期，感染造成的死亡率达40％-78％。随着新的免疫抑制药物的出现及其联合应用，使单一药物用量有所下降，从而使感染引起的移植早期死亡率显著下降。尽管如此，在导致器官移植受者死亡的原因中，感染仍居首位，其中病毒感染占很大的比例。移植后病毒感染早期可能没有明显的临床表现，对移植肾的损伤也不易被发现，感染后期却会影响移植肾的功能。同时，不同的病毒感染，往往需要不同的治疗方案才能奏效，因此，尽早诊断和预防病毒感染，同时进行病毒载量与感染情况的不断监测，对降低肾移植后病毒感染的危害有很大的临床意义。

巨细胞病毒(Cytomegalovirus CMV)，EB病毒，Epstein-Barr virus(EBV)以及BK病毒BK(polyomavirus BKV)是实体器官移植后最常见的病毒感染。即使在无症状的感染情况下，也会对移植器官造成影响。目前已经有多种检测方法用于病毒滴度或载量的检测。最常用的为免疫学方法和定量PCR方法。然而这些方法都只能同时检测一种病毒感染情况，病人要想了解这三种病毒的感染情况，至少得做三个检测。最近有前瞻性研究表明，这三种病毒存在共感染的情况，如果能有一种同时检测这三种病毒载量的方法，将会使检测过程变得方便、快速。

实时荧光定量PCR技术(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real TimePCR)以其快速、灵敏、特异、重复性好等特点前最常用病毒基因载量检测方法之一，广泛的应用在各种病毒上。特别是Taqman探针技术，应用更加广泛。在移植相关病毒检测领域目前已经有成熟的CMV，BKV，EBV病毒Taqman探针定量PCR检测试剂盒，均能够准确迅速的检测病毒的载量。然而如前所述，这些检测试剂盒均只能检测一个靶标。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒诊断检测领域。在移植后病毒检测方面，Kaoru Wada等用多重定量PCR技术，同时检测27例造血干细胞病人和19例肝移植病人全血样品中的HHV-6病毒，CMV以及EBV病毒共计303份样品，结果显示多重PCR体系与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。YasuhitoFunahashi等用多重定量PCR技术同时检测BKV病毒、JCV病毒以及腺病毒，同样取得良好结果。这些结果都说明了多重PCR技术用于病毒检测可靠性。但是到目前为止，尚无报道有同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能同时检测CMV病毒，EBV病毒以及BKV病毒的多重定量Taqman PCR方法，同时基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于人全血或尿液标本的检测。

一种同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中同时采用以下三套引物及探针：

CMV-FP：ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，

CMV-RP：GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，

CMV-探针：CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1；

EBV-FP：GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，

EBV-RP：ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，

EBV-探针：CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1；

BKV-FP：AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，

BKV-RP：TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，

BKV-探针：A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2；

CMV-探针，EBV-探针和BKV-探针的5’端标记的荧光素不同，分别为FAM，HEX和ROX。

所述实时荧光定量PCR的体系如下：

2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix：12.5ul，5uM CMV-FP：0.5ul，5uM CMV-RP0.5ul，uM CMV-探针1ul，5uM EBV-FP 0.5ul，5uM EBV-RP 0.5ul，5uM EBV-探针1ul，5uMBKV-FP 0.5ul，5uM BKV-RP 0.5ul，5uM BKV-探针1ul，待测模板1～3ul，补充双蒸水至25ul。

所述实时荧光定量PCR的反应程序如下：

Step 1 95℃ 15min，

Step 2 94℃ 60s，

Step 3 60℃ 60s，

Step 4 读数，Go to step 2 for 40个循环。

同时检测人EBV、BKV和CMV病毒的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针：

CMV-FP：ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，

CMV-RP：GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，

CMV-探针：CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1；

EBV-FP：GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，

EBV-RP：ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，

EBV-探针：CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1；

BKV-FP：AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，

BKV-RP：TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，

BKV-探针：A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2；

还包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三种病毒，每种病毒分别6个浓度梯度的18个标准品。

所述标准品的浓度梯度分别为1×10⁶拷贝/ul，1×10⁵拷贝/ul，1×10⁴拷贝/ul，1×10³拷贝/ul，1×10²拷贝/ul，1×10¹拷贝/ul。

还包括病毒DNA提取试剂。

还包括实时荧光定量PCR扩增所需的PCR缓冲液、Taq酶，dNIPs。

所述引物、荧光探针、PCR缓冲液、Taq酶和dNIPs混合呈PCR预混液。

本发明根据三种病毒的基因组序列特征，分别设计三种病毒的特异性引物和探针，探针分别用三种不同荧光素标。经试验证明，三套探针引物同时扩增待测模板或人工配置的验证标准品，都能够特异地正确反映三种病毒在样品中的存量，且互不干扰。

根据设计得到的三套引物及荧光探针，本发明提供了实时荧光定量PCR方法和试剂盒，并提供了优化的PCR体系和程序。当然本领域技术人员根据实时荧光定量PCR的一般要求可以调整PCR体系和程序，也同样能够实现检测的目的。

在本发明提供的试剂盒的一种优选实施方式中，在试剂盒中装入包括含有EBV、BKV和CMV三种病毒模板的呈浓度梯度的6份标准品，用于制备标准曲线。

为了更进一步提高试剂盒的方便程度，在制备的一些试剂盒中，装入病毒DNA提取试剂，实时荧光定量PCR所需的缓冲液，Taq酶，dNTPs等试剂。

在一个优选实施例中，优选将引物，探针，缓冲液，Taq酶，dNTPs等试剂按比例混合制成预混液，用于检测时，加入待测模板即可。

附图说明

图1单重扩增系统与三重扩增系统扩增三种病毒标准品建立的标准曲线

具体实施方式

实施例1三种病毒引物以及Taqman探针的设计和体系优化

根据NCBI公布的CMV、EBV和BKV病毒基因组序列，使用Primer Express 3(AppliedBiosystems)以及Primer Premier 5(Premier Biosoft International)引物设计软件，所设计引物以及探针序列如表1所示：

表1所设计的检测引物和荧光标记

三种引物扩增片段分别如Seq ID No.1～3所示

表1中标记于Taqman探针两端的HEX，BHQ1，ROX，BHQ2和FAM是本领域常用的Taqman探针的荧光标记物和淬灭基团，其全称如下：

以上引物探针由上海生物工程有限公司合成。

实施例2.三种病毒基因序列的克隆

定量PCR绝对定量的基础是构建标准曲线，根据所设计Taqman探针引物的序列，在其两端设计PCR引物，以ATCC(美国标准生物品收藏中心)CMV质粒、BKV病毒，BKV病毒标准质粒为模板，进行扩增，将扩增产物克隆到T载体上，进行转化并鉴定。最终得到克隆有目标序列的质粒标准品。再将其进行定量稀释，构建成标准曲线。具体操作步骤如下：1目标序列克隆引物的设计

根据Genebank中三种病毒的基因组序列，结合已经设计的Taqman探针引物序列，使用Primer Premier 6软件，设计三个病毒的克隆引物，其序列如下表2：

2目标基因PCR扩增

以ATCC标准质粒为模板，用以上三对引物分别对目标序列进行扩增，扩增体系如下：

PCR扩增条件如下：95℃预变性15min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，扩增30个循环；72℃延伸10min。(MJ research PTC-200)

3将目标基因克隆到T-easy Vector上

将PCR产物进行凝胶分离，并从凝胶中回收特定的PCR产物，并将其连接到Promega公司的pGEM-T Easy Vectors上，所有步骤按照说明书进行。

用连接产物转化感受态的DH5a菌(购于天根生化科技(北京)有限公司)，并进行蓝白斑筛选。阳性菌落首先进行PCR检测，PCR检测阳性的样品送往上海生工进行质粒DNA测序进一步确认阳性菌落。测序结果如Seq ID No.4～6所示。

4标准品的构建

培养细菌，用TIANGEN公司大量质粒提取试剂盒提取质粒，所有步骤按照说明书进行。用pH 8.0的TE缓冲液(购于天根生化科技(北京)有限公司)溶解质粒，用分光光度计对其进行浓度精确定量。

根据测定浓度将其稀释成每微升1×10⁸个拷贝浓度的储存液。并进行10倍梯度稀释到每微升10个拷贝。

实施例3.标准曲线以及多重荧光实时定量PCR(Triplex Real-time PCR)体系建立

将构建的三种质粒标准品分别稀释成1000000拷贝/ul，100000拷贝/ul，10000拷贝/ul，1000拷贝/ul，100拷贝/ul，作为扩增模板，分别建立多重扩增体系和单个扩增体系，体系配比如下：

三重体系：

单个体系：

扩增反应条件均为：

荧光定量PCR仪器为：MJ Research Chromo 4，分析软件，Opticon Monitor Version 2.03，MJ Research

结果：如表3以及图1所示，每个基因的标准品同一浓度在单重扩增体系和多重扩增体系中的Ct值基本上一致，说明各个扩增之间没有干扰，从扩增结果图(图1)可以看出，不管是多重扩增还是单重扩增，扩增结果的线性都非常好，线性系数均大于0.99，说明设计的引物探针以及扩增体系，可以很好的扩增目标基因。

表3：单个扩增系统与三重扩增系统ct值比较

实施例4三种基因同时扩增干扰分析，检测体系重复性分析

配制以下病毒质粒样品混合液进行测试：

1#CMV 10000拷贝/反应，EBV10000拷贝/反应，BKV10000拷贝/反应；

2#CMV 5000拷贝/反应，EBV5000拷贝/反应，BKV5000拷贝/反应；

3#CMV 200拷贝/反应，EBV200拷贝/反应，BKV200拷贝/反应；

4#CMV 10000拷贝/反应，EBV5000拷贝/反应，BKV200拷贝/反应；

5#CMV 5000拷贝/反应，EBV10000拷贝/反应，BKV200拷贝/反应；

6#CMV 200拷贝/反应，EBV5000拷贝/反应，BKV10000拷贝/反应；

7#CMV 10000拷贝/反应，EBV200拷贝/反应，BKV5000拷贝/反应；

8#CMV 5000拷贝/反应，EBV10000拷贝/反应，BKV200拷贝/反应，混合于含有200ng/ml人基因组DNA的溶液里；

9#CMV 200拷贝/反应，EBV5000拷贝/反应，BKV10000拷贝/反应，混合于含有200ng/ml人基因组DNA的溶液里；

10#CMV 10000拷贝/反应，EBV200拷贝/反应，BKV5000拷贝/反应，混合于含有200ng/ml人基因组DNA的溶液里；

采用实施例3的三重体系对混合配制的样品进行扩增，每个样品测试10个重复样，测定完成后，计算结果的准确性以及变异系数cv％。

结果如表4所示，在三重体系中，各样品回收率均在90％-110％之间，测定的变异系数均小于15％。在含有人基因组DNA的样品中(样品8#，9#，10#)，扩增结果的回收率和变异系数与没有混入的没有差别，说明人基因组DNA对所设计的引物探针的特异扩增没有干扰。

表4：三重体系中不同浓度组合的回收率以及变异系数

实施例5试剂盒的制备

试剂盒主要包括以下组分及其制备方法：

1#含有引物及荧光探针，Taq酶，dNTP以及其他扩增需要的预混体系，制备方法为：将设计和选择好的探针引物混入2×Quantitech Multiplex PCR NoRox Master Mix(Qiagen公司货号：204745)中，各引物探针的终浓度为0.2uM，混合均匀-20℃保存。使用时加入反应体系20ul。

2#含有三种病毒的质粒标准品，每种病毒质粒6个不同的浓度，浓度分别，1×10⁶拷贝/ul，1×10⁵拷贝/ul，1×10⁴拷贝/ul，1×10³拷贝/ul，1×10²拷贝/ul，1×10¹拷贝/ul；制备方法为：将三种质粒按照需要的浓度用无菌水稀释，-20℃保存。

3#阴性对照，不含任何模板DNA的水溶液；

4#病毒DNA提取试剂：采用QIAGEN公司生产的QIAamp DNA Blood Mini Kit中的试剂。

实施例6用试剂盒扩增临床样品

收集5例肾移植的病人的血清样品，用试剂盒检测样品的三种病毒的载量，其检测方法为：

1DNA提取：首先用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA，最终溶解在50ul洗脱液中。

2扩增体系设立：每次扩增，6个标准曲线点设复孔，共12管，阴性对照孔1孔，其他根据样品数量，每管取1#预混试剂的20ul，标准曲线孔每孔加入标准品5ul，阴性对照孔加阴性对照5ul，样品孔中加入提取的DNA5ul，混合好放入机器。

3曲线扩增：设定以下扩增条件进行扩增反应。

扩增反应条件均为：

4根据标准曲线计算样品中三种病毒的浓度，5例病人的病毒浓度测定结果如下。与采用现有的三种试剂盒(Qiagen HCMV DNA，达安基因EBV kit，北京同昕BKV kit)分别进行PCR扩增定量的结果基本一致。

Claims

1.同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应体系中同时采用以下三套引物及探针：

CMV-FP：ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，

CMV-RP：GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，

CMV-探针：CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1；

EBV-FP：GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，

EBV-RP：ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，

EBV-探针：CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1；

BKV-FP：AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，

BKV-RP：TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，

BKV-探针：A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2；

2.根据权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR方法，所述实时荧光定量PCR的体系如下：

3.根据权利要求1所述的三重实时荧光定量PCR方法，所述实时荧光定量PCR的反应程序如下：

Step 1 95℃ 15min，

Step 2 94℃ 60s，

Step 3 60℃ 60s，

Step 4 读数，Go to step 2 for 40个循环。

4.同时检测人EBV、BKV和CMV的三重实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如以下核苷酸序列所示的引物及荧光探针：

CMV-FP：ATC AAC ATA AGG ACT TTT CAC ACT TT，

CMV-RP：GAA TAC AGA CAC TTA GAG CTC GGG GT，

CMV-探针：CTG GCC AGC ACG TAT CCC AAC AGC A-BHQ1；

EBV-FP：GGA ACC TGG TCA TCC TTT GC，

EBV-RP：ACG.TGC.ATG.GAC.CGG.TTA.AT，

EBV-探针：CGC.AGG.CAC.TCG.TACTGC.TCG.CT-BHQ1；

BKV-FP：AGT GGA TGG GCA GCC TAT GTA，

BKV-RP：TCA TAT CTG GGT CCC CTG GA，

BKV-探针：A GG TAG AAG A GG TTA GGG TGT TTG ATG GCA CA G-BHQ2；

5.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，还包括EBV、BKV和CMV病毒基因的三种病毒，每种病毒分别6个浓度梯度。

6.根据权利要求5所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所述标准品的浓度梯度分别为1×10⁶拷贝/ul，1×10⁵拷贝/ul，1×10⁴拷贝/ul，1×10³拷贝/ul，1×10²拷贝/ul，1×10¹拷贝/ul。

7.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所还包括病毒DNA提取试剂。

8.根据权利要求4所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，还包括荧光实时定量PCR扩增所需的PCR缓冲液、Taq酶和dNIPs。

9.根据权利要求8所述的三重实时荧光定量PCR试剂盒，所述引物、荧光探针、PCR缓冲液、Taq酶和dNIPs混合呈PCR预混液。