CN101565741B - 实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测疫苗半成品、疫苗成品等样品中宿主DNA残留量的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应技术快速、定量检测疫苗半成品、疫苗成品样品中vero细胞残留DNA的试剂盒。

Description

实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒

技术领域

本发明涉及定性与定量检测Vero细胞DNA(即非洲绿猴基因组DNA)的试剂盒，特别是涉及以实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术快速、准确、定量检测疫苗样品中vero细胞残留DNA含量的试剂盒。

背景技术

Vero细胞是一种非洲绿猴肾细胞系的传代细胞，具有许多优点：与原代细胞相比，它不含有任何外源污染因子；它可从一个冻存安瓶的细胞通过培养扩增至相当大的量，具有良好的均一性；第三，原代细胞的获得必须靠手工操作，不适合工业化生产。其次，与人二倍体细胞相比，Vero细胞使用代次较高，培养更易，有利于大规模培养，所以，Vero细胞被认为是一种理想的疫苗生产基质，WHO推荐发展中国家用Vero细胞生产疫苗满足防疫需要。然而，用传代细胞株生产疫苗的一个重要问题是其安全性，表现为具潜在致瘤性的残留细胞DNA(Report of a WHO Study Group.WHO Technical Report Series.I987，747：7-25；GriffithsJ B.Continuous cell lines as substrates for biological[J].Bulletin d’informationnewsletter(International Association of Biological Standardization)1988，73：4-11)，因此WHO对精制疫苗中残留DNA有严格的限制，如WHO规定精制vero细胞狂犬病疫苗中残余vero细胞DNA含量不超过100pg/剂量(相当于100pg/ml)。残余vero细胞DNA含量是基于vero细胞生产的精制疫苗的主要质量控制指标之一，必须进行严格检定并纯化，使含量不能高于规定标准。

由于DNA残留含量的规定非常低，需采用较敏感的核酸杂交技术。而目前用于检测疫苗残留DNA的方法主要是分子杂交法，如利用随机引物方法，用地高辛(Dig)、酶、生物素或放射性同位素标记Vero细胞DNA，并制备成DNA探针，以此探针与待测样品总DNA以及已知浓度的参比样品DNA在硝酸纤维膜上进行点杂交，最后通过显色信号强度来判断样品中DNA含量。使用该方法，虽然灵敏度可以达到要求，但是操作周期长，一般需要2-3个工作日；其次，采用随机引物标记DNA探针的方法，稳定性和重现性较差；而且，通过杂交显色的强度来判定DNA含量的标准不客观。目前，也有研究报道对传统的随机引物标记探针的方法进行了改进，即直接用地高辛标记一段特异性的核酸片段制备成探针，但是还是存在周期长，判定DNA含量的标准不客观等因素，因此，迫切需要研究一种快速、准确、敏感和易于操作的检测试剂盒。

实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有核电偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种(Mackay IM et al.Real-time PCR in virology.Nucleic Acids Res.2002 5；30(6)：1292-1305；Lie，Y.S.，Petropoulos，C.J.，Advances in quantitative PCR technology：5’nuclease assays.Current Opinion in Biotechnology 1998.9，43-48.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。

与分子杂交方法相比，TaqMan PCR技术应用于定量检测中具有如下优点：通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析，摒弃分子杂交法受多种因素干扰的终点分析方法，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测疫苗纯化的效果；将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时、动态监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大缩短了结果分析时间，使得该方法更加快捷、方便；由于采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性；由于在普通PCR基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，有效结合了PCR和探针杂交的双重特异性，进一步提高了检测目标靶多核苷酸的特异性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的分子杂交方法，在病原体的定量或定性检测中得到十分广泛的应用。

美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。虽然已经有用实时荧光PCR技术(染料法)检测CHO细胞残留DNA的报道(Nissom PM.Specificdetection of residual CHO host cell DNA by real-time PCR.Biologicals.2007，35(3)：211-5.)，但在疫苗残留DNA的检测中，目前还没有可供快速检测用的荧光PCR检测试剂盒。因此，现在需要开发一种能够快速检测疫苗中残留DNA含量的试剂盒，满足疫苗生产与质检等工作的需要。

众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析疫苗样品中某特定靶核酸 的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人将实时荧光定量PCR技术开发了相应的试剂盒应用于非洲绿猴的所有已知变异体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测vero细胞DNA的试剂盒，特别是本试剂盒可用于检测疫苗样品中vero细胞残留DNA，从而对疫苗生产过程中进行质量监测。

本试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物和一条靶多聚核苷酸的特异性探针，在含有耐热DNA聚合酶、高质量的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg²⁺的PCR反应缓冲液中，通过荧光PCR扩增仪实现靶多核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测靶多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测疫苗样品中vero细胞残留DNA的试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其特征在于PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增的正向引物vero-F和反向引物vero-R的序列分别是5’-TTC TTT CCA GTT TTG AACGGA AGA TAT TTC CTT-3’(SEQ ID NO：1)和5’-TGT TCT TGT GGA ATT GGC AAA CGG ATATT-3’(SEQ ID NO：2)，其中正向引物vero-F可向5’和3’端方向各延伸5个碱基，反向引物vero-R可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。

根据本发明的-个优选实施方案，PCR扩增反应液中用于靶多核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针vero-P的序列是5’-CAT AGC CCT CTA TGG GCT TCC AAA TAT CCG TT-3’(SEQID NO：3)，其中该寡核苷酸探针序列可向5’和3’端方向各延伸5个碱基。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中DNA提取液由chelex-100、NaOH、EDTA组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中PCR扩增反应液由(a)耐热DNA聚合酶、(b)脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、(c)含镁离子的缓冲液、(d)能够与双链靶多核苷酸的第一条链结合的正向引物，(e)能够与双链靶多核苷酸的第二条链结合的反向引物，和(f)能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针组成。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.30～0.34μmol/L、探针浓度为0.20～0.25μmol/L；

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增反应液中的最佳镁离子浓度为 1.9～2.2mmol/L、耐热DNA聚合酶最佳用量为2U～4U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸最佳浓度为0.18～0.22mmol/L。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：93℃预变性2～3min；然后93℃ 45s，55℃ 1min，10个循环；最后93℃ 30s，55℃ 45s，30个循环。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中阳性质控品为vero细胞DNA，包括1.0×10⁴pgDNA/ml的强阳性质控品和1.0×10¹pgDNA/ml的临界阳性质控品。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中定量参考品为vero细胞DNA，包括4个浓度梯度：1.0×10⁴pg DNA/ml、1.0×10³pg DNA/ml、1.0×10²pgDNA/ml、1.0×10¹pgDNA/ml。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测出vero细胞DNA的最低浓度为1.0×10⁰pg DNA/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对vero细胞基因组DNA的基因保守区设计特异引物和探针，可检测出vero细胞基因组DNA，但不能检测出非vero细胞基因组DNA，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测疫苗半成品、成品等样品中vero细胞残留DNA的试剂盒；可为疫苗半成品、成品等生产环节提供等提供可靠的质控证据，为疫苗安全生产与使用提供重要保障。

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在疫苗检测中的使用方法，具体见实施例2。

附图说明

图1显示4个阳性参考品的检测结果图，4个阳性参考品的Ct值为18～29，扩增曲线有明显指数增长期，成S型，可明确判定为阳性

图2显示阴性参考品的检测结果图，7个阴性参考品的扩增曲线平直或斜向下且与基线无交叉，没有Ct值，可明确判定为阴性。7个阴性参考品包括中国仓鼠卵巢细胞CHO、HEK293细胞、人基因组DNA、狂犬病毒cDNA、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌。

图3显示线性与灵敏度标准品扩增结果的标准曲线。针对模板数为1.0×10⁵～1.0×10^-1pg/mL的反应体系进行TaqMan PCR分析。当Vero细胞基因组DNA为1.0×10⁰pg/mL时，检测样品的Ct值在34左右，为明显阳性，即检测下限灵敏度可达到1.0×10⁰pg/mL。绘制得到的标准曲线斜率为-3.77，在Y轴截距为21.94，相关系数(R²)＝0.996。

图4显示同一份阳性标本10次重复性实验的检测曲线，可看出不同的扩增曲线均在同一Ct值范围，变异系数CV＜6％，说明试剂盒的重复性好。

图5显示10个疫苗半成品和成品样本的扩增曲线。其中2个样本无Ct值，可明确判定为阴性；另外8个样本的Ct值分别是23.71，27.10，28.59，29.22，29.99，31.37，32.24，33.33；结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。

具体实施方式

下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：vero细胞DNA检测试剂的研制

1、引物和探针的设计：通过对Genbank数据库已有的非洲绿猴全部核酸序列以及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以与vero细胞有关的主要基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，利用软件和人工设计多对引物和探针。

2、样本的选择：根据疫苗生产各环节的需求，可以选择疫苗半成品、成品等需要对Vero细胞残留DNA质控的样本。

3、疫苗样品DNA提取试剂的选择与优化

分别采用TAKARA抽提试剂盒、项目组自主研发的DNA提取液提取疫苗样品DNA，以及直接取疫苗样品液作为DNA模板，用此三种方法分别获得巴斯德狂犬疫苗产品、辽宁成大公司狂犬疫苗产品、广州诺诚公司狂犬疫苗产品以及广州诺诚公司狂犬疫苗半成品的DNA模板后，同时做FQ-PCR分析，通过多次重复实验，结果表明：项目组自主研发的DNA提取液所提取的DNA损失小，得率高，结果稳定。通过进一步优化chelex-100、NaOH、EDTA等组分可以用于疫苗样品DMA的提取。

4、反应体系的建立与优化

样品的准备：以猴肾细胞系VERO E6(IgRCD4)作为阳性参考品；以中国仓鼠卵巢细胞CHO、HEK293细胞、人外周血单核细胞、狂犬病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌作为阴性参考品。按照实施例2中的方法提取上述阳性参考品与阴性参考品的DNA待用。

引物探针的筛选：以上述1中设计的多组引物探针分别检测上述的阳性参考品与阴性参考品的基因组DNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物探针组合(如序列表中SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3)。

引物探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.15μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的引物和从0.075μmol/L至0.5μmol/L浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的引物浓度为0.30～0.34μmol/L、探针浓度为0.20～0.25μmol/L。

镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为1.9～2.2mmol/L。

酶用量的优化：在40μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的酶用量为2U～4U/反应。

dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.18～0.22mmol/L。

反应温度的优化：根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：93℃预变性2～3min；然后93℃ 45s，53℃ 1min，10个循环；最后93℃ 30s，53℃ 45s，30个循环。

5、灵敏度实验：提取阳性参考品vero细胞的DNA，经紫外分光光度计测定OD260与OD280数值，计算出原液浓度为7.4×10⁷pg/mL，稀释成浓度为1.0×10⁶pg/mL，然后10倍梯度稀释成1.0×10⁵pg/mL、1.0×10⁴pg/mL、1.0×10³pg/mL、1.0×10²pg/mL、1.0×10¹pg/mL、1.0×10⁰pg/mL、1.0×10^-1pg/mL作为阳性灵敏度参考品，检测结果表明，本试剂盒的检测下限灵敏度为1.0×10⁰pg/mL。

6、疫苗样本检测；以疫苗半成品、成品作为待检标本，分别用DNA提取液煮沸法提取标本的基因组DNA后，经上述优化建立的核酸扩增体系检测，结果表明本试剂盒可以很灵敏的检测出疫苗样品中的Vero细胞残留DNA。

实施例2：vero细胞残留DNA检测试剂盒及其使用

1、制备包括下列组成成分的试剂盒：DNA提取液(500μl/管)2管、PCR扩增反应液(40μl/管)20管、阴性质控品(100μl/管)1管、阳性质控品(50μl/管)1管、定量参考品(50μl/管)4管。

2、标本采集、运送和保存

(1)标本采集：包括各种用Vero细胞作为培养基质生产的疫苗半成品、成品等，按照国家生物制品检定所取样要求进行操作，密闭送检。

(2)标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送时应保存在0℃～8℃。

3、检测步骤

(1)样品处理与DNA提取

疫苗冻干粉末：先用生理盐水或成品包装盒自带的溶解液进行适当稀释溶解成疫苗液体 样品，混匀备用；

疫苗液体样品：直接混匀后备用。

取疫苗液体样品50μl，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，12,000rpm离心5分钟，备用。

(2)PCR反应与结果分析

分别取阴性质控品、标本、阳性质控品、定量参考品品各5μl，加入PCR反应管中进行PCR扩增。PCR循环条件是：93℃预变性3min；然后93℃ 45s，53℃ 1min，10个循环；最后93℃ 30s，53℃ 45s，30个循环。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)(参见附图3所示)。由附图1可以看出，阳性样品的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，由交点所在位置得出Ct值分别为18.26，22.60，26.04，28.85；在附图2中，由于阴性标本的荧光曲线低于阈值，故没有Ct值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即4个样品中Vero细胞残留DNA的浓度分别为：4.87×10⁴、2.46×10³、2.31×10²、3.35×10¹pgDNA/ml。。

实施例3：应用Vero细胞DNA检测试剂盒定量检测疫苗样品

疫苗样品来自巴斯德狂犬疫苗产品(冻干粉末)、辽宁成大公司狂犬疫苗产品(冻干粉末)、广州诺诚公司狂犬疫苗产品(冻干粉末)以及广州诺诚公司狂犬疫苗半成品(液体样品)，样品处理与DNA提取、PCR反应与结果分析参照实施例2进行。

PCR反应结束后，根据扩增曲线先调节分析参数，使标准曲线(Std curve)窗口下的标准曲线达到最佳(即相关性数值绝对值＞0.97)，然后分析疫苗样品。10个疫苗样品的检测结果如附图5所示：其中2个样本无Ct值，可明确判定为阴性；另外8个样本的Ct值分别是23.71，27.10，28.59，29.22，29.99，31.37，32.24，33.33，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。参照同一次试验中线性定量参考品的标准曲线图(如附图3所示)可以判定8个阳性疫苗标本中Vero细胞残留DNA的浓度分别为：2.53×10³、2.42×10²、8.62×10¹、5.60×10¹、3.28×10¹、1.27×10¹、6.92×10⁰、3.27×10⁰pgDNA/ml。

序列表 

Claims (8)

1.一种检测疫苗样品中vero细胞残留DNA含量的试剂盒，该试剂盒包括：(1)分别装有DNA提取液、PCR扩增反应液、阴性质控品、阳性质控品和定量参考品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中PCR扩增反应液由耐热DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、含镁离子的缓冲液、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针组成，其特征在于用于靶多核苷酸扩增的正向引物和反向引物的序列分别为5’-TTC TTT CCA GTT TTG AAC GGA AGA TAT TTC CTT-3’和5’-TGT TCT TGT GGA ATT GGC AAA CGG ATA TT-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中所使用的寡核苷酸探针的序列为5’-CAT AGC CCT CTA TGG GCT TCC AAA TAT CCG TT-3’。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中正向引物浓度为0.30～0.34μmol/L，反向引物浓度为0.30～0.34μmol/L，寡核苷酸探针浓度为0.20～0.25μmol/L。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中耐热DNA聚合酶的浓度为2U～4U/反应。

5.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为0.18～0.22mmol/L。

6.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于PCR扩增反应液中镁离子浓度为1.9～2.2mmol/L。

7.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于待检样品选自基于vero细胞基质培育制备的所有类型的疫苗半成品、疫苗成品。

8.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于待检样品中残留DNA来自vero细胞。

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