CN116790822A - 一种应用数字pcr检测狂犬疫苗dna残留的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，包括步骤：提取人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品中的DNA；建立数字PCR体系；制备微滴；进行数字PCR扩增；通过经数字PCR扩增得出的人用狂犬病疫苗样品中Vero细胞DNA残留拷贝数浓度，计算为国标单位值。根据狂犬病毒的GP基因序列设计引物和探针，并对反应条件和反应程序的优化，通过特异性和重复性试验对建立数字PCR方法进行评估，从而建立了应用数字PCR检测人用狂犬病疫苗DNA残留的方法，本方法特异性好且重复性好，本方法易于操作，可在较短时间内完成样品的检测；特别是由于其不涉及标准品，能够大幅提高检验效率和检验精准度，具有十分重要的借鉴和推广意义。
Description
技术领域
本发明涉及多价疫苗中各组分DNA比例检测技术领域，尤其涉及一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法。
背景技术
微滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是近几年发展起来的第三代PCR技术,是一种核酸分子绝对定量技术。其中应用最广泛的是微滴式数字PCR（ddPCR），其方法是通过油包水（反应液）将反应液分为数万个独立的纳米级微滴，在每个微滴完成PCR反应，完成后通过微滴读取仪对逐个微滴进行检测记录，软件自动读取统计带荧光（阳性，蓝色）与未带荧光（阴性，黑色）微滴个数与比例，并自动计算出拷贝数，从而实现对核酸的绝对定量，检测灵敏度提高到单分子水平。目前，微滴式数字PCR平台中的逆转录微滴式聚合酶链式反应（reverse transcriptase droplet digitalpolymerase chain reaction，RT-ddPCR）无需单独进行逆转录反应，可直接对DNA进行定量。
微滴式数字PCR（Droplet digital PCR，ddPCR）是近几年发展起来的第三代PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术，方法是通过油包水（反应液）将反应液分为数万个独立的纳米级微滴，在每个微滴完成PCR反应，完成后通过微滴读取仪对逐个微滴进行检测记录，软件自动读取统计带荧光（阳性，蓝色）与未带荧光（阴性，黑色）微滴个数与比例，并自动计算出拷贝数，从而实现对核酸的绝对定量。
狂犬病（rabies）是由狂犬病毒属（Lyssavirus）病毒引起的一种人畜共患急性传染病，发病后通常导致急性脑炎或脑膜炎，病死率几乎100%。暴露后处置（PEP）主要包括狂犬病疫苗和狂犬病免疫球蛋白（HRIG）的应用，是暴露后预防狂犬病发生的唯一有效手段。
目前，国内已上市人用狂犬病疫苗生产用细胞基质主要包括原代细胞系(primarycell lines，PCLs)、传代细胞系(continuous cell lines，CCLs )及二倍体细胞系(diploidcell lines，DCLs)，代表性的细胞基质分别为原代地鼠肾细胞、Vero细胞和MRC-5细胞，其中以采用Vero细胞生物反应器发酵生产为主。但Vero细胞残余DNA具有致瘤性、外源因子传播和致畸性等安全风险，为保证产品质量，确保患者用药安全，确认生产过程中残余DNA量实属必要。
《中国药典》三部（2015版）中收录了通过RT-PCR技术对Vero细胞DNA残留量进行检测。荧光法可测定来源于人及表达宿主样品中的双链DNA，方便快捷，但容易受RNA、ssDNA、dsDNA的干扰，且容易受到标准品的影响，这种影响主要是指标准品在运输、储存过程中由于处理不当导致标准品降解、失活。
发明内容
本发明提供一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法的检测方法，以克服上述问题。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，包括以下步骤：
S1：提取人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品中的DNA，其中所述人用狂犬病疫苗以Vero细胞作为疫苗生产细胞；
S2：以步骤S1的DNA为模板，以加入狂犬病毒的糖蛋白（GP）基因的上游引物、下游引物及探针来建立数字PCR体系；
步骤S2中所述的上游引物如SEQ NO:1所示，下游引物序列如SEQ NO:2所示，探针序列如SEQNO:3所示；
S3：制备微滴：将建立好的数字PCR反应体系加入至微滴生成板中与微滴生成油生成微滴，并封膜；
S4：进行数字PCR扩增；
S5：通过经数字PCR扩增得出的人用狂犬病疫苗样品中Vero细胞DNA拷贝数浓度，计算出狂犬病疫苗样品中Vero细胞DNA残留量的国标单位值。
优选的，所述数字PCR体系的总体积为22μL，在所述数字PCR体系中，所述上游引物的终浓度为30μM，所述下游引物的终浓度为30μM，所述探针的终浓度为10μM，所述DNA模板的终浓度为10-5μg/ml。
优选的，所述数字PCR扩增的程序为：42°C 60min，95°C10min；95°C 0.5min，58°C1min，共50个循环；最后维持在4°C；每步升降温速度为2°C/s。
本发明根据狂犬病毒的糖蛋白（GP）基因序列的特征，设计出相应的引物和探针，同时验证本方法的特异性、灵敏性以及重复性。通过试验发现本数字PCR法的最适退火温度为：58℃，最优的引物浓度及探针浓度分别为30μM和10μM；此外采用数字PCR同时检测浓度为10-4(μg/ml)的3份样本，每个浓度重复3次，每隔1周进行一次实验重复，通过批内重复性试验变异系数0.64%、0.81%、0.97%，批间重复性试验变异系数12.43%、0.64%、0.41%，CV值的变异系数小于5%，可见本方法具有良好的重复性，可用于狂犬疫苗Vero细胞DNA残留的快速检测和定量分析。
优选的，步骤S3中，封膜温度为180℃，时间为5s。
本发明的有益效果是：
本发明根据狂犬病毒的糖蛋白（GP）基因序列设计引物和探针，并对反应条件和反应程序的优化，同时通过特异性和重复性试验对本发明所建立数字PCR方法进行评估，从而建立了应用数字PCR检测人用狂犬病疫苗DNA残留的方法，本发明所建立的人用狂犬疫苗数字PCR方法特异性好且重复性好，本方法易于操作，可在较短时间内完成样品的检测；本方法对狂犬疫苗的生产、销售和使用领域的质量检验中具有重要的实用价值，特别是由于其不涉及标准品，能够大幅提高检验效率和检验精准度，具有十分重要的借鉴和推广意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中公开的一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法的人用狂犬疫苗基因及NTC孔生成微滴总数量图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例提供的一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法的建立及应用效果验证：
1、材料方法
1.1、疫苗：
狂犬病疫苗原液为大连雅立峰购买，规格为1ml，批号为DG2021003 ；
1.2、主要仪器、试剂及耗材：
本发明所选用的仪器包括：伯乐微滴自动生成仪（QX200)，伯乐微滴自动读取仪（QX200)，伯乐PCR仪（T100)，伯乐PCR热封仪（PX1)；
所选用的实验试剂及耗材包括：聚乙二醇辛基苯基（西格玛282103），一步法微滴数字PCR试剂盒（伯乐1864021），热封膜（伯乐1814040），ddPCR 96孔板（伯乐12001925），DG32 自动化微滴生成卡（伯乐 1864108），系统废弃枪头盒（伯乐1864125），ddPCR枪头盒（伯乐1864120），探针法自动化微滴发生油（伯乐1864110），ddPCR微滴读取油（伯乐1863004），Vero细胞DNA残留检测试剂盒（湖州申科），宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（磁珠法）（湖州申科SK030203D100）；
1.3、引物探针设计及合成：
从NCBI网站获得狂犬病毒的糖蛋白（GP）基因序列，应用Primer软件对狂犬病毒GP基因序列进行探针引物设计：
引物及探针均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成；
1.4、提取并稀释人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品中的DNA：
1.4.1样品提取：在100μl样品和100μl NCS（阴性质控品）中依次加入10μl NaCl、15μl蛋白酶K和30μl样品缓冲液（湖州申科NND021），充分振荡混匀后，离心10s，放入55℃水浴１小时；从水浴中取出样品，快速离心10s，依次加入200μl结合液，200μl异丙醇，15μl磁珠（磁珠加入前需振荡混匀）；振荡混匀；
将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上振荡5min，快速离心10s后静置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清；
从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入700μl洗涤液A（湖州申科NND014），振荡使磁珠和洗涤液A混匀，快速离心10s后，将离心管置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液；
从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入700μl洗涤液B（80%乙醇），振荡使磁珠和洗涤液B混匀，快速离心10s后，将离心管置于磁性分离架上，待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液；
将离心管再次快速离心10s，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用10μl枪头小心的将残余液体吸除干净；从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥1分钟，除去残留乙醇；
沿离心管壁加入150μl洗脱液（湖州申科NND018），轻微振荡使磁珠和洗脱液混匀，70℃水浴7min，水浴过程中再次振荡混匀2次；
孵育完成后，将离心管快速离心10s，然后至于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移到干净的离心管中，所得即为提取的样品DNA；
1.4.2样品稀释：取6支干净的0.2ml薄壁PCR管，分别标记为①，②，③，④，⑤。按下表依次进行稀释，获得浓度为5*10-4ng/μl的DNA模板；
| 名称 | 稀释 | DNA稀释浓度(μg/ml) |
| DNA初始浓度 | NA | 20 |
| ① | 10μl 初始浓度+ 190μl 超纯去离子水 | 1 |
| ② | 10μl ①+90μl 超纯去离子水 | 10-1 |
| ③ | 10μl ②+90μl 超纯去离子水 | 10-2 |
| ④ | 10μl ③+90μl 超纯去离子水 | 10-3 |
| ⑤ | 10μl ④+90μl 超纯去离子水 | 10-4 |
1.5、对引物和探针分别进行稀释：
根据样品管上标识用超纯去离子水分别对引物探针进行稀释，使引物终浓度为30μM，探针终浓度为10μM，分装并置于-20℃储存；
上游引物：5’-GAATTGTAACACCCCTACAATGGATGCC-3’（SEQ NO:1）；
下游引物：5’-CCTGGATCCTCTACAATGGATGCTTAG-3’（SEQ NO:2）；
探针：5’-TIGTACTCCAGTTRGCACACAT-3’（SEQ NO:3）；
1.6、方法的建立
1.6.1、制备PCR反应体系：
将Vero细胞DNA残留检测试剂盒（湖州申科）的各组分：DNA聚合酶，300mM二硫苏糖醇（DTT）以及引物、探针放置于冰上融化，待完全融化后，轻微振荡混匀，短时间快速离心5s；
取1支1.5ml EP管，置于冰盒上。根据ddPCR反应要求，配置N（样品复孔数+NTC孔数）×1.3个孔的反应液；
ddPCR反应体系配置如下表：
| 组分 | 单孔加入量（μl） |
| DNA聚合酶 | 5 |
| 300mM 二硫苏糖醇（DTT） | 1 |
| 30μM上游引物 | 0.6 |
| 30μM下游引物 | 0.6 |
| 10μM探针 | 0.5 |
| 超纯去离子水 | 10.3 |
配制完成后，震荡混匀15s，离心去除气泡；
将ddPCR 96孔板置于冰盒上，根据仪器出厂说明书要求反应体积至少22ul，因此原20ul反应体系增加10%的加入量，即每个反应孔分别倒吸加入19.8µl上述配置的反应体系，再加入2.2µl浓度已稀释至5×10-4ng/μl的DNA模板，NTC孔中只加入2.2µl超出去离子水；
1.6.2、制备微滴：
1.6.2.1、准备阶段：
热封仪使用前需提前10min打开，预热至180℃；将加好反应体系的96孔板置于热封仪上的96孔板固定器上，将热封膜有红线标记的一面朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的热封仪对其进行封膜，运行程序为：热封温度180℃，热封时间5s；通过是否能够轻易揭开封板膜来确认各样品孔是否密封好，将封好的96孔板充分震荡混匀15s，高速离心机200g条件下离心30s~1min，观察反应液无气泡，准备进行反应微滴的制备；
1.6.2.2、微滴制备阶段：
提前插上微滴生成仪电源，仪器自检后，界面显示Oil Type，触屏选择Probe微滴生成油；轻轻上拉打开仪器的门，将微滴生成卡，吸头废物箱，去除盖子的吸头盒，密封好的ddPCR 96孔板以及放在冰盒上接收微滴的96孔板依次放入微滴生成仪指定位置，放置完成后底部会亮起绿灯，并且触屏界面会显示绿色的Ready；注意微滴生成仪所在房间温度不宜过低，最好在25°C左右；点击Configure，选中加样的列数，点击OK，点击START，再点击StartRun；微滴生成仪自动吸取20µl样品反应体系，加入70µl微滴生成油，混合后吸取40µl混合物至DG32微滴生成卡中；微滴生成结束后，触摸屏上会显示Droplets Ready。轻轻上拉打开仪器的门，取出生成微滴的96孔板。微滴生成后，要轻拿轻放，不可摇晃或颠倒；将已生成微滴的96孔板再次置于热封仪上封膜。此次封膜后不可离心，轻轻放至PCR仪内进行扩增；
1.6.3、进行数字PCR扩增：
按照下表设置PCR程序，热盖温度选择105℃，PCR体积选择40 µl；
每步升降温速度为2 ℃/s；
读取拷贝数：
提前打开微滴读取仪预热30min；将完成PCR扩增的96孔板放入plate holder压板固定器中，盖好顶部支架，之后轻轻平稳的放入微滴读取仪中，并通过QuantaSoft软件读取结果；
为保证实验的结果可靠性，对系统适用性有一定的要求：
反应孔微滴生成总数量＞10000；NTC孔中拷贝数浓度＜400 copies/20μl；样品复孔CV值≤20%；
1.6.4、结果计算：通过经数字PCR扩增得出的人用狂犬病Vero细胞原液DNA残留的拷贝数浓度，计算得出人用狂犬病Vero细胞原液DNA残留国标单位（ng/剂）值：
结果：检测样品DNA拷贝数浓度计算公式为：
结果取均值；
再根据拷贝数计算公式：
其中，NA：阿伏伽德罗常数，NA=6.02*1023；C:质粒浓度；M：质粒长度；
Vero细胞DNA残留量（ng/剂）=C（ng⁄μl）*V（μl）。
实施例1
退火温度优化：
使用步骤1.3中合成引物、探针，以步骤1.4提取的人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品DNA为模板，按照步骤1.6所建立的方法对人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品进行检测，退火温度分别设置为50℃、54℃、58℃、62℃、66℃、70℃，引物浓度为30μM，探针浓度为10μM，重复3次，取平均值汇总各温度下的微滴数据，结果显示58℃为最优退火温度，如下表表1所示；
表1退火温度优化结果。
| 退火温度（℃） | 50 | 54 | 58 | 62 | 66 | 70 |
| 绝对定量值 | 270 | 291 | 310 | 301 | 295 | 285 |
实施例2
扩增引物浓度优化：
采用与实施例1相同的引物、探针序列以及DNA模板，按照步骤1.6所建立的方法对人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品进行检测，其中引物浓度分别设置为10μM，30μM，50μM，退火温度取实施例1中优化的最佳值，探针浓度为10μM，实验重复三次，根据表2对比筛选出引物最佳浓度为30μM；
表2引物浓度优化结果。
| 引物浓度（μM） | 10 | 30 | 50 |
| 绝对定量值 | 104 | 310 | 312 |
实施例3
探针浓度优化：
采用与实施例1相同的引物、探针序列以及DNA模板，按照步骤1.6所建立的方法对人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品进行检测，探针浓度分别为1μM，10μM，20μM，引物浓度取实施例2中优化的最佳值30μM，退火温度取实施例1中优化的最佳值，实验重复三次，根据表3，对比筛选出探针的最佳浓度为10μM；
表3探针浓度优化结果。
| 探针浓度（μM） | 1 | 10 | 20 |
| 绝对定量值 | 100 | 310 | 312 |
实施例4
特异性验证：
用建立的ddPCR方法分别对人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液，甲肝疫苗、乙肝疫苗进行检测，本方法人用狂犬病疫苗(Vero细胞)原液有扩增，对其他均疫苗无扩增，表明本方法特异性较好，如表4所示。
表4特异性验证结果
| 疫苗种类 | 人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液 | 甲肝疫苗 | 乙肝疫苗 |
| 绝对定量值 | 310 | 0 | 0 |
实施例5
重复性验证：
以不同浓度的DNA作为模板，每个浓度重复三次，进行扩增，进行批内的重复试验，结果如表5所示；
表5批内重复试验结果
| 浓度(μg/ml) | 10-5 | 10-4 | 10-3 |
| 绝对定量值 | 30 | 310 | 3124 |
| 绝对定量值 | 25 | 308 | 3099 |
| 绝对定量值 | 32 | 312 | 3108 |
| 平均值 | 29 | 310 | 3110.333333 |
| 标准偏差 | 3.605551275 | 2 | 12.66227994 |
| 变异系数 | 12.43293543% | 0.64516129% | 0.407103631% |
以与上述浓度一致的DNA作为模板，每个浓度重复三次，每隔1个星期进行一次实验，共重复三次，进行批间的重复试验，记录并统计结果，结果如表6所示；
表6批间重复试验结果
| 时间（周） | 第一周 | 第二周 | 第三周 |
| 绝对定量值 | 310 | 310 | 311 |
| 绝对定量值 | 308 | 313 | 305 |
| 绝对定量值 | 312 | 308 | 308 |
| 平均值 | 310 | 310.3333333 | 308 |
| 标准偏差 | 2 | 2.516611478 | 3 |
| 变异系数 | 0.64516129% | 0.810938178% | 0.974025974% |
表格6结果显示：批内重复性试验变异系数（CV）在0.64%、0.81%、0.97%，批间重复性试验变异系数（CV）在12.43%、0.64%、0.41%，除浓度10-5μg/ml外，Ct值的变异系数均小于5%，由此证明所建立的ddPCR方法具有良好的重复性。
实施例6：
采用建立的ddPCR方法检测人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液中Vero细胞DNA残留量，结果如下：
根据检测样品DNA拷贝数浓度计算公式：
结合如图1所示的人用狂犬疫苗基因及NTC孔生成微滴总数量图，可得出人用狂犬疫苗原液Vero细胞的DNA拷贝数浓度为：
结果为：
因国家药典规定的Vero细胞DNA残留应不高于3ng/剂，所以再根据拷贝数计算公式：
已知M=1923bp，可得出人用狂犬疫苗原液Vero细胞的DNA拷贝数浓度C（ng⁄μl）为：
Vero细胞DNA残留量（ng/剂）=C（ng⁄μl）*V（μl）
DNA残留=C*V=0.003*500=1.5ng/剂；
因此，本方法的最优退火温度为58℃，引物最佳浓度为30μM，探针的最佳浓度为10μM，经特异性验证及重复性验证可知本发明所建立的ddPCR方法的特异性较好，且具有良好的重复性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
1 序列表信息
1-1 文件名 序列表-B230487(S).xml
1-2 DTD版本 V1_3
1-3 软件名称 WIPO Sequence
1-4 软件版本 2.3.0
1-5 生产日期 2023-07-31
2 基本信息
2-1 当前申请: 知识产权局
2-2 当前申请: 申请号
2-3 当前申请: 申请日
2-4 当前申请: 申请人档案名 JILIN INSTITUTEFORDRUG GONIROL
2-5 最早优先权申请: 知识产权局
2-6 最早优先权申请: 申请号
2-7 最早优先权申请: 申请日
2-8zh申请人姓名或名称 吉林省药品检验研究院
2-8en申请人姓名或名称: 拉丁名称 JILIN INSTITUTEFORDRUG GONIROL
2-9 发明人姓名
2-9en发明人姓名: 拉丁名称
2-10zh发明名称 一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法
2-11序列总量 3
3-1 序列
3-1-1序列号[ID] 1
3-1-2分子类型 DNA
3-1-3长度 28
3-1-4-1特征位置/限定符
source 1..28
mol_type=other DNA
organism=Artificial Sequence
3-1-5残基 gaattgtaacacccctacaatggatgcc 28
3-2 序列
3-2-1序列号[ID] 2
3-2-2分子类型 DNA
3-2-3长度 27
3-2-4-1特征位置/限定符
source 1..27
mol_type=other DNA
organism=Artificial Sequence
3-2-5残基 cctggatcctctacaatggatgcttag 27
3-3 序列
3-3-1序列号[ID] 3
3-3-2分子类型 DNA
3-3-3长度 22
3-3-4-1特征位置/限定符
source 1..22
mol_type=other DNA
organism=Artificial Sequence
3-3-5残基 tngtactccagttrgcacac at 22
Claims (5)
1.一种应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取人用狂犬病疫苗（Vero细胞）原液样品中的DNA，其中所述人用狂犬病疫苗以Vero细胞作为疫苗生产细胞；
S2：以步骤S1的DNA为模板，以加入狂犬病毒的糖蛋白（GP）基因的上游引物、下游引物及探针来建立数字PCR体系；
步骤S2中所述的上游引物如SEQ NO:1所示，下游引物序列如SEQ NO:2所示，探针序列如SEQ NO:3所示；
S3：制备微滴：将建立好的数字PCR反应体系加入至微滴生成板中与微滴生成油生成微滴，并封膜；
S4：进行数字PCR扩增；
S5：通过经数字PCR扩增得出的人用狂犬病疫苗样品中Vero细胞DNA拷贝数浓度，计算出狂犬病疫苗样品中Vero细胞DNA残留量的国标单位值。
2.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，其特征在于，所述数字PCR体系的总体积为20-25μL，在所述数字PCR体系中，所述上游引物的终浓度为10μM-30μM，所述下游引物的终浓度为10μM-30μM，所述探针的终浓度为10μM-30μM，所述DNA模板的终浓度为10-5μg/ml-10-4μg/ml。
3.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，其特征在于，所述数字PCR体系的总体积为22μL，在所述数字PCR体系中，所述上游引物的终浓度为30μM，所述下游引物的终浓度为30μM，所述探针的终浓度为10μM，所述DNA模板的终浓度为10-5μg/ml。
4.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，其特征在于，所述数字PCR扩增的程序为： 42°C 60min，95°C10min；95°C 0.5min，58°C 1min，共50个循环；最后维持在4°C；每步升降温速度为2°C/s。
5.根据权利要求1所述的应用数字PCR检测狂犬疫苗DNA残留的方法，其特征在于，步骤S3中，封膜温度为180℃-220℃，时间为5s-15s。
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|---|---|---|---|
| CN202311019339.1A CN116790822A (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 一种应用数字pcr检测狂犬疫苗dna残留的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN202311019339.1A CN116790822A (zh) | 2023-08-14 | 2023-08-14 | 一种应用数字pcr检测狂犬疫苗dna残留的方法 |
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|---|---|
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN101565741A (zh) * | 2008-04-25 | 2009-10-28 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 实时荧光定量PCR检测Vero细胞DNA残留的试剂盒 |
| CN101780276A (zh) * | 2010-03-26 | 2010-07-21 | 辽宁依生生物制药有限公司 | 利用超声结合edta溶液去除狂犬病疫苗制品中残留dna的方法 |
| CN111249456A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-06-09 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种狂犬病病毒灭活疫苗的纯化方法 |
-
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- 2023-08-14 CN CN202311019339.1A patent/CN116790822A/zh not_active Withdrawn
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