CN106435013A - 犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 - Google Patents
犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106435013A CN106435013A CN201610603626.0A CN201610603626A CN106435013A CN 106435013 A CN106435013 A CN 106435013A CN 201610603626 A CN201610603626 A CN 201610603626A CN 106435013 A CN106435013 A CN 106435013A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dog
- primer
- pcv
- circovirus
- detection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法，根据犬圆环病毒基因组中衣壳蛋白基因序列设计特异性引物，建立了犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法。所述的特异性引物对序列为：上游引物：5’‑AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC‑3’；下游引物：5’‑CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA‑3’。采用本发明引物检测犬圆环病毒，具有敏感性高、特异性强、快速简便等优点；本发明犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法特异性好，假阳性低，灵敏度高，可对产物进行定量，操作简便，自动化程度高，可达到扩增和检测一步实现对犬圆环病毒快速准确检测并鉴定的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法。
背景技术
犬圆环病毒（Dog circovirus，DogCV）于2012年美国首次报道，随后被认为是犬坏死性血管炎和肉芽肿性淋巴结炎的病原体。临床多表现为犬呕吐、出血性腹泻等症状。DogCV为无囊膜单股环状DNA 病毒，分类地位上属于圆环病毒科圆环病毒属成员。序列分析显示，DogCV基因组大小为2kb左右，具有两个主要的阅读框（ORF）：分别编码复制酶Rep蛋白和衣壳Cap蛋白。近年来，美国、意大利、德国相继报道了该病毒，给犬群健康造成严重的威胁。由于犬圆环病毒是新发现的哺乳动物圆环病毒，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对犬群的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的犬圆环病毒检测方法。
荧光定量PCR方法作为一种新技术，在动物传染病中已被成功地应用猪圆环2型、乙脑、禽流感等检测及流行病学调查。荧光定量PCR方法又分为探针法和SYBR GreenⅠ染料法。相比较探针法SYBR GreenⅠ染料法，不需要合成探针，且价格低廉，只需要设计出序列特异的引物。影响结果的引物二聚体和非特异性扩增可以通过融解曲线分析克服。与传统的PCR相比，荧光定量PCR能有效地减少试验过程中产生污染的危险，并以其高灵敏度、高特异性、速度快等优点在病原体的定性和定量检测方面得到了广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于针对当前犬圆环病毒特异性检测技术手段的缺乏，提供一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法。该实时荧光PCR检测方法的检测灵敏度可达4.67×101个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，可以实现对犬圆环病毒快速准确检测并鉴定的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的一方面，提供一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物，该特异性引物是针对犬圆环病毒ORF2基因设计出的能够检测犬圆环病毒的特异性引物，特异性引物对序列为：
上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’；
下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。
本发明的另一方面，提供一种利用上述特异性引物检测犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法，该实时荧光 PCR 检测方法还采用SYBR Green I染料进行检测，该实时荧光PCR 检测方法是将用于检测犬圆环病毒的特异性引物和SYBR Green I染料置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。
在本发明的另一方面，提供检测犬圆环病毒的实时荧光PCR检测的反应程序，具体为：预变性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循环40次。
采用本发明犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法进行犬圆环病毒的特异性检测，具有以下优点：
（1）特异性好，本发明提供的检测用引物对狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型基因组，均无特异性扩增，说明引物对目的基因具有良好的特异性。
（2）灵敏度高，荧光检测技术是极灵敏的检测技术，采用本发明提供的检测用引物进行检测，检测灵敏度可达4.67×101个拷贝的病毒分子。
（3）可对产物进行定量，由于荧光信号的强度和每次扩增产物量成意义对应的线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。
（4）操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步完成。
（5）养殖户通过本发明的犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法，能够尽快知道是否犬群患有犬圆环病毒，及早采取措施，减少损失。
附图说明
图1为本发明实施例1犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验结果；如图1所示，图中1、2、3、4其中4份犬圆环病毒样品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；图中5为其他样品及阴性对照（超纯水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。
图2为本发明实施例2犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果。犬圆环病毒的特异性扩增曲线，Ct值均小于33；其他样品狂犬病病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型和阴性对照（超纯水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。
图3为本发明实施例3犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验结果。阳性模板在4.67×101个拷贝数仍有扩增曲线。由图3表明该方法检测灵敏度可达4.67×101个拷贝。
具体实施方式
下面结合附图和实施例和附图对本发明做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。
实施例1
犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验
1、设计引物
针对犬圆环病毒ORF2基因设计能够检测犬圆环病毒的特异性引物序列：
上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’，
下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。
上下游引物均由上海生工公司合成，其中SYBR Green I染料购自普洛麦格有限公司。
2、实验所用的病毒和样品
32份犬血液样本采集于广西壮族自治区玉林市，由广西动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。
3、提取犬圆环病毒DNA
将32份来自玉林的犬血清按照天根基因组试剂盒（天根生物技术有限公司）说明书提取病毒基因组。
4、实时荧光PCR检测
反应体系为20µL，上游引物、下游引物各1µL，SYBR Green I染料10µL，DNA模板2µL，补超纯水至20µL。在ABI 7500荧光PCR扩增仪上进行扩增反应，设定程序条件为：预变性95℃5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循环40次。
5、试验结果
荧光PCR仪收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图1所示1、2、3、4其中4份犬圆环病毒样品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；5为其他样品及阴性对照无Ct值并且无特异性的扩增曲线。扩增产物经测序鉴定为犬圆环病毒，表明设计的引物能特异性检测犬圆环病毒。
实施例2
犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的特异性试验
1、实验所用的病毒和样品
32份犬圆环病毒组织样品采集于广西壮族自治区玉林市，由广西动物疫病预防控制中心兽医实验室提供。
其他犬源病毒：狂犬病毒（Rabies virus，RV）、犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV ）、犬瘟热病毒（Canine Distemper，CD）、犬副流感病毒（Canine ParainfluenzaVirus，CPIV）、犬腺病毒2型（Canine adenovirus type 2，CAV-2）均由军事兽医研究所病毒学与免疫学实验室保存。
2、病毒核酸提取
将将犬圆环病毒样品及其他其他犬源病毒按照天根基因组试剂盒（天根生物技术有限公司）说明书提取病毒基因组。
3、实时荧光PCR检测方法的特异性试验
采用实施例1中所提供的荧光PCR检测方法分别对提取的核酸样品进行检测，以确定方法的特异性，并以构建的犬圆环病毒标准品为对照。
4、试验结果
荧光PCR仪收集荧光信号，生成样品扩增曲线。如图2所示犬圆环病毒标准品的Ct值均小于等于33，且出现特异性的扩增曲线；狂犬病毒、犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒2型以及纯水对照的Ct值均大于33，且无特异性的扩增曲线。表明该荧光PCR检测方法具有良好的特异性。
实施例3
犬圆环病毒的实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验
1、实验所需样品
将犬圆环病毒基因克隆测序正确后作为标准质粒，测定质粒浓度和纯度并稀释至4.67×100，4.67×101，4.67×102，4.67×103，4.67×104，4.67×105，4.67×106，4.67×107，4.67×108拷贝/µL。
2、实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验
以稀释好的梯度质粒作为样品，采用实施例1中所提供的荧光PCR检测方法进行检测，以确定方法的灵敏性。
3、试验结果
荧光PCR仪收集荧光信号，自动生成样品扩增曲线。如图3所示，犬圆环病毒基因质粒拷贝数为4.67×101和4.67×108时的扩增曲线Ct大于33，拷贝数为4.67×101，4.67×102，4.67×103，4.67×104，4.67×105，4.67×106，4.67×107，4.67×108的质粒扩增曲线Ct小于33，表明该方法检测灵敏度可达4.67×101个拷贝。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心
<120> 犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用引物及检测方法
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aagttccata gcaacggggt ctc 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cccactgaac cgttacagga gaa 23
<210> 3
<211> 677
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggagtaagtc cccttttaaa gcctgccgcc atattaaaag attttgatga tgatctgtct 60
tgtagagggt cgtatatgaa tggagcctta ttggggtctt ttggttgctc cattgttcct 120
ggtactgtcc ctgggtccag gtgtgatctt gtagcattcc ctcttccctg atcttctccg 180
tcaagatcta gtgctgttct tccaagtacg ttctccatca gtgttctggg ccagttgatc 240
catttagccc ttacgaagat ctttttgaat ttataatatc taaaaggtgg gagatgctgg 300
aaatctcctg tgccgtgaga ggcttgtaag aagtcagtca gtttgaatga cagatggtcg 360
aagttccata gcaacggggt ttctgtctgc ggatcattgg ttggtttgac tggtgctgtc 420
ggccaatcag ctgtcagtgt tctgcgcagt cgcagatgaa acagtttgaa attgttttgg 480
cgccttctcc tgtaacggat caatgggcgt gtcctgtatc tccggcgact tgcccgggca 540
tgtcttcgta cgcgcatgcg ccgtctgaat gttctccttc tgagcctgcg cagagaatga 600
ggatgtggtt agtgacgtca gcgtatcgag gtgcctggca tagtattacc cggcacctcg 660
tcacagacac agcacag 677
Claims (3)
1.一种犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物，其特征在于，所述的特异性引物是针对犬圆环病毒ORF2基因设计出的能够检测犬圆环病毒的特异性引物，特异性引物对序列为：上游引物：5’-AAGTTCCATAGCAACGGGGTCTC-3’；下游引物：5’-CCCACTGAACCGTTACAGGAGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物，其特征在于，实时荧光 PCR 检测还采用SYBR Green I染料进行检测，实时荧光 PCR 检测是将用于检测犬圆环病毒的特异性引物和SYBR Green I染料置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。
3.根据权利要求2所述的犬圆环病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物，其特征在于，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃ 5min；然后95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 30sec循环40次。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610603626.0A CN106435013A (zh) | 2016-07-28 | 2016-07-28 | 犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610603626.0A CN106435013A (zh) | 2016-07-28 | 2016-07-28 | 犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106435013A true CN106435013A (zh) | 2017-02-22 |
Family
ID=58184674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610603626.0A Pending CN106435013A (zh) | 2016-07-28 | 2016-07-28 | 犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106435013A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108048604A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-18 | 石河子大学 | 快速检测犬圆环病毒感染的rpa引物及其用途及试剂 |
| CN108264541A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-10 | 温州大学 | 一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白的方法 |
-
2016
- 2016-07-28 CN CN201610603626.0A patent/CN106435013A/zh active Pending
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DECARO ET AL.: "Genomic Characterization of a Circovirus Associated with Fatal Hemorrhagic Enteritis in Dog, Italy.", 《PLOS ONE》 * |
| HSU ET AL.: "High detection rate of dog circovirus in diarrheal dogs.", 《BMC VETERINARY RESEARCH》 * |
| KAPOOR ET AL.: "Complete Genome Sequence of the First Canine Circovirus", 《GENOME ANNOUNCEMENT》 * |
| LI ET AL.: "Circovirus in Tissues of Dogs with Vasculitis and Hemorrhage.", 《EMERGING INFECTIOUS DISEASES》 * |
| 孙文超 等: "犬圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立", 《动物医学进展》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108264541A (zh) * | 2018-01-12 | 2018-07-10 | 温州大学 | 一种高效表达犬圆环病毒Cap蛋白的方法 |
| CN108048604A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-05-18 | 石河子大学 | 快速检测犬圆环病毒感染的rpa引物及其用途及试剂 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111235316B (zh) | 鉴定新型冠状病毒的引物探针及在三重荧光rpa的应用 | |
| CN108676920B (zh) | 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法 | |
| CN104195268B (zh) | 检测口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的试剂盒及制备方法 | |
| CN103757139A (zh) | 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法 | |
| CN106636472B (zh) | 检测禽流感病毒与鸡细小病毒的成套试剂与方法 | |
| CN105256073A (zh) | 3型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法 | |
| CN109762942A (zh) | 一种快速检测呼吸道合胞病毒的含内参双重等温核酸扩增方法 | |
| CN112094944A (zh) | 一种定量检测新型冠状病毒拷贝数的试剂盒 | |
| CN106834549A (zh) | 检测伪狂犬病病毒野毒株的交叉引物扩增‑免疫层析试纸联用法的引物和探针组以及试剂盒 | |
| Gou et al. | The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3 | |
| CN106435013A (zh) | 犬圆环病毒的实时荧光pcr检测用引物及检测方法 | |
| CN105256072A (zh) | 1型鸭甲肝病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测试剂盒及方法 | |
| Xiao et al. | Development and application of a novel Bio–Plex suspension array system for high–throughput multiplexed nucleic acid detection of seven respiratory and reproductive pathogens in swine | |
| CN105002284A (zh) | 一种副鸡嗜血杆菌荧光定量pcr检测方法 | |
| CN103131793A (zh) | 疱疹病毒荧光pcr检测试剂盒 | |
| CN115725788A (zh) | 一种用于检测猫细小病毒的引物和TaqMan探针及其应用 | |
| CN109457052A (zh) | 检测人类免疫缺陷病毒核酸的引物、探针、试剂盒及检测方法 | |
| CN102337352A (zh) | 一种pcr微阵列检测多种流感病毒的试剂盒 | |
| CN110592269A (zh) | 草鱼出血病2型病毒（gcrv-2）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN107937615A (zh) | 用于区分猪乙型脑炎病毒野毒株和疫苗株的引物和探针 | |
| CN106636457A (zh) | 一种用于检测4/91型传染性支气管炎病毒的试剂盒 | |
| CN105779656A (zh) | 一种猪细环病毒2型环介导等温扩增试剂盒及其应用 | |
| CN110564892A (zh) | 用于检测高致病性h7n9禽流感病毒的荧光rt-pcr引物、探针及方法 | |
| CN110777219A (zh) | 鸡细小病毒与h9亚型禽流感病毒三重pcr检测引物组、试剂盒及方法 | |
| CN104342500B (zh) | 检测口蹄疫Asia 1型病毒的引物、检测试剂盒和制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170222 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |