CN103757139A

CN103757139A - 犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法

Info

Publication number: CN103757139A
Application number: CN201410053541.0A
Authority: CN
Inventors: 吴志明; 闫若潜; 赵明军; 赵雪丽; 王淑娟; 刘毅; 王东方; 安春霞; 谢彩华; 钱勇; 刘梅芬; 张代宝; 张林海
Original assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Current assignee: HENAN PROVINCIAL CENTER FOR ANIMAL DISEASE CONTROL AND PREVENTION
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-02-17
Also published as: CN103757139B

Abstract

本发明属动物疫病检测检疫技术领域，公开了一种用于犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）二重TaqManMGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法。本发明所述的CDV/CPV二重TaqManMGB荧光定量PCR检测试剂包含1对基于CDVH基因设计的特异性引物和1条5'端标记为FAM的TaqManMGB探针，1对基于CPVVP2基因设计的特异性引物和1条5'端标记为VIC的TaqManMGB探针；所述的二重TaqManMGB荧光定量PCR检测方法包含2对引物序列、2条TaqManMGB标记探针序列及标记荧光、总RNA和DNA的制备、反转录、荧光PCR扩增及结果判定等。本发明经过一个PCR反应可同时检测CDV和CPV两种病毒核酸，可同时对CDV/CPV进行快速、特异、敏感的鉴别检测，对犬瘟热、犬细小病毒病的防控具有重要意义。

Description

犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂及其检测方法

技术领域

本发明属于动物疫病检疫检测技术领域。涉及犬瘟热病毒、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂和检测方法。

背景技术

犬瘟热（Canine distemper，CD）是世界范围内广泛发生的一种犬的急性、高接触性传染病，其病原为犬瘟热病毒（CDV），于1905 年首次报道，其自然宿主包括大部分的食肉目动物。该病传染性强，易继发细菌和其他病毒的混合感染或继发感染，发病率高达80%，康复后易出现麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。该病无特效药物治疗，成为危害养犬业的主要疫病之一。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属、负链单股不分节的RNA病毒，基因组全长为15 616bp。病毒的蛋白主要有核衣壳蛋白( Nucleocapsid protein, N) 、磷蛋白(Phosphoprotein, P) 、基质膜蛋白( Matrix protein, M) 、融合蛋白( Fusion protein, F) 、附着或血凝蛋白(Attachment protein or Hemagglutinin protein, H) 、大蛋白( the large virus specificied RNA directed RNA polymerase protein, L) 6 种，编码基因在基因组的位置从它的3'端到5'端依次为3c端前导序列、N、P、M、F、H 和L 基因以及5c端前导序列，其中H蛋白是CDV与细胞受体结合的蛋白，并决定着病毒感染的细胞嗜性，H蛋白基因常作为诊断检测所用的靶基因。

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬的一种急性接触性传染病，病犬主要以剧烈呕吐、出血性肠炎、严重脱水、白细胞减少和心肌炎等为主要特征，犬细小病毒于1978年从患有肠炎的病犬体内首次分离获得，幼犬对CPV的易感性较高，并可以发生心肌炎。发病率高达50%~100%，病死率为10%~50%，对养犬业、犬科经济动物养殖和犬科野生动物危害巨大。CPV是细小病毒科、细小病毒属成员，具有细小病毒属病毒典型形态和结构。基因组为单股DNA，病毒粒子有VP1、VP2 和VP3 三种多肽，其中VP2为衣壳蛋白主要成分，为主要抗原基因，常作为检测CPV的主要靶基因。

临床上CDV、CPV多混合感染，是当前严重危害犬、猫健康的主要疫病，防控难度大，对养犬业危害严重，每年均造成巨大的经济损失。由于二者引起的临床症状相似，单凭临床症状和剖检病变难以确诊，因此必须借助实验室检测进行确诊。目前已有的CDV/CPV的检测方法主要有病毒分离鉴定、免疫荧光法( IF) 、免疫组织化学技术( IHT) 、免疫电镜法( IEM) 、血凝/血凝抑制试验（HA / HI）、中和试验和酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，这些方法存在操作繁琐、技术要求和试验条件要求高、试验周期长等缺点，难以满足快速、大量检测的需要，并且是针对某一种病毒的单一PCR或FQ-PCR检测方法。因此急需建立一种快速、高效、特异、敏感的检测方法，且同时对CDV和CPV两种病毒核酸进行快速鉴别检测。

发明内容

本发明目的在于提供CDV/CPV二重TaqMan MGB FQ-PCR检测试剂及其检测方法，经过一个PCR反应可同时对CDV和CPV两种病毒核酸进行快速鉴别检测。

为实现本发明的目的，本发明分别根据CDV H基因和CPV VP2基因设计了特异性引物对和TaqMan MGB探针；通过优化反应体系组分、反应条件，进行特异性、灵敏性、重复性验证，利用建立成功的二重FQ-PCR方法进行初步应用检测。主要内容如下：

1．引物序列

经大量比对GenBank中CDV H基因和CPV VP2基因序列，选取CDV H基因和CPV VP2基因高度保守且具有型特异性基因序列为模板，设计CDV/CPV特异性引物对和TaqMan MGB探针，分别命名为CDV-F(P1)、CDV-R(P2)、CPV-F(P3)、CPV-R(P4)、CDV-MGB-FAM-Probe(Probe-P5)、CPV-MGB-VIC-Probe(Probe-P6)，由宝生物工程（大连）有限公司合成，用于CDV/CPV二重TaqMan MGB FQ-PCR扩增的引物和探针序列如下：

P1：ggatggtgcc tgcattgg 18

P2：ccgactccag acaatttttt tgt 23

P3：atgccattta ctccagcagc tat 23

P4：ggtatggttg gtttccatgg at 22

Probe-P5：5'-FAM-ctctgagcaa caagaag-MGB-3' 17

Probe- P6：5'-VIC-agatctgaga cattgggttt-MGB-3' 20

2．总RNA和DNA的制备

2.1 模板RNA的制备：以CDV细胞培养物为阳性对照，正常VERO细胞为阴性对照，与含有CDV的犬唾液、鼻液、眼角分泌物等待检样品同时采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下：分别取灭活的CDV细胞培养物、阴性对照及待检样品各200 μL 于1.5 ml离心管中，再加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，离心后，取上清转入另1.5 ml离心管中，加200 μL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC（焦磷酸二乙酯）水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存；

2.2 模板DNA的制备：以CPV细胞培养物为阳性对照，正常MDCK细胞为阴性对照，与含有CPV的犬粪便、肠内容物或血清等待检样品提取总DNA。具体操作如下：分别取灭活的CPV细胞培养物、阴性对照及待检样品（如为组织时先加适量PBS研磨后取上清）各100 μL 于1.5 ml离心管中，加入500 μL消化液（含终浓度10mM Tris-HCl（pH 8.0）、终浓度25mM EDTA（pH 8.0）、终浓度0.5%SDS（w/v）、终浓度100mM NaCl ）和10 μL蛋白酶K（终浓度20mg/mL）混匀；置55℃水浴30 min～1 h，加入500 μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1）混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经－20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，用质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20 μL TE 缓冲液溶解沉淀，－20℃冻存备用；

2.3 反转录

每管CDV反转录反应体系含如下成份：5×M-MLV 缓冲液 4 μL；2.5 mmol/L dNTPs（三磷酸脱氧核苷酸） 4 μL；M-MLV反转录酶 0.5 μL；RNA酶抑制剂 0.5 μL；P₂引物1 μL；总体积10 μL 。向每管反转录反应体系中加入步骤2.1所制得的 RNA 10 μL，37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用；

3 、CDV/CPV标准品的制备

将含有CDV标准株H基因和CPV标准株VP2基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的CDV/CPV重组阳性质粒应用分光光度计测定其OD₂₆₀和OD₂₈₀值及OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 值，共重复5次，确定质粒DNA的浓度和纯度，定量并稀释至1.0×10⁰～1.0×10¹⁰拷贝／μL，－20℃保存备用；

4、CDV/CPV二重FQ-PCR反应条件的优化

将步骤3所得的pGEM-T/CDV 和pGEM-T/CPV重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁵ 拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4引物对分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol/L， Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol/L，应用荧光PCR仪（美国ABI公司，型号：ABI7000）采用矩阵法筛选不同浓度的CDV/CPV引物和探针组合，筛选针对CDV/CPV的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件；

5、敏感性试验和标准曲线的建立

将步骤3所得的pGEM-T/CDV 和pGEM-T/CPV重组质粒分别作10倍系列稀释，两种质粒1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×10⁷～1.0×10⁰拷贝/μL，共8个稀释度，按步骤4优化的FQ-PCR反应条件进行CDV/CPV二重FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重组质粒起始模板数的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数C _t值为Y轴作回归曲线，建立二重FQ-PCR方法的标准曲线；

6 、特异性试验

按步骤2所述方法对狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）等提取RNA并按2.3进行反转录，Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)等则直接提取DNA，同时设经灭活的CDV和CPV标准株等量细胞培养物混合物为阳性对照，正常VERO细胞和MDCK细胞为阴性对照，按步骤4优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性；

7、稳定性和重复性试验

分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重组等量质粒混合物（每种质粒终浓度1.0×10³～1.0×10⁰）按照步骤4优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性；

8 、应用试验

依据建立的CDV/CPV二重FQ-PCR和CDV RT-PCR、CPV PCR普通检测方法，配制检测试剂，以灭活的CDV和CPV标准株等量细胞培养物混合物为阳性对照，正常VERO细胞和MDCK细胞为阴性对照，对48份临床疑似CDV或CPV感染样品（样品编号为：1～48）进行了应用检测，对这两种方法的检测结果进行比较分析，并与CDV、CPV病毒分离鉴定和测序结果比较。

本发明所述的CDV/CPV二重TaqMan MGB FQ-PCR快速检测试剂及鉴别检测方法可实现一个反应同时对两种病毒进行快速鉴别检测，可在1 h～2 h内完成，具有快速、特异、敏感、高通量等优点，能满足大批量、快速鉴别检测CDV、CPV的要求。

附图说明

图1：CDV/CPV二重FQ-PCR扩增曲线；图注说明： 1为FAM探针CDV扩增曲线， 2为VIC探针CPV扩增曲线，3,4 为阴性对照。

图2：CDV/CPV二重FQ-PCR检测CDV敏感性扩增曲线；图注说明：自左到右1～7为分别对应的质粒浓度1.0×10⁷, 1.0×10⁶, 1.0×10⁵, 1.0×10⁴, 1.0×10³, 1.0×10², 1.0×10¹, 1.0×10⁰ copies/μL；8、9为阴性对照。

图3：CDV/CPV二重FQ-PCR检测CDV标准曲线。

图4：CDV/CPV二重FQ-PCR检测CPV敏感性扩增曲线：图注说明：自左到右1～7为分别对应的质粒浓度1.0×10⁷, 1.0×10⁶, 1.0×10⁵, 1.0×10⁴, 1.0×10³, 1.0×10², 1.0×10¹, 1.0×10⁰ copies/μL, 8、9为阴性对照。

图5：CDV/CPV二重FQ-PCR检测CPV标准曲线。

图6：CDV/CPV二重FQ-PCR体系单一检测CDV特异性扩增曲线；图注说明：1：CDV扩增曲线；2：CPV VIC扩增曲线, 3,4：阴性对照。

图7：CDV/CPV二重FQ-PCR体系单一检测CPV特异性扩增曲线；图注说明：1：CPV扩增曲线, 2: CDV FAM扩增曲线, 3,4: 阴性对照。

图8：CDV/CPV二重FQ-PCR检测其他病毒特异性扩增曲线；图注说明：1：CDV扩增曲线, 2：CPV扩增曲线, 3,4：CPIV cDNA, 5,6：RV cDNA, 7,8：CAV-1 DNA, 9,10：CAV-2 DNA, 11,12：阴性对照。

图9：CDV/CPV二重FQ-PCR方法重复性和稳定性试验结果图；图注说明：D1-D3, D4-D6, D7-D9, D10-D12分别对应的质粒浓度为1.0×10³、1.0×10²、 1.0×10¹、1.0×10⁰copies/μL的CDV扩增曲线，P1-P3, P4-P6,P7-P9, P10-P12分别对应的质粒浓度为1.0×10³、1.0×10²、 1.0×10¹、1.0×10⁰copies/μL的CPV扩增曲线。

图10-1、10-2：CDV/CPV二重FQ-PCR方法对48份疑似样品检测结果图；图注说明：D+为CDV标准扩增曲线，P+为CPV标准扩增曲线，D7-D10, D15-D17, D28-D33, D37为CDV检测阳性, P1,P2,P4,P5, P 13,P14,P21 ,P25,P26,P35-P37, P39-P46为CPV检测阳性, D(P)27, D(P)38, D(P)47, D(P)48为CDV/CPV检测双阳性, 其余样品为阴性。

图11： CDV RT-PCR方法对48份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图注说明：P为CDV阳性对照，N为阴性对照，7,9, 15-17, 29,30, 47,48为CDV检测阳性, 其余样品为阴性。

图12：CPV PCR对48份疑似样品琼脂糖凝胶电泳检测结果图；图注说明：P为CDV阳性对照，N为阴性对照，1,2,4,5, 6,13,14,21, 35-39, 41-48为CPV检测阳性, 其余样品为阴性。

具体实施方式

、材料与方法

1.1　材料

1.1.1 毒株

犬瘟热和犬细小病毒分离株由河南省动物疫病预防控制中心实验室分离鉴定；其他对照病毒或细菌株由河南省动物疫病预防控制中心实验室保存；

1.1.2仪器和试剂　

荧光PCR仪，美国ABI公司产品，型号ABI7000；PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；凝胶成像分析系统，美国Alpha Innotech公司产品；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品；台式高速冷冻离心机，美国Heraeus公司产品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司，pGEM-T Easy载体、JM109感受态细胞购自Promega公司；

1.2方法

1.2.1 引物设计和合成

P1：ggatggtgcc tgcattgg 18

P2：ccgactccag acaatttttt tgt 23

P3：atgccattta ctccagcagc tat 23

P4：ggtatggttg gtttccatgg at 22

Probe-P5：5'-FAM- ctctgagcaa caagaag -MGB-3' 17

Probe- P6：5'-VIC- agatctgaga cattgggttt -MGB -3' 20

1.2.2 总RNA和DNA的制备

（1）模板RNA的制备：以CDV细胞培养物为阳性对照，正常VERO细胞为阴性对照，与含有CDV的犬唾液、鼻液、眼角分泌物等待检样品同时采用Trizol法提取总RNA。具体操作如下：分别取灭活的CDV细胞培养物、阴性对照及待检样品各200 μL 于1.5 ml离心管中，再加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，离心后，取上清转入另1.5 ml离心管中，加200 μL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC（焦磷酸二乙酯）水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存。

（2）模板DNA的制备：以CPV细胞培养物为阳性对照，正常MDCK细胞为阴性对照，与含有CPV的犬粪便、肠内容物或血清等待检样品提取总DNA。具体操作如下：分别取灭活的CPV细胞培养物、阴性对照及待检样品（如为组织时先加适量PBS研磨后取上清）各100 μL 于1.5 ml离心管中，加入500 μL消化液（含终浓度10mM Tris-HCl（pH 8.0）、终浓度25mM EDTA（pH 8.0）、终浓度0.5%SDS（w/v）、终浓度100mM NaCl ）和10 μL蛋白酶K（终浓度20mg/mL）混匀；置55℃水浴30 min～1 h，加入500 μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（体积比为25：24：1）混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经－20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，用75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20 μL TE 缓冲液溶解沉淀，－20℃冻存备用；

1.2.3 反转录

每管CDV反转录反应体系含如下成份：5×M-MLV 缓冲液 4 μL；2.5 mmol/L dNTPs（三磷酸脱氧核苷酸） 4 μL；M-MLV反转录酶 0.5 μL；RNA酶抑制剂 0.5 μL；P₂引物1 μL；总体积10 μL。向每管反转录反应体系中加入步骤1.2.2（1）所制得的 RNA 10 μL，37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用；

1.2.4标准品的制备

将含有CDV标准株H基因和CPV标准株VP2基因的阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程（大连）有限公司采用T7和SP6引物进行测序。测序正确的CDV/CPV重组阳性质粒应用分光光度计测定其OD₂₆₀和OD₂₈₀值及OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 值，共重复5次：pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV质粒标准品OD₂₆₀平均值分别为3.641和3.562，OD₂₈₀平均值分别为1.996和1.941，OD₂₆₀/ OD₂₈₀平均值分别为1.824和1.835；参考质粒DNA拷贝数计算方法，计算pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV质粒DNA溶液的浓度分别为9.67×10¹⁰拷贝/μL和9.25×10¹⁰拷贝/μL，定量并稀释至1.0×10⁰～1.0×10¹⁰拷贝／μL，－20℃保存备用；

1.2.5 CDV/CPV二重FQ-PCR反应条件的优化

将步骤1.2.4所得的pGEM-T/CDV 和pGEM-T/CPV重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁵ 拷贝/μL作为检测模板，P1/P2、P3/P4引物对分别稀释为终浓度0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol/L， Probe-P5、Probe-P6探针分别稀释到终浓度为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和1.0 μmol/L，应用荧光PCR仪（美国ABI公司，型号：ABI7000）采用矩阵法筛选不同浓度的CDV/CPV引物和探针组合，筛选针对CDV/CPV的二重FQ-PCR最佳引物浓度、探针浓度和最佳反应条件：

25μL反应体系， CDV和CPV上、下游引物P1/P2、P3/P4终浓度各0.4 μmol/L，Probe-P5终浓度为0.6 μmol/L，Probe-P6终浓度为0.7 μmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×Ex Taq 缓冲液 2.5 μL，5U/μL Ex Taq酶0.25 μL，1.0×10⁵拷贝/μL的质粒模板各2 μL，补足去离子水至终体积 25μL；优化的反应程序为：94℃，5 min后，94℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

结果判定：阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。阴性对照的检测结果应无特定的扩增曲线，且Ct值＞32.0或无，阳性对照的Ct值应≤29.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立。如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效。在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤29.0，而且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct值＞32.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性；32.0≥Ct值＞29.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验；

1.2.6 敏感性试验和标准曲线的建立

将步骤1.2.4所得的pGEM-T/CDV 和pGEM-T/CPV重组质粒分别作10倍系列稀释，两种质粒1:1比例混合，每种质粒终浓度调整为1.0×10⁷～1.0×10⁰拷贝/μL，共8个稀释度，按步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行CDV/CPV二重FQ-PCR敏感性试验。分别以pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重组质粒起始模板数的对数为X轴，以FQ-PCR循环次数C _t值为Y轴作回归曲线，建立二重FQ-PCR方法的标准曲线。二重FQ-PCR检测CDV和CPV最低检出限均为1.0×10¹拷贝/μL。由敏感性检测结果建立CDV标准曲线，相关系数为0.997，斜率为－3.17，截距为32.9，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.17×log拷贝数+32.9；由敏感性检测结果建立CPV标准曲线，相关系数0.997，斜率为－3.07，截距为32.59，从而可以得出拷贝数（X）与Ct值之间的线性关系表达式：Ct=－3.07×log拷贝数+32.59。根据仪器读取的Ct值代入表达式就可算出CDV和CPV的初始拷贝数；

1.2.7特异性试验

按步骤1.2.2所述方法对狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）等提取RNA并按1.2.2（1）进行反转录，Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)等则直接提取DNA，同时设经灭活的CDV和CPV标准株等量细胞培养物混合物为阳性对照，正常VERO细胞和MDCK细胞为阴性对照，按步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行FQ-PCR扩增以验证该方法的特异性。Ct值分别为11.2和11.8，且出现特定的扩增曲线；但正常VERO细胞、MDCK细胞、狂犬病病毒（RV）、犬副流感病毒（CPIV）、Ⅰ型和Ⅱ型犬腺病毒(CAV-1、CAV-2)、弓形虫、犬钩端螺旋体等均未出现特定的扩增曲线；

1.2.8 稳定性和重复性试验

分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-T/CDV和pGEM-T/CPV重组等量质粒混合物（每种质粒终浓度1.0×10³～1.0×10⁰）按照步骤1.2.5优化的FQ-PCR反应条件进行扩增，每个系列设定3个重复，以验证该方法的稳定性和重复性。重复性试验结果表明，浓度为1.0×10³拷贝/μL、1.0×10²拷贝/μL、1.0×10¹拷贝/μL的3个浓度的CDV/CPV重组质粒等量混合物3次试验结果均为阳性，浓度为1.0×10⁰拷贝/μL的CDV/CPV重组质粒等量混合物3次试验结果均为阴性，说明建立的CDV/CPV二重FQ-PCR方法具有很好的稳定性和重复性；

1.2.9应用试验

依据建立的CDV/CPV二重FQ-PCR和CDVRT-PCR、CPV PCR普通检测方法，配制检测试剂，以灭活的CDV和CPV标准株等量细胞培养物混合物为阳性对照，正常VERO细胞和MDCK细胞为阴性对照，对48份临床疑似CDV或CPV感染样品（样品编号为：1～48）进行了应用检测，对这两种方法的检测结果进行比较分析，并与CDV和CPV病毒分离鉴定和测序结果比较。结果表明，采用CDV/CPV二重FQ-PCR检测，14份为CDV阳性，20份为CPV阳性，4份为CDV/CPV双阳性；采用PCR检测7份为CDV阳性，19份为CPV阳性，2份为CDV/CPV双阳性。表明本发明建立的CDV/CPV二重FQ-PCR方法比PCR方法的灵敏性高，该FQ-PCR方法检测结果与CDV/CPV病毒分离鉴定和CDV H基因、CPV VP2基因测序结果符合率为100%。

Claims

1. 一种鉴别犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂，其特征在于：包含1对基于CDV H基因设计的特异性引物P1/P2和1条5'端标记为FAM的TaqMan MGB探针Probe-P5；1对基于CPV VP2基因设计的特异性引物P3/P4和1条5'端标记为VIC的TaqMan MGB探针Probe-P6；所用的4条引物DNA序列、2条探针DNA序列及标记荧光为：

引物P1：ggatggtgcc tgcattgg 18

引物P2：ccgactccag acaatttttt tgt 23

引物P3：atgccattta ctccagcagc tat 23

引物P4：ggtatggttg gtttccatgg at 22

探针Probe-P5：5'-FAM- ctctgagcaa caagaag -MGB-3' 17

探针Probe- P6：5'-VIC- agatctgaga cattgggttt -MGB -3' 20 。

2.应用权利要求1所述的犬瘟热、犬细小病毒二重TaqMan MGB荧光定量PCR检测试剂的非诊断检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）总RNA和DNA的制备

① 总RNA的制备：以CDV细胞培养物为阳性对照，正常VERO细胞为阴性对照，与含有CDV的犬唾液、鼻液、眼角分泌物待检样品同时采用Trizol法提取总RNA，具体操作如下：分别取灭活的CDV细胞培养物、阴性对照及待检样品各200 μL 于1.5 ml离心管中，再加入600 μL的Trizol于涡旋器震荡2～3 min，加入200 μL氯仿，4℃,12000 rpm离心10 min后，取上清转入另1.5 ml离心管中，加200 μL异丙醇沉淀，质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后用20 μL DEPC水溶解沉淀，取10 μL用于反转录，其余－20℃保存；

② 总DNA的制备：以CPV细胞培养物为阳性对照，正常MDCK细胞为阴性对照，与含有CPV的犬粪便、肠内容物或血清待检样品提取总DNA，具体操作如下：分别取灭活的CPV细胞培养物、阴性对照及待检样品各100 μL 于1.5 ml离心管中，加入500 μL消化液：含终浓度10mM Tris-HCl、pH 8.0，终浓度25mM EDTA、pH 8.0，重量体积比终浓度0.5%SDS、终浓度100mM NaCl，然后和10 μL终浓度20mg/mL蛋白酶K混匀；置55℃水浴30 min～1 h，加入500 μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇，体积比为25：24：1混合液抽提，离心后吸取上清液加入等体积经－20℃预冷的异丙醇沉淀DNA，用质量百分比75%乙醇洗涤沉淀，干燥，最后加入20 μL TE 缓冲液溶解沉淀，－20℃冻存备用；

（2）反转录

每管CDV反转录反应体系含如下成份：5×M-MLV缓冲液4 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL；M-MLV反转录酶 0.5 μL；RNA酶抑制剂 0.5 μL；P2引物1 μL；总体积10 μL ；向每管反转录反应体系中加入步骤（1）①所得的CDV RNA 10 μL，37℃水浴1 h或置于PCR仪中37℃反应1 h，反应结束后，70℃，15 min 灭活反转录酶，直接用于下面的PCR扩增或－20℃冻存备用；

（3）荧光PCR扩增

以CDV反转录产物、CPV 总DNA为模板进行二重TaqMan MGB荧光定量PCR扩增，通过对PCR反应体系及反应条件的优化，确定反应体系如下：采用25 μL反应体系，其中：CDV和CPV上、下游引物P1/P2、P3/P4终浓度各0.4 μmol/L，Probe-P5终浓度为0.6 μmol/L，Probe-P6终浓度为0.7 μmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，10×Ex Taq 缓冲液 2.5 μL，5U/μL Ex Taq酶0.25 μL， CDV反转录产物和CPV DNA各2 μL，用去离子水补至 25 μL；反应条件为：94℃ 5 min后，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环；

（4）判定标准

阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整；阴性对照的检测结果无特定的扩增曲线，且Ct值＞32.0或无，阳性对照的Ct值应≤29.0，且出现特定的扩增曲线，判定检测结果成立；如阴性对照和阳性对照结果不满足以上条件，此次实验视为无效；在检测结果成立的前提下，若样品检测结果Ct值≤29.0，而且出现特定的扩增曲线，判定为阳性；Ct值＞32.0或无，并且无特定的扩增曲线，则判定为阴性；32.0≥Ct值＞29.0且有特定扩增曲线的样品判定为可疑，对可疑样品重新试验，结果为阳性者判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性，结果再为可疑者应重新采集该动物样品重新试验。