CN106967843B - 犬细小病毒核酸快速检测试剂盒 - Google Patents
犬细小病毒核酸快速检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种犬细小病毒(CPV)核酸快速检测试剂盒，所述试剂盒包括以下内容：裂解液、稀释液、含引物的冻干酶管、检测液、试纸条。本发明采用常温核酸扩增技术，利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37‑45℃恒温条件下10‑30分钟内使待检DNA扩增数百万倍，配合免疫胶体金层析检测技术，可以实现对待检DNA的快速检定。本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种犬细小病毒核酸快速检测试剂盒。
背景技术
犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)是一种主要感染犬的传染性病毒，于1978年最初被分离获得，属细小病毒科，细小病毒属。犬之间通过对于其粪便的直接或间接接触而传播该病。犬细小病毒感染健康犬后引起的传染性肠炎和心肌炎发病急，死亡率高，传染性强，为犬类重要传染病之一，对犬类生命和养犬业造成极大威胁。
传统犬细小病毒检测主要为免疫法，包括免疫胶体金、酶联免疫吸附等，但都存在特异性不高和灵敏度不强等问题。目前，已有少数针对犬细小病毒核酸的检测方法，主要包括PCR技术、实时荧光定量PCR技术和LAMP技术，对犬细小病毒的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但这些技术也存在一些局限性，其中PCR技术和实时荧光定量PCR技术均需要配备价格高昂的PCR仪或实时荧光定量PCR仪，因此无法用于基层和现场检测；LAMP技术操作复杂，对操作者技术要求较高，反应温度相对较高易造成污染，反应时间较长，因此目前并未得到广泛应用。
如中国专利CN 101624635 A，公开了一种犬细小病毒LAMP检测试剂盒及其检测方法，其所述技术需要对样本进行核酸提取，核酸提取操作繁琐、耗时较长，对操作者要求较高；LAMP的反应温度为60-65℃，温度相对较高容易引起扩增产物蒸发，导致较高污染风险；其所述试剂盒反应液需要低温保存、冷链运输。
因此，怎样能够满足基层检测用时少、技术和仪器要求低、操作简单方便的需求，成为业内急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是弥补目前现有检测手段的不足，提供一种操作简单、时间短、仪器要求低的犬细小病毒(CPV)核酸快速检测试剂盒，适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
为达到上述目的，本发明的技术方案是：犬细小病毒核酸快速检测试剂盒，所述犬细小病毒核酸快速检测试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)稀释液；
(3)含引物的冻干酶管；
(4)检测液；
(5)试纸条。
所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含0.1-2M/L的KAc 100ul、0.1-2M/L的KOH 120ul、0.1-2M/L的TrisAc 250ul、水30ul。
所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含0.1-2M/L的 MgAc2 1.12ml、0.1-2M/L的KAc 1.20ml、0.1-2M/L的TrisAc 4.00ml、 1-50％的PEG8K 12.00ml、水61.68ml。
所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有 1-20mM DNA解旋酶100μL、1-20mM单链DNA结合蛋白115μL、 1-20mM DNA聚合酶100μL、1-100μM的引物CGP007402.5μL、 1-100μM的引物CGP00719 2.5μL、0.1-2M磷酸肌酸钠115μL、ATP 115μL、dNTP 20μL、1-20mM Tris-HCl 40ul、1-5％海藻糖8μL、 10-200mM KCl 3.382ml。所述含引物的冻干酶管的成分经冻干后保存。
所述引物CGP00740是：5’ FAM-CAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAAC-3’。
所述引物CGP00719是：5’ Biotin-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTTTAAGTC-3’。
所述检测液的成分如下：每380ul检测液中含有0.1-2M/L的 KAc 100ul、0.1-2M/L的TrisAc 250ul、水30ul。
所述试纸条是特异性识别FAM和Biotin的胶体金试纸条。
优选的，本发明所述犬细小病毒核酸快速检测试剂盒包括裂解液、稀释液、含引物的冻干酶管、检测液和试纸条；
其中，所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含2M/L的 KAc 100ul、0.5M/L的KOH 120ul、1M/L的TrisAc 250ul、水30ul；
其中，所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含1M/L的 MgAc2 1.12ml、2M/L的KAc1.20ml、1M/L的TrisAc 4.00ml、50％的PEG8K 12.00ml、水61.68ml；
其中，所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有10mM DNA解旋酶100μL、10mM单链DNA结合蛋白115μL、 10mM DNA聚合酶100μL、100μM的引物CGP00740 2.5μL、100μM 的引物CGP00719 2.5μL、1M磷酸肌酸钠115μL、ATP 115μL、dNTP 20μL、10mM Tris-HCl 40ul、5％海藻糖8μL、100mM KCl 3.382ml；所述引物CGP00740是：5’FAM-CAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAAC-3’；
所述引物CGP00719是：5’ Biotin-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTTTAAGTC-3’；所述含引物的冻干酶管的成分经冻干后保存；
其中，所述检测液的成分如下：每380ul检测液中含有2M/L 的KAc 100ul、1M/L的TrisAc 250ul、水30ul；
其中，所述试纸条是特异性识别FAM和Biotin的胶体金试纸条。
本发明的使用方法是：
1、用棉签取犬粪便适量(固体样本取1/4到1/2棉签头大小样本，液体样本则将棉签头浸润)，加到500μL裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
2、取样品裂解液20μL，加入到稀释液中，颠倒混匀8-10次；
3、取20μL稀释液加入含引物的冻干酶管中，充分混匀；
4、42℃恒温装置中保温30分钟；
5、反应结束后将反应液与800μL检测液混匀，加到试纸条加样垫中，5分钟内查阅试纸条结果，5分钟后结果无效。
本发明采用常温核酸扩增技术 (Enzymes-Mediated-Amplification，EMA)，以下简称EMA技术，利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下10-30分钟内使待检DNA扩增数百万倍，配合免疫胶体金层析检测技术，可以实现对待检DNA的快速检定。
本发明的引物序列是从NCBI中下载犬细小病毒基因组序列(序列号NC_001539.1)，通过oligo7软件设计引物，通过凝胶电泳筛选最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒6(10-4ng/μL)、无引物二聚体、扩增无杂带产生。筛选好引物后将引物进行标记，正反向引物5’端分别标记FAM和Biotin，从而得到本发明所含引物对：
CGP00740：5’FAM-CAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAAC-3’；
CGP00719：5’Biotin-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTTTAAGTC-3’。
本发明不需要核酸提取步骤，而是利用裂解液一步释放病毒颗粒中的核酸，同时将粪便中抑制EMA反应的蛋白类物质变性。
本发明中的稀释液即为EMA扩增缓冲液，既可以缓冲裂解液的高pH值，又可直接用于EMA扩增。
本发明的EMA体系(包括裂解液、稀释液、含引物的冻干酶管) 通过比较酶加样量、引物浓度、反应温度、反应时间等确定最终反应体系。
本发明的裂解液对犬粪便样本进行处理，处理条件仅为室温2-3 分钟，大大简化处理条件和时间。
检测液既起到将EMA体系中相关酶变性和稀释的作用，对试纸条也有一定的洗脱作用(去除背景)。
本发明的有益效果包括：
1、本发明只需对样本进行简单处理(用裂解液对样本进行处理，用缓冲液稀释)就能进行核酸扩增，无需核酸提取过程，取消了检测设备，缩短反应时间，操作简单、对操作者技术要求低；
2、本试剂盒中反应体系经过冻干处理，可常温保存和运输，免去了低温保存、冷链运输的设备要求；
3、本发明中核酸扩增条件为37℃到42℃，对温度要求低，不易造成污染；
4、反应时间短，仅需30分钟；
5、利用试纸条检测扩增结果，反应迅速、清晰明了。
本发明操作简单、反应时间短、仪器要求低，非常适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，所选配方为试剂盒的优选配方，但并不用来限制本发明的范围。
实施例1，犬细小病毒核酸快速检测
采用犬细小病毒核酸快速检测试剂盒。所述犬细小病毒核酸快速检测试剂盒包括：
1、裂解液lysis buffer 500μL；
2、稀释液rehydrate buffer 1.8ml；
稀释液每80ml含有：
3、含引物的冻干酶管4ml；所述含引物的冻干酶管中的成分经冻干后保存；
其中，引物对的序列如下：
CGP00740：5’FAM-CAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAAC-3’
CGP00719：5’Biotin-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTTTAAGTC-3’
4、检测液；
5、试纸条：特异性识别FAM和Biotin的胶体金试纸条。
所述犬细小病毒核酸快速检测试剂盒的使用步骤如下。
1、用棉签取疑似患犬粪便适量(固体样本取1/4到1/2棉签头大小样本，液体样本则将棉签头浸润)，加到500μL裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
2、取样品裂解液20μL，加入到稀释液中，颠倒混匀8-10次；
3、取20μL稀释液加入含引物的冻干酶管中，充分混匀；
4、42℃恒温装置中保温30分钟；
5、反应结束后将反应液与800μL检测液混匀，加到试纸条加样垫中，5分钟内查阅试纸条结果，5分钟后结果无效。
经本发明检测犬类粪便样本17例(其中CPV阳性样本11例、阴性样本5例)，阳性检出率为100％，而对比的两个市售品牌的免疫胶体金试纸条检出率分别为91％和82％。阴性检出率和同类产品一致，均为100％。分别用上述试剂检测梯度稀释的阳性样本，结果表明本发明的检测灵敏度较免疫胶体金试剂高10倍以上。
本发明采用常温核酸扩增技术(EMA技术)，利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37-45℃恒温条件下10-30分钟内使待检DNA扩增数百万倍，配合免疫胶体金层析检测技术，可以实现对待检DNA的快速检定。本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于宠物传染性疾病的快速诊断。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州点晶生物科技有限公司
<120> 犬细小病毒核酸快速检测试剂盒
<130> 0
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> canine parvovirus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<400> 1
caattggagg taaagcagga attaac 26
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> canine parvovirus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<400> 2
ggtgcattta catgaagtct tggttttaag tc 32
Claims (2)
1.犬细小病毒核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下内容：
(1)裂解液；
(2)稀释液；
(3)含引物的冻干酶管；
(4)检测液；
(5)试纸条；
所述裂解液的成分如下：每500μL裂解液中含0.1-2M/L的KAc100ul、0.1-2M/L的KOH120ul、0.1-2M/L的TrisAc 250ul、水30ul；
所述稀释液的成分如下：每80ml稀释液中含0.1-2M/L的MgAc21.12ml、0.1-2M/L的KAc1.20ml、0.1-2M/L的TrisAc 4.00ml、1-50％的PEG8K 12.00ml、水61.68ml；
所述含引物的冻干酶管的成分如下：每4ml冻干酶管中含有1-20mM DNA解旋酶100μL、1-20mM单链DNA结合蛋白115μL、1-20mM DNA聚合酶100μL、1-100μM的引物CGP00740 2.5μL、1-100μM的引物CGP00719 2.5μL、0.1-2M磷酸肌酸钠115μL、ATP115μL、dNTP 20μL、1-20mMTris-HCl 40ul、1-5％海藻糖8μL、10-200mM KCl 3.382ml；所述含引物的冻干酶管的成分经冻干后保存；
所述引物CGP00740是：5’FAM-CAATTGGAGGTAAAGCAGGAATTAAC-3’；
所述引物CGP00719是：5’Biotin-GGTGCATTTACATGAAGTCTTGGTTTTAAGTC-3’；
所述检测液的成分如下：每380ul检测液中含有0.1-2M/L的KAc100ul、0.1-2M/L的TrisAc 250ul、水30ul；
所述试纸条是特异性识别FAM和Biotin的胶体金试纸条。
2.如权利要求1所述的犬细小病毒核酸快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用步骤是：
(1)、用棉签取犬粪便适量，加到500μL裂解液中，充分搅拌混匀，室温放置2-3分钟；
(2)、取样品裂解液20μL，加入到稀释液中，颠倒混匀8-10次；
(3)、取20μL稀释液加入含引物的冻干酶管中，充分混匀；
(4)、42℃恒温装置中保温30分钟；
(5)、反应结束后将反应液与800μL检测液混匀，加到试纸条加样垫中，5分钟内查阅试纸条结果，5分钟后结果无效。
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