CN108841998A

CN108841998A - 检测猫疱疹病毒i型核酸的引物探针组、快速检测试剂盒及方法

Info

Publication number: CN108841998A
Application number: CN201810716854.8A
Authority: CN
Inventors: 胡振新; 郜安国; 谭卓; 彭莉
Original assignee: Suzhou Dianjing Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Dianjing Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-07-03
Filing date: 2018-07-03
Publication date: 2018-11-20

Abstract

本发明涉及检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组、快速检测试剂盒及方法。该引物探针组由上游引物、下游引物以及探针组成。该试剂盒包括含有引物探针组的冻干酶粉、裂解液和稀释液。该检测方法采用前述试剂盒进行检测，并判断结果是否为阳性。本发明的试剂盒特异性高、灵敏度高、反应迅速，可常温保存和运输；采用该试剂盒的检测方法，基于常温核酸扩增技术，省略核酸提取操作，简化了操作步骤并降低了操作难度；降低反应温度，反应条件更温和，降低仪器要求，降低污染风险；缩短反应时间；结果清晰明了。

Description

检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组、快速检测试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及一种检测猫疱疹病毒I型的引物探针组，采用该引物探针组的快速检测试剂盒，以及相应的检测方法，属于体外诊断试剂技术领域。

背景技术

据发明人所知，猫疱疹病毒I型(feline herpesvirus 1，FHV-1)又叫猫鼻气管炎病毒(feline rhinotracheitis virus)，属疱疹病毒科，是有囊膜的双链DNA病毒，直径为128～168nm，能在猫胚肾、肺以及睾丸细胞培养物内良好增殖和传代。该病毒主要侵害仔猫，感染症状严重时，出现体温升高，是一种常见引起猫眼部和上呼吸道感染的病原菌，主要以上呼吸道症状为主。该病毒能致发猫鼻气管炎病，该病唯一的自然宿主和主要传染源就是猫，通过直接接触传播。猫鼻气管炎发病率可达100％，死亡率可达50％，几乎95％的猫都曾暴露于该病原菌前。该病毒在病猫的鼻、咽喉、气管和支气管以及舌、结膜等部位增殖。该病最早发现于美国，随后在拿大、英国、荷兰、瑞士、匈牙利、越南等地发现和流行，我国也多次发现可疑病例，并分离到病毒。

猫受到FHV-1感染后的临床症状多种多样。有些猫感染FHV-1后仅仅表现出轻微的结膜炎；而一些猫则会表现出比较严重的眼部病变和鼻部病变，打喷嚏，咳嗽等；有一些猫会出现角膜溃疡，角膜溃疡是非常疼痛和严重的疾病，主人通常能在角膜上看到有角膜发白的变化，当角膜溃疡继发细菌感染时，溃疡将会发展非常迅速，最后导致角膜穿孔，引起失明。

当猫从FHV-1的感染中恢复后，几乎有80％的猫会终生携带FHV-1。也就是说，所谓治愈FHV-1其实是让疱疹病毒从活跃型转变为潜伏型，潜伏的病毒继续存在于猫的面部。当有压力或者疾病时容易导致病毒的复发。而反复感染或者长期感染可能会导致一系列的并发症，例如干眼症，睑球粘连(结膜粘在角膜或者结膜上)，角膜腐骨(一块棕色或者黑色的斑块出现在角膜上)和嗜酸性角膜炎(一种免疫介导的疾病)。

目前治疗FHV-1的主要目的是控制临床症状和并发症。有些猫初次治疗以后就不会再有任何临床症状，而一些猫则会在初次治愈后反复发作，且一般复发的猫都会有应激反应的历史。所以，尽可能避免应激反应能够减少FHV-1复发几率。FHV-1的检测主要是采用病毒的分离鉴定、组织学检查、免疫荧光等方法。FHV-1严重威胁猫科动物的养殖，至今尚无特效药物和有效的治疗办法控制其发生和复发，在诊断和预防方面还需要进一步建立准确、简便、快速的方法。

传统猫疱疹病毒Ⅰ型检测方法主要有：直接涂片或组织切片法、组织培养法、动物实验法、酶联免疫吸附法等。直接涂片或组织切片法虽然简单快速，但漏诊率高；组织培养法和动物实验法最真实可靠，但操作烦琐，耗时长，成本高；酶联免疫吸附法简便，快速，敏感性尚可，但由于个体免疫系统的差异，有时指标不能真实反映感染的情况，可能造成漏诊或误诊。

目前，已有少数针对猫疱疹病毒Ⅰ型核酸的检测方法，主要包括PCR技术和实时荧光定量PCR技术，对猫疱疹病毒Ⅰ型的检测灵敏度和特异性有了很大提升。但PCR技术和实时荧光定量PCR技术均涉及变温步骤，且需要配备价格高昂的PCR仪或实时荧光定量PCR仪，耗时较长、操作技术要求较高。

常温核酸扩增技术(Enzymes-Mediated-Amplification，EMA)，以下简称EMA技术，是本发明研究者发明的新型核酸扩增技术(参见申请号CN201310086850.3、申请公布号CN104059905A的中国发明专利申请)，EMA技术利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及其他辅助因子，可达到在42℃、30分钟内使目的DNA片段扩增数百万倍的目的。该方法操作简单、扩增温度低、扩增时间短、仪器要求低、非常适合用于疾病的快速诊断，目前还没有关于该技术在猫疱疹病毒Ⅰ型检测上的应用。

经检索发现，申请号CN201710340186.9、申请公布号CN106978511A的中国发明专利申请，公开了一种检测猫疱疹病毒的方法，采用检测猫疱疹病毒的引物对，通过SYBRGreen I荧光定量PCR方法检测猫疱疹病毒。然而，以该技术方案为代表的现有技术或多或少存在以下不利之处：(1)需要另外配备样本核酸提取试剂，核酸提取操作繁琐、耗时较长，对操作者要求较高；(2)PCR方法需要多次快速升降温处理，对仪器设备要求较高；(3)PCR的反应时间为约1.5小时，时间相对较长；(4)所用反应液不能常温保存；(5)采用SYBR Green与核酸结合产生荧光，需要通过溶解曲线区分非特异扩增，延长反应时间。

发明内容

本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提供一种用于检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组，采用该引物探针组的快速检测试剂盒，以及采用该试剂盒的检测方法，能简便、快速地完成检测，并实现常温保存和运输试剂盒。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

用于检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组，由上游引物、下游引物以及探针组成，其特征是，

所述上游引物的序列为5’-GCTACAATTATACTCAAGCCAGAATCG-3’；所述下游引物的序列为5’-GACCGTAAAGCACATATTCCAAATTCCC-3’；所述探针的序列为TTCCCGTTTAGGATCACAAAGTCTCATA/i6-FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/AAGAAACATAGGG-3’C3Spacer；在探针中，“i6-FAMdT”为6-FAM荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”为带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“3’C3Spacer”指3’羟基封闭；6-FAM为6-羧基荧光素。

采用上述引物探针组后，可实施对猫疱疹病毒I型核酸的检测。

猫疱疹病毒I型核酸的快速检测试剂盒，其特征是，含有前文所述的引物探针组。

优选地，所述试剂盒包括冻干酶粉，所述冻干酶粉按管等量分装；所述引物探针组含于冻干酶粉内，所述冻干酶粉中还含有DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、ATP再生蛋白、DNA限制性内切酶、辅助蛋白、磷酸肌酸钠、ATP、dNTP、pH8.0的Tris-Ac、海藻糖、以及KAc。

优选地，所述试剂盒包括裂解液和稀释液，所述裂解液含有KAc、KOH、pH8.0的Tris-Ac、以及水；所述稀释液含有MgAc₂、KAc、pH8.0的Tris-Ac、PEG8K、以及水。

采用上述试剂盒，可在后续的检测方法中快速检测猫疱疹病毒I型核酸。

非诊断目的猫疱疹病毒I型核酸检测方法，其特征是，采用前文所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：

第一步、将目标样本加至裂解液中，混匀后放置至少2分钟；

第二步、从第一步所得混合液中取预定体积的液体加至稀释液中并混匀；

第三步、按管取冻干酶粉，从第二步所得混合液中取预定体积的液体加入管中，充分混匀；

第四步、将第三步所得混合液放入核酸荧光检测仪中进行扩增、采集荧光数据、并绘制时间-荧光信号曲线；

第五步、根据第四步所得时间-荧光信号曲线进行判断：如果该曲线呈S形，则检测结果为阳性；反之，则检测结果为阴性。

优选地，第一步中，所述裂解液的体积为500μl；每500μl的裂解液由0.1-2M的KAc100μl、0.1-2M的KOH 120μl、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 250μl、以及水30μl组成；放置温度为15℃-35℃，放置时间为2-3分钟。(注：单位M指mol/L，下同。)

优选地，第二步中，所述预定体积为20μl，所述稀释液的体积为1ml；每80ml的稀释液由0.1-2M的MgAc₂ 1.12ml、0.1-2M的KAc 1.20ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 4.00ml、质量浓度1％-50％的PEG8K 12.00ml、以及水61.68ml组成。(注：质量浓度的单位为g/ml，下同。)

优选地，第三步中，所述预定体积为20μl；每管冻干酶粉由20μl冻干酶混合液经冻干后获得，每4ml冻干酶混合液以下组分组成：

120-150ng/μl的DNA解旋酶200μl、400-450ng/μl的单链DNA结合蛋白240μl、90-100ng/μl的DNA聚合酶96μl、5-10ng/μl的ATP再生蛋白80μl、15-20ng/μl的DNA限制性内切酶200μl、15-20ng/μl的辅助蛋白60μl、100μM的上游引物6μl、100μM的下游引物6μl、10μM的探针10μl、1M的磷酸肌酸钠115μl、80-100mM的ATP 115μl、25mM的dNTP 20μl、1-2M pH8.0的Tris-Ac40μl、质量浓度2-5％的海藻糖8μl、KAc 0.02g、余量为水。

优选地，第四步中，扩增条件为在37℃-45℃下扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次。

优选地，所述检测方法采用稀释液为阴性对照品，采用含目的基因序列的质粒干粉作为阳性对照品，所述目的基因序列为猫疱疹病毒Ⅰ型基因组gD基因序列。

采用上述检测方法，可快速检测目标样本中是否含有猫疱疹病毒I型核酸。

与现有技术相比，本发明的试剂盒特异性高、灵敏度高、反应迅速，可常温保存和运输；采用该试剂盒的检测方法，基于常温核酸扩增技术，省略核酸提取操作，简化了操作步骤并降低了操作难度；降低反应温度，反应条件更温和，降低仪器要求，降低污染风险；缩短反应时间；结果清晰明了。

附图说明

图1为本发明实施例3的检测结果示意图。

图2为本发明实施例5的检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。以下内容中涉及的实验操作，如未注明具体实验条件，则按照常规条件进行，例如，可参照SAMBROOK.J等编著的《分子克隆实验指南》第3版(Molecular Cloning：ALaboratoryManual；NEW York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中述及的条件，或参照制造厂商所建议的条件。

实施例1、设计用于检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组

从NCBI中获取猫疱疹病毒Ⅰ型基因组(序列号NC_013590.2)的gD基因序列，使用oligo7软件设计引物，通过凝胶电泳筛选得到最适引物。筛选标准：引物灵敏度至少到质粒6(10^-4ng/μl)、副反应尽量少。筛选好引物后，以上下游引物中间的序列设计一条探针，要求是二级结构少。最终所得上下游引物和探针为：

上游引物：5’-GCTACAATTATACTCAAGCCAGAATCG-3’，如SEQ ID NO.1所示。

下游引物：5’-GACCGTAAAGCACATATTCCAAATTCCC-3’，如SEQ ID NO.2所示。

探针：TTCCCGTTTAGGATCACAAAGTCTCATA/i6-FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/AAGAAACATAGGG-3’C3Spacer。其中，“i6-FAMdT”是6-FAM(6-羧基荧光素)荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”是带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“3’C3Spacer”指3’羟基封闭。

实施例2、设计快速检测猫疱疹病毒I型核酸的试剂盒

本实施例采用实施例1的引物探针组。

本实施例基于常温核酸扩增技术(即EMA技术)，分别设计裂解液、稀释液、以及按管等量分装的冻干酶粉，从而组成试剂盒。

(1)裂解液

通过比较不同浓度、不同比例、不同时间裂解液处理效果，最终选用的裂解液为：每500μL的裂解液由0.1-2M的KAc 100μl、0.1-2M的KOH 120μl、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac250μl、以及水30μl组成。

(2)稀释液

通过比较不同比例稀释效果，最终选用的稀释液为：每80ml的稀释液由0.1-2M的MgAc₂ 1.12ml、0.1-2M的KAc 1.20ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac4.00ml、质量浓度1％-50％的PEG8K 12.00ml、以及水61.68ml组成。

(3)冻干酶粉

通过比较不同酶量下扩增效果，最终选用每管冻干酶粉由20μl冻干酶混合液经冻干后获得，每4ml冻干酶混合液以下组分组成：

其中，上游引物、下游引物、以及探针即实施例1最终获得的相应序列。

实施例3、建立非诊断目的猫疱疹病毒I型核酸检测方法

本实施例采用实施例2试剂盒。

本实施例检测方法包括：

第一步、将目标样本加至500μl裂解液中，充分搅拌混匀，15℃-35℃放置2-3分钟；

第二步、取20μl上步所得混合液，加至1ml稀释液中并混匀(如颠倒混匀8-10次)；

第三步、取一管冻干酶粉，取20μl上步所得混合液加至管中，充分混匀；

第四步、将上步所得混合液放入核酸荧光检测仪中进行扩增、采集荧光数据、并绘制时间-荧光信号曲线；扩增条件为在37℃-45℃下扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次；

第五步、观察第四步所得时间-荧光信号曲线，若该曲线呈S形，则检测结果为阳性(如图1中的曲线①)；反之，则检测结果为阴性(如图1中的水平线②)。

实施例4、检测实例

1、本实施例采用的试剂盒包括：

(1)裂解液，每份500μl。

每500μl的裂解液按下表组成：

(2)稀释液，每份1ml。

每80ml的稀释液按下表组成：

(3)按管等量分装的冻干酶粉，每管冻干酶粉由20μl冻干酶混合液经冻干后获得，每4ml冻干酶混合液以下组分组成：

2、待测样本

非诊断目的的未知样本：12份未知核酸样本。

3、检测过程

采用实施例3建立的检测方法进行检测。

此外，在检测时，采用稀释液为阴性对照品，采用含目的基因序列的质粒干粉作为阳性对照品，目的基因序列为猫疱疹病毒Ⅰ型基因组gD基因序列。阳性对照品的使用浓度建议为0.5pg/μl。

4、检测结果

结果检出猫疱疹病毒Ⅰ型的阳性样本4例、阴性样本8例。

采用两个市售品牌的PCR法检测试剂盒做为对比例，本实施例与两个市售品牌的PCR法检测试剂盒检验一致率均为100％。证明本发明试剂盒灵敏度与特异度与市售产品一致，但是本发明不必进行DNA的提取，也不必进行PCR扩增，因此在耗时及成本上，本发明更具有优势。

实施例5、交叉反应检测

采用猫泛白细胞减少症病毒、猫冠状病毒、猫杯状病毒核酸，以猫疱疹病毒Ⅰ型阳性样本为对照，采用实施例2试剂盒按实施例3检测方法进行检测，结果如图2所示，其中，只有猫疱疹病毒Ⅰ型阳性样本为典型“S”型曲线，为阳性结果，其他样本均为水平线，为阴性结果。

该结果显示，除猫疱疹病毒Ⅰ型阳性样本外，其它样本结果均为阴性，证明本发明试剂盒与其它宠物传染性疾病病原体核酸无交叉反应。

综合以上各实施例结果可知，本发明以猫疱疹病毒Ⅰ型基因组的gD基因序列为目的基因，筛选最佳引物和探针，并配合以最适浓度及配比的酶和各种试剂，形成最优的实验反应体系，使本发明试剂盒具有检测能力上的优势与特点，不仅检测简单易行，而且具有较高的准确度、精密度、特异性以及可重复性。

本发明使用常温核酸扩增技术，通过DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶等多个酶促反应，可在37℃-45℃恒温条件下，10-30分钟内使目的DNA扩增数百万倍，配合荧光检测技术，可以实现对待检RNA的快速检定。本发明操作简单、时间短、仪器要求低，非常适合用于猫疱疹病毒Ⅰ型疾病的快速检测。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

序列表

<120> 检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组、快速检测试剂盒及方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gctacaatta tactcaagcc agaatcg 27

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

gaccgtaaag cacatattcc aaattccc 28

Claims

1.用于检测猫疱疹病毒I型核酸的引物探针组，由上游引物、下游引物以及探针组成，其特征是，

所述上游引物的序列为5’-GCTACAATTATACTCAAGCCAGAATCG-3’；所述下游引物的序列为5’-GACCGTAAAGCACATATTCCAAATTCCC-3’；所述探针的序列为TTCCCGTTTAGGATCACAAAGTCTCATA/i6-FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/AAGAAACATAGGG-3’C3Spacer；在探针中，“i6-FAMdT”为6-FAM荧光标记的dT核苷酸，“idSp”指碱基缺失，“iBHQ1dT”为带有BHQ1淬灭基团标记的dT核苷酸，“3’C3Spacer”指3’羟基封闭。

2.猫疱疹病毒I型核酸的快速检测试剂盒，其特征是，含有权利要求1所述的引物探针组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括冻干酶粉，所述冻干酶粉按管等量分装；所述引物探针组含于冻干酶粉内，所述冻干酶粉中还含有DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶、ATP再生蛋白、DNA限制性内切酶、辅助蛋白、磷酸肌酸钠、ATP、dNTP、pH8.0的Tris-Ac、海藻糖、以及KAc。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括裂解液和稀释液，所述裂解液含有KAc、KOH、pH8.0的Tris-Ac、以及水；所述稀释液含有MgAc₂、KAc、pH8.0的Tris-Ac、PEG8K、以及水。

5.非诊断目的猫疱疹病毒I型核酸检测方法，其特征是，采用权利要求4所述的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：

第一步、将目标样本加至裂解液中，混匀后放置至少2分钟；

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第一步中，所述裂解液的体积为500μl；每500μl的裂解液由0.1-2M的KAc 100μl、0.1-2M的KOH 120μl、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac250μl、以及水30μl组成；放置温度为15℃-35℃，放置时间为2-3分钟。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第二步中，所述预定体积为20μl，所述稀释液的体积为1ml；每80ml的稀释液由0.1-2M的MgAc₂ 1.12ml、0.1-2M的KAc 1.20ml、0.1-2M pH8.0的Tris-Ac 4.00ml、质量浓度1％-50％的PEG8K 12.00ml、以及水61.68ml组成。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第三步中，所述预定体积为20μl；每管冻干酶粉由20μl冻干酶混合液经冻干后获得，每4ml冻干酶混合液以下组分组成：

120-150ng/μl的DNA解旋酶200μl、400-450ng/μl的单链DNA结合蛋白240μl、90-100ng/μl的DNA聚合酶96μl、5-10ng/μl的ATP再生蛋白80μl、15-20ng/μl的DNA限制性内切酶200μl、15-20ng/μl的辅助蛋白60μl、100μM的上游引物6μl、100μM的下游引物6μl、10μM的探针10μl、1M的磷酸肌酸钠115μl、80-100mM的ATP 115μl、25mM的dNTP 20μl、1-2M pH8.0的Tris-Ac 40μl、质量浓度2-5％的海藻糖8μl、KAc 0.02g、余量为水。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，第四步中，扩增条件为在37℃-45℃下扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次。

10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征是，所述检测方法采用稀释液为阴性对照品，采用含目的基因序列的质粒干粉作为阳性对照品，所述目的基因序列为猫疱疹病毒Ⅰ型基因组gD基因序列。