CN116411141A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂盒及应用 - Google Patents

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含特异性crRNA、猪A群轮状病毒特异性RPA引物对及ssDNA探针，所述特异性crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述RPA上游引物RPA‑F1‑PoRVA如SEQ ID NO:2所示，RPA下游引物RPA‑R3‑PoRVA如SEQ ID NO:3所示，荧光法和试纸条法ssDNA探针的核苷酸序列分别如TTTATTT和SEQ ID NO:6所示；探针5’端标记荧光基团，3’端标记猝灭基团。所述试剂盒具有操作便捷、耗时少、灵敏性高和特异性强等特点，全程在37℃环境下进行，可以有效脱离实验室大型仪器的依赖，便于快速现场检测。

Description

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂 盒及应用
技术领域
本发明属于病原体快速检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂盒及应用。
背景技术
轮状病毒是一种常见的腹泻病原，其主要引起幼儿和幼龄动物的急性胃肠炎和腹泻。“轮状病毒”的名称源于电子显微镜观察到的病毒粒子外观(Estes et al.,2001)。猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是重要的仔猪病毒性腹泻病原，其中临床上主要流行A群猪轮状病毒(Porcine rotavirus A,PoRVA)。PoRV通过粪口途径传播，感染动物的成熟小肠肠上皮细胞被破坏，损伤特征是短绒毛、稀疏和不规则的微绒毛以及单核细胞浸润固有层。发病猪一般出现消瘦、脱水、呕吐、水样腹泻等症状，其胃肠道病变主要为胃壁弛缓且充满凝乳块和乳汁，小肠黏膜呈条状或弥漫性出血。PoRV一般呈地方性流行特点，不同年龄段个体可以相互感染并可以在猪群中长期存在，易感宿主只要存在少量病毒载量就可以引起疾病。断奶猪和成年猪的临床症状较轻，但其生长和繁殖性能会受到一定损伤，对猪场造成经济损失。RV可以感染家养和野生动物，导致新生动物死亡，具有广泛交叉中和效力的疫苗接种是减少严重轮状病毒相关胃肠炎和死亡率的重要措施，但是频繁突变和重组引起的遗传多样性会降低保护性免疫反应，这引起了人们对轮状病毒疫苗长期实施和有效性的担忧。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas技术是近年快速发展的基因编辑技术，该技术为生物工程、医药领域、病原核酸检测等领域带来新的思路。Cas12a又称Cpf1，当Cas12a识别靶标DNA后，Cas12a/crRNA/DNA形成三元复合物被激活，Cas12a在特异性切割靶标序列的同时，可以非特异性切割体系中任意的单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)。基于Cas12a蛋白的核酸检测依赖其与靶标核酸结合后表现出的反式切割活性，通过在体系中引入单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)报告子，建立靶向目标核酸的检测平台。
RPA是2006年英国公司TwistDx Inc开发的等温核酸扩增技术，其特点是重组酶与引物相结合形成的复合物定位模板链上同源序列，随后引发链置换反应并启动DNA合成，达到对目的片段指数级扩增。RPA反应中有3种主要成分，分别为重组酶(如T4 uvsX、E.colirecA等)、单链结合蛋白(如T4 gp32等)和链置换DNA聚合酶(如B.subtilis Pol I、S.aureus Pol等)。RPA反应完成后可以通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，但是由于RPA反应体系中存在一些影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移的物质，可能导致凝胶成像结果中出现拖带现象。针对这一问题，将CRISPR/Cas技术、荧光探针技术和测流层析核酸试纸条技术等与RPA技术结合，开发出不需要专业复杂的仪器设备，更加适合现场检测的快速检测方案。
发明内容
针对现有技术中缺少可以现场快速可视化检测猪A群轮状病毒的检测方法，本发明提供了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的试剂盒及应用。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
第一方面，本发明保护一种用于检测猪A群轮状病毒的组合物，所述组合物主要包括特异性crRNA序列、特异性RPA引物序列，以及荧光法ssDNA探针或试纸条法ssDNA探针：
所述特异性crRNA序列信息如下所示：
crRNA-PoRVA(SEQ ID NO:1)：
5’–UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCUGGAAAAUCUAUKGGKAG-3’；
crRNA序列信息中的带下划线的序列为LbCas12a同源的茎环序列；
所述特异性RPA扩增引物序列信息如下所示：
RPA上游引物RPA-F-PoRVA(SEQ ID NO:2)：
5’-AAAGCGCTACAGTGATGTCTCTYRGYATTGACGT-3’；
RPA下游引物RPA-R1-PoRVA(SEQ ID NO:3)：
5’-TCGTTYGAWGCAGRATCAGADGGTCCAATATC-3’；
所述荧光法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-1：5’-6-FAM-TTTATTT-BHQ1-3’，探针5’端标记荧光基团为6-羧基荧光素(6-Carboxy Fluorescein，6-FAM)，3’端标记猝灭基团为黑洞猝灭剂1(Black HoleQuencher1，BHQ1)；
所述试纸条法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-2(SEQ ID NO:6)：5’-6-FAM-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-Biotin-3’，探针5’端标记荧光基团为6-羧基荧光素(6-Carboxy Fluorescein，6-FAM)，3’端标记猝灭基团为生物素(Biotin)。
第二方面，本发明保护一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的产品，所述产品选自如下任一种：
(A1)含有权利要求1所述组合物的试剂；
(A2)含有权利要求1所述组合物的试剂盒；
(A3)含有(A1)所述试剂的试剂盒。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包含RPA恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物WLB8201KIT)和CRISPR/Cas12a切割检测试剂。
在具体的实施方案中，所述试剂盒还包含CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)，该试纸条包括检测线T线和质控线C线，具体包被有双抗的质控线C线和包被有链霉亲和素的检测线T线。
本发明针对猪A群轮状病毒基因组中的序列保守区域，设计了特异性RPA扩增引物以及crRNA序列；通过先对待测样品进行扩增，再在crRNA的介导下，引导CRISPR/Cas12a体系对扩增产物进行识别结合并激活非特异性核酸酶的切割功能，然后任意切割体系中的ssDNA荧光探针得到切割产物，最后通过切割产物的可视化检测结果进行判断。
第三方面，本发明还保护前文所述的组合物，前文所述的试剂，或前文所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
(1)在可视化检测猪A群轮状病毒中的应用；
(2)在制备可视化检测猪A群轮状病毒的产品中的应用。
第四方面，本发明保护一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，是通过以下步骤予以实现的：
步骤1，获取待检样品的cDNA：提取待测样品的RNA，反转录为cDNA模板；
步骤2，使用特异性RPA引物进行目的基因片段的扩增：以步骤1中获得的cDNA作为模板，将上述特异性RPA引物RPA-F-PoRVA(SEQ ID NO:2)和RPA-R1-PoRVA(SEQ ID NO:3)加入体系，在37～39℃下进行恒温核酸扩增反应，得到扩增产物；
步骤3，进行CRISPR/Cas12a切割反应：利用上述的crRNA-PoRVA(SEQ ID NO:1)制备Cas12a-crRNA复合物，再加入ssDNA-Probe-1或者ssDNA-Probe-2(SEQ ID NO:6)探针，以及步骤2得到的扩增产物，在37±1℃下进行切割反应得到切割产物；
步骤4，荧光可视化检测结果：若在步骤3中加入的是前文所述的ssDNA-Probe-1探针，则将步骤3得到的切割产物在蓝光照射下或凝胶成像仪中进行裸眼观察或显色，若在蓝光照射下或凝胶成像仪显像时无荧光亮度，则表示待测样品中无猪A群轮状病毒感染，反之若可观察到荧光亮度，则表示待测样品中存在猪A群轮状病毒感染；
步骤5，试纸条可视化检测结果：若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-2(SEQ IDNO:6)探针，则在步骤3得到的切割产物加入nuclease-free水至体积为50μL，滴于CRISPRCas12/13HybriDetect试纸条上，若检测线T线显示红色条带则表示待测样品中存在猪A群轮状病毒感染；若是检测线T线未显示条带，质控线C线上出现红色条带，则表示待测样品中不存在猪A群轮状病毒感染；若是检测线T线和质控线C线都未出现红色条带，则该检测结果提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误，需要进行重新检测。
进一步地，步骤1中反转录使用
Figure BDA0004179209720000041
II 1st Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random hexamers,1μL Oligo(dT)23VN,5μLnuclease-free Water,5μL总RNA，4μL 4×gDNA wiper Mix，吹打混匀后42℃加热2min，继续加入：2μL 10×RT Mix、2μL/>
Figure BDA0004179209720000042
II Enzyme Mix。
进一步地，步骤1中反转录的反应程序为：50℃加热15min，85℃加热2min，反应后得到cDNA模板。
进一步地，步骤2中RPA恒温扩增的反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA各2μL，1μL cDNA模板，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM；反应程序为37℃反应20min。
进一步地，步骤3中CRISPR/Cas12a切割反应的体系为：1μL步骤2得到的扩增产物，2μL NEBuffer 2.1，0.5μLcrRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000043
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；反应程序为37℃反应25min。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明筛选得到了一种用于检测猪A群轮状病毒的组合物，所述组合物由特异性crRNA、特异性RPA引物对和探针组成，所述RPA引物对和crRNA的特异性好，灵敏性高，可以快速准确地检测到猪A群轮状病毒；
2、本发明采用CRISPR/Cas12a体系建立了快速可视化检测猪A群轮状病毒的方法，通过RPA扩增以及crRNA识别双重特异地对猪A群轮状病毒进行检测，反应全程在37～40℃环境下进行，检测结果可通过蓝光照射下裸眼直接观察、凝胶成像仪显色或者CRISPRCas12/13 HybriDetect试纸条显色三种方法可供选择进行观察，脱离了实验室大型仪器的限制和依赖，实现现场快速检测，具有成本低、操作便捷、耗时少、灵敏性高和特异性强的优点。
3、本发明中检测方法的建立，为猪A群轮状病毒的监测提供了可靠的技术支持。
附图说明
图1为不同特异性RPA引物对序列检测猪A群轮状病毒的凝胶成像图；
图2为不同浓度Lba Cas12a蛋白酶和crRNA组合检测体系检测猪A群轮状病毒的凝胶成像图；
图3为不同CRISPR/Cas12a切割反应时间的试纸条显色结果图；
图4为CRISPR/Cas12a切割反应最佳体系检测梯度浓度阳性标准质粒(1×100～1×107copies/μL)的凝胶成像图(A)、蓝光照射显色图(B)和核酸试纸条显色结果图(C)；
图5为特异性试验，使用CRISPR/Cas12a切割反应最佳体系检测其它病原阳性样品的蓝光照射显色图(A)、凝胶成像图(B)和核酸试纸条显色结果图(C)，图中1～6：猪A群轮状病毒，猪流行性腹泻病毒，猪呼吸和繁殖综合征病毒，经典猪瘟病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪圆环病毒2型。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
用于检测猪A群轮状病毒的特异性crRNA和特异性RPA引物对的设计
1、实验方法
(1)在美国国家生物技术信息中心网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载目前已有所有的猪A群轮状病毒(Porcine rotavirus A,PoRVA)的NSP5基因序列并进行序列比对；
(2)使用MEGA7和Oligo7.0软件针对PoRVA基因保守区域进行特异性crRNA序列和特异性RPA引物序列的设计，为了筛选扩增效率更高的RPA引物对，围绕crRNA分别设计1条RPA上游引物序列和3条RPA下游引物序列，将其两两组合可以得到共3组RPA引物对，通过核酸凝胶电泳筛选出扩增效率最高的RPA引物对；
(3)将设计完成的多对特异性RPA引物、荧光法ssDNA探针和试纸条法ssDNA探针交由上海生工生物公司进行合成，特异性crRNA交由北京擎科生物科技有限公司进行合成。
2、实验结果
(1)设计的具体序列如下：
所述用于检测猪A群轮状病毒的特异性crRNA序列信息如下所示：
crRNA-PoRVA(SEQ ID NO:1)：
5’–UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUCCAAAUGAGAGAAYUACCAA-3’；
crRNA序列信息中的带下划线的序列为LbCas12a同源的茎环序列。
所述用于检测猪A群轮状病毒的特异性RPA扩增引物序列信息如下所示：
RPA上游引物RPA-F-PoRVA(SEQ ID NO:2)：
5’-AAAGCGCTACAGTGATGTCTCTYRGYATTGACGT-3’；
RPA下游引物RPA-R1-PoRVA(SEQ ID NO:3)：
5’-TCGTTYGAWGCAGRATCAGADGGTCCAATATC-3’；
RPA下游引物RPA-R2-PoRVA(SEQ ID NO:4)：
5’-AGTGGRTCGTTYGAWGCAGRATCAGADGGTCC-3’；
RPA下游引物RPA-R3-PoRVA(SEQ ID NO:5)：
5’-GCAGRATCAGADGGTYCAATATCYTCYGGAG-3’；
所述用于检测猪A群轮状病毒的荧光法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-1：5’-6-FAM-TTTATTT-BHQ1-3’；
所述用于检测猪A群轮状病毒的试纸条法ssDNA探针序列信息如下所示：
ssDNA-Probe-2(SEQ ID NO:6)：5’-6-FAM-CCGGAAAAAAAAAAAACCGG-Biotin-3’
实施例2
最佳特异性RPA引物对的设计和筛选
1、实验方法
(1)提取PoRVA阳性样品的总RNA，反转录后得到cDNA样品，使用实施例1中设计并合成的特异性RPA引物对，使用恒温快速扩增试剂盒(安普未来生物WLB8201KIT)，进行重组酶聚合酶扩增反应(RPA)，扩增目的片段；
(2)根据说明书，RPA恒温扩增反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA各2μL，1μL cDNA模板，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的反应产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行成像分析。
2、实验结果
如图1所示，经过筛选我们选择RPA-F-PoRVA(SEQ ID NO:2)和RPA-R1-PoRVA(SEQID NO:3)作为本检测试剂盒中的特异性RPA引物对。
实施例3
构建最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系
1、实验方法
(1)使用RPA引物对1×103拷贝/μL阳性质粒标准品进行扩增，获得包含crRNA互补区域的扩增产物，作为Cas12a切割靶标dsDNA；
(2)分别将12.5nM、25nM、37.5nM和50nM浓度Lba Cas12a蛋白酶和125nM、250nM、375nM和500nM浓度crRNA进行两两组合构成不同的切割反应体系，体系中其余成分加入量为：2μL NEBuffer 2.1，荧光法ssDNA探针和RPA产物各1μL，用nuclease-free水将体积补充到20μL。
(3)将反应体系置于
Figure BDA0004179209720000061
96荧光定量仪中，选择FAM荧光通道，设置程序为37℃反应40min，每分钟收集一次荧光信号，通过观察每个反应体系的最终荧光信号强度和反应效率，并置于凝胶成像仪蓝光照射下观察体系荧光状态，得到切割反应最佳LbaCas12a蛋白酶及crRNA浓度。
2、实验结果
表1最佳体系的探究
Figure BDA0004179209720000071
(1)如表1和图2所示，当体系中加入0.5μL的
Figure BDA0004179209720000072
Lba Cas12a(Cpf1)和0.25μLcrRNA时，荧光定量仪收集到的荧光强度以及反应效率综合效果最佳，蓝光照射下的凝胶成像和肉眼观察时荧光强度无明显区别；
(2)最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系为：1μL步骤2得到的扩增产物，2μLNEBuffer 2.1,，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000073
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL。
实施例4
构建最佳CRISPR/Cas12a切割反应时间
1、实验方法
(1)使用RPA引物对1×103拷贝/μL阳性质粒标准品进行扩增，获得包含crRNA互补区域的扩增产物，作为Cas12a切割靶标dsDNA；
(2)使用最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系中：1μL步骤2得到的扩增产物，2μLNEBuffer 2.1，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000074
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(3)将反应体系置于
Figure BDA0004179209720000075
96荧光定量仪中，选择FAM荧光通道，将反应体系在37℃反应时间设置为：30min、25min、20min、15min和10min，通过观察检测线(T线)的变化，确定最佳反应时间。
2、实验结果
如图3所示，当切割反应时间在25min时检测线(T线)显示红色条带，当切割反应时间在20min时检测线(T线)不显示条带，最佳切割反应时间确定为25min。
实施例5
基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的试剂盒的灵敏性检验
1、实验方法
(1)构建猪A群轮状病毒目的基因标准质粒：使用普通PCR扩增目的基因，将目的基因连接到pMD-18T质粒中，制备稀释倍数为10倍，浓度为1×107copies/μL～1×100copies/μL的标准质粒；
(2)使用上述质粒标准品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA和cDNA模板各2μL，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL，其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系中：1μL步骤2得到的扩增产物，2μL NEBuffer 2.1，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000081
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR/Cas12a切割反应程序：在37℃下反应25min，反应在荧光定量仪中进行，反应过程中收集荧光信号，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
2、实验结果
(1)如图4所示，当体系中加入荧光法ssDNA探针，通过荧光定量仪收集荧光信号、蓝光照射下肉眼观察以及凝胶成像仪中成像的结果，可以得到荧光法检测灵敏性为10copies/μL；当体系中加入试纸条法ssDNA探针，通过对试纸条的显色结果进行判读，可以得到试纸条法检测灵敏性为10copies/μL。
实施例6
基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的试剂盒的特异性检验
1、实验方法
(1)使用猪圆环病毒2型、猪繁殖和呼吸综合征病毒、经典猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒阳性样品，提取样品的总RNA，反转录为cDNA模板样品；
(2)使用上述cDNA模板样品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA各2μL，1μL cDNA模板，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系中：1μL步骤2得到的扩增产物，2μL NEBuffer 2.1，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000082
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR/Cas12a切割反应程序：在37℃下反应25min，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
2、实验结果
(1)如图5所示，当体系中加入荧光法ssDNA探针，凝胶成像仪成像和蓝光照射肉眼观察结果显示只有猪A群轮状病毒阳性样品检测结果显示阳性，荧光法检测特异性表现优异；当体系中加入试纸条法ssDNA探针，CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条显色结果显示只有猪A群轮状病毒阳性样品检测结果显示阳性，试纸条法检测特异性表现优异。
实施例7
基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的试剂盒的临床样品检测
1、实验方法
(1)对来自于全国各地猪场的16份组织和拭子样品进行总RNA提取，反转录后得到cDNA模板样品；
(2)使用上述cDNA模板样品进行RPA恒温扩增，反应体系为：29.4μL A buffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA各2μL，1μL cDNA模板，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM；
(3)RPA恒温扩增反应程序为：37℃下反应20min，得到扩增产物；
(4)使用步骤(3)得到的各浓度质粒标准品RPA扩增产物，置于最佳CRISPR/Cas12a切割反应体系中：1μL步骤2得到的扩增产物，2μL NEBuffer 2.1，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure BDA0004179209720000091
Lba Cas12a(Cpf1)，1μL ssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；
(5)CRISPR/Cas12a切割反应程序：在37℃下反应25min，反应结束后置于凝胶成像仪中进行蓝光照射下的成像和肉眼观察，或将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条(沃博生物JY0301)进行反应并进行结果判读。
(6)使用猪A群轮状病毒普通PCR检测方法检测步骤(1)得到的cDNA模板样品，将PCR检测结果与步骤(5)得到的检测结果进行对比验证。
2、实验结果
对比RPA-CRISPR/Cas12a检测结果和PCR检测结果，两者检测结果一致，16份临床样品中共有12份阳性样品和4份阴性样品，表明本发明可用于临床检测猪A群轮状病毒。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物主要包括crRNA序列、特异性RPA引物对，以及荧光法ssDNA探针或试纸条法ssDNA探针；
所述crRNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述特异性RPA引物对的上游引物RPA-F1-PoRVA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物RPA-R3-PoRVA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述荧光法ssDNA探针的核苷酸序列如TTTATTT所示；
所述试纸条法ssDNA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的产品，其特征在于，所述产品选自如下任一种：
(A1)含有权利要求1所述组合物的试剂；
(A2)含有权利要求1所述组合物的试剂盒；
(A3)含有(A1)所述试剂的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的产品，其特征在于，当产品为试剂盒时，所述试剂盒还包含Cas12a专用核酸检测试纸条，所述Cas12a专用核酸检测试纸条包括检测线T线和质控线C线；
优选的，所述T线上包被有双抗，所述C线上包被链霉亲和素。
4.权利要求1所述的组合物，权利要求2所述的产品，或权利要求3所述的试剂盒在如下任一所述的应用：
(1)在可视化检测猪A群轮状病毒中的应用；
(2)在制备可视化检测猪A群轮状病毒的产品中的应用。
5.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
步骤1，获取待检样品的cDNA：提取待测样品的RNA，反转录为cDNA模板；
步骤2，使用特异性RPA引物进行目的基因片段的扩增：以步骤1中获得的cDNA作为模板，将权利要求1所述的特异性RPA引物RPA-F-PoRVA和RPA-R1-PoRVA加入体系，在37～39℃下进行恒温核酸扩增反应，得到扩增产物；
步骤3，进行CRISPR/Cas12a切割反应：利用权利要求1所述的crRNA-PoRVA制备Cas12a-crRNA复合物，再加入权利要求1所述的ssDNA-Probe-1或者SEQ ID NO:7所述的ssDNA-Probe-2探针，以及步骤2得到的扩增产物，在37±1℃下进行切割反应得到切割产物。
6.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-1探针，则将步骤3得到的切割产物在蓝光照射下或凝胶成像仪中进行裸眼观察或显色，若在蓝光照射下或凝胶成像仪显像时无荧光亮度，则表示待测样品中无猪A群轮状病毒感染，反之若可观察到荧光亮度，则表示待测样品中存在猪A群轮状病毒感染。
7.根据权利要求5所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，若在步骤3中加入的是ssDNA-Probe-2探针，则在步骤3得到的切割产物中加入nuclease-free水至体积达到50μL，将切割产物滴于CRISPR Cas12/13HybriDetect试纸条上，若检测线T线显示红色条带则表示待测样品中存在猪A群轮状病毒感染；若是检测线T线未显示条带，质控线C线上出现红色条带，则表示待测样品中不存在猪A群轮状病毒感染；若是检测线T线和质控线C线都未出现红色条带，则该检测结果提示所用的试纸条或扩增试剂可能已经损坏、失效或操作有误，需要进行重新检测。
8.根据权利要求5-7任一所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，步骤1中反转录使用
Figure FDA0004179209710000021
II 1st Strand cDNASynthesis Kit进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Oligo(dT)23VN,1μL Random hexamers,5μL总RNA，4μL4×gDNAwiper Mix，5μL nuclease-free Water,吹打混匀后42℃加热2min，继续加入：2μL10×RT Mix、2μL />
Figure FDA0004179209710000022
II Enzyme Mix；
优选的，步骤1中反转录的反应程序为：50℃加热15min，85℃加热2min，反应后得到cDNA模板。
9.根据权利要求5-7任一所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，步骤2中RPA恒温扩增的反应体系为：29.4μL Abuffer，RPA-F-PoRVA、RPA-R1-PoRVA各2μL，1μL cDNA模板，2.5μL B buffer，ddH2O加至体系总体积为50μL；其中引物浓度均为10μM；反应程序为37℃反应20min。
10.根据权利要求5-7任一所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒的方法，其特征在于，步骤3中CRISPR/Cas12a切割反应的体系为：1μL步骤2得到的扩增产物，2μL NEBuffer 2.1，0.5μL crRNA-PoRVA，0.25μL
Figure FDA0004179209710000023
Lba Cas12a(Cpf1)，1μLssDNA-Probe-1或ssDNA-Probe-2，nuclease-free水加至体系总体积为20μL；反应程序为37℃反应25min。
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