CN118109650A - 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒 - Google Patents

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒 Download PDF

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CN118109650A
CN118109650A CN202410440586.7A CN202410440586A CN118109650A CN 118109650 A CN118109650 A CN 118109650A CN 202410440586 A CN202410440586 A CN 202410440586A CN 118109650 A CN118109650 A CN 118109650A
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rpa
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sva
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cas12a
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赵晓民
童德文
高娟
舒金琪
查银河
常玲玲
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Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd
Northwest A&F University
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Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd
Northwest A&F University
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Abstract

本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a检测猪A型塞内卡病毒的试剂盒及核酸检测模板的制备方法，通过样品预处理将采集自猪的生物检材制成用于SVA核酸检测的模板提取液，随后根据建立的免核酸提取SVA检测体系，通过RPA方法进行扩增，利用Cas12a和crRNA组装的复合物识别并结合RPA扩增的特异产物上的特定位点序列以激活Cas12a的附属切割活性，从而对ssDNA探针进行切割，最后在紫外灯下肉眼观察显色结果判定猪感染SVA的情况。本发明对SVA的检测操作简单，并且具有较高的灵敏度和特异性，为现场筛查提供了快速检测试剂。

Description

一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化 检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，是一种基于CRISPR/Cas12a检测系统与RPA技术相结合实现SVA可视化检测方法，涉及一种SVA的扩增引物组、RPA扩增试剂盒和检测体系的建立。
背景技术
A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)属于小核糖核酸病毒科塞内卡病毒属的唯一成员，是一种无包膜单股正链RNA病毒，是引起猪塞内卡病毒病的主要病原。
猪塞内卡病毒病的主要发病特征为引起猪群鼻部、唇部、蹄部、腹部、背部等部位出现水泡、脓包、溃疡等病变，由于它的临床症状与口蹄疫、猪传染性水疱病、猪水疱性皮疹、猪水疱性口炎等疾病的临床症状极为相似，这给疾病的鉴别诊断造成了严重的困难，所以急需开发一种快速、准确的诊断方法，用于鉴别塞内卡病毒的感染、评估塞内卡病毒的传染性以及评价疫苗的免疫效果。
目前市面上存在许多检测SVA感染的方法，包括PCR、血清中和试验、间接免疫荧光法(IFA)和竞争性酶联免疫吸附试验(竞争ELISA)等。血清中和试验和间接免疫荧光法存在检测速度较慢、检测过程繁琐的问题。竞争ELISA检测技术需要特异性较好的单克隆抗体和血清抗体之间竞争，来结合抗原，问题在于单克隆抗体制备技术复杂，费时费力，在动物疫病的检测中需要花费较高的成本。PCR是一种快速检测核酸的方法，能快速检测并确定动物个体是否感染该病毒，但需要PCR仪，不能实现现场诊断，且不能通过肉眼观察结果。因此有必要建立一种更加快捷、灵敏、可用于现场诊断，不依赖于大型仪器，可用肉眼诊断的检测方法。
重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一项等温扩增技术，模板不用热变性，能够在等温条件下快速扩增DNA或RNA，耗时较短。RPA具有操作简单快速、结果精确、节能等优点，使利用其建立快速、便捷的现场病毒核酸检测技术成为可能。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是在细菌和古细菌中发现的具有保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统，发挥作用是通过与CRISPR相关(Cas)蛋白的结合来阻止病毒和噬菌体的入侵，现在越来越多的研究者将重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)与CRISPR技术相结合，利用相关蛋白(Cas)的特性，切割靶向双链DNA的同时，也会反向切割非靶向的ssDNA，此时我们提供带有荧光团和猝灭连接的ssDNA，当ssDNA被切割后将从其猝灭剂中释放荧光团，并且可以检测到荧光，紫外灯下肉眼可见，使判定检测结果更加方便、直观。
目前仅见一种诊断A型塞内卡病毒快速检测的流动试纸条的专利，专利公开号为CN108796123A，其为流动试纸条，根据T线处是否显色来判定检测结果，且该种方法需要提取核酸，增加了交叉污染的风险，本专利是建立的一种荧光显色方法，在紫外灯下肉眼观察判定结果，同时省去了核酸提取的步骤，此方法尚未见专利报道，RPA不同于PCR技术，引物设计的要求更为严苛，无法完全依照软件设计实现，筛选有效的特异性扩增引物以及筛选CRISPR相关(Cas)蛋白及其所识别的crRNA浓度和反应条件，都需要专业人员过硬的理论知识和娴熟的操作技能才能，这些都是实现SVA可视化检测的难题。
发明内容
本发明的目的在于基于CRISPR/Cas12a系统建立一种SVA的可视化检测试剂盒，可实现核酸免提取及在紫外灯下可观察结果，具有读取结果简单快捷，耗时短等优点，应用前景广泛。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明一方面提供了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒，所述试剂盒包括免核酸提取试剂、SVA扩增引物组、RPA扩增试剂盒以及检测试剂盒反应液；其中
(1)所述免核酸提取试剂的成分：蛋白酶K 9～11mg/L、Tritonx-1000.8～1.2％、EDTA 4～6mM、PEG8000 1.8～2％、盐酸胍45～50mM，及Tris-HCl180～200mM；pH7.0～9.0；
(2)所述SVA扩增引物组包括SVA扩增引物组P1，所述引物组P1的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CTACTTCAAACCAGGAACACTACTCGAG-3'；
下游引物：5'-CCGGCAGCACCGAAGTTCGCGGGGCTATCC-3'；
(3)所述检测试剂盒反应液包括crRNA核苷酸序列P2、ssDNA核苷酸序列P3、Cas12a蛋白。其中：
所述crRNA核苷酸序列P2为：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCAGAAUGUUGAGCCAACAUA；
所述ssDNA的核苷酸序列P3为：5’-FAM-TTTTT-BHQI-3’。
优选地，本发明所述的crRNA核苷酸序列P2的工作浓度为400～500nM。
优选地，本发明所述Cas12a蛋白工作浓度为250～300nM。
优选地，本发明所述的RPA扩增试剂盒包括RPA反应单元冻干粉、RPA缓冲液和启动剂，其中RPA反应单元冻干粉包含重组酶蛋白Uvs x和Uvs y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶。
再一方面，本发明还提供了一种所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测猪的生物样品与免核酸提取试剂混合处理：
(2)采用SVA扩增引物组P1对(1)处理后的样品进行RPA扩增试剂盒扩增，得到扩增产物；
(3)将扩增后产物投入检测试剂盒反应液中进行Cas12a的切割反应；
(4)将反应后产物进行紫外荧光灯下观察结果，若PCR管中发出肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品含有感染获得的A型塞内卡病毒；若没有肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品不含有A型塞内卡病毒。
优选地，本发明所述步骤(1)将待测猪的生物样品与免核酸提取试剂混合处理的具体方法为：
步骤一：取样品与免核酸提取试剂按体积比0.8～1:1～1.2混合均匀，得到混合溶液；
步骤二：将所述混合溶液置于50～60℃水浴锅中水浴保温25～30min，得到混合反应液；
步骤三：吸取混合反应液作为核酸检测的模板，置于-20℃保存待用。
优选地，本发明所述步骤(2)中RPA扩增试剂盒扩增反应的总反应体系为50μL；其中
反应体系为：SVA cDNA模板2μL、SVA扩增引物组P1上游引物2μL、SVA扩增引物组P1下游引物2μL、RPA缓冲液25μL、3μL启动剂以及ddH2O16μL，混匀后转至RPA反应单元冻干粉中进行；
反应程序为：40℃扩增20～30min。
优选地，本发明所述步骤(3)中检测试剂盒反应液中进行Cas12a的切割反应的体系为：
250～300nM Cas12a 2.0～2.1μL、400～500nM crRNA 2.0～2.1μL、5μM ssDNA1.5～2μL、1×RPA缓冲液2～2.5μL以及≤3μL的RPA扩增后产物，补水至20μL；
其反应程序为：30～45℃扩增20～40min，冰上终止反应。
优选地，本发明所述步骤(1)中的猪的生物样品包括血清、组织液、鼻拭子。
本发明的有益效果体现在：
本发明通过核酸检测样品的处理试剂(即免核酸提取试剂)提取样本核酸后，经设计和筛选的SVA扩增引物在RPA扩增试剂盒中进行扩增后，投检测体系中，建立了基于CRISPR/Cas12a检测系统同RPA技术相结合的SVA可视化检测方法，检测结果采用紫外荧光灯下进行观察判读结果，具有检测速度快、成本低、灵敏度和稳定性高，以及特异性强的优势，对基因扩增设备的要求低(不需要PCR仪)，方便在现场开展A型塞内卡病毒的快速筛查。
进一步地，本发明利用所述的SVA扩增引物组结合反应体系优化，在紫外荧光灯下可以进行结果观察判读，降低了检测结果会受到降解的影响。
本发明具有以下优点：
(1)本发明检测方法操作简单，具有等温、免核酸提取的优点，且不需要昂贵复杂的仪器设备，非常适用于资源受限地区或实验室快速检测。
(2)本发明可以在紫外荧光下发出强烈的绿色荧光，可通过肉眼来判定检测结果，使结果读取更加方便、直观。
(3)本发明的RPA扩增引物组是针对SVA保守基因序列设计，利用该引物组对口蹄疫病毒、猪水疱病毒进行检测，均未扩增出条带，表明引物组的特异性强。
(4)本发明对SVA的检测灵敏度高，可达到1copy/μL。
(5)本发明的检测结果通过紫外荧光下通过肉眼进行判读，通过对荧光定量结果进行优化Cas12a和crRNA反应体系，在降低检测成本的同时，更是提高了检测结果的灵敏性，解决了CRISPR/Cas12a-RPA检测方法稳定性不足的难题，可以有效的控制检测误差。
附图说明
图1为本发明实施例中为免核酸提取试剂对SVA病毒液进行核酸提取后PCR扩增结果的电泳图：其中，泳道M：DL2000 Plus Marker；泳道1：引物对SVA F-R(扩增目的片段为199bp)；泳道2：阴性对照。
图2为本发明实施例中SVA的SVA扩增引物扩增结果的电泳图：其中，泳道M：DL2000Plus Marker；泳道1：引物对SVA F-R(扩增目的片段为199bp)；泳道2：阴性对照。
图3为本发明实施例中SVA的基于CRISPR/Cas12a的可视化检测的可行性分析图，孔1：体系中包含Cas12a蛋白、SVA核酸、crRNA、ssDNA；孔2、3、4、5：体系中分别为只有reporter DNA组、缺失Cas12a组、缺失crRNA组、缺失SVA核酸。
图4为本发明实施例中SVA的基于CRISPR/Cas12a的可视化检测对Cas12a浓度和crRNA浓度优化图：左侧Cas12a蛋白浓度稀释梯度分别为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L、200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L；右侧crRNA浓度梯度分别为200nmol/L、300nmol/L、400nmol/L和500nmol/L。
图5为本发明实施例中SVA的CRISPR/Cas12a荧光法的灵敏性检测结果图：其中1-6孔：靶标核酸的浓度分别为：105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL、1copy/μL；7：阴性对照。
图6为本发明实施例中SVA的PCR引物灵敏性扩增检测结果图：泳道M：DL 2000PlusMarker；1-6泳道：靶标核酸的浓度分别为：105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、10copies/μL、1copy/μL；7：阴性对照。
图7为本发明实施例中SVA的CRISPR/Cas12a荧光法的特异性检测结果图：1-4孔：分别为SVA、FMDV、SWPV、阴性对照。
图8试剂盒的具体检测步骤示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而非对本发明保护范围的限制。
实施例1：病毒cDNA的制备
(1)引物的设计与合成
在GeneBank中收集SVA基因组序列，利用MegAlign对序列进行比对分析，选出SVA高度保守且种族间特异性强的区段作为检测的靶标基因，然后根据SVA保守基因序列设计RPA扩增SVA的引物。
采用以下引物筛选原则，剔除根据引物碱基互补配对等引物一般设计要求获得的候选引物中不符合以下要求的引物，从而提高了引物筛选效率：
A.引物长度在30～35bp之间；
B.引物的TM值不作为参考，但是GC含量应在40％～60％之间；
C.引物不存在发卡结构，避免二聚体和错配；
D.引物的5＇端前3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤，3＇端最后4个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤：
E.引物中避免出现特殊结构，例如，回文序列、长串的聚嘌呤或聚嘧啶(不超过6个)等。
筛选出的引物送北京擎科生物科技股份有限公司合成，上、下游引物序列如下。
上游引物：5'-CTACTTCAAACCAGGAGAACACTACTCGAG-3'
下游引物：5'-CCGGCAGCACCGAAGTTCGCGGGGCTATCC-3'
(2)免核酸提取试剂及样品处理
免核酸提取试剂成分：蛋白酶K 9～11mg/L、Tritonx-100 0.8～1.2％、EDTA 4～6mM、PEG8000 1.8～2％、盐酸胍45～50mM，及Tris-HCl 180～200mM；pH7.0～9.0。
本试剂可用于含有DNA或RNA病毒的处理，处理方法包括以下步骤：
步骤一 取样品与上述样品处理试剂按体积比0.8～1:1～1.2混合均匀，得到混合溶液；
步骤二 将所述混合溶液置于50～60℃水浴锅中水浴保温25～30min，得到混合反应液；
步骤三 吸取混合反应液作为核酸检测的模板。
(3)逆转录合成病毒cDNA
用微量移液器吸取(2)中提取的总RNA 2μg和Oligo(dT)18 1μL于PCR管中，补水至8μL，混匀，离心，放入PCR仪器中65℃恒温反应5min；取出反应物后加入10μL 2×RT Mix、2μLHiScript Enzyme Mix，至总体系为20μL后混合均匀，放入PCR仪器中按照25℃5min、50℃45min、85℃2min程序进行反应后，4℃终止反应，随后放入-20℃冰箱中保存备用。
实施例2：质粒的构建
(1)目的片段的扩增
以SVA的cDNA做为模板，按照按20μLPCR体系(2×Taq PCR Mix 10μL、10μM上、下游引物各1μL、病毒cDNA 2μL以及ddH2O 6μL)进行目的片段扩增，反应程序为：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃40s，35个循环；72℃5min；4℃10min。反应结束后，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用胶回收试剂盒进行琼脂糖凝胶回收，PCR扩增结果如图1所示。
(2)连接转化
将上述胶回收产物连接至pMD19-T载体(TaKaRa公司)，将连接产物加入到DH5α感受态细胞中(冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2min)。将菌液转移至无抗性的LB培养基中，在37℃、220rpm的条件下振荡培养45min。取50μL菌液，均匀涂布于含有氨苄的LB培养平板上，37℃恒温过夜培养。
(3)阳性克隆的筛选及鉴定
挑取LB培养平板上的单克隆菌落，加入到5mL具有氨苄抗性的LB培养基中，在37℃、220rpm条件下振荡培养12h。使用对应的引物，做菌液PCR验证(扩增对应的目的片段)、测序，用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒备用。
实施例3：RPA扩增(乐尚生物DNA LS01)
(1)RPA反应体系配置
50μL反应体系：以SVA cDNA作为模板2μL、RPA缓冲液25μL、10μM上游引物2μL、10μM下游引物2μL、ddH2O 16μL以及3μL启动剂。
(2)RPA恒温扩增反应
将配好的50μL体系加入转移到反应单元中，手弹冻干粉(包含重组酶蛋白Uvs x和Uvs y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶)充分溶解，在反应管盖上加上3μL启动剂，小心盖紧管盖，通过短暂离心使启动剂进入预混液中，手弹混匀短暂离心，40℃扩增20～30min，冰上终止反应，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。
实施例4：基于CRISPR/Cas12a系统的荧光检测方法的建立
(1)基于CRISPR/Cas12a系统的荧光检测反应的体系
20μL反应体系：RPA扩增后产物作为模板2μL、ssDNA(博徕斯M20802-P001)2μL、1×RPA缓冲液2μL、Cas12a蛋白(博徕斯M20301-0500)2μL、crRNA(博徕斯M20801-F003)2μL以及ddH2O 10μL。
(2)基于CRISPR/Cas12a系统的荧光检测反应
将配好的20μL体系加入分装进8联管，检测靶标加在8联管的管壁上，通过离心进入反应液，整个过程需要尽可能在冰盒上配制，在荧光定量PCR仪中37℃恒温反应60min。
(3)基于CRISPR/Cas12a系统的荧光检测反应的可行性分析
CRISPR/Cas12a的检测体系由1×RPA缓冲液、ssDNA、Cas12a蛋白、crRNA以及待检测靶标核酸组成。其中Cas12a蛋白的切割活性、crRNA是否具有向导作用以及扩增产物是否可用等问题都有待验证，根据上述(1)(2)反应操作，分别配置体系中包含Cas12a蛋白、SVA核酸、crRNA、ssDNA孔和仅有ssDNA组孔，以及分别缺失Cas12a组、crRNA组、SVA核酸组的反应体系，结果如图3所示。
(4)依据荧光定量结果优化Cas12a和crRNA
根据荧光定量PCR仪中每隔1min收集一次荧光信号，结束后保存数据用于后续数据分析，同时对反应完成后的样本放置紫外凝胶成像仪下观察荧光并拍照记录，最终确定反应体系中的最佳Cas12a蛋白和crRNA的浓度，结果如图4所示。Cas12a在250nmol/L显示出较强的荧光信号，而crRNA在400nmol/L时荧光信号强度较强，因此选择250nmol/L的Cas12a蛋白和400nmol/L的crRNA浓度用于后续实验。
实施例5：检测灵敏性
利用(实施例2)中的阳性质粒计算拷贝数后进行10倍倍比稀释，最终得到105～100拷贝数的阳性质粒，分别以其为模板，按照(实施例3)中的体系进行RPA扩增，取等温扩增反应完成后的产物2μL作为模板，同时设立ddH2O为阴性对照，按照(实施例4)中Cas12a和crRNA的最佳反应浓度进行检测反应，在荧光定量PCR仪中选择FAM通道，37℃恒温反应60min，每隔1min收集一次荧光信号，结束后保存数据用于后续数据分析。同时与普通PCR方法作比较，比较二者的灵敏性，结果如图5所示，表明建立的荧光检测方法的灵敏度可达1copy/μL；而如图6所示常规PCR方法的灵敏度为102copies/μL，表明建立的荧光检测方法具有更好的灵敏度。
实施例6：检测特异性
用建立的基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法，分别对SVA、口蹄疫病毒(FMDV)、猪痘病毒(SWPV)基因组进行检测，SVA的DNA模板是反转录得到的病毒cDNA，按2000ng反转录，加入2μL；其余病毒的模板是人工构建的基因片段，模板含量30～50ng，加入2μL。
按照(实施例3)中的体系进行RPA扩增，取等温扩增反应完成后的产物2μL作为模板，同时设立ddH2O为阴性对照，按照(实施例4)中Cas12a和crRNA的最佳反应浓度进行反应，在荧光定量PCR仪中选择FAM通道，37℃恒温反应60min，每隔1min收集一次荧光信号，结束后保存数据用于后续数据分析，结果如图7所示，在荧光定量PCR仪中只能检测到SVA组的荧光信号值，且只能在SVA组观察到强烈的绿色荧光，表明建立的基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法具有良好的特异性。
实施例7：检测重复性
用基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法，将(实施例2)中的阳性质粒分别稀释为105copies/μL、103copies/μL、101copies/μL的质粒浓度进行3次批内重复性试验和3次批间重复性试验，按照(实施例3)中的体系进行RPA扩增，取等温扩增反应完成后的产物2μL作为模板，同时设立ddH2O为阴性对照，按照(实施例4)中Cas12a和crRNA的最佳反应浓度进行反应，在荧光定量PCR仪中选择FAM通道，37℃恒温反应60min，每隔1min收集一次荧光信号，结束后保存数据用于后续数据分析，结果如表1所示，根批内重复性结果显示批内变异系数在4.1％～8.5％之间，批间重复性结果显示批间变异系数在4.1％～6.5％之间，变异系数值均小于10％，其中阴性对照均无荧光信号，表明建立的基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法具有良好的重复性。
表1 SVA的CRISPR/Cas12a荧光法的重复性检测结果
实施例8：检测试剂盒的制备
为了方便上述基于CRISPR/Cas12a的荧光检测方法的应用，本发明人根据实施例1～实施例7的方法和结果，提出了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒，该试剂盒包括免核酸提取试剂、SVA扩增引物组、RPA扩增试剂盒以及检测试剂盒反应液。
(1)所述免核酸提取试剂的成分：蛋白酶K 9～11mg/L、Tritonx-100 0.8～1.2％、EDTA 4～6mM、PEG8000 1.8～2％、盐酸胍45～50mM，及Tris-HCl 180～200mM；pH7.0～9.0。
所述免核酸提取方法包括以下步骤：
步骤一：取样品与免核酸提取试剂按体积比0.8～1:1～1.2混合均匀，得到混合溶液；
步骤二：将所述混合溶液置于50～60℃水浴锅中水浴保温25～30min，得到混合反应液；
步骤三：吸取混合反应液作为核酸检测的模板，置于-20℃保存待用。
(2)所述SVA扩增引物组包括SVA扩增引物组P1，所述引物组P1的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CTACTTCAAACCAGGAACACTACTCGAG-3'；
下游引物：5'-CCGGCAGCACCGAAGTTCGCGGGGCTATCC-3'。
(3)所述RPA扩增试剂盒购自乐尚生物DNA LS01，包含RPA反应单元冻干粉、RPA缓冲液和启动剂。其中RPA反应单元冻干粉包含重组酶蛋白Uvs x和Uvs y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶。
(4)所述检测试剂盒反应液包括crRNA核苷酸序列P2、ssDNA核苷酸序列P3、Cas12a蛋白。其中：
所述crRNA核苷酸序列P2为(即针对RPA扩增靶标区的单链gRNA)：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCAGAAUGUUGAGCCAACAUA；其中crRNA核苷酸序列P2的工作浓度为400～500nM。
所述ssDNA的核苷酸序列P3为：5’-FAM-TTTTT-BHQI-3’。
所述Cas12a蛋白工作浓度为250～300nM。
(5)所述试剂盒的具体检测步骤如下所示(示意图如图8)：
①将待测猪的生物样品(如血清、组织液、鼻拭子等)与免核酸提取试剂混合处理，具体如下：
步骤一：取样品与免核酸提取试剂按体积比0.8～1:1～1.2混合均匀，得到混合溶液；
步骤二：将所述混合溶液置于50～60℃水浴锅中水浴保温25～30min，得到混合反应液；
步骤三：吸取混合反应液作为核酸检测的模板，置于-20℃保存待用。
②采用上述SVA扩增引物组P1对上述处理后的样品进行RPA扩增试剂盒扩增，得到扩增产物。RPA扩增试剂盒扩增反应的总反应体系为50μL：
反应体系为：SVA cDNA(①中处理后的样品)2μL、SVA扩增引物组P1上游引物2μL、SVA扩增引物组P1下游引物2μL、RPA缓冲液25μL、3μL启动剂以及ddH2O 16μL，混匀后转至RPA反应单元冻干粉中进行。
反应程序为：40℃扩增20～30min。
③将扩增后产物投入检测试剂盒反应液中进行Cas12a的切割反应：
反应体系为：RPA扩增后产物≤3μL和1×RPA缓冲液2～2.5μL、5μM ssDNA 1.5～2μL、250～300nM Cas12a蛋白2.0～2.1μL、400～500nM crRNA 2.0～2.1μL，补水至20μL混匀37℃反应30～60min。
④将反应后产物进行紫外荧光灯下观察结果，若PCR管中发出肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品含有感染获得的A型塞内卡病毒；若没有肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品不含有A型塞内卡病毒。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免核酸提取试剂、SVA扩增引物组、RPA扩增试剂盒以及检测试剂盒反应液；其中
(1)所述免核酸提取试剂的成分：蛋白酶K 9～11mg/L、Tritonx-1000.8～1.2％、EDTA4～6mM、PEG8000 1.8～2％、盐酸胍45～50mM，及Tris-HCl180～200mM；pH7.0～9.0；
(2)所述SVA扩增引物组包括SVA扩增引物组P1，所述引物组P1的核苷酸序列为：
上游引物：5'-CTACTTCAAACCAGGAACACTACTCGAG-3'；
下游引物：5'-CCGGCAGCACCGAAGTTCGCGGGGCTATCC-3'；
(3)所述检测试剂盒反应液包括crRNA核苷酸序列P2、ssDNA核苷酸序列P3、Cas12a蛋白。其中：
所述crRNA核苷酸序列P2为：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUCAGAAUGUUGAGCCAACAUA；
所述ssDNA的核苷酸序列P3为：5’-FAM-TTTTT-BHQI-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的crRNA核苷酸序列P2的工作浓度为400～500nM。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Cas12a蛋白工作浓度为250～300nM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的RPA扩增试剂盒包括RPA反应单元冻干粉、RPA缓冲液和启动剂，其中RPA反应单元冻干粉包含重组酶蛋白Uvs x和Uvs y、单链结合蛋白gp32和Bsu DNA聚合酶三种酶。
5.一种权利要求1所述试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将待测猪的生物样品与免核酸提取试剂混合处理：
(2)采用SVA扩增引物组P1对(1)处理后的样品进行RPA扩增试剂盒扩增，得到扩增产物；
(3)将扩增后产物投入检测试剂盒反应液中进行Cas12a的切割反应；
(4)将反应后产物进行紫外荧光灯下观察结果，若PCR管中发出肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品含有感染获得的A型塞内卡病毒；若没有肉眼可见的绿色荧光，则所述生物样品不含有A型塞内卡病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)将待测猪的生物样品与免核酸提取试剂混合处理的具体方法为：
步骤一：取样品与免核酸提取试剂按体积比0.8～1:1～1.2混合均匀，得到混合溶液；
步骤二：将所述混合溶液置于50～60℃水浴锅中水浴保温25～30min，得到混合反应液；
步骤三：吸取混合反应液作为核酸检测的模板，置于-20℃保存待用。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中RPA扩增试剂盒扩增反应的总反应体系为50μL；其中
反应体系为：SVA cDNA模板2μL、SVA扩增引物组P1上游引物2μL、SVA扩增引物组P1下游引物2μL、RPA缓冲液25μL、3μL启动剂以及ddH2O 16μL，混匀后转至RPA反应单元冻干粉中进行；
反应程序为：40℃扩增20～30min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中检测试剂盒反应液中进行Cas12a的切割反应的体系为：
250～300nM Cas12a 2.0～2.1μL、400～500nM crRNA 2.0～2.1μL、5μM ssDNA 1.5～2μL、1×RPA缓冲液2～2.5μL以及≤3μL的RPA扩增后产物，补水至20μL；
其反应程序为：30～45℃扩增20～40min，冰上终止反应。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的猪的生物样品包括血清、组织液、鼻拭子。
CN202410440586.7A 2024-04-12 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a检测A型塞内卡病毒核酸可视化检测试剂盒 Pending CN118109650A (zh)

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