CN116574844B - 一组检测牛病毒性腹泻病毒的rpa引物对、试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法，涉及分子检测技术领域。本发明所述RPA引物对，包括BVDV‑F和BVDV‑R，其特异性强、敏感性好。本发明还基于所述RPA引物对构建了可视化试剂盒，该试剂盒具有仪器设备要求低、操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为BVD的现场可视化检测提供新方法，适合于口岸或样品中病原病毒的现场检测。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法。
背景技术
牛病毒性腹泻病毒(Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV)是一种正义的核糖核酸(RNA)病毒，属于黄病毒科瘟病毒属，可以引起牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine ViralDiarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD)。BVD是一种急性、热性、接触性传染病，临床上以发热、腹泻、黏膜糜烂、溃疡、白细胞减少、持续感染与免疫耐受、免疫抑制、怀孕母牛流产、产死胎和畸型胎、致死性粘膜病为主要特征。目前，BVDV严重威胁我国甚至全球的畜牧业发展，造成极大的经济损失，因此BVDV的检测及预防有着十分重要的意义。
目前，检测BVDV的方法包括血清学中和试验、细胞分离培养、酶联免疫吸附试验、PCR技术等。血清学方法存在费时、费力、准确率低等缺点。我国诊断BVDV国家标准技术采用细胞分离法，但其费时费力、病毒分离率低，且非致细胞病变型BVDV并不出现细胞病变。分子生物学的检测方法存在假阳性、环境污染、重复性不高等不足。因此，亟需建立一套快速、准确、简便的诊断方法，为该病的现场诊断提供新一代的检测技术与手段。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)是不同于PCR的核酸检测技术，主要有结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶三种酶参与。RPA温度要求低，反应短时间短、操作简单，不需要特殊设备。在反应体系中嵌入SYBR Green I染料可直接用于检测DNA产物，根据色差对结果进行判读。目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，并没有关于BVDV的检测相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法，特异性强，灵敏度高，可用于现场可视化检测。
本发明提供了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，包括BVDV-F和BVDV-R，所述BVDV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述BVDV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
本发明还提供了一种包含上述RPA引物对的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。
优选的，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、无菌去离子水和SYBR Green I荧光染料。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SEQ IDNo.1所示的重组质粒；所述阴性对照为无菌去离子水。
本发明还提供了上述RPA引物对或上述试剂盒在制备检测牛病毒性腹泻病毒的工具中的应用。
本发明还提供了一种非诊疗目的的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：提取样本基因组RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用上述RPA引物对或上述试剂盒配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据扩增产物判断是否存在牛病毒性腹泻病毒。
优选的，所述反应体系以50μL计，包括：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μLRPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL，2.5μL醋酸镁溶液和4mg RPABasic冻干粉。
优选的，所述RPA扩增反应的温度为37～41℃，所述RPA扩增反应的时间为20～40min。
优选的，当利用荧光染料的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将SYBRGreen I荧光染料与扩增产物混合，用395nm波长的紫外照射，若扩增产物呈现荧光，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物不呈现荧光，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒；
当用肉眼观察，若扩增产物颜色变化为绿色，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物颜色不变，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。
优选的，当采用电泳的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，若出现208bp目的条带，即为阳性反应，表示样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若没有出现208bp目的条带，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。
有益效果：本发明提供了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，包括BVDV-F和BVDV-R，其特异性强、敏感性好。本发明还基于所述RPA引物对构建了可视化试剂盒，该试剂盒具有仪器设备要求低、操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为BVD的现场可视化检测提供新方法，适合于口岸或样品中病原病毒的现场检测。本发明对疑似腹泻样本进行了可视化RPA检测，结果显示利用不同的检测方法进行检测，检测灵敏度略有不同，如日光下，BVDV SYBR Green I可视化最低检测阈为1×103copies/μL；UV下，BVDV SYBR Green I最低检测阈1×101copies/μL；琼脂糖凝胶电泳最低检测阈为1×10-1copies/μL。表明该方法适用于BVDV的检测，同时也证实了所建立的可视化RPA检测方法的可靠性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明构建的重组质粒pcDNA3.1-BVDV的质粒图谱图；
图2为本发明重组质粒pcDNA3.1-BVDV的酶切鉴定凝胶电泳图，其中M.1kb plusDNAMarker；1.Bam HI单酶切；2.Bam HI-Hind III双酶切；
图3为本发明BVDV 5-UTR基因的RPA扩增引物筛选的凝胶电泳图，其中M.50bpDNAMarker；1.5-UTR-1引物；2.5-UTR-2引物；3.5-UTR-3引物；4.阴性对照；
图4为本发明BVDV RPA扩增反应温度优化的凝胶电泳图，其中M.DNA 50bpmarker；1.30℃；2.32℃；3.35℃；4.37℃；5.39℃；6.42℃；7.阴性对照；
图5为本发明BVDV RPA扩增反应时间优化的凝胶电泳图，其中M.DNA 50bpmarker；1.10min；2.15min；3.20min；4.25min；5.30min；6.40min；7.阴性对照；
图6为本发明BVDV RPA检测的特异性实验的凝胶电泳图，其中M.DNA 50bpmarker；1.BVDV；2.BVDV；3.BCoV；4.BRV；5.BNoV；6.BAstV；7.阴性对照；
图7为本发明BVDV RPA检测SYBR Green I可视化浓度筛选图，其中A.日光下，BVDVRPA可视化图；B.UV下，BVDV RPA可视化图；1～3.三个重复；4.阴性对照；
图8为本发明BVDV RPA检测的灵敏性实验图，其中M.DNA 50bp marker；1～11.1×106copies/μL～1×10-4copies/μL；12.阴性对照；
图9为本发明BVDV RPA临床样本检测，其中A.牛鼻拭子样本的RPA检测；B.牛肛拭子样本的RPA检测；C.牛血清样本的RPA检测；1～10.牛临床样本；11.阴性对照；12.阳性对照。
具体实施方式
本发明提供了一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，包括BVDV-F和BVDV-R，所述BVDV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述BVDV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
BVDV-F:5'-GAGTTCGTTGGATGGCTGAAGCCCTGAGTA-3'；
BVDV-R:5'-AGTAGCATTACAGTGGGCCTCTGCAGCACC-3'。
本发明还提供了一种包含上述RPA引物对的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。
本发明所述试剂盒优选还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、无菌去离子水和SYBR Green I荧光染料。本发明所述试剂盒优选还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SEQ ID No.1所示的重组质粒；所述阴性对照为无菌去离子水。
本发明还提供了上述RPA引物对或上述试剂盒在制备检测牛病毒性腹泻病毒的工具中的应用。
本发明还提供了一种非诊疗目的的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：提取样本基因组RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用上述RPA引物对或上述试剂盒配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据扩增产物判断是否存在牛病毒性腹泻病毒。
本发明以样本基因组RNA反转录得到的cDNA为模板，且对于所述基因组RNA的提取方法以及反转录的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法进行即可。本发明利用所述cDNA构建反应体系，所述反应体系以50μL计，优选包括：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL，2.5μL醋酸镁溶液和4mg RPABasic冻干粉。本发明所述RPA扩增反应的温度优选为37～41℃，所述RPA扩增反应的时间优选为20～40min。
本发明所述可视化检测，优选包括三种检测方法：荧光染料的紫外照射法，荧光染料的直接观察法以及电泳观察法。其中，当利用荧光染料的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，优选将SYBR Green I荧光染料与扩增产物混合，用395nm波长的紫外照射，若扩增产物呈现荧光，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物不呈现荧光，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒；当用肉眼观察，若扩增产物颜色变化为绿色，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物颜色不变，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。本发明所述SYBR Green I荧光染料的用量优选为1～2μL/反应体系。
在本发明中，当采用电泳的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，优选将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，若出现208bp目的条带，即为阳性反应，表示样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若没有出现208bp目的条带，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对、试剂盒和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
牛病毒性腹泻病毒RPA扩增引物组的设计与筛选
(1)模板构建
受病原体来源限制，人工合成病原体基因组序列，人工合成BVDV 5-UTR(GenBankID：KF205301.1)基因组序列作为模板进行后续实验。
在GenBank中收集牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的全基因组序列，利用Mega软件对序列进行比对分析，选取种内保守且种间特异的基因作为检测靶基因，确定BVDV的5-UTR基因(GenBankID：KF205301.1)为靶基因。进一步比对靶基因序列，截取其中相对保守的365bp序列，确定为拟扩增的目的基因。用Bam HI和Hind III酶切位点将目的基因SEQ ID No.1构建至pcDNA3.1载体，得到pcDNA3.1-BVDV重组质粒，质粒图谱如图1所示。对构建的重组质粒提取质粒后，进行双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，结果与预期一致。
此外，选取牛鼻气管炎病毒(IBRV，GenBank ID：MK654723.1)、牛冠状病毒(BCoV，GenBank ID：KT318096.1)、牛轮状病毒(BRV，GenBank ID：GenBank ID：M92651.1)、牛诺如病毒(BNoV，GenBank ID：KX189094.1)、牛星状病毒(BAstV，GenBank ID：MH123914.1)相对保守基因片段构建至pcDNA3.1载体的Hind III和XHoI酶切位点之间，用于BVDV RPA的特异性检测。
(2)引物设计
BVDV 5-UTR基因的引物设计，按照以下原则进行设计：
A.引物长度在30～35bp之间；
B.引物的TM值不作为参考，但GC含量应在40％～60％之间；
C.引物不含发卡结构，避免二聚体和错配；
D.引物的5'端前3个核苷酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤，3'端最后3个核昔酸包含胞嘧啶或鸟嘌呤；
E.引物中避免出现特殊结构，例如，回文序列、长串的聚嘌呤或聚嘧啶(不超过5个)等。
引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列相关信息见表1。
表1 BVDV RPA引物信息表
实施例2牛病毒性腹泻病毒RPA可视化检测试剂盒的设计与优化
(1)BVDV RPA检测方法的建立
参照TwistBasic RPA试剂盒(TwistDx公司)说明，以提取的重组质粒pcDNA 3.1-BVDV为模板进行RPA扩增。按照试剂盒推荐配置RPA以下反应体系：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL、2.5μL醋酸镁溶液，混匀后充分溶解于4mg RPABasic冻干粉。RPA反应程序为：39℃，20min。产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳后，在UV凝胶成像系统中观察扩增结果并拍照。部分扩增产物加入lμL的SYBR Greenl荧光染料混匀后用395nm波长的紫外照射，阳性呈现荧光，阴性则不呈现荧光；或肉眼观察颜色，阳性反应为绿色，阴性反应为橘黄色。
(2)BVDV RPA引物筛选
据实施例1步骤(2)设计3对引物(表1)按照上述已建立的PRA方法进行PRA扩增反应，琼脂糖电泳结果如图3所示。结果显示，引物对5-UTR-1F/R扩增的目的条带最亮，扩增效果最好，因此选用5-UTR-1F/R作为后期RPA检测引物。
(3)BVDV RPA检测体系优化
根据已筛选出的最佳引物，对RPA检测体系进行反应温度和反应时间优化，分别设置6个反应温度(30℃、32℃、35℃、37℃、39℃、42℃)和6个反应时间(10min、15min、20min、25min、30min、40min)，以确定最佳的RPA检测体系。结果表明，当反应温度为37℃时，RPA扩增产物的电泳条带最亮(图4)，扩增效果最理想；因此，以37℃作为BVDV RPA扩增反应温度。在RPA扩增反应进行到25min时，RPA扩增产物的电泳条带最亮(图5)，扩增效果最理想。因此，选择25min作为BVDV RPA扩增时间。
(4)BVDV RPA检测方法的特异性
分别对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛鼻气管炎病毒(IBRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)、牛诺如病毒(BNoV)、牛星状病毒(BAstV)重组质粒进行RPA检测，以确定所建立RPA检测的特异性。结果表明，仅在pcDNA 3.1-BVDV重组质粒中出现目的条带(图6)，其他均无条带，说明所建立的PRA检测方法具有特异性。
(5)BVDV RPA检测方法的灵敏性
将已定量的pcDNA 3.1-BVDV重组质粒进行11个梯度的稀释，即1×106copies/μL～1×10-4copies/μL，分别通过荧光染料技术或电泳检测技术进行RPA检测灵敏度试验。SYBR Green I的浓度筛选如图7所示，日光下，BVDV SYBR Green I最低检测限为10×，以50×效果最明显；UV下，BVDV SYBR Green I最低检测限为0.16×，以50×效果最明显。BVDVRPA灵敏性实验如图8所示，日光下，BVDV SYBR Green I可视化最低检测阈为1×103copies/μL；UV下，BVDV SYBR Green I最低检测阈1×101copies/μL；琼脂糖凝胶电泳最低检测阈为1×10-1copies/μL。
实施例3BVDV RPA检测的应用
为考察本发明建立的BVDV RPA可视化检测方法对临床样本的检测效果，于宁夏地区(2022年7月)分别采集10份腹泻牛鼻拭子、肛拭子、血清样本，采用Trizol法提取总RNA，以反转录的cDNA为模板，同时以去离子水为阴性对照，以人工合成的重组质粒pcDNA 3.1-BVDV为阳性对照，利用建立的可视化RPA检测BVDV。同时利用聚合酶链式扩增反应(PCR法)检测样本，以验证RPA检测结果。PCR检测上游引物(SEQ ID No.8):TCTCGACCGGGGACATTATCT；下游引物(SEQ ID No.9)：CATTCTGCAACGCGAAGGTG，扩增产物为354bp；反应条件设置如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃延伸10min。结果如图9所示，BVDV临床样品的RPA检测与PCR检测阈值相等，SYBR Green I可视化明显，检测灵敏度比PCR高。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一组检测牛病毒性腹泻病毒的RPA引物对，其特征在于，包括BVDV-F和BVDV-R，所述BVDV-F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述BVDV-R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种包含权利要求1所述RPA引物对的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的试剂盒。
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、无菌去离子水和SYBRGreenI荧光染料。
4.根据权利要求2或3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为SEQ ID No.1所示的重组质粒；所述阴性对照为无菌去离子水。
5.权利要求1所述RPA引物对或权利要求2～4任一项所述试剂盒在制备检测牛病毒性腹泻病毒的工具中的应用。
6.一种非诊疗目的的可视化检测牛病毒性腹泻病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样本基因组RNA，反转录为cDNA后作为模板，利用权利要求1所述RPA引物对或权利要求2～4任一项所述试剂盒配制反应体系，进行RPA扩增反应，根据扩增产物判断是否存在牛病毒性腹泻病毒。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述反应体系以50μL计，包括：2μL模板、11.2μL无菌去离子水、29.5μLRPA反应缓冲液、上下游引物各2.4μL，2.5μL醋酸镁溶液和4mgRPABasic冻干粉。
8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述RPA扩增反应的温度为37～41℃，所述RPA扩增反应的时间为20～40min。
9.根据权利要求6所述方法，其特征在于，当利用荧光染料的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将SYBRGreenI荧光染料与扩增产物混合，用395nm波长的紫外照射，若扩增产物呈现荧光，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物不呈现荧光，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒；
当用肉眼观察，若扩增产物颜色变化为绿色，即为阳性反应，表示待测样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若扩增产物颜色不变，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。
10.根据权利要求6或9所述方法，其特征在于，当采用电泳的方法判断是否存在牛病毒性腹泻病毒时，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察，若出现208bp目的条带，即为阳性反应，表示样品中含有牛病毒性腹泻病毒；若没有出现208bp目的条带，则为阴性反应，表示样品中不含牛病毒性腹泻病毒。
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