CN107365862A

CN107365862A - 用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒

Info

Publication number: CN107365862A
Application number: CN201710753085.4A
Authority: CN
Inventors: 陈家旭; 肖宁; 陈韶红; 艾琳; 陈木新; 田利光; 储言红; 卢艳; 蔡玉春; 吴秀萍; 俞英昉; 宋鹏; 陈海宁; 李�浩
Original assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute of Parasitic Diseases of Chinese Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2017-08-29
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2017-11-21

Abstract

本发明提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，序列如SEQ ID No.3所示。还提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的试剂盒，含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示。采用本发明的引物、探针和试剂盒，可以高敏感性、特异性的快速检测靶基因DNA，即使当标本中含有痕量棘球绦虫DNA时亦可检出。

Description

用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种寄生虫的检测方法，具体来说是一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒。

背景技术

细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)是带科、棘球属的绦虫，又称包生绦虫。成虫寄生在犬科动物，其幼虫——棘球蚴可寄生在多种反刍动物和人体内，引起一种严重的人兽共患病，称为棘球蚴病(Echinococcosis)或包虫病(hydatid disease,hydatidosis)。本病呈世界性分布，主要流行于欧洲、非洲北部、亚洲、南美洲和大洋洲，在我国主要见于新疆、宁夏、青海、西藏、甘肃、四川阿坝等放牧地区。棘球蚴病的终末宿主以犬科动物为主，棘球绦虫感染的诊断主要有粪便虫卵检查法、剖检法、氢溴酸槟榔碱泻下法、粪抗原ELISA法、粪便虫体DNA检查法和血清抗体ELISA法等。

除剖检法之外的另外几种方法在临床上应用较多，各有优劣。剖检法的阳性检出率比其他几种方法高出很多，但是实际操作起来比较麻烦，可行性不大。氢溴酸槟榔碱泻下法是仅次于剖检法的检查方法，但有相当一部分犬只对槟榔碱不敏感，另外存在工作难度大、耗时费力、工作人员易感染虫卵的潜在危险和对周围生活环境污染的危险。所以，与氢溴酸槟榔碱泻下法检出率相近的粪抗原ELISA法应用起来就比较方便。粪抗原在感染后的第2～3周可检出，在早期诊断野生犬科动物自然感染棘球绦虫病中也具有很高的应用价值，但由于粪抗原成分复杂，检测中常出现假阳性结果，该实验方法仍需进一步改进和完善。粪便虫卵检查法阳性检出率不高，在实际应用中意义不大。目前，已建立了诊断犬细粒棘球绦虫感染的PCR方法。PCR方法样品用量少，灵敏度一般较传统方法高，在棘球绦虫的检测中为常用的检测手段。但是，传统的核酸扩增技术需要特殊训练的技术人员才能操作得到稳定可靠的结果，标本的处理、试剂制备、核酸扩增及检测需要在个别独立的空间进行，其中的每一个步骤皆需要时间，且操作过程中易造成污染，产生假阳性。上述方法中，常规检测方法具有感染人和周围环境的危险，且检测过程复杂，耗费人力和时间。

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。RealTime PCR的基本目标是精确测量和鉴别非常微量的特异性核酸，从而可通过监测CT值而实现对原始目标基因的含量定量。实时荧光定量PCR法最大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差，实现DNA/RNA的精确定量。该技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题本发明提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒，所述的这种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒要解决现有技术中检测犬粪中细粒棘球绦虫的过程复杂、耗费人力和时间的技术问题。

本发明提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；

本发明还提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示；在所述的探针的3’端设置有荧光淬灭基团，在所述的探针的5’端设置有荧光报告基团。

进一步的，所述的荧光报告基团为ROX，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明还提供了一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示；在所述的探针的5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。。

进一步的，在所述的试剂盒中还包含2×Premix Ex Taq Master Mix、标准阳性模板、去离子水。

进一步的，所述的上游引物、下游引物和探针的浓度为10μmol/L。

本发明根据细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因cox1(GenBank^TM accession number:MF004310和AB813188)存在核苷酸序列差异(见下)来设计了荧光定量PCR引物和探针。

该引物和探针针对细粒棘球绦虫进行荧光定量PCR可得到特异性的曲线，利用该扩增区域两种棘球绦虫存在核苷酸序列差异，通过建立Taqman的实时荧光定量PCR方法对犬粪便中的细粒棘球绦虫进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得的溶解曲线存在差异，可根据溶解曲线是否出现来直接对细粒棘球绦虫感染情况进行诊断。

本发明通过所述引物和探针建立基于Taqman的实时荧光定量PCR方法，根据该引物和探针扩增的细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫线粒体cox1基因所存在的核苷酸差异，可分别特异性地扩增细粒棘球绦虫，产生特异的溶解曲线，直接对细粒棘球绦虫感染进行鉴别。

本发明检测时，先对细粒棘球绦虫虫卵的DNA进行提取，从检测的犬粪便样本中分别提取细粒棘球绦虫的DNA；然后以待测个体的基因组DNA为模板，分别利用特异性引物(EgF/EgR)和探针(EG)，采用Taqman荧光定量PCR技术，检测犬粪中细粒棘球绦虫的感染情况，根据扩增曲线结果判定待测个体的虫种。如果扩增曲线仅有EG探针起跳，则待测个体为细粒棘球绦虫。

本发明和已有技术相比，其技术进步是积极和明显的。本发明利用特异性的引物和探针对细粒棘球绦虫进行荧光定量PCR反应可有效扩增，配合实时荧光定量PCR在电脑并利用仪器自带的分析软件，可特异性地针对细粒棘球绦虫感染情况进行鉴别诊断。采用本发明的引物、探针和试剂盒，再采用荧光定量PCR，可以高敏感性、特异性的快速检测靶基因DNA，即使当标本中含有痕量棘球绦虫DNA时亦可检出。本发明鉴定方法简单，效率和准确性高，成本可控。

附图说明

图1为本发明的细粒棘球绦虫特异引物分别对常见寄生虫(牛带绦虫、猪带绦虫、蛔虫、钩虫、鞭虫、华支睾吸虫、大片吸虫、肝片吸虫)DNA模板进行荧光定量PCR扩增曲线结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a laboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1用于区分犬粪中细粒棘球绦虫的实时荧光定量PCR引物特异引物和探针的获得。

根据细粒棘球绦虫的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因cox1(GenBank^TMaccession number:MF004310)，采用Primer Express 3.0软件设计并合成Taqman荧光定量PCR特异引物和探针，包括：

一组特异性扩增细粒棘球绦虫的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列为：

上游引物EgF：5’-GTTGGTTTTTTTGTTGGTTAGTATGTG-3’，

下游引物EgR：5’-ACTAAAAACACTTGAAACACCAGCC-3’，

探针EG：5’-F-ATTTTATCCGCCGTTGTCCTCGTCG-Q-3’。

其中，F为荧光报告基团ROX，Q为荧光淬灭基团TAMRA。

实时定量PCR反应使用的扩增体系以25μL，优化出的最佳反应体系为：

实时定量PCR反应使用的条件为：

犬粪便基因组DNA的提取使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒(购自Qiagen公司)。

分别利用特异性引物(EgF/EgR)和探针(EG)，根据扩增曲线结果判定待测个体的虫种。具体为：若扩增曲线仅有EG探针起跳，则待测个体为细粒棘球绦虫。

由图1可知，图中起跳的曲线表示检测的个体为细粒球绦虫，其他常见寄生虫(牛带绦虫、猪带绦虫、蛔虫、钩虫、鞭虫、华支睾吸虫、大片吸虫、肝片吸虫)DNA未能扩增。

实施例2犬粪中细粒棘球绦虫虫卵的检测应用

按照实施例1的方法，对30个来自西藏的犬粪便样本进行了荧光定量PCR检测，再使用病原学和基因检测的金标准——基因测序法对该30份样本进行测序检测。结果表明，Taqman荧光定量PCR实验结果与病原学和基因测序的结果100％吻合。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120> 用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒

<141> 2017-08-29

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)

<400> 1

gttggttttt ttgttggtta gtatgtg 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)

<400> 2

actaaaaaca cttgaaacac cagcc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)

<400> 3

attttatccg ccgttgtcct cgtcg 25

Claims

1.一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，其特征在于：其上游引物的序列如SEQID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，其特征在于：所述探针的序列如SEQ IDNo.3所示；在所述的探针的 5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，其特征在于：所述的荧光报告基团为ROX，所述的荧光淬灭基团为TAMRA。

4.一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒中含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物，其上游引物的序列如SEQ ID No.1所示；下游引物的序列如SEQ ID No.2所示；还含有用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的探针，所述探针的序列如SEQ ID No.3所示；在所述的探针的 5’端设置有荧光报告基团，3’端设置有荧光淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的试剂盒，其特征在于：在所述的试剂盒中包含2×Premix Ex Taq Master Mix、标准阳性模板、去离子水。