CN113584186A - 检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒 - Google Patents

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李雄
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Abstract

本发明公开了一种检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒。所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物以及核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的探针，所述探针的5’端和3’端分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。所述引物和探针能够特异性扩增及识别棘球绦虫COX3基因片段，且检出的最低浓度是101拷贝数量级。该试剂盒快速、高效、灵敏，能够适用于任何含有棘球绦虫、虫卵或幼虫的样本。

Description

检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒。
背景技术
棘球蚴病，又称包虫病，是一种由棘球绦虫中绦期(metacestode)幼虫寄生于人或动物体内引起的一种危害严重的人畜共患寄生虫病，在世界范围内严重危害人体健康和畜牧业发展。棘球蚴病呈全球性分布，我国主要流行于西藏、四川、青海、宁夏等省(自治区)，其中属四川省甘孜藏族自治州最为严重。
棘球绦虫的终末宿主要是犬、猫、狐、狼等食肉类动物，牛、羊等有蹄类动物是常见的中间宿主，而人类也会通过误食绦虫虫卵被感染，成为中间宿主。棘球蚴中的原头蚴可在终末宿主小肠内发育成成虫，并产生虫卵。虫卵会随宿主粪便排出，影响周边水源等环境，中间宿主感染后，虫卵会在体内发育成棘球蚴，几乎可以感染任何器官(尤其是肝脏)，在器官上无限繁殖，形成囊型或泡型包虫病，导致器官发生功能障碍，严重的可致死亡。
目前棘球蚴病的检测手段主要包括影像学诊断和免疫学检测。影像学在人群筛查方面是主要的临床诊断方法，有着准确、直观等优势，便携式超声设备的成熟也使得影像学在对动物现场诊断方面实现了突破。免疫学以ELISA最为常见，在流行病学调查方面，可通过对血清抗体和粪样中的抗原进行检测，了解流行情况和推测未来趋势。
因此，建立一种对犬、猫、狐、狼等食肉类动物，牛、羊等有蹄类动物样本的快速、高效、灵敏的检测方法进行质量检测，有助于避免受感染的肉类在市面流通而导致人类误食致病，有效切断棘球绦虫的传染链条。
发明内容
本发明目的在于提供一种检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
本发明的第一目的在于提供一种扩增棘球绦虫基因片段的引物，所述引物包括：
上游引物5’-TCACTATGAGTCGGCTT–3’(SEQ ID No.1)；
下游引物5’-ACGGAATCTCCAACGAA-3’(SEQ ID No.2)。
本发明的第二目的在于提供一种检测棘球绦虫基因片段的探针：5’-TTGCTGGTCTTATGTTAGTTTGTCT-3’(SEQ ID No.3)，所述探针的5’端和3’端分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
上述引物和探针是基于棘球绦虫的COX3基因序列而设计，具有高度同源性，对于检测样本中的细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫、福氏棘球绦虫或石渠棘球绦虫均能特异性扩增及检出。
进一步，所述荧光报告基团选自FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red或CY5中的一种。
进一步，所述荧光淬灭基团选自Dabcyl、BHQ-1、QYS-7或BHQ-2中的一种。
本发明的第三目的在于提供一种检测棘球绦虫的试剂盒，包括前述的引物和探针。
进一步，所述试剂盒包括实时荧光PCR反应试剂(2×)12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，探针(10μmol/L)0.5μL，阳性对照模板5μL，灭菌超纯水补至25μL。
扩增程序：95℃，5min；(95℃，15s，55℃，30s)×40个循环；55℃，30s处收集荧光。
本发明包括以下有益效果：
所提供的试剂盒所包含的引物和探针能够特异性扩增及识别棘球绦虫COX3基因片段，且检出的最低浓度是101拷贝数量级。该试剂盒快速、高效、灵敏，能够适用于任何含有棘球绦虫、虫卵或幼虫的样本。
附图说明
图1是实施例2中优化退火温度的结果对比图；
图2是实施例2中优化引物、探针用量的结果对比图；
图3是实施例3中特异性试验结果图；
图4是实施例4中灵敏度试验结果图；
图5是实施例5中病变组织样本检测结果图；
图6是实施例5中犬粪样本荧光PCR检测结果图。
各图中标号P为阳性对照模板的检测结果，标号N为阴性对照的检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1，引物和探针的设计
根据NCBI基因库获得的细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫、少节棘球绦虫、福氏棘球绦虫和石渠棘球绦虫COX3基因序列，选择高度同源区域设计一组特异性引物、探针，如表1所示。由赛默飞公司合成核苷酸片段。
表1棘球绦虫特异性引物及探针
Figure BDA0003224946400000021
实施例2，检测体系的建立
以合成的COX3基因标靶序列制作阳性对照模板，通过预实验对反应条件、反应程序等参数进行测试，包括引物探针浓度、扩增程序参数。
结合引物、探针Tm值的大小，在退火阶段使用梯度功能分别进行53℃、55℃、57℃反应，测试不同退火温度。确定退火温度后，对引物探针分别使用三种用量进行比对测试(引物探针浓度均为10μmol/L)，根据扩增曲线形状、Ct值大小和荧光值综合判定，最终确定在55℃退火下，上游引物1μL、下游引物1μL，探针0.5μL的条件为最优，如图1和图2所示。
即，所述检测棘球绦虫的实时荧光PCR反应体系(25μL)为：实时荧光PCR反应试剂(2×)12.5μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μmol/L)1μL，探针(10μmol/L)0.5μL，阳性对照模板5μL，灭菌超纯水补至25μL。
扩增程序：95℃，5min；(95℃，15s；55℃，30s)×40个循环；55℃，30s处收集荧光，报告基团为FAM。
实施例3，特异性试验
以犬弓首蛔虫、多头绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫的基因组DNA为模板，再取实施例2中的阳性对照模板为阳性对照，使用实施例2建立的反应体系和反应程序进行实时荧光PCR检测，验证所建立方法的特异性。
结果如图3所示，对犬弓首蛔虫、多头绦虫、猪带绦虫、牛带绦虫的检测均未出现扩增曲线，特异性效果良好。
实施例4，灵敏度试验
将阳性对照模板以10倍梯度进行稀释，取107～100共10个梯度的阳性对照模板作为灵敏度试验的阳性标准品。使用实施例2建立的反应体系和反应程序进行实时荧光PCR检测，验证所建立方法的灵敏度。
结果如图4所述，共8个样品出现扩增曲线，检出的最低浓度梯度是101拷贝的数量级。曲线从左到右依次为107～100。
实施例5，寄生有棘球绦虫的样本检测
由天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司提供寄生有棘球绦虫的牛、羊解剖的病变组织样本及其囊液共18份，以及84份犬粪样本。以实施例2建立的检测体系进行实时荧光PCR检测，再以天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司提供样本时已使用ELISA方法对犬粪样本进行检测的结果与实施例2所建立的实时荧光PCR检测的结果进行对比，以检验所建立方法对样品的检测情况。
病变组织的检测结果如图5所示，18份样本的检测结果均为阳性，结果与解剖情况完全一致。
犬粪样本的检测结果如图6所示。84份犬粪中共有41份样本阳性，天之泰生物技术研究院(珠海)有限公司的ELISA结果为84份犬粪中共有43份样本阳性。经对比，仅19号和30号样本实时荧光PCR结果为阴性，与ELISA结果不一致。所以符合率为97.6％。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
SEQUENCE LISTING
<110> 拱北海关技术中心
<120> 检测棘球绦虫的引物、探针及其试剂盒
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcactatgag tcggctt 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acggaatctc caacgaa 17
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgctggtct tatgttagtt tgtct 25

Claims (7)

1.一种扩增棘球绦虫基因片段的引物，其特征在于，上游引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示；下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测棘球绦虫基因片段的探针，其特征在于，探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探针的5’端和3’端分别设置有荧光报告基团和荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red或CY5中的一种。
4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光淬灭基团选自Dabcyl、BHQ-1、QYS-7或BHQ-2中的一种。
5.一种检测棘球绦虫的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物以及如权利要求2至4任一项所述的探针。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光PCR反应试剂和阳性对照模板；优选地，所述实时荧光PCR反应试剂为2倍浓度，添加量为12.5μL；优选地，所述阳性对照模板的添加量为5μL。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10μmol/L，用量1μL；所述探针的浓度为10μmol/L，用量0.5μL。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107365862A (zh) * 2017-08-29 2017-11-21 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 用于检测犬粪中细粒棘球绦虫的引物和探针及其试剂盒

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Title
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贾万忠;闫鸿斌;史万贵;王玉朝;郭爱疆;詹芳;付宝权;才学鹏;: "带属绦虫线粒体基因组全序列生物信息学分析", 中国兽医学报, no. 11, pages 1480 - 1485 *
贾万忠;闫鸿斌;郭爱疆;史万贵;詹芳;付宝权;: "带科绦虫线粒体基因组全序列研究进展", 中国人兽共患病学报, no. 06, pages 596 - 600 *

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