KR102496413B1 - 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 d68 동시 검출용 프라이머 세트 - Google Patents

인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 d68 동시 검출용 프라이머 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 급성 호흡기 감염증 원인체 중 유전적으로 유사하나 위험성이 높아 반드시 구분하여 진단해야 하는 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68의 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 병원체를 특이적으로 동시에 구분하여 검출할 수 있고, 공지된 방법에 비하여 민감도가 우수하므로 상기 병원체에 대한 감시체계 구축 마련에 도움이 될 수 있다.

Description

인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트 {Primer sets for simultaneous detection of human rhinovirus and enterovirus D68}
본 발명은 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68을 동시에 구분하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
바이러스에 의한 급성 호흡기 감염증은 노약자, 면역기능저하환자, 신생아 및 미숙아에서 높은 이환율과 사망률을 보인다. 호흡기 바이러스는 전염력이 매우 높아 단기간에 폭발적으로 전파될 수 있기 때문에, 호흡기 바이러스의 감염을 조기에 진단하는 것이 매우 중요한 문제이다.
엔테로바이러스(Enterovirus)는 Picornaviridae, Genus Enterovirus에 속하는 바이러스로써 구조적 특징은 외피가 없고 single-stranded positive sense RNA를 가지고 있으며, VP1, VP2, VP3 및 VP4의 polypeptide로 구성되어 있다. 엔테로바이러스 속은 15개의 species로 구성되어 있으며 이 중 인간에게서 감염을 일으키는 종은 엔테로바이러스 4종(EV A~D)과 인간 리노바이러스 3종(HRV A~C)이다. 리노바이러스(Rhinovirus) 종은 상부 호흡기 질환의 주요 원인인 반면, 엔테로바이러스 종은 일반적으로 위장관에 감염된 후 전신으로 전파될 수 있다고 알려져 있다.
인간 리노바이러스(human rhinovirus, HRV)는 A, B 및 C로 분류되는데 HRV-A와 HRV-B는 1950년 대에 발견되었으며, HRV-C는 2006년 분자생물학적 확인법에 의해 새로이 분류되었다. Viral genomic RNA는 약 7.2 kb이며, 11개의 protein을 인코딩하는 단일 open reading frame (ORF)과 양쪽 말단에 각각 5’ 및 3’ untranslated region(UTR)으로 구성되어 있다. VP1, VP2, VP3 및 VP4의 네 가지 단백질은 RNA genome을 감싸는 캡시드를 구성하며, 나머지 nonstructural protein은 genome 복제 및 조립에 관여한다. VP1, VP2 및 VP3 단백질은 바이러스의 항원 다양성을 결정하며 VP4는 RNA 코어를 캡시드에 고정시키는 역할을 한다. 전파 경로는 사람 대 사람간 접촉이나 에어로졸을 통하며, Rhinovirus는 대부분 일반적인 감기로 취급하는 상부 호흡기 감염을 일으키나 하부 호흡기에서는 폐렴이나 천식의 악화 등 더욱 심각한 질병을 유발할 수 있다. 특히 HRV-A와 HRV-C가 영유아에 더 심각한 질병을 일으킨다고 알려져 있다.
2014년 미국 전역에서 191명의 아동이 원인을 알 수 없는 마비 증세를 일으키는 사건이 발생하였으며, 역학조사를 통해 엔테로바이러스 D68(enterovirus D68, EV D68)이 원인 병원체임이 밝혀졌고 총 1,153건의 발병이 확인되었다. 미국 CDC에서는 2년을 주기로 발병건수가 증가세를 보이는 것으로 확인, 지속적인 모니터링 검사를 수행하고 있다. 엔테로바이러스 D68은 또한 영유아에서 심각한 합병증을 유발할 수 있다고 알려진 인간 리노바이러스와 유전적으로 유사하여 이들을 정확히 구분하여 진단하는 것이 중요하다. 국내에서도 수족구병, 장염 등 엔테로바이러스 속의 바이러스가 원인인 감염증이 단체 시설을 통해서 급속도로 확산되는 사례가 증가함에 따라서 지속적인 모니터링 검사를 통한 확산 방지 조치 및 예방이 필요한 실정이다.
호흡기 바이러스에 대한 진단방법은 전통적인 바이러스 배양법, 면역형광염색법, 신속항원검출법, 핵산증폭법 등이 알려져 있다. 상기 바이러스 배양법은 민감도와 특이도가 높지 않고 검사결과를 얻기까지 오랜 시간(예컨대, 바이러스 배양은 2-14일의 시간이 소요됨)이 걸린다. 또한, 면역형광법은 수시간 이내에 결과를 확인할 수 있고 동시에 다중 바이러스를 동정할 수 있다는 장점이 있으나, 숙련된 검사자가 필요하고 재현성이 다소 떨어진다는 단점이 있다. RSV(respiratory syncytial virus) 또는 인플루엔자 바이러스의 동정을 위해 개발된 신속항원검출법은 빠른 시간(약 15-30분) 안에 검사결과를 알 수 있다는 장점이 있지만, 민감도(약 40-95%) 및 음성예측도(약 70-90%)가 낮아서 추가적인 검사를 필요로 한다는 단점을 가진다.
이에 반해, 핵산증폭검사법은 다양한 호흡기 바이러스를 신속하게 검출할 수 있는 장점 때문에 최근에 병원검사실에서 주로 사용된다. 특히, 바이러스 배양법과 항원 검출법에 비해 민감도와 특이도가 우수하다. 핵산증폭검사법으로는 PCR(polymerase chain reaction) 방법이 가장 많이 이용되고 있다. 최근에는, 증폭반응 후 전기영동이 필요하지 않아 오염가능성이 낮고 수행 상의 부담이 적은 실-시간(real-time) PCR 방법이 선호되고 있지만, 보다 정확하고 효율적으로 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트 및/또는 프로브 및 이를 이용한 신속하고 정확한 호흡기 바이러스 동시 검출 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있는 실정이다.
한국등록특허 제1380414호는 다중 호흡기 바이러스의 동시 검출 방법 및 이의 용도에 관해 개시하고 있고, 미국공개특허 제2010-0279273호는 호홉기 바이러스의 증폭과 검출을 위한 핵산 서열에 관해 개시하고 있으며, 미국공개특허 제2016-0355897호는 엔테로바이러스 D68을 검출화기 위한 조성물 및 방법에 관해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
한국등록특허 제1380414호 미국공개특허 제2010-0279273호 미국공개특허 제2016-0355897호
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 급성 호흡기 감염증 원인체 중 유전적으로 유사하나 위험성이 높아 반드시 구분하여 진단해야 하는 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68의 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 동시 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하고, 서열번호 4, 서열번호 7 또는 서열번호 8을 포함하는 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 동시 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유발 질환 진단용 조성물
상기 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유발 질환은 호흡기 질환에 관한 것이다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 사용하여 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68의 검출용 프라이머 세트와 이를 이용한 검출방법은 기존의 상기 바이러스들을 단일 검출할 수 있는 시스템에 비하여 한 번의 반응으로 두 가지 목표물을 동시에 확인할 수 있으므로 신속하고 효율성이 높다. 또한 동일한 검출 원리를 이용하여 공지된 방법들과의 비교 시험을 통하여 본 발명의 임상적 유용성이 높다는 것을 확인하였다. 본 발명을 통하여 유사 증상을 보이는 종들과의 정확한 감별 진단으로 불필요한 치료 및 조사 활동을 사전에 방지함으로써 효과적인 방역 대책 마련에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 인간 리노바이러스(HRV) 및 엔테로바이러스 D68(EV D68)에 대한 대표적인 실시간 정량 PCR 증폭 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 따른 인간 리노바이러스(HRV) 및 엔테로바이러스 D68(EV D68)에 대한 단독(siglplex mix) 또는 동시검출(multiplex reaction mix) 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 구현 예에 따른 인간 리노바이러스(HRV) 검출 민감도를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현 예에 따른 엔테로바이러스 D68(EV D68) 검출 민감도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 동시 검출용 프라이머 세트에 관한 것이다.
NCBI 데이터베이스로부터 HRV 및 EV D68의 염기서열을 수집하고 Multi-alignment 결과로부터 해당 바이러스 간 공통의 보존서열을 찾아내어 표적 유전자, 즉 HRV의 5‘ UTR과 EV D68의 VP1과 각 primer-probe의 표적 부위를 선정하였으며 GC 비율 및 melting temperature를 고려하여 primer 및 probe를 디자인하였다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
HRV 및 EV D68 검출용 프로브는 이 분야에 알려진 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5‘ 및 3’ 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기에서 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르며 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자가 별개로 검출이 가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4, 서열번호 7 또는 서열번호 8을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 50 내지 250 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 검출용 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유발 질환 진단용 조성물
상기 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유발 질환은 호흡기 질환에 관한 것이고, 코감기, 천식, 알러지성 및 계절성 비염, 인두염, 위막성 후두염(croup), 후두염의 상기도 감염과 이로 인한 부비동염, 중이염 합병증, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 폐기종(emphysema), 폐렴, 폐렴의 하기도 감염에 의한 호흡기 질환 및 염증성 기도 질환을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1 및 2를 포함하는 리노바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 3을 포함하는 리노바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5를 포함하는 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머; 및 서열번호 6을 포함하는 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트를 사용하여 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자를 증폭하는 단계; 및 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> HRV 및 EV D68 검출용 특이적 프라이머 및 프로브 제작
타겟 유전자인 HRV의 5’UTR 및 EV D68의 VP1의 염기서열을 미국국립생물정보센터(NCBI, https://www.hcbi.nlm.nih.gov/)BLAST search를 이용하여 수집한 후, 데이터베이스 내 염기서열과의 상동성(homoly)을 분석하여 가장 특이적인 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다(표 1). 멀티플렉스를 위한 프로브의 리포터는 HRV의 경우 FAM, EV D68은 JOE를 이용하였고 소광자는 MGBNFQ 또는 black hole quencher(BHQ)를 이용하였다. 프라이머 디자인 소프트웨어 (Primer Express, USA)를 이용하여 프라이머 및 프로브의 Tm (melting temperature) 값이 각각 58~60℃ 및 68~70℃ 범위에 해당되도록 설계하였다.
<염기서열>
검출 목표 프라이머 또는 프로브 염기서열 (5’→3’) 서열 번호
Human
rhinovirus
(5’UTR)		 제1 정방향
프라이머		 CTA GCC YGC GTG GY 1
제2 정방향
프라이머		 GCC YGC GTG GTG CCC 2
역방향
프라이머		 GAA ACA CGG ACA CCC AAA GTA GT 3
프로브 CCG GCC CCT GAA TG 4
Enterovirus
D68
(VP1)		 정방향
프라이머		 ATR ACC ATA CCT TTT ATG TGY ATY AA 5
역방향
프라이머		 AAT AGT GTC AGC TGG ATT TAT TCC ATA 6
제1 프로브 TTT TTT ATG ATG GCT TTG CYG GAT TTG AG 7
제2 프로브 TTT TTT ATG ATG GTT TTG CYG GAT TTG AG 8
<형광물질>
검출 목표 형광물질 소광자
Human rhinovirus FAM MGBNFQ
Enterovirus D68 JOE BHQ1
<실시예 2> HRV와 EV D68을 동시 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 농도 조건 최적화
실시예 1에서 제작한 각각의 프라이머 및 프로브가 타겟으로 하는 병원체에 대해 최상의 성능을 나타내면서, 다른 프라이머 또는 프로브와 경쟁하여 PCR 반응에 영향을 주지 않는 프라이머 및 프로브의 농도를 확인하고자 하였다.
각 검출 목표 유전자 부위의 증폭 플롯 (amplification plot)의 △Rn 및 기울기를 유사하게 조절하여 각 타겟 프라이머 및 프로브의 증폭 효율을 유사하게 맞추고, 비특이적인 증폭산물이 생성되지 않으며 증폭 효율을 유지하는 선에서 프라이머의 농도를 최소화할 수 있는 조건을 찾고자 하였으며 최적화된 농도 조건은 표 3과 같다. 표 4에 기재된 반응액 조성 및 표 5에 기재된 반응 조건에 따라, 실시간 PCR 기기 (Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system, Life technologies, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
<프라이머 및 프로브의 최적 농도 조건>
검출 목표 프라이머 또는 프로브 최종 농도
Human rhinovirus HRV 제 1 정방향 프라이머 250 nM
HRV 제 2 정방향 프라이머 250 nM
HRV 역방향 프라이머 250 nM
HRV 프로브 50 nM
Enterovirus D68 EV D68 정방향 프라이머 250 nM
EV D68 역방향 프라이머 250 nM
EV D68 제 1 프로브 150 nM
EV D68 제 2 프로브 150 nM
<시약 조성물>
시약 종류 사용량
(㎕)
Rhinovirus Primer/probe mix (최종농도 : F primer1 250nM, F primer2 250nM, R primer 250nM, 50nM) 1
EVD68 Primer/probe mix (최종농도 : F primer 250nM, R primer 250nM, Probe1 150nM, Probe2 150nM) 1
IC Primer/probe mix
(최종농도 : F primer 50nM, R primer 50nM, Probe 50nM)		 1
IC template 1
4X RT PCR MasterMix 5
ROX reference dye (1.2X) 1
TE buffer 5
Total 15
<반응 조건>
온도(℃) 시간 사이클 수
50 30분 1
95 10분 1
95 15초 40
60 1분
그 결과, 상기 멀티플렉스 최적 농도조건과 각 프라이머 및 프로브가 단독으로 포함되어 있는 싱글플렉스 조건을 비교하였을 때, 유사한 성능을 나타냄을 확인하였다(도 2 참조).
<실시예 3> 검출 효율 확인
실시예 1의 프라이머 및 프로브 세트 및 시약 조성물을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행하였을 때, 각 타겟 병원체의 민감도를 확인하기 위하여, in vitro transcripts를 제작하였다. 이를 단계적으로 희석한 후, 표 4에 기재된 반응액 조성 및 표 5에 기재된 반응 조건에 따라서 실시간(Real-time) PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system, Life technologies, 미국)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 106부터 101 copies까지 직선성이 유지되는 것으로 확인되었고 95% 이상 검출이 가능한 최소 검출 한계는 HRV 25, EV D68 10 RNA copies/uL이므로 민감도가 우수한 것으로 판단되었다(도 3 및 도 4 참조).
임상 증상이 유사한 다른 호흡기 감염체들과의 교차반응을 확인한 결과 모두 타겟 바이러스에서만 검출반응이 일어나 본 개발 시약의 특이성을 입증하였다.
<교차반응 시험 결과>
Figure 112020130609667-pat00001
<실시예 4> 임상시료를 이용한 성능 확인
본 발명의 시약과 기존에 Rhinovirus 및 Enverovirus D68을 검출하기 위해 사용한 Real-time RT-PCR 방법을 임상시료를 이용해 비교 평가하였다. HRV의 경우 개발시약 양성, 기존 검사법에서 음성으로 확인된 시료들을 추가인 염기서열분석(sequencing)방법으로 검증하였고 그 결과 HRV C형까지 검출이 가능하여 검출 범위가 향상이 된 것이 입증되었고, EV D68은 참고문헌의 시험법과 동등한 검출력을 확인하였다. 하지만 개발 시약은 기존의 방법들과는 다르게 HRV와 EV D68을 한번의 시험으로 동시에 검출할 수 있는 시스템이므로 그 효용성이 더 크다고 할 수 있다.
<HRV 검출능 평가 결과>
No. 발명 시약
Rhinovirus / Enterovirus D68
(Ct value)		 기존 상용화 시약
Rhinovirus singlplex
(Ct value)		 염기서열분석 결과
1 31.8 32.8
2 37.2 39.2
3 29.7 - HRV C
4 27.7 32.6
5 31.0 29.3
6 25.1 - HRV C
7 34.8 34.3
8 37.1 37.3
9 22.9 - HRV C
10 35.5 34.9
11 34.6 33.4
12 37.4 36.1
13 33.5 31.4
14 30.4 29.5
15 30.5 29.5
16 26.1 21.6
17 36.2 39.7
18 23.4 - HRV C
19 25.9 24.9
20 24.8 28.8
21 26.3 29.1
<EV D68의 검출능 평가 결과>
No. 발명 시약
Rhinovirus / Enterovirus D68
(Ct value)		 참고문헌
Enterovirus D68 singlplex
(Ct value)
1 33.1 30.8
2 32.2 31.1
3 30.9 29.4
4 29.7 31.6
5 22.2 25.8
6 36.9 38.0
7 23.1 29.0
8 26.7 25.2
9 28.4 29.5
10 30.9 29.6
11 27.5 27.0
12 28.4 30.4
13 28.2 31.2
14 29.4 30.3
<110> KDCA <120> Primer sets for simultaneous detection of human rhinovirus and enterovirus D68 <130> M20-0000 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRV forward primer 1 <400> 1 ctagccygcg tggy 14 <210> 2 <211> 15 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRV forward primer 2 <400> 2 gccygcgtgg tgccc 15 <210> 3 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRV reverse primer <400> 3 gaaacacgga cacccaaagt agt 23 <210> 4 <211> 14 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRV probe <400> 4 ccggcccctg aatg 14 <210> 5 <211> 26 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV D68 forward primer <400> 5 atraccatac cttttatgtg yatyaa 26 <210> 6 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV D68 reverse primer <400> 6 aatagtgtca gctggattta ttccata 27 <210> 7 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV D68 probe 1 <400> 7 ttttttatga tggctttgcy ggatttgag 29 <210> 8 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EV D68 probe 2 <400> 8 ttttttatga tggttttgcy ggatttgag 29

Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 2로 이루어진 리노바이러스 정방향 프라이머;
    서열번호 3로 이루어진 리노바이러스 역방향 프라이머; 및
    서열번호 4로 이루어진 프로브; 및
    서열번호 5로 이루어진 엔테로바이러스 D68 정방향 프라이머;
    서열번호 6로 이루어진 엔테로바이러스 D68 역방향 프라이머; 및
    서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 프로브로 이루어진 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 프라이머 세트
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 조성물
  6. 제5항에 있어서, 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 동시 검출용 조성물
  7. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 감염증 진단용 조성물
  8. 제7항에 있어서, 상기 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 감염증은 호흡기 질환인 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 감염증 진단용 조성물
  9. 제7항에 있어서, 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 감염증 진단용 조성물
  10. 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
    제1항의 프라이머 세트를 사용하여 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및
    실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 리노바이러스 및 엔테로바이러스 D68 유전자 동시 검출방법
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