JP2023516472A - 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 - Google Patents

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２）、インフルエンザａ及びインフルエンザｂを検出するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

生物学的サンプル若しくは非生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの存在若しくは非存在を迅速に検出するための方法が開示される。本方法は、増幅ステップ、ハイブリダイズステップ、及び検出するステップを実施することを含み得る。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを標的とするプライマー及びプローブ並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出するために設計されたキットが提供される。

Description

発明の分野
本開示は、ウイルス診断の分野に関し、より具体的には、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡウイルス（インフルエンザＡ）及びインフルエンザＢウイルス（インフルエンザＢ）の検出に関する。
発明の背景
Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、２６～３２キロベースの範囲の長さの一本鎖ポジティブセンスＲＮＡゲノムを有する。コロナウイルスは、いくつかの鳥類宿主において、並びにラクダ、コウモリ、ハクビシン、マウス、イヌ及びネコを含む様々な哺乳動物において同定されている。新規な哺乳動物コロナウイルスは、現在定期的に同定されている。例えば、コウモリ起源のＨＫＵ２関連コロナウイルスは、２０１８年に豚の致命的な急性下痢症候群の原因であった。
ヒトに対して病原性であるいくつかのコロナウイルスの中で、ほとんどは、以下の２つの顕著な例外を除いて、軽度の臨床症状に関連している：重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、すなわち、２００２年１１月に中国南部の広東省で出現し、その結果、８０００を超えるヒト感染症及び７７４人の死亡を２００２－０３年の間に３７ヵ国でもたらした新規なベータコロナウイルス；２０１２年にアラビアで初めて検出され、２０１２年９月以降に検査室で確認された感染症の症例２４９４件及び死亡者８５８人の原因であり、韓国へ一回持ち込まれた後の死亡者３８人を含む、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）。
２０１９年１２月下旬に、ウイルス性肺炎に罹患した数人の患者が、中国湖北省の武漢の市場に疫学的に関連していることが分かった。ここでは、鳥やウサギなどの多くの非水生動物も大流行前に販売されていた。２０１９新規コロナウイルス（２０１９－ｎＣｏＶ）と最初に命名された新規ヒト感染性コロナウイルスを、次世代シーケンシングを使用して同定した。この新規コロナウイルスは、コロナウイルス科、ベータコロナウイルス属及びサルベコウイルス亜属に分類され、Ｌｕ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０２０，Ｖｏｌ．３９５，ｐ．５６５－５７４による「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ２０１９ ｎｏｖｅｌ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ」に記載されている。国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）は、このウイルスの正式名を重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）と発表した。２０２０年３月１日現在、中国ではほぼ８０，０００件の確認症例及び２８００人を超える死者が報告されており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は米国を含む国際的に少なくとも６０カ所で検出されている。したがって、当該技術分野では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的かつ高感度の方法が必要とされている。
インフルエンザ、すなわち流感は、オルトミクソウイルス科の高度に伝染性のウイルス性呼吸器疾患である。流感の感染症はいつでも起こり得るが、通常、各半球における冬の数ヶ月間の季節的大流行によって特徴付けられる。症状は、患者ごとに重症度が大きく異なるが、典型的には、咳、発熱、鼻水又は鼻詰まり、喉の痛み、身体の痛み、及び疲労のうちの１つ以上を含む。流感は誰にでも感染し得るが、高齢者及び幼児、並びに免疫能力の低下及び特定の既存の症状を有する者にとって特に危険である。
インフルエンザウイルスには、４つの既知のタイプがあり、インフルエンザウイルスＡ～Ｄと示される。ヒトはインフルエンザウイルスＡ、Ｂ及びＣに感染し得るが、ヒトのインフルエンザＤ感染の症例は報告されていない。ヒトに感染する最も一般的なタイプはインフルエンザＡであり、次いでインフルエンザＢである。インフルエンザＡは、ウイルス粒子の外表面に見られる２つのタンパク質、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）のバリエーションに基づいて血清型にさらに分けられる。ヘマグルチニン変異体Ｈ１～Ｈ３及びノイラミニダーゼ変異体Ｎ１及びＮ２は、季節的大流行の間に生じる最も一般的な血清型を形成する。数年の間に、インフルエンザＡの大流行は、世界中で壊滅的な影響を及ぼし、流感パンデミックをもたらした。例えば、１９１８年のスペイン流感のパンデミックでは、１７００万人～５０００万人が死亡したと推定されている。１９５７年のアジア流感のパンデミック及び１９６８年の香港流感のパンデミックによって、それぞれ１００万人以上の人々が死亡した。インフルエンザＡ Ｈ１Ｎ１血清型は、１９１８年のスペイン流感の原因であり、一方で、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２血清型は、それぞれアジア流感及び香港流感のパンデミックの原因因子であった。
インフルエンザＢ及びインフルエンザＣは、ヒトに感染することができるが、はるかに危険ではない。インフルエンザＢは単一の血清型を有するので、このウイルスに対する集団免疫を確立し維持することがより容易である。それにもかかわらず、小児及び青年の重大な感染症、さらには局所的な流行がこのウイルスで起こり得る。インフルエンザＣは、ヒトに感染することができるが、インフルエンザＢよりも危険性はさらに低く、患者は軽度の症状しか示さない。
したがって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２自体を検出するための迅速で信頼性があり、特異的かつ高感度の方法の必要性を超えて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症及びインフルエンザ感染症の迅速で正確な診断及び区別もまた、呼吸器感染症が疑われる個体において重要である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインフルエンザの季節性範囲は重複しており、２つの疾患の臨床症状は類似している可能性があり、大多数の個体における無症候性又は軽度の「インフルエンザ様」の病気（発熱、咳、息切れ、又は筋痛など）からより重症で生命を脅かす疾患まで及ぶ。しかしながら、２つのウイルスタイプは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２患者が前駆症状性である間に感染を拡散し得る一方で、インフルエンザ患者は症状をより迅速に発症し、前駆症状性である間にウイルスを排出しないという点で異なる。結果として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とインフルエンザの両方の迅速かつ正確な検出及び区別は、タイムクリティカルな医学的意思決定を知らせ、感染制御努力を促し、効率的な資源供給を促進し、標的療法及び抗菌剤の使用を最適化し、付随的な試験又は手順を減らすのに役立ち得る。したがって、当該技術分野では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出及び区別するための迅速で、信頼性があり、特異的でかつ高感度の方法が必要とされている。
発明の概要
本開示は、生物学的又は非生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在の迅速な検出、例えば、単一の試験管又は単一のウェル内での定性的又は定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の多重検出のための方法を提供する。本開示はまた、生物学的又は非生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの存在又は非存在の迅速かつ同時の検出、例えば、単一の試験管又は単一のウェル内での定性的又は定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの多重検出のための方法を提供する。実施形態は、逆転写ステップと、増幅ステップ及びハイブリダイズステップを含み得る少なくとも１つのサイクリングステップとを行うことを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの検出方法を含む。さらに、実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するため、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを単一のチューブ又は単一のウェル内で多重検出するために設計されたプライマー、プローブ及びキットを含む。検出方法は、各標的ゲノムの様々な領域を標的とするように設計される。例えば、本方法は、構造エンベロープ（Ｅ）領域及び／又は非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａポリタンパク質及びＯＲＦ１ａ／ｂポリタンパク質をコードするＯＲＦ１ａ／ｂ遺伝子）領域をコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの領域を標的とするように設計されている。本方法はまた、Ｓ遺伝子（細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする）、ＯＲＦ３ａｂ、Ｅ遺伝子（エンベロープタンパク質をコードする）、及びＭ遺伝子（膜タンパク質をコードする）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの他の領域を単独で又は組み合わせて標的とするように設計され得る。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在し、これらも標的となり得る。
インフルエンザＡ及びＢに関して、本方法は、それらのゲノムを構成する８つのセグメント内の任意の遺伝子又は非コード領域を標的とするように設計され得る。例えば、インフルエンザＡの場合、本方法は、インフルエンザＡセグメント７マトリックスタンパク質２（Ｍ２）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）配列を標的とするように設計され得る。インフルエンザＢの場合、本方法は、インフルエンザＢセグメント８核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）及び非構造タンパク質１（ＮＳ１）配列を標的とするように設計され得る。
単一の試験管又は単一のウェルにおけるＲＴ－ＰＣＲによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの同時検出のための方法はまた、ヒトにおいて、特に上気道において呼吸器疾患を引き起こし得るさらなるウイルスを単一の試験管又は単一ウェルにおいてＲＴ－ＰＣＲによって同時に検出することを含み得る。これらのウイルスの例には以下が含まれるがこれらに限定されない：コロナウイルス（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルス（Ｂ、Ｅ、Ｕ、Ｃ）、エンテロウイルス、ライノウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルス（１、２、３、４）。
一実施形態では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための方法であって、プライマーセットとサンプルを接触させて、サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に増幅産物を産生することを含む、増幅ステップを実施するステップと、増幅産物を一種以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズステップを実施するステップと、増幅産物の存在又は非存在を検出するステップであって、増幅産物の存在がサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、前記増幅産物の非存在がサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す、増幅産物の存在又は非存在を検出するステップとを含み、プライマーセットが、配列番号１～２０、２７～３１及び４０～４１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又はそれらからなり、一種以上の検出可能なプローブは、配列番号２１～２６、３２、及び４２～４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又はそれからなる、方法が提供される。
一実施形態では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための多重方法であって、サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に、サンプルを第１のプライマーセットと接触させて増幅産物を産生すること、及びサンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に、サンプルを第２のプライマーセットと接触させて増幅産物を産生することを含む増幅ステップを実施するステップと、増幅産物を第１のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブ及び第２のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの第２の検出可能なプローブと接触させることを含むハイブリダイズステップを実施するステップと、増幅産物（複数可）の存在又は不存在を検出するステップとを含み、増幅産物（複数可）の存在はサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、増幅産物の非存在はサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示し、第１のプライマーセットは、配列番号１～３、及び２７～３１からなる群から選択されるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド配列及び配列番号７～１４からなる群から選択されるリバースプライマーオリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなり、第２のプライマーセットは、配列番号４～６、及び４０からなる群から選択されるフォワードプライマーオリゴヌクレオチド配列及び配列番号１５～２０、及び４１からなる群から選択されるリバースプライマーオリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれらからなり、第１のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブは、配列番号２１～２３、及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又はそれらからなり、第２のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブは、配列番号２４～２６、３２、及び４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか、又はそれらからなる、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、第１のプライマーペアはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸に特異的にハイブリダイズして増幅し、第２のプライマーペアはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸にハイブリダイズして増幅する。いくつかの実施形態では、第２のプライマーペアは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸及び亜属サルベコウイルス由来の他のコロナウイルス標的核酸にハイブリダイズして増幅する。いくつかの実施形態では、第１のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸に特異的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、第２のプライマーペアによって産生される増幅産物にハイブリダイズする少なくとも１つの検出可能なプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸及びサルベコ亜属由来の他のコロナウイルス標的核酸にハイブリダイズする。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１～６、２７～３１、及び４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる第１のプライマーと、配列番号７～２０、及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる第２のプライマーとを含み、増幅産物の検出のための一種以上の検出可能なプローブは、配列番号２１～２６、３２、４２、及び４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の特異的な増幅のためのプライマーセットは、配列番号１～３、及び２７～３１からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第１のプライマーと、配列番号７～１４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第２のプライマーとを含み、増幅産物の検出のための一種以上の検出可能なプローブは、配列番号２１～２３、及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の特異的な増幅のためのプライマーセットは、配列番号４０の第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第１のプライマーと、配列番号４１の第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第２のプライマーとを含み、増幅産物の検出のための一種以上の検出可能なプローブは、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号４～６からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第１のプライマーと、配列番号１５～２０からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はからなる第２のプライマーとを含み、増幅産物の検出のための一種以上の検出可能なプローブは、配列番号２４～２６、及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はからなる。いくつかの実施形態では、プライマーセットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸及び亜属サルベコウイルス由来の他のコロナウイルス標的核酸の増幅に適している。
別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる検出可能なプローブとを含む。別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号２７及び３０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、検出可能なプローブは、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号７、８、又は９のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーと、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる検出可能なプローブとを含む。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号９、１０、又は１１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーと、配列番号２２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる検出可能なプローブとを含む。
別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、検出可能なプローブは、配列番号２５及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。さらに別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、検出可能なプローブは、配列番号２６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１～６及び２７～３１及び４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号７～２０及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーとを含む。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１～３及び２７～３１からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号７～１４からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーとを含む。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号４～６からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号１５～２０からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含むか又はそれからなる第２のプライマーとを含む。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第１のプライマーと、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる第２のプライマーとを含む。別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号２７及び３０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。さらに別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。さらに別の実施形態では、第１のプライマーは、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２のプライマーは、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的の増幅のためのプライマーセットは、複数の第１のプライマー、複数の第２のプライマー及び複数の検出可能なプローブを含み、複数の第１のプライマーは、配列番号１及び２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーとの組み合わせであり、前記複数の第２のプライマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーと、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとの組み合わせであり、前記複数の検出可能なプローブは、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２５及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである。さらに別の実施形態では、複数の第１のプライマーは、配列番号１及び２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーとの組み合わせであり、前記複数の第２のプライマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーと、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーと、配列番号１８のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとの組み合わせであり、複数の検出可能なプローブは、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２５及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２６のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである。さらに別の実施形態では、複数の第１のプライマーは、配列番号２７のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーとの組み合わせであり、複数の第２のプライマーは、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーと、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとの組み合わせであり、複数の検出可能なプローブは、配列番号４２のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである。
別の態様では、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢを同時に検出するための方法であって、サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及び／又はインフルエンザＡ、及び／又はインフルエンザＢが存在する場合に、サンプルを第１のプライマーセット、第２のプライマーセット、及び第３のプライマーセットと接触させて１つ以上の増幅産物を産生することを含む、増幅ステップを実施するステップであって、第１のプライマーセットがサンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に増幅産物を産生し、第２のプライマーセットがサンプル中にインフルエンザＡが存在する場合に増幅産物を産生し、第３のプライマーセットがサンプル中にインフルエンザＢが存在する場合に増幅産物を産生する、増幅ステップを実施するステップと、増幅産物（複数可）を３つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズステップを実施するステップであって、３つ以上の検出可能なプローブが、第１のプライマーセット、第２のプライマーセット及び第３のプライマーセットの各々の増幅産物に特異的な少なくとも１つのプローブを含む、ハイブリダイズステップを実施するステップと、増幅産物の存在又は非存在を検出するステップであって、増幅産物の存在が、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの存在を示し、増幅産物の非存在が、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの非存在を示す、増幅産物の存在又は非存在を検出するステップとを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、第４のプライマーセット及び第４の検出可能なプローブを提供するステップをさらに含む。ここで、第４のプライマーセットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は亜属サルベコウイルス由来の他のコロナウイルス標的核酸がサンプル中に存在し、検出可能な第４のプローブが増幅産物の存在又は非存在を検出する場合に、増幅産物を産生し得、増幅産物の存在は、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又は亜属サルベコウイルス由来の他のコロナウイルス標的核酸の存在を示す。別の実施形態では、第４のプライマーセットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がサンプル中に存在し、検出可能な第４のプローブが増幅産物の存在又は非存在を検出する場合に、増幅産物を産生し得、増幅産物の存在は、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す。
別の実施形態では、該方法（複数可）で使用される第１のプライマーセットは、配列番号１～３及び２７～３１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号７～１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、第２のプライマーセットは、配列番号３３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号３４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、第３のプライマーセットは、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号３７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、第１の検出可能なプローブは、配列番号２１～２３及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第２の検出可能なプローブは、配列番号３５又は４４のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなり、第３の検出可能なプローブは、配列番号３８又は４５のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、該方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びサルベコウイルス亜属由来の他のコロナウイルス標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を産生する第４のプライマーセットを提供することをさらに含む。特定の実施形態では、第４のプライマーセットは、配列番号４～６及び４０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１５～２０及び４１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、第４の検出可能なプローブは、配列番号２４～２６、３２及び４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、第４のプライマーセットは、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、第４の検出可能なプローブは、配列番号２４～２６及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸がサンプル中に存在する場合に第４の増幅産物を産生する第４のプライマーセットであって、第４のプライマーセットは、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、増幅産物を検出するための第４の検出可能プローブは、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列を含む。
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がサンプル中に存在する場合に増幅産物を生成する第１のプライマーセットは、配列番号２７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、増幅産物を検出するための第１の検出可能プローブが、配列番号２１又は４２のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びサルベコウイルス亜属由来の他のコロナウイルス標的核酸がサンプル中に存在する場合に増幅産物を産生する第４のプライマーセットは、配列番号５又は４０のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるフォワードプライマーと、配列番号１５又は４１のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなるリバースプライマーとを含み、増幅産物を検出するための第４の検出可能なプローブは、配列番号３２又は４３のオリゴヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる。
本開示は、配列番号１～４５から選択されるヌクレオチドの配列又はその相補体を含むか又はそれらからなるオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。さらに、本開示は、配列番号１～４５又はその相補体の１つと少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％など）を有する核酸を含むオリゴヌクレオチドであって、１００個以下のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドを提供する。一般に、これらのオリゴヌクレオチドは、これらの実施形態では、プライマー核酸、プローブ核酸などであり得る。ある特定の態様において、オリゴヌクレオチドは、４０個以下のヌクレオチド（例えば、３５個以下のヌクレオチド、３０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、２０個以下のヌクレオチド、１５個以下のヌクレオチドなど）を有する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、非改変ヌクレオチドと比較して核酸ハイブリダイゼーション安定性を変化させるために、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、任意に少なくとも１つの標識及び／又は任意に少なくとも１つのクエンチャー部分を含む。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの保存的に改変された変異を含む。特定の核酸配列の「保存的に改変された変異」若しくは単に「保存的変異」とは、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、若しくは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。当技術分野の当業者であれば、コードされた配列中の単一のヌクレオチド又は低いパーセント比率のヌクレオチド（典型的には５％未満、より典型的には４％、２％又は１％未満）を変更、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加は、改変がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された変異」であることを認識するであろう。
一態様において、増幅は、５’から３’へのヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用することができる。したがって、ドナー蛍光部分及びアクセプター部分、例えばクエンチャーは、プローブの長さに沿って互いに５～２０ヌクレオチド（例えば、８又は１０ヌクレオチド）以内であり得る。他の態様において、プローブは、二次構造の形成を可能にする核酸配列を含む。そのような二次構造の形成は、第１の蛍光部分と第２の蛍光部分との間の空間的近接をもたらし得る。この方法によれば、プローブ上の第２の蛍光部分はクエンチャーであり得る。
一態様では、特異的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢのプローブは、レポーターとして作用する蛍光色素で標識され得る。プローブはまた、クエンチャーとして作用する第２の色素を有し得る。レポーター色素は、規定された波長で測定され、したがって、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの標的の検出及び識別を可能にする。完全なプローブの蛍光シグナルは、クエンチャー色素によって抑制される。ＰＣＲ増幅ステップの間、プローブの特異的な一本鎖ＤＮＡ鋳型へのハイブリダイゼーションにより、ＤＮＡポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性により切断され、レポーター色素及びクエンチャー色素が分離し、蛍光シグナルが産生される。各ＰＣＲサイクルに伴い、切断プローブ量が増加し、レポーター色素の累積シグナルが同時に増加する。任意に、１つ以上のさらなるプローブ（例えば、内部参照対照又は他の標的プローブなど（例えば、他のウイルス核酸）もまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢプローブに関連する蛍光色素標識とは固有かつ個別のレポーター蛍光色素で標識され得る。そのような場合、特定のレポーター色素が規定された波長で測定されるので、増幅されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢ標的及び１つ以上のさらなるプローブの同時検出及び識別が可能である。
また、本開示は、個体由来の生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸の存在若しくは非存在を検出する方法も提供する。本開示はまた、個体由来の生体サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢ、又は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢの核酸（複数可）の存在又は非存在を検出する方法も提供する。これらの方法は、診断試験に使用するために、鼻咽頭（ＮＳＰ）及び中咽頭のスワブサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢの核酸（複数可）の存在又は非存在を検出するために使用することができる。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢの核酸（複数可）を検出するために他のサンプルタイプを評価するために、当業者によって同じ試験が使用され得る。そのような方法は一般に、逆転写ステップと、増幅ステップ及び色素結合ステップを含む少なくとも１つのサイクリングステップとを行うことを含む。典型的には、増幅ステップは、核酸分子がサンプル中に存在する場合に１つ以上の増幅産物を生成する複数対のオリゴヌクレオチドプライマーとサンプルを接触させることを含み、色素結合ステップは、増幅産物を二本鎖ＤＮＡ結合色素と接触させることを含む。そのような方法はまた、増幅産物への二本鎖ＤＮＡ結合色素の結合の存在若しくは非存在を検出することを含み、結合の存在はサンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢ核酸（複数可）が存在することを示し、結合の非存在はサンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／若しくはインフルエンザＢ核酸（複数可）が存在しないことを示す。代表的な二本鎖ＤＮＡ結合色素は、臭化エチジウムである。他の核酸結合色素としては、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＯｌｉＧｒｅｅｎ（登録商標）、及びＹＯ－ＹＯ（登録商標）及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなどのシアニン色素が挙げられる。さらに、そのような方法はまた、増幅産物と二本鎖ＤＮＡ結合色素との間の融解温度を決定することを含むことができ、融解温度は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの核酸（複数可）の存在又は非存在を確認する。
さらなる実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ以上の核酸を検出するためのキットが提供される。キットは、遺伝子標的の増幅に特異的な１つ以上のプライマーセット；及び増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１つ以上の核酸、インフルエンザＡの１つ以上の核酸、及びインフルエンザＢの１つ以上の核酸を同時に検出するためのキットが提供される。キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子標的、インフルエンザＡ遺伝子標的及びインフルエンザＢ遺伝子標的の増幅に特異的な１つ以上のプライマーセット、並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの増幅産物の検出に特異的な１つ以上の検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを含み得る。
一態様において、キットは、ドナー及び対応するアクセプター部分、例えば他の蛍光部分又は暗色クエンチャーで既に標識されているプローブを含むことができ、又はプローブを標識するためのフルオロフォア部分を含み得る。キットはまた、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ及び核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含むことができる。キットはまた、添付文書及びプライマー、プローブ及びフルオロフォア部分を使用してサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの核酸（複数可）の存在若しくは非存在を検出するための説明書を含み得る。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が本主題の実施又は試験で使用され得るが、好適な方法及び材料が以下に記載される。加えて、材料、方法、及び実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に示されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、図面及び発明を実施するための形態、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ここではＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１と表示する）及びＳＡＲ－ＣｏＶのゲノム構成並びに本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブの標的領域の位置を示す。Ｅ：エンベロープタンパク質遺伝子；Ｍ：膜タンパク質遺伝子；Ｎ：ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子；ＯＲＦ１ａ／ｂ：非構造遺伝子のＯＲＦ；Ｓ：スパイクタンパク質遺伝子；アンプリコンの下の番号は、Ｗｕｈａｎ－Ｈｕ－１、ＧｅｎＢａｎｋ ＭＮ９０８９４７によるゲノム位置である。 図２は、ｎＣｏＶ１アッセイのためのプライマー及びプローブを様々な濃度の線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ鋳型に対して試験した実験のＰＣＲ増幅曲線を示す。 図３は、ｎＣｏＶ１アッセイのためのプライマー及びプローブを様々な濃度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＮＡ転写物に対して試験した実験のＰＣＲ増幅曲線を示す。 図４は、Ｐａｎ－Ｓａｒｂｅｃｏ－２アッセイのためのプライマー及びプローブを様々な濃度の線状化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＤＮＡ鋳型に対して試験した実験のＰＣＲ増幅曲線を示す。 図５は、ｎＣｏＶ１アッセイ（上）及び全サルベコウイルス－１アッセイ（下）について実施例５に記載されるマルチプレックスＰＣＲ試験における、合成インビトロ転写物を使用して試験された示されたレベル（１ｅ＋８～１ｅ＋１）にわたる、増殖曲線（左）及びダイナミックレンジをプロットしたＣｔチャート（右）を示す。 図６は、図５に示す実験データからの検出限界（ＬＯＤ）データの要約を示す。 図７は、ｎＣｏＶ１アッセイ（左）及び全サルベコウイルス－１アッセイ（右）を含む、マルチプレックスＰＣＲ試験において、検体希釈液（ＳＤ）で希釈した示されたレベルの患者サンプルからの単離ゲノムＲＮＡを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験から作成した増幅曲線を示す。 図８は、ｎＣｏＶ１アッセイ（左）及び全サルベコウイルス－１アッセイ（右）を含む、マルチプレックスＰＣＲ試験において、鼻咽頭試料溶出液（ＮＳＰ）で希釈した示されたレベルの患者サンプルからの単離ゲノムＲＮＡを使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験から作成した増幅曲線を示す。 図９Ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ここではＷｕｈａｎ－Ｈｕ－１と表示する）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのゲノム構成並びにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＆インフルエンザＡ／ＢアッセイのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブの標的領域の位置を示す。図９Ｂは、インフルエンザＡプライマー及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＆インフルエンザＡ／Ｂアッセイのプローブの標的領域の位置を示す。 図９Ｃは、インフルエンザＢプライマー及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＆インフルエンザＡ／Ｂアッセイのプローブの標的領域の位置を示す。 図１０は、合成インビトロ転写物を使用して試験した示されたレベル（１ｅ＋９～５ｅ＋０）にわたるＦｌｕＡアッセイ（上、フィルタ＝１）及びｎＣｏＶ１アッセイ（下、フィルタ＝２）について実施例１１に記載されるマルチプレックスＰＣＲ試験における増幅曲線を示す。 図１１は、合成インビトロ転写物を使用して試験した示されたレベル（１ｅ＋９～５ｅ＋０）にわたる全サルベコウイルス－１アッセイ（上、フィルタ＝３）及びＦｌｕＢアッセイ（下、フィルタ＝４）について実施例１１に記載されるマルチプレックスＰＣＲ試験における増幅曲線を示す。 図１２は、図１０及び図１１に示す増幅曲線の合成線形性プロット（ダイナミックレンジをプロットしたＣｔチャート）を示す。 図１３は、実施例１２に記載されるように、疑似鼻咽頭マトリックスにおけるマルチプレックスＰＣＲ試験における増幅曲線を示す。
発明の詳細な説明
核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の診断は、ウイルス感染を迅速に、正確に、確実に、特異的に、及び感度よく検出するための方法を提供する。非生物学的又は生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲアッセイを本明細書に記載する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを含有する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度の上昇、並びにサンプルの封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、臨床検査室におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断及び予後診断に使用することができる。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出アッセイはまた、他の核酸、例えばインフルエンザウイルス、ＳＡＲ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のための他のアッセイと並行して多重化され得る。
さらに、核酸増幅によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢ感染症の同時診断は、これらの呼吸器ウイルス感染症を迅速に、正確に、確実に、特異的に、及び感度よく検出及び区別するための方法を提供する。非生物学的又は生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを検出及び区別するためのリアルタイム逆転写酵素ＰＣＲアッセイを本明細書中に記載する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢを検出するためのプライマー及びプローブが提供され、そのようなプライマー及びプローブを含有する製造品又はキットも提供される。他の方法と比較してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢの検出のためのリアルタイムＰＣＲの特異性及び感度の上昇、並びにサンプルの封じ込め及び増幅産物のリアルタイム検出を含むリアルタイムＰＣＲの機能が改善されたことにより、臨床検査室におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢ感染症の日常的な診断のためのこの技術の実施が実現可能になる。さらに、この技術は、インビトロ診断及び予後診断に使用することができる。このＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検出マルチプレックス・アッセイはまた、他のウイルス標的、例えばインフルエンザＣウイルス、インフルエンザＤウイルス、ＳＡＲ－ＣｏＶ又はＭＥＲＳ－ＣｏＶの検出のための他のアッセイと並行してさらに多重化され得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、２９，９０３塩基長のポジティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子であり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７に示される）、以下のような遺伝子の順序（５’から３’）を有する：レプリカーゼＯＲＦ１ａｂ（ウイルス複製及びウイルス構築に必須の１６個の予測非構造タンパク質を有する２１，２９１塩基）、スパイク（Ｓ遺伝子、細胞受容体への結合に関与するスパイクタンパク質をコードする３，８２２塩基）、ＯＲＦ３ａｂ（８２８塩基長）、エンベロープ（Ｅ遺伝子、エンベロープタンパク質をコードする２２８塩基）、膜（Ｍ遺伝子、膜タンパク質をコードする６６９塩基）、ヌクレオカプシド（Ｎ遺伝子、ゲノムＲＮＡと複合体を形成するヌクレオカプシドタンパク質をコードする１２６０塩基）。さらに、５’末端に２６５塩基の非コード領域、３’末端に２２９塩基の非コード領域が存在する。
インフルエンザＡゲノムは、１３，５８８塩基長のセグメント化されたネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子である（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅｓ／ＦＬＵ／ＦＬＵ．ｈｔｍｌ参照）。ゲノムは、株に応じて、１０～１４個の遺伝子をコードする８つのセグメントで構成される。最長から最短まで、セグメント及びそれにコードされる遺伝子は以下の通りである：セグメント１（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２）；セグメント２（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ１及びＰＢ１－Ｆ２タンパク質）；セグメント３（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ及びＰＡ－Ｘタンパク質）；セグメント４（赤血球凝集素）；セグメント５（核タンパク質）；セグメント６（ノイラミニダーゼ）；セグメント７（マトリックスタンパク質Ｍ１及びマトリックスタンパク質Ｍ２）；セグメント８（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＥＰ）。赤血球凝集素及びノイラミニダーゼは、インフルエンザビリオンの外側に見られる大きなタンパク質である。赤血球凝集素（ＨＡ）は、インフルエンザウイルス粒子の標的細胞への結合及びウイルスゲノムの細胞への侵入を担う。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、感染細胞からのビリオンの放出を触媒する。ＨＡには１６種類、ＮＡには９種類のサブタイプが存在するが、通常ヒトに見られるのはＨ１、Ｈ２、Ｈ３とＮ１、Ｎ２だけである。
インフルエンザＢゲノムは、インフルエンザＡゲノムと同様に、１４，５４８塩基長の８セグメントのネガティブセンス一本鎖ＲＮＡ分子である。インフルエンザＢのゲノムは、いくつかの例外を除いて、インフルエンザＡのゲノムと非常に類似している。最長から最短まで、セグメント及びそれにコードされる遺伝子は以下の通りである：セグメント１（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ２）；セグメント２（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＢ１タンパク質）；セグメント３（ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＰＡ）；セグメント４（赤血球凝集素）；セグメント５（核タンパク質）；セグメント６（ノイラミニダーゼ及びマトリックスタンパク質ＮＢ）；セグメント７（マトリックスタンパク質Ｍ１及び膜タンパク質ＢＭ２）；セグメント８（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＥＰ）。インフルエンザＢは、ヒトにおいてインフルエンザＡよりも流行性が低いが、小児及び青年に不釣り合いに影響を及ぼす。
本開示は、例えばＴａｑＭａｎ（登録商標）増幅及び検出技術を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を特異的に同定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム（例えば、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子及び／又はＥ遺伝子）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー及び蛍光標識加水分解プローブを含む。オリゴヌクレオチドは、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子及び／又はＥ遺伝子に特異的にハイブリダイズする。ゲノム内の複数の位置にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを有することは、単一コピー遺伝子座を標的化することと比較して、感度を改善するのに有利である。
開示される方法は、逆転写ステップと、１つ以上のプライマーペアを使用してサンプルからの核酸分子遺伝子標的の１つ以上の部分を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリングステップとを実施することを含み得る。本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー（複数可）」とは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列を特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列の例には、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子、Ｓ遺伝子、ＯＲＦ３ａｂ遺伝子、Ｅ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＮ遺伝子並びに他の予測ＯＲＦ領域内の核酸が含まれる。検討されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーは各々、各増幅産物の少なくとも一部が標的に対応する核酸配列を含むように、標的領域にアニーリングする。１つ以上の核酸がサンプル中に存在すれば、１つ以上の増幅産物が生成され、したがって、１つ以上の増幅産物の存在がサンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在することを示す。増幅産物は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２についての一種以上の検出可能なプローブに相補的な核酸配列を含まなければならない。本明細書で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブ（複数可）」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸と特異的にアニーリングするオリゴヌクレオチドプローブを指す。各サイクリングステップは、増幅ステップ、ハイブリダイゼーションステップ、及び検出ステップを含み、サンプルは、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を検出するために１つ以上の検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブと接触する。
同様に、本明細書で使用される「インフルエンザＡプライマー（複数可）」及び「インフルエンザＢプライマー（複数可）」という用語は、それぞれインフルエンザＡゲノム及びインフルエンザＢゲノムに見られる核酸配列を特異的にアニーリングし、それぞれの増幅産物を産生する適切な条件下でそこからＤＮＡ合成を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを指す。本明細書で使用される「インフルエンザＡプローブ（複数可）」及び「インフルエンザＢプローブ（複数可）」という用語は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに見られる核酸配列に特異的にアニーリングし、それぞれの標的増幅産物の検出を可能にするオリゴヌクレオチドプローブを指す。
本明細書で使用される場合、「増幅する」という用語は、鋳型核酸分子（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムからの核酸分子）の一方若しくは両方の鎖に相補的な核酸分子を合成するプロセスを指す。核酸分子を増幅することは、典型的には、鋳型核酸を変性すること、プライマーの融解温度未満の温度でプライマーを鋳型核酸にアニーリングすること、及び増幅産物を生成するためにプライマーから酵素的に伸長することを含む。増幅には、典型的には、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ）並びにポリメラーゼ酵素の最適な活性のための適切な緩衝液及び／又は補因子（例えば、ＭｇＣｌ2及び／又はＫＣｌ）の存在が必要である。
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、当業者に知られており、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を「プライミング」することができる改変オリゴヌクレオチドも指しており、すなわち、例えばオリゴヌクレオチドの３’末端が遊離３’－ＯＨ基を提供し、そこに、３’から５’へのホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによってさらに「ヌクレオチド」が結合され得て、それによってデオキシヌクレオシド三リン酸が使用され、それによってピロリン酸が放出される。
「ハイブリダイズする」という用語は、増幅産物への１つ以上のプローブのアニーリングを指す。「ハイブリダイゼーション条件」は、典型的には、プローブの融解温度より低いが、プローブの非特異的ハイブリダイゼーションを回避する温度を含む。
「５’から３’へのヌクレアーゼ活性」という用語は、典型的には核酸鎖合成に関連し、それによってヌクレオチドが核酸鎖の５’末端から除去される核酸ポリメラーゼの活性を指す。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素を指し、すなわち、該酵素は、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒し、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔ．ルーバー（Ｔ．ｒｕｂｅｒ）、Ｔ．サーモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｔ．アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔ．ラクテウス（Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ）、Ｔ．ルベンス（Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、及びメタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓ）から単離されている。それにもかかわらず、必要に応じて酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに用いることもできる。
「その相補体」という用語は、所与の核酸と同じ長さであり、正確に相補的である核酸を指す。
核酸に関して使用される場合の「伸長」又は「延長」という用語は、追加のヌクレオチド（又は他の類似の分子）が核酸に組み込まれる場合を指す。例えば、核酸は、ヌクレオチドを取り込む生体触媒によって、例えば、典型的には核酸の３’末端にヌクレオチドを付加するポリメラーゼによって、任意に伸長される。
２以上の核酸配列の文脈における「同一」又は「同一性」パーセントという用語は、例えば、当業者に利用可能な配列比較アルゴリズムの１つを使用して又は目視検査によって測定して最大の一致に関して比較及びアラインメントした場合に、同一又は特定パーセンテージの同一ヌクレオチドを有する２以上の配列又は部分配列を指す。パーセント配列同一性及び配列類似性の決定に適した例示的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラムであり、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、Ｇｉｓｈ ｅｔ ａｌ．（１９９３）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｂｙ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｅａｒｃｈ」Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ｓｅｒｖｅｒ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２、及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）「ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ：Ａ ｎｅｗ ｎｅｔｗｏｒｋ ＢＬＡＳＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６に記載されている。
オリゴヌクレオチドの文脈における「改変ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも１つのヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドに所望の特性を提供する異なるヌクレオチドによって置き換えられる変化を指す。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド中で置換され得る例示的な改変ヌクレオチドとしては、例えば、ｔ－ブチルベンジル、Ｃ５－メチル－ｄＣ、Ｃ５－エチル－ｄＣ、Ｃ５－メチル－ｄＵ、Ｃ５－エチル－ｄＵ、２，６－ジアミノプリン、Ｃ５－プロピニル－ｄＣ、Ｃ５－プロピニル－ｄＵ、Ｃ７－プロピニル－ｄＡ、Ｃ７－プロピニル－ｄＧ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＣ、Ｃ５－プロパルギルアミノ－ｄＵ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＡ、Ｃ７－プロパルギルアミノ－ｄＧ、７－デアザ－２－デオキシ－キサントシン、ピラゾロピリミジン類似体、擬似ｄＵ、ニトロピロール、ニトロインドール、２’－０－メチルリボ－Ｕ、２’－０－メチルリボ－Ｃ、Ｎ４－エチル－ｄＣ、Ｎ６－メチル－ｄＡ等が挙げられる。オリゴヌクレオチド中で置換され得る多くの他の改変ヌクレオチドは、本明細書で言及されるか、又は当技術分野で知られている。特定の実施形態では、改変ヌクレオチド置換は、対応する改変されていないオリゴヌクレオチドの融解温度と比較して、該オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）を改変する。さらに説明すると、特定の改変ヌクレオチド置換は、いくつかの実施形態では、非特異的核酸増幅を減少させ（例えば、プライマーダイマー形成などを最小限に抑える）、意図する標的アンプリコンの収率を増加させることなどができる。これらの種類の核酸改変の例は、例えば、米国特許第６，００１，６１１号に記載されている。他の改変ヌクレオチド置換は、オリゴヌクレオチドの安定性を変化させ得るか、又は他の望ましい特徴を提供し得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増幅及び検出
本開示は、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の一部を増幅することによってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する方法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸配列が利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＮ９０８９４７）。具体的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子標的を増幅及び検出するためのプライマー及びプローブが本開示の実施形態によって提供される。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出のために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を増幅するためのプライマー及びプローブが提供される。本明細書に例示される核酸以外のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸も、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するために使用し得る。例えば、機能的変異体は、日常的な方法を使用して当業者によって特異性及び／又は感度について評価され得る。代表的な機能的変異体は、例えば、本明細書に開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸における１つ以上の欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、配列番号１～３２及び３９～４３から選択される配列を有する核酸、配列番号１～３２及び３９～４３の１つと、少なくとも例えば８０％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体、又は配列番号１～３２及び３９～４３の相補体及び変異体を含む。
Figure 2023516472000002
Figure 2023516472000003
Figure 2023516472000004
一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有すると疑われる生物学的サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出を提供するために、上述のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブのセットが使用される（表１～３）。プライマーセット及びプローブは、配列番号１～３２及び３９～４３の核酸配列を含むか、若しくはそれからなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列に特異的なプライマー及びプローブを含むか、若しくはそれからなり得る。別の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的のためのプライマー及びプローブは、配列番号１～３２及び３９～４３のプライマー及びプローブのいずれかの機能的に活性な変異体を含むか、若しくはそれからなる。
配列番号１～３２及び３９～４３のプライマー及び／又はプローブのいずれかの機能的に活性な変異体は、開示される方法においてプライマー及び／又はプローブを使用することによって同定され得る。配列番号１～３２及び３９～４３のいずれかのプライマー及び／又はプローブの機能的に活性な変異体は、配列番号１～３２及び３９～４３のそれぞれの配列と比較して、記載の方法又はキットにおいて、類似し、又はより高い特異性及び感度を提供するプライマー及び／又はプローブに関する。
変異体は、例えば、配列番号１～３２及び３９～４３のそれぞれの配列の５’末端及び／又は３’末端における１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換等の１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって、配列番号１～３２及び３９～４３の配列から変化し得る。上に詳述したように、プライマー（及び／又はプローブ）は化学的に改変されていてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは改変ヌクレオチド若しくは非ヌクレオチド化合物を含んでいてもよい。したがって、プローブ（又はプライマー）は改変オリゴヌクレオチドである。「改変ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）は、いくつかの改変によって天然の「ヌクレオチド」とは異なるが、依然として、塩基若しくは塩基様化合物、ペントフラノシル糖若しくはペントフラノシル糖様化合物、リン酸部分若しくはリン酸様部分、又はそれらの組み合わせからなる。例えば、「ヌクレオチド」の塩基部分に「標識」を結合させて、「改変ヌクレオチド」を得ることができる。「ヌクレオチド」中の天然塩基は、例えば、７－デアザプリンで置き換えられてもよく、それによっても同様に「改変ヌクレオチド」が得られる。用語「改変ヌクレオチド」又は「ヌクレオチド類似体」は、本出願において互換的に使用される。「改変ヌクレオシド」（又は「ヌクレオシド類縁体」）は、「改変ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類縁体」）について上に概説したように、何らかの改変によって天然のヌクレオシドとは異なる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的をコードする核酸分子を増幅する改変オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類縁体を含むオリゴヌクレオチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の別の部位をコードする核酸は、例えば、ＯＬＩＧＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｃ．Ｃａｓｃａｄｅ，Ｃｏｌｏ．）などのコンピュータプログラムを使用して設計し得る。増幅プライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドを設計する際の重要な特徴としては、検出（例えば、電気泳動によって）を容易にするための適切なサイズの増幅産物、一対のプライマーのメンバーに対する同様の融解温度、及び各プライマーの長さ（すなわち、プライマーは、配列特異性でアニーリングし、合成を開始するのに十分な長さである必要があるが、オリゴヌクレオチド合成中に正確性が低下するほど長くはない）が挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは８～５０ヌクレオチド長（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０ヌクレオチド長）である。
プライマーセットに加えて、本方法は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在若しくは非存在を検出するために１つ以上のプローブを使用し得る。「プローブ」という用語は、合成的若しくは生物学的に生成された核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）を指し、これは、設計若しくは選択により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（標的）核酸が存在する場合に、規定される所定のストリンジェンシーの下で特異的に（すなわち、優先的に）、「標的核酸」にハイブリダイズすることを可能にする、特定のヌクレオチド配列を含む。「プローブ」は、標的核酸を検出することを意味する「検出プローブ」と称され得る。
いくつかの実施形態では、開示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブは、少なくとも１つの蛍光標識で標識され得る。一実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブは、ドナー蛍光部分、例えば、蛍光色素、及び対応するアクセプター部分、例えば、クエンチャーで標識し得る。一実施形態では、プローブは蛍光部分を含むか、若しくはそれからなり、核酸配列は配列番号２１～２６、３２、及び４２～４３を含むか、若しくはそれからなる。
プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドの設計は、プライマーの設計と同様の方法で行うことができる。実施形態は、増幅産物の検出のために単一のプローブ又は一対のプローブを使用することができる。実施形態に応じて、使用するプローブ（単数又は複数）は、少なくとも１つの標識及び／又は少なくとも１つのクエンチャー部分を含み得る。プライマーと同様に、プローブは通常、同様の融解温度を有し、各プローブの長さは、配列特異的ハイブリダイゼーションが起こるのに十分でなければならないが、合成中に忠実度が低下するほど長くはない。オリゴヌクレオチドプローブは、一般に１５～４０（例えば、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチド長である。
コンストラクトは、それぞれがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブ核酸分子のうちの１つを含有するベクターを含み得る。コンストラクトは、例えば、対照鋳型核酸分子として使用することができる。使用に適したベクターは、市販されている、及び／又は当技術分野で日常的な組換え核酸技術法によって製造される。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子は、例えば、化学合成、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの直接クローニング、又は核酸増幅によって得ることができる。
本方法での使用に適したコンストラクトは、典型的には、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子（例えば、配列番号１～３２及び３９～４３の１つ以上の配列を含む核酸分子）に加えて、所望のコンストラクト及び／又は形質転換体を選択するための選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）をコードする配列、及び複製起点を含む。ベクター系の選択は、通常、宿主細胞の選択、複製効率、選択性、誘導性及び回収の容易さを含むがこれらに限定されない、いくつかの要因に依存する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子を含有するコンストラクトを、宿主細胞内で増殖させ得る。本明細書で使用される宿主細胞という用語は、原核生物及び真核生物、例えば酵母、植物及び動物細胞を含むことを意味する。原核生物宿主としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）及びバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が挙げられる。真核生物宿主としては、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、ＣＯＳ細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞、昆虫細胞、並びにアラビドプシス タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）及びニコチアナ タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）などの植物細胞が挙げられる。構築物を、当業者に一般的に知られている技術のいずれかを使用して宿主細胞に導入することができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション及びウイルス媒介核酸移入は、核酸を宿主細胞に導入するための一般的な方法である。さらに、ネイキッドＤＮＡを細胞に直接送達することができる（例えば、米国特許第５，５８０，８５９号及び同第５，５８９，４６６号参照）。
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの増幅及び検出
本開示はまた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列の一部、インフルエンザＡ核酸配列の一部、及びインフルエンザＢ核酸配列の一部を増幅することによって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢを同時に検出する方法を提供する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子標的を増幅及び検出するためのプライマー及びプローブは、前のセクションに記載した。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの核酸配列は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＣ７８１４５０（Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／０１／２０１０（Ｈ１Ｎ１）及びＫＭ６５４６０８（Ｂ／Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ／Ｆｌｕ１０３／２０１３）で入手可能である。具体的には、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの核酸分子標的を増幅及び検出するためのプライマー及びプローブが本開示の実施形態によって提供される。図９Ｂ及び図９Ｃは、インフルエンザＡプライマー及びプローブによって標的化される位置（配列番号３３～３５及び４４はセグメント７のＭ１及びＭ２遺伝子を標的とする）及びインフルエンザＢプライマー及びプローブによって標的化される位置（配列番号３６～３８及び４５はセグメント８のＮＥＰ及びＮＳ１遺伝子を標的とする）を示す。
より具体的には、オリゴヌクレオチドの実施形態はそれぞれ、インフルエンザＡについては配列番号３３～３５及び４４、配列番号３３～３５及び４４の１つに対して少なくとも、例えば８０％、９０％又は９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体、又は配列番号３３～３５及び４４の相補体、及び変異体；又は、インフルエンザＢについては配列番号３６～３８及び４５、配列番号３６～３８及び４５の１つに対して少なくとも、例えば８０％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するその実質的に同一の変異体、又は配列番号３６～３８及び４５の相補体、及び変異体から選択される配列を有する核酸を含む。
Figure 2023516472000005
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号は、従来のＰＣＲ技術を開示している。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。いくつかの実施形態では有用なプライマーは、記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸配列内の核酸合成の開始点として作用し得るオリゴヌクレオチド（例えば、配列番号１～２０、２７～３１、４０～４１）を含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率には一本鎖が好ましいが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性され、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。
鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、二本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長などの反応の特徴に応じて、約９０℃～約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には、約３０秒間～４分間（例えば、１分～２分３０秒、又は１．５分）行われる。
二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、その標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。アニーリングの温度は、通常、約３５℃～約６５℃、（例えば、約４０℃～約６０℃、約４５℃～約５０℃）である。アニーリング時間は、約１０秒～約１分（例えば、約２０秒～約５０秒、約３０秒～約４０秒）であり得る。次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、鋳型核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに充分でなくてはならないが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、一般的に、約４０℃～約８０℃（例えば、約５０℃～約７０℃、約６０℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒～約５分（例えば、約３０秒～約４分、約１分～約３分、約１分３０秒～約２分）であり得る。
レトロウイルス又はＲＮＡウイルス、例えばＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、並びに他のフラビウイルスのゲノムは、リボ核酸、すなわちＲＮＡから構成される。そのような場合、鋳型核酸であるＲＮＡは、酵素逆転写酵素の作用を介して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に最初に転写されなければならない。逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型及びＲＮＡの３’末端に相補的な短いプライマーを使用して、第１鎖ｃＤＮＡの合成を指示し、次いでこれをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として直接使用することができる。
ＰＣＲアッセイは、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を用いることができる。鋳型核酸は精製される必要はなく、ヒト細胞に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸等の複合混合物の微量画分であり得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｅｒｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．）に記載されているものなどの日常的な技術によって生物学的サンプルから抽出され得る。核酸は、任意の数の供給源、例えばプラスミド、又は、細菌、酵母、ウイルス、細胞小器官、又は植物若しくは動物などの高等生物を含む天然供給源から得ることができる。
オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号１～２０、２７～３１、４０～４１）を、プライマー伸長を誘導する反応条件下でＰＣＲ試薬と組み合わせる。例えば、鎖伸長反応には、一般に、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．００１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５～１．０μｇの変性された鋳型ＤＮＡ、５０ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ及び１０％ＤＭＳＯ）が含まれる。反応物は、通常、それぞれ１５０～３２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はそれらの１つ以上の類似体を含有する。
新規に合成された鎖は、反応の後続ステップで使用できる二本鎖分子を形成する。標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸分子に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、鎖分離、アニーリング、及び伸長のステップを必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリングステップ（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、好ましくは少なくとも１回繰り返される。検出での使用では、サイクリングステップの数は、例えば、サンプルの性質による。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクリングステップが必要となる。一般に、サイクリングステップは少なくとも約２０回繰り返されるが、４０、６０、又は１００回繰り返してもよい。
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）
ＦＲＥＴ技術（例えば、米国特許第４，９９６，１４３号、同第５，５６５，３２２号、同第５，８４９，４８９号、同第６，１６２，６０３号を参照）は、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分が互いに一定の距離内に配置されると、２つの蛍光部分間でエネルギー移動が生じ、それを可視化することができ、又は他の方法で検出及び／又は定量することができるという概念に基づいている。典型的に、ドナーは好適な波長の光照射によって励起されると、アクセプターにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプターは移動されたエネルギーを異なる波長の光照射の形態で再発光する。特定の系では、非蛍光エネルギーは、実質的に非蛍光のドナー部分（例えば、米国特許第７，７４１，４６７号を参照）を含む生体分子を介して、ドナー部分とアクセプター部分との間で移動され得る。
一例では、オリゴヌクレオチドプローブは、ドナー蛍光部分（例えば、ＨＥＸ）と、蛍光性であってもなくてもよく、光以外の形態で伝達されたエネルギーを散逸させる対応するクエンチャー（例えば、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（ＢＨＱ）とを含有することができる。プローブがインタクトである場合、エネルギー移動は、典型的には、ドナー蛍光部分からの蛍光発光がアクセプター部分によってクエンチされるように、ドナー部分とアクセプター部分との間で起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長ステップ中、増幅産物に結合したプローブは、ドナー蛍光部分の蛍光発光がもはやクエンチされないように、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって切断される。この目的のための例示的なプローブは、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，９９４，０５６号、及び同第６，１７１，７８５号に記載されている。一般的に使用されるドナー－アクセプター対は、ＦＡＭ－ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーク・クエンチャーは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ－６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ、ミシガン州デクスタ）を包含する。
別の例では、それぞれが蛍光部分を含有する２つのオリゴヌクレオチドプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される特定の位置で増幅産物にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプローブが適切な位置で増幅産物核酸にハイブリダイゼーションすると、ＦＲＥＴシグナルが生成される。ハイブリダイゼーション温度は、約１０秒間～約１分間、約３５℃～約６５℃の範囲であり得る。
蛍光分析は、例えば、光子計数落射蛍光顕微鏡システム（適切なダイクロイックミラー及び特定の範囲の蛍光発光を監視するためのフィルタを備える）、光子計数光電子増倍管システム、又は蛍光光度計を使用して行うことができる。エネルギー移動を開始するため、又は蛍光体の直接検出を可能にするための励起は、アルゴンイオンレーザー、高強度水銀（Ｈｇ）アークランプ、キセノンランプ、光ファイバー光源、又は所望の範囲の励起のために適切にフィルタリングされた他の高強度光源を用いて行うことができる。
ドナー部分及び対応するアクセプター部分に関して本明細書で使用される場合、「対応する」とは、ドナー蛍光部分の発光スペクトルと重複する吸光度スペクトルを有するアクセプター蛍光部分又はダーク・クエンチャーを指す。アクセプター蛍光部分の発光スペクトルの波長最大値は、ドナー蛍光部分の励起スペクトルの波長最大値よりも少なくとも１００ｎｍ大きくなければならない。したがって、それらの間で効率的な非照射エネルギー移動を行うことができる。
蛍光ドナー部分及び対応するアクセプター部分は、一般に、（ａ）高効率Ｆｏｅｒｓｔｅｒエネルギー移動、（ｂ）大きな最終ストークスシフト（＞１００ｎｍ）、（ｃ）可能な限り可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）への発光のシフト；及び（ｄ）ドナー励起波長での励起によって生じるラマン水蛍光発光よりも高い波長への発光のシフトのために選択される。例えば、ドナー蛍光部分は、レーザー線付近のその最大励起波長（例えば、ヘリウム－カドミウム４４２ｎｍ又はアルゴン４８８ｎｍ）、高い吸光係数、高い量子収率、及び、その蛍光発光の対応するアクセプター蛍光部分の励起スペクトルとの良好な重複を有するものを選択することができる。対応するアクセプター蛍光部分は、高い吸光係数、高い量子収率、ドナー蛍光部分の発光とのその励起の良好な重複、及び可視スペクトルの赤色部分（＞６００ｎｍ）の発光を有するものを選択することができる。
ＦＲＥＴ技術において様々なアクセプター蛍光部分と共に使用することができる代表的なドナー蛍光部分としては、フルオレセイン、ルシファーイエロー、Ｂ－フィコエリトリン、９－アクリジンイソチオシアネート、ルシファーイエローＶＳ、４－アセトアミド－４’－イソチオ－シアナトスチルベン－２、２’－ジスルホン酸、７－ジエチルアミノ－３－（４’－イソチオシアナトフェニル）－４－メチルクマリン、スクシンミル１－ピレンブチレート、及び４－アセトアミド－４’－イソチオシアナトスチルベン－２，２’－ジスルホン酸誘導体が挙げられる。代表的なアクセプター蛍光部分としては、使用されるドナー蛍光部分に応じて、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０、ＬＣ Ｒｅｄ ７０５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ローダミンｘイソチオシアネート、エリスロシンイソチオシアネート、フルオレセイン、ジエチレントリアミンペンタアセテート、又はランタニドイオンの他のキレート（例えば、ユウロピウム、又はテルビウム）が挙げられる。ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州ジャンクションシティ）又はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（ミズーリ州セントルイス）から得ることができる。
ドナー蛍光部分及びアクセプター蛍光部分を、リンカーアームを介して適切なプローブオリゴヌクレオチドに結合することができる。リンカーアームはドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の距離に影響を及ぼすので、各リンカーアームの長さは重要である。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離であり得る。一般に、リンカーアームは約１０Å～約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。
ＬＣ Ｒｅｄ ６４０などのアクセプター蛍光部分を、アミノリンカー（例えば、ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスターシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能なＣ６－アミノホスホラミダイト）を含有するオリゴヌクレオチドと組み合わせて、例えば、ＬＣ Ｒｅｄ ６４０標識オリゴヌクレオチドを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン－ＣＰＧ）、アミド－リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のＣＸ－フルオレセイン－ＣＰＧなどの、フルオレセイン－ＮＨＳ－エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン－ＮＨＳ－エステルの結合を必要とする３’－アミノ－ＣＰＧが挙げられる。
増幅産物の検出
本開示は、生体サンプル若しくは非生体サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在若しくは非存在を検出するための方法を提供する。提供される方法は、サンプルの汚染、偽陰性、及び偽陽性の問題を回避する。本方法は、逆転写ステップと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマーの１つ以上のペアを使用してサンプルからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子の一部を増幅することを含む少なくとも１つのサイクリングステップと、ＦＲＥＴ検出ステップとを行うことを含む。複数のサイクリングステップは、好ましくはサーモサイクラーで行われる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を検出するためにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブを使用して方法を実施することができ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出はサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示す。
本明細書に記載されるように、増幅産物は、ＦＲＥＴ技術を利用する標識ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。１つのＦＲＥＴフォーマットは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を利用して、増幅産物の存在若しくは非存在、したがってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在若しくは非存在を検出する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、例えば、１つの蛍光色素（例えばＨＥＸ）及び１つのクエンチャー（例えばＢＨＱ）で標識された１つの１本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用し、これは蛍光性であってもよく、そうなくてもよい。第１の蛍光部分が適切な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーは、ＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分又はダーク・クエンチャーに移動する。第２の蛍光部分は、一般的には、クエンチャー分子である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップ中、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡ（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階中に、例えばＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、蛍光部分とクエンチャー部分とが互いに空間的に分離される。結果として、クエンチャーの非存在下において第１の蛍光部分を励起すると、第１の蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。例として、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術を使用し、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在若しくは非存在を検出するための本明細書に記載の方法を実施するのに適している。
ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用して、リアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部分及び第２の蛍光部分で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は一般的にはクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。標的核酸（すなわち、増幅産物）へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、蛍光部分が互いに分離され、それにより、適切な波長の光による励起後、第１の蛍光部分の発光を検出することができる。
ＦＲＥＴ技術の別の一般的な形式は、２つのハイブリダイゼーションプローブを利用する。各プローブは、異なる蛍光部分で標識することができ、一般に、標的ＤＮＡ分子（例えば、増幅産物）内で互いに近接してハイブリダイズするように設計される。ドナー蛍光部分、例えばフルオレセインは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔの光源によって４７０ｎｍで励起される。ＦＲＥＴの間、フルオレセインは、そのエネルギーをアクセプター蛍光部分、例えばＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ６４０（ＬＣ Ｒｅｄ ６４０）又はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）－Ｒｅｄ ７０５（ＬＣ Ｒｅｄ ７０５）に伝達する。次いで、アクセプター蛍光部分はより長い波長の光を放出し、これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器の光学検出システムによって検出される。効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。放出されたシグナルの強度は、元の標的ＤＮＡ分子の数（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの数）と相関させることができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸の増幅が起こり、増幅産物が産生される場合、ハイブリダイズするステップは、プローブ対のメンバー間のＦＲＥＴに基づく検出可能なシグナルをもたらす。
一般に、ＦＲＥＴの存在はサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、ＦＲＥＴの非存在はサンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す。しかしながら、不十分な検体収集、輸送遅延、不適切な輸送条件、又は特定の収集スワブ（アルギン酸カルシウム又はアルミニウムシャフト）の使用はいずれも、試験結果の成功及び／又は精度に影響を及ぼし得る条件である。
本方法の実施に使用することができる代表的な生物学的サンプルとしては、呼吸器検体（鼻咽頭及び中咽頭スワブ）、尿、糞便検体、血液検体、血漿、皮膚スワブ、創傷スワブ、血液培養物、皮膚及び軟部組織感染が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルの収集及び保存方法は、当業者に知られている。生物学的サンプルを（例えば、当技術分野で知られている核酸抽出方法及び／又はキットによって）処理してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２核酸を放出させ得、若しくはいくつかの場合では、生物学的サンプルをＰＣＲ反応成分及び適切なオリゴヌクレオチドと直接接触させ得る。
融解曲線分析は、サイクルプロファイルに含めることができる追加のステップである。融解曲線分析は、ＤＮＡ二本鎖の半分が一本鎖に分離した温度として定義される融解温度（Ｔｍ）と呼ばれる特徴的な温度でＤＮＡが融解するという事実に基づいている。ＤＮＡの融解温度は、主にそのヌクレオチド組成に依存する。したがって、Ｇ及びＣヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子は、Ａ及びＴヌクレオチドが豊富なＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する。シグナルが失われる温度を検出することにより、プローブの融解温度を決定することができる。同様に、シグナルが発生する温度を検出することにより、プローブのアニール温度を決定することができる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２増幅産物からのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブの融解温度（複数可）により、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の有無を確認し得る。
各サーモサイクラーを運転している間に、対照サンプルも同様にサイクルすることができる。陽性対照サンプルは、例えば、対照プライマー及び対照プローブを使用して、（記載された標的遺伝子の増幅産物以外の）標的核酸対照鋳型を増幅することができる。陽性対照サンプルはまた、例えば、標的核酸分子を含むプラスミド構築物を増幅することができる。そのようなプラスミド対照は、意図された標的の検出に使用されるのと同じプライマー及びプローブを使用して、内部で（例えば、サンプル中で）又は患者のサンプルと並んで実行される別々のサンプル中で増幅することができる。そのような対照は、増幅、ハイブリダイゼーション及び／又はＦＲＥＴ反応の成功又は失敗の指標である。各サーモサイクラー実行はまた、例えば、標的鋳型ＤＮＡを欠く陰性対照を含むことができる。陰性対照は汚染を測定することができる。これにより、システム及び試薬が偽陽性シグナルを生じないことが保証される。したがって、対照反応は、例えば、プライマーが配列特異性によりアニールし、伸長を開始する能力、並びにプローブが配列特異性によりハイブリダイズし、ＦＲＥＴが発生する能力を容易に決定することができる。
一実施形態では、本方法は、汚染を回避するステップを含む。例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼを利用する酵素的方法は、あるサーモサイクラー運転と次のサーモサイクラー運転との間の汚染を低減又は排除するために、米国特許第５，０３５，９９６号、同第５，６８３，８９６号及び同第５，９４５，３１３号に記載される。
ＦＲＥＴ技術と組み合わせた従来のＰＣＲ法を使用して、この方法を実施することができる。一実施形態では、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）機器が使用される。以下の特許出願は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、同第９７／４６７１４号、及び同第９７／４６７１２号。
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）は、ＰＣワークステーションを使用して動作させることができ、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＮＴオペレーティングシステムを利用することができる。サンプルからのシグナルは、機械が光学ユニット上に毛細管を順次配置するときに得られる。ソフトウェアは、各測定の直後にリアルタイムで蛍光シグナルを表示することができる。蛍光取得時間は１０～１００ミリ秒（ｍｓｅｃ）である。各サイクリングステップの後、蛍光対サイクル数の定量的表示を、全てのサンプルについて連続的に更新することができる。生成されたデータは、さらなる分析のために保存することができる。
ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ又はＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。
当業者は、他の核酸又はシグナル増幅方法も使用され得ることを理解するであろう。そのような方法の例としては、限定されないが、分岐ＤＮＡシグナル増幅、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ ＳＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、又はスマート増幅プロセスバージョン２（ＳＭＡＰ ２）が挙げられる。
本開示の実施形態は、１つ以上の市販の機器の構成によって限定されないことが理解される。
製造品／キット
本開示の実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための製造品、組成物若しくはキットをさらに提供する。製造品は、適切な包装材料と共に、標的ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２遺伝子を検出するために使用されるプライマー及びプローブを含み得る。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するための代表的なプライマー及びプローブは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、キットはまた、固体支持体、緩衝液、酵素及びＤＮＡ標準のような、ＤＮＡ固定化、ハイブリダイゼーション及び検出に必要な適切に包装された試薬及び材料を含み得る。プライマー及びプローブを設計する方法が本明細書に開示され、増幅してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸分子にハイブリダイズするプライマー及びプローブの代表的な例が提供される。
製造品はまた、プローブを標識するための１つ以上の蛍光部分を含むことができ、あるいは、キットと共に供給されるプローブを標識することができる。例えば、製造品は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プローブを標識するためのドナー及び／又はアクセプター蛍光部分を含み得る。好適なＦＲＥＴドナー蛍光部分及び対応するアクセプター蛍光部分の例を上に提供する。
製造品はまた、サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブを使用するための説明書を有する添付文書若しくは包装ラベルを含み得る。製造品は、本明細書に開示される方法を実施するための試薬（例えば、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、補因子、又は汚染を防止するための薬剤）をさらに含み得る。そのような試薬は、本明細書に記載の市販の機器の１つに特異的であり得る。
本開示の実施形態は、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
以下の実施例及び図は、主題の理解を助けるために提供されており、その主題の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の要旨から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
実施例１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイの説明
ＣＤＣ臨床基準を満たす患者の鼻咽頭（ＮＳＰ）及び中咽頭のスワブサンプルでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からの核酸の定性的検出を可能にするｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムで、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）試験を開発した。アッセイは、以下を検出する：（ｉ）１つのチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）由来の特定の核酸配列及び（ｉｉ）異なるチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む全てのサルベコウイルスに共通の構造エンベロープ（Ｅ）遺伝子位置中の保存された配列。結果は、感染の急性期中に鼻咽頭及び中咽頭のスワブサンプルで検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡの特異的検出に関するものである。
患者サンプルからの核酸及び添加されたＲＮＡ内部対照分子（既存のＲＮＡ ＱＳ試薬と同じ）を同時に抽出する。ウイルス核酸は、プロテイナーゼ及び溶解試薬をサンプルに添加することによって放出される。放出された核酸は、添加された磁性ガラス粒子のシリカ表面に結合する。未結合物質及び不純物、例えば変性タンパク質、細胞デブリ及び潜在的なＰＣＲ阻害剤は、その後の洗浄試薬ステップで除去され、精製された核酸は、高温の溶出緩衝液で磁性ガラス粒子から溶出される。
実施例２：ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２アッセイの設計戦略
診断試験は、コロナウイルス科、ベータコロナウイルス属及びサルベコウイルス亜属に分類される（Ｌｕ ｅｔ ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ，２０２０，（２０）３０２５１－８）新規コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の検出のために設計された。このコロナウイルスは新規であり、どの領域が変異又は組換えを受けるかは知られていない。このウイルスに関する知識が不足していることを考慮して、ＦＡＭチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＨＥＸチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むサルベコウイルス亜属ファミリーの核酸配列の特異的検出のために、単一分析物二重標的アッセイを設計した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ゲノム類似性を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶと密接に関連している。
配列は、ＮＣＢＩ及びＧｌｏｂａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ ｏｎ Ｓｈａｒｉｎｇ Ａｌｌ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｄａｔａ（ＧＩＳＡＩＤ）データベースからダウンロードした。ＧＩＳＡＩＤデータベースから７つの配列をダウンロードした。
亜属サルベコウイルス（分類ＩＤ ２５０９５１１）からの配列をＮＣＢＩデータベースからダウンロードした。２００塩基長を超える配列が１，０９４個存在した。このときＮＣＢＩはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を「武漢海産物市場肺炎ウイルス」と分類し、分類ＩＤは付与しなかった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の包含グループを作成するために、これらのサルベコウイルス配列を検査して、「武漢海産物市場肺炎ウイルス」と標識されたウイルスを同定した。７つの配列が利用可能であり、６つの重複しない領域における７つの標的領域を同定するために使用された。他のサルベコウイルスと比較し、次いでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に固有のＯＲＦ１ａ非構造領域内の領域を選択することによって、領域の保存された性質を評価した。全サルベコウイルス検出のために、構造タンパク質エンベロープＥ遺伝子内の保存領域、及び保存されたＯＲＦ１ａ／ｂ領域も選択した。全サルベコウイルス検出セットはまた、新規ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出することができた。この二重標的設計戦略は、配列の利用可能性が限られており、この新しいウイルスの安定性が経時的に理解されているため、単一標的に取って代わった。ＲＮＡ内部対照の選択的増幅は、コロナウイルスのゲノムと相同性のない非競合的配列特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーの使用によって達成された。増幅には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いた。
ＮＣＢＩ及びＧＩＳＡＩＤデータベースをモニタリングして、新たに利用可能な配列をダウンロードし、利用可能な場合、分類ＩＤ、国及びサンプル収集日及び配列寄託日を取得した。これらの配列は、中国、米国、英国、オーストラリア、日本、イタリア、ドイツ、フィンランド、フランス、ネパール、台湾、シンガポール及び韓国から収集された。二つのデータベース間で利用可能な配列は１７５個あり、一つを除く全ての利用可能なウイルス配列について配列はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイ標的領域において同一であった。ＭＴ０３９８９０は、プローブハイブリダイゼーション部位の３’末端付近に一塩基多型（ＳＮＰ）を有し、これはアッセイの性能に影響を及ぼさないはずである。
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２プライマー及びプローブオリゴヌクレオチドの選択
コロナウイルス型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サルベコウイルス亜属のメンバー及びＲＮＡ内部対照核酸にそれぞれ特異的な検出プローブを含むマスターミックスを提供した。コロナウイルス及びＲＮＡ内部対照検出プローブをそれぞれ、レポーターとして作用する固有の蛍光色素で標識した。それぞれのプローブは、クエンチャーとして作用する第２の色素も含んでいた。目的の領域を増幅するためのＰＣＲプライマーを、標的領域における報告されたＳＮＰＳを避けるようにして設計した。したがって、以下を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出する単一ウェルアッセイ設計で試験を開始した：（ｉ）１つのチャネル（ＦＡＭ）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムの非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）由来の特定の核酸配列（ｎＣｏＶ１アッセイ）及び（ｉｉ）異なるチャネル（ＨＥＸ）における２つの全サルベコウイルスアッセイ（ｐａｎ－１及び／又はｐａｎ－２）を使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む他の全てのサルベコウイルスに共通のＯＲＦ－１及び構造エンベロープ（Ｅ）遺伝子位置中の保存された配列は、高度のロバスト性を提供する。ＳＡＲ－ＣｏＶゲノム上の位置と比較したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム上のアンプリコン標的の相対位置を図１に示す。プロセス対照の検出に使用されるＧＩＣオリゴヌクレオチドと多重化することができるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイのバイオインフォマティクス分析を行って、性能についての初期アッセイをスクリーニングした。プライマーセットとプローブの選択された組み合わせを表５に示す。
Figure 2023516472000006
実施例４：ＰＣＲアッセイ試薬及び条件
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリアルタイムＰＣＲ検出は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムプラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、カリフォルニア州プレザントン）を使用して行った。増幅試薬の最終濃度を以下に示す：
Figure 2023516472000007
 以下の表は、ＰＣＲ増幅反応に使用される典型的な熱プロファイルを示す：
Figure 2023516472000008
Ｐｒｅ－ＰＣＲプログラムは、初期変性及びＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５°Ｃ、６０°Ｃ及び６５°Ｃでのインキュベーションを含んでいた。３種の温度でのインキュベーションは、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（生物の遺伝的変異体など）も転写されるが、より高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、したがってより効率的な転写をもたらすという有利な効果を併せ持つ。ＰＣＲサイクリングを２つの測定に分け、いずれの測定も１段階の設定を適用する（アニーリングと伸長を組み合わせる）。５５℃での最初の５サイクルは、わずかにミスマッチした標的配列を予備増幅することによって包括性の増加を可能にするが、第２の測定の４５サイクルは、５８℃のアニーリング／伸長温度を使用することによって特異性を高める。
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験の性能評価
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験のための成分、ワークフロー及びアッセイ試薬の評価を、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００試薬を使用して行った。線状化組換えプラスミドをアッセイオリゴヌクレオチドで試験して性能を評価した。合成ＲＮＡを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、ＱｕｂｉｔをＤＮＡ及びＲＮＡ標準と共に使用して行った。プラスミドＤＮＡ及び転写物をＭｕｌｔｉＰｒｅｐ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｕｌｋ Ｇｅｎｅｒｉｃ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔとしても知られる）で段階希釈し、アッセイ性能試験に使用した。線状化ＤＮＡ転写物及びＲＮＡ転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド（汎用内部対照、ＧＩＣ）を含めた。実験は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００汎用熱サイクリングプロファイルを使用してｃｏｂａｓ（登録商標）６８００フィルタを取り付けて較正したＲｏｃｈｅ ＬＣ４８０サイクラーで行った。鼻咽頭（ＮＳＰ）サンプルを、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ培地（３ｍＬ）に収集した。改変されたサンプル調製ワークフロー（プロセス及び溶出液、ＰｎＥ）をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで使用し、３００又は４００μＬのＮＳＰサンプルのいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００に対する同じＮＳＰサンプル調製プロセスに従い内部サンプル処理対照として機能するｇＩＣ外装ＲＮＡ（ＱＳ ＲＮＡ対照）を含有する。次いで、溶出液を、ＬＣ４８０及び／又はｃｏｂａｓ（登録商標）６８００分析サイクラーでの増幅及び検出を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを用いた試験で使用した。
アッセイオリゴヌクレオチドを最初にシングルプレックス・アッセイで評価した。増幅曲線及び平均ＣＴ（ｎ＝３レプリケート）として表される、ＰＣＲ反応あたり１．０ Ｅ＋８コピー（ｃｐ）から１．０Ｅ＋０１ ｃｐまでの標的配列を有する線状化組換えプラスミドを用いたｎＣｏＶ１シングレプレックス・アッセイ（配列番号１、７、２１）の性能を図２に示す。ｎＣｏｖ１アッセイは、ＰＣＲ反応あたり１０コピーまでの標的配列の検出で良好な感度を示した。アッセイをインビトロ転写物でも評価し、データを図３に示す。ここで、このアッセイは、合成ＲＮＡ転写物を用いて、許容され得るダイナミックレンジ及びＰＣＲ効率で、ｇＩＣアッセイあり及びなしで、ＰＣＲ反応あたり１００コピーまでの標的転写物の検出で良好な感度を示した。次に、線状化プラスミドＤＮＡ並びに転写物を使用してＰａｎ－Ｓａｒｂｅｃｏ－２アッセイ（配列番号６、１８、２６）を評価して、アッセイの感度を決定し、結果を図４に示す。
次いで、ｎＣｏＶ１アッセイのプライマー及びプローブオリゴヌクレオチド（配列番号１、７、２１）、Ｐａｎ－１アッセイのプライマー及びプローブオリゴヌクレオチド（配列番号５、１５、２５）を単一反応で試験するマルチプレックスＰＣＲアッセイを行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びサルベコウイルス標的領域（すなわち、それぞれＯＲＦ１ａ／ｂ及びエンベロープ遺伝子）を含む組換えプラスミドを使用して、インビトロ転写物を生成した（２５０塩基及び２６１塩基）。ＲＮＡを、アッセイと共に提供されるＲＮＡ標準を用いてＱｕｂｉｔ蛍光光度計で定量した。広いダイナミックレンジをカバーするために、転写物ストックの段階希釈液を、キャリアＲＮＡを含有する検体希釈液（ＳＤ＝Ｔｒｉｓ緩衝液）において１ｅ８～１ｅ１コピー（ｃｐ）／ＰＣＲの１０倍濃度レベルで調製し、１０のレプリケートで試験した。ＰＣＲは、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００フィルタを取り付けたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（ＬＣ４８０）サーモサイクラーでの増幅及び検出で試験プライマー及びプローブを添加した一般的なｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００マスターミックスを使用して手動でセットアップした。図５には、合成インビトロ転写物を使用して試験したレベルにわたる、増殖曲線及びＣｔチャート（２つの標的についてダイナミックレンジをプロットした）が示されている。
データは、広いダイナミックレンジにわたってロバストな増幅曲線及びＰＣＲ効率を示し、転写物は両標的についてＰＣＲ反応あたり１０コピーまで検出された。初期の検出限界（ＬＯＤ）試験データを図６に要約しており、これは検体希釈サンプル中の１０コピー／ＰＣＲ反応までのレベルで１００％のヒット率を示す。
実施例６：患者サンプル分離株を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験のアッセイ性能
Ｑｉａｇｅｎウイルスサンプル調製プロトコルを使用して、ＢＥＩ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｉｓｏｌａｔｅ ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０（２．８Ｅ＋５ ＴＣＩＤ50／ｍＬ）から全ゲノムウイルスＲＮＡを単離した。溶出液中の１００％ゲノムＲＮＡ回収を仮定して、２．８Ｅ＋５ ＴＣＩＤ50／ｍＬから２．８０Ｅ－０２ ＴＣＩＤ50／ｍＬ（７レベル）まで１０倍段階希釈液を調製した。最終希釈は、２０μＬ（約５．６ｅ+3、５．６ｅ+2、５．６ｅ+1、５．６ｅ+0、５．６ｅ-1、５．６ｅ-2、５．６ｅ-3 ＴＣＩＤ50／ｍＬ）の以下の２つのマトリックスのうちの１つに、５μＬの精製ＲＮＡを添加することによって行った：ａ）より低いレベルで１０レプリケート及び上の３レベルで３レプリケートでのｃｏｂａｓ（登録商標）検体希釈緩衝液／トリス緩衝液（ＳＤ）、及びｂ）上気道感染症状を有する対象からの臨床上鼻咽頭スワブ検体、２レプリケートでの（ＮＳＰ）鼻咽頭スワブ検体溶出液（ＮＳＰ）から調製されたｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システム溶出液。ｃｏｂａｓ（登録商標）ＳＤ中のＲＮＡ転写物を対照として含めた。
ｎＣｏｖ１アッセイのプライマー／プローブセット（配列番号１、７、２１）及び全サルベコウイルス－１アッセイのプライマー／プローブセット（配列番号５、１５、２５）を使用して、患者サンプルから単離したゲノムＲＮＡに対してマルチプレックスＰＣＲ試験を実施し、ＳＤマトリックス及びＮＳＰマトリックスで生成した増幅曲線をそれぞれ図７及び図８に示す。この実験から決定されたＣｔ値を表８に要約する。
Figure 2023516472000009
検体希釈剤中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｉｓｏｌａｔｅ ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ゲノムＲＮＡの試験は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験が５．６Ｅ-03ＴＣＩＤ５０当量の投入まで検出できたことを示している（１００％の抽出効率を仮定）。ゲノムＲＮＡデータを合成転写物コピー数データと比較すると、これは約１０コピーの標的鋳型検出に相当する。さらに、これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験が鼻咽頭マトリックス中の分離株ＵＳＡ－ＷＡ１／２０２０ゲノムＲＮＡを検出できることを実証した（疑似ＮＳＰシステム）。
実施例７：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験の排他性／交差反応性試験
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２試験を、ＭＥＲＳ及び４つのコロナウイルス（２２９Ｅ、ＯＣ４３、ＨＫＵ１及びＮＬ６３）を含む他の呼吸器ウイルスに対する排他性／交差反応性について評価した。評価した全てのウイルス核酸溶出液のリストを表９に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２との相互作用は観察されず、この試験の特異性を実証した。
Figure 2023516472000010
実施例８：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂアッセイの説明
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂ試験は、４つの異なるチャネルを使用してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢのウイルスＲＮＡゲノム配列を検出するマルチプレックスの単一ウェルアッセイである：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デュアルは、（ｉ）１つのチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノム中の非構造オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１ａ／ｂ）由来の特定の核酸配列、及び（ｉｉ）第２のチャネルにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含む全てのサルベコウイルスに共通の保存された配列構造エンベロープ（Ｅ）遺伝子位置を標的とし、第３のチャネルは、インフルエンザＡセグメント７マトリックスタンパク質２（Ｍ２）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）配列を検出し、インフルエンザＢセグメント８核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）及び非構造タンパク質１（ＮＳ１）配列は、第４のチャネルにおいて検出される。結果は、感染の急性期中に鼻咽頭及び中咽頭のスワブサンプルで検出可能なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢのウイルスＲＮＡゲノム配列の特異的検出に関するものである。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＆インフルエンザＡ／Ｂ試験は、サンプル調製（核酸抽出及び精製）とそれに続くＰＣＲ増幅及び検出のために、様々な診断試験での使用についてＦＤＡが承認／認可した完全自動化システムであるｃｏｂａｓ（登録商標）６８００／８８００システムで行うことができる。サンプルからの標的核酸の選択的増幅は、標的特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーの使用によって達成される。マスターミックスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢに特異的な検出プローブ、並びにＲＮＡ内部対照核酸を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びＲＮＡ内部対照検出プローブはそれぞれ、レポーターとして作用する固有の蛍光色素で標識される。ＲＮＡ内部参照の増幅は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢのゲノムと相同性を有さない非競合的配列特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーの使用によって達成される。増幅には、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用いる。それぞれのプローブは、クエンチャーとして作用する第２の色素も有する。ワークフローは、市販のｃｏｂａｓ（登録商標）汎用試薬（ＭＧＰカセット、溶解緩衝液、検体希釈液、洗浄緩衝液）を、既存のプロテイナーゼ、溶出緩衝液、ＭＭＸ Ｒ１（補因子）を含む既存の試薬カセットと共に使用し、内部対照は、前述の新たに開発された試薬と共に使用することが計画されている。患者サンプルからの核酸及び添加されたＲＮＡ内部対照分子（既存のＲＮＡ ＱＳ試薬と同じ）を同時に抽出する。外部対照（陽性及び陰性）は、各ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂの実行で同じ方法で処理する。
実施例９：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂアッセイの設計戦略
診断試験は、２０１９新規コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢの検出及び識別のために設計されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイのために、一方のチャネル（ＦＡＭ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び別チャネル（ＨＥＸ）においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２も含むサルベコウイルス亜属ファミリーを検出するための二重標的アッセイを設計した。また、第３のチャネル（ＣＯＵ）においてインフルエンザＡ配列及び第４のチャネル（ＪＡ２７０）においてインフルエンザＢ配列を検出するようにアッセイを設計した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイは、６つのオリゴヌクレオチド：２つのゲノム領域に対してそれぞれ１つの逆転写（ＲＴ）プライマー、それぞれ１つの非ＲＴプライマー、及び、それぞれＦＡＭ及びＨＥＸフルオロフォアで標識された１つのプローブを有する。インフルエンザＡアッセイは、１つのＲＴプライマー、１つの非ＲＴプライマー、及びＣＯＵフルオロフォアで標識されたプローブを含む。それは、インフルエンザＡセグメント７マトリックスタンパク質２（Ｍ２）及びマトリックスタンパク質１（Ｍ１）のＲＮＡ配列を検出する。インフルエンザＢアッセイはまた、２つのインフルエンザＢ系統を含む全ての一般的なインフルエンザＢ株を検出するためのＰａｎ－ＦｌｕＢアッセイとして設計される。Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ。アッセイは、１つのＲＴプライマー、１つの非ＲＴプライマー、及びＪＡ２７０フルオロフォアで標識されたプローブを含む。それは、インフルエンザＢセグメント８核外輸送タンパク質（ＮＥＰ）及び非構造タンパク質１（ＮＳ１）配列を検出する。
実施例１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂアッセイプライマー及びプローブ選択
マスターミックスは、コロナウイルス型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、サルベコウイルス亜属のメンバーに特異的な検出プローブ、並びにインフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対する検出プローブ、並びにＲＮＡ内部対照核酸を、それぞれ固有のフルオロフォアと共に含有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢゲノム上のアンプリコン標的の相対位置をそれぞれ図９Ａ、図９Ｂ及び図９Ｃに示す。プライマーセットとプローブの選択された組み合わせを表１０に示す。
Figure 2023516472000011
実施例１０：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びインフルエンザＡ／Ｂ試験の性能評価
組み合わされたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２＆インフルエンザＡ／Ｂ試験のための構成要素（表１０に示すプライマーとプローブの選択された組み合わせを含む）、ワークフロー及びアッセイ試薬の実現可能性評価は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００試薬を使用する研究による実験的評価に基づく。線状化組換えプラスミドをアッセイオリゴヌクレオチドで試験して性能を評価した。合成ＲＮＡを使用したアッセイの性能を評価するために、インビトロ転写物も生成した。核酸の定量は、ＱｕｂｉｔをＤＮＡ及びＲＮＡ標準と共に使用して行った。プラスミドＤＮＡ及び転写物をＭｕｌｔｉＰｒｅｐ Ｓｐｅｃｉｍｅｎ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＧＳＤとしても知られる、ＭＰＳＤ）で段階希釈し、アッセイ性能試験に使用した。線状化ＤＮＡ転写物及びＲＮＡ転写物の両方を用いた評価には、内部対照オリゴヌクレオチド（汎用内部対照、ＧＩＣ）を含めた。実験は、実施例４に記載されているｃｏｂａｓ（登録商標）６８００汎用熱サイクリングプロファイルを使用して、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００フィルタを取り付けて較正した６８００フィルタサイクラーを備えたＲｏｃｈｅ Ｚ４８０で行った。
鼻咽頭（ＮＰＳ）サンプルを、凝集スワブを使用して上気道症状を呈する患者から得て、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｖｉｒａｌ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ培地（３ｍＬ）に収集した。これらのサンプルは、社内で開発されたＰＣＲアッセイによって特徴付けられ、以下のウイルスを除外することが示された：ＰＣＲ産物のＭｉＳｅｑ配列決定によるＦｌｕＡ、ＦｌｕＢ、ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、ＡｄＶ、ＥＶ／ＲＶ及びＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ４及びヒトコロナウイルス（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＨＫＵ１及びＯＣ４３）。これらのＮＰＳサンプルを－７０°Ｃで凍結保存し、解凍し、必要に応じて実験に使用した。改変されたサンプル調製ワークフロー（プロセス及び溶出液、Ｐ＆Ｅ）をｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで使用し、３００又は４００μＬのＮＰＳサンプルのいずれかを処理して核酸溶出液を調製した。これらの溶出液は、ｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムに対する同じＮＰＳサンプル調製プロセスに従い内部サンプル処理対照として機能するｇＩＣ外装ＲＮＡ（ＱＳ ＲＮＡ対照）を含有する。次いで、溶出液を、６８００フィルタサイクラーを備えたＺ４８０及び／又はｃｏｂａｓ（登録商標）６８００分析サイクラーでの増幅及び検出を伴うＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アッセイを用いた試験で使用した。
実施例１１：クリーンシステムにおける転写物を用いた検出の線形性及び限界
表１０に列挙したプライマーセットとプローブの組み合わせを使用して、クリーンシステム（ＢＧＳＤ）を使用して各標的アッセイ領域に対応する合成転写物で実験を最初に行った。４つの転写物を高いコピーレベルでプールし、いくつかの希釈レベル（より低いレベルではより多くのレプリケート）で６８００で試験した。図１０、図１１、図１２及び表１１の結果は、全サルベコウイルス及びＦｌｕＢアッセイについて、高い投入レベルで良好な再現性を示し、より低い投入レベルで低い標準偏差を示し、５ ｃｐ／ＰＣＲでそれぞれ１つの脱落のみを示す。ＰＣＲにおける広いダイナミックレンジ（１Ｅ＋９～１Ｅ＋１ ｃｐ）での各アッセイの優れた感度が実証された。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢの標的について、良好な線形性及び１０６％～１１２％の範囲の高いＰＣＲ効率が観察された。
Figure 2023516472000012
実施例１２：疑似鼻咽頭マトリックスにおけるウイルス培養物を使用した線形性
市販のウイルス培養物からの３つのゲノムＲＮＡ溶出液を高コピーレベルでプールし、いくつかの希釈レベルでｃｏｂａｓ（登録商標）６８００システムで試験した（ｎ＝２／レベル）。表１２及び図１３の結果は、８－ｌｏｇダイナミックレンジ全体にわたって良好な性能を示し、全てのレベルが良好な検出可能なシグナルを生成する。各ウイルスロットのＴＣＩＤ５０の液滴デジタルＰＣＲコピー数推定値を使用して、ＰＣＲごとのローエンド検出は、インフルエンザＡ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、及びインフルエンザＢについてそれぞれ＜２コピー、＜１０コピー、及び＜３０コピーと計算される。
Figure 2023516472000013
前述の発明を明確化及び理解するためにある程度詳細に説明してきたが、本開示を読むことにより、形態及び詳細の様々な変更を行うことができることが当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、上述した全ての技術及び装置を、様々な組み合わせで使用することができる。

Claims (37)

  1. サンプル中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を検出する方法であって、
    － 前記サンプルをプライマーセットと接触させて、前記サンプル中に核酸が存在する場合に増幅産物を産生することを含む、増幅ステップを実施するステップと、
    － 前記増幅産物を１つ以上の検出可能なプローブと接触させることを含む、ハイブリダイズステップを実施するステップと、
    － 前記増幅産物の存在又は非存在を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在を示し、前記増幅産物の非存在が前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の非存在を示す、前記増幅産物の存在又は非存在を検出するステップと
    を含み、
    前記プライマーセットが、配列番号１～６及び２７～３１、４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマーと、配列番号７～２０及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマーとを含み、
    前記１つ以上の検出可能なプローブの検出可能なプローブが、配列番号２１～２６、３２、及び４２～４３からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、方法。
  2. 前記ハイブリダイズステップが、前記増幅産物を、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分で標識された前記検出可能なプローブと接触させることを含み、
    前記検出するステップが、前記プローブの前記ドナー蛍光部分と前記アクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の存在又は非存在を検出することを含み、蛍光の存在又は非存在が、前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在又は非存在を示す、請求項１に記載の方法。
  3. 前記増幅ステップが、５’－３’ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する、請求項２に記載の方法。
  4. 前記サンプルが、鼻咽頭サンプル又は中咽頭サンプルから選択される生物学的サンプルである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 並行して１つ以上の他のウイルスから核酸を検出する方法をさらに含み、前記１つ以上の他のウイルスが、インフルエンザウイルス、コウモリ・コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（ＳＡＲ－ＣｏＶ）及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、コロナウイルス（２２９Ｅ、ＮＬ６３、ＯＣ４３、ＨＫＵ１）、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、アデノウイルス（Ｂ、Ｅ、Ｕ、Ｃ）、エンテロウイルス、ライノウイルス、及びヒトパラインフルエンザウイルス（１、２、３、４）、並びに上記の任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記第１のプライマーが、配列番号１～３及び２７～３１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号７～１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号２１～２３及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 配列番号４～６及び４０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマー、配列番号１５～２０及び４１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマー、及び配列番号２４～２６、３２及び４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む検出可能なプローブをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第１のプライマーが、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号１５～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号２４～２６及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の増幅のための前記プライマーセットが、複数の第１プライマーと、複数の第２プライマーと、複数の検出可能なプローブとを含み、
    前記複数の第１のプライマーが、配列番号１及び２７からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーと、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含む第１のプライマーとの組み合わせであり、
    前記複数の第２のプライマーが、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーと、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含む第２のプライマーとの組み合わせであり、
    前記複数の検出可能なプローブが、配列番号２１のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号２５及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブとの組み合わせである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１のプライマーが、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  11. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の核酸を検出するためのキットであって、
    － 配列番号１～６及び２７～３１及び４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマーと、
    － 配列番号７～２０及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマーと、
    － 配列番号２１～２６、３２及び４２～４３からなる群から選択される第３の蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又は相補体であって、前記第１のプライマー及び前記第２のプライマーによって生成されたアンプリコンにハイブリダイズするように構成された、第３の蛍光検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列又は相補体と
    を含む、キット。
  12. 前記第３の検出可能に標識されたオリゴヌクレオチド配列が、ドナー蛍光部分及び対応するアクセプター部分を含む、請求項１１に記載のキット。
  13. 前記サンプルが、鼻咽頭サンプル又は中咽頭サンプルから選択される生物学的サンプルである、請求項１１及び１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及び前記核酸ポリメラーゼの機能に必要な緩衝液をさらに含む、請求項１１～１３のいずれか一項に記載のキット。
  15. 前記第１のオリゴヌクレオチド配列、前記第２のオリゴヌクレオチド配列、及び前記第３のオリゴヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つが、少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む、請求項１１～１４のいずれか一項に記載のキット。
  16. 前記第１のプライマーが、配列番号１～３及び２７～３１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号７～１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号２１～２３及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のキット。
  17. 配列番号４～６及び４０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマーと、配列番号１５～２０及び４１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマーと、配列番号２４～２６、３２及び４３からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む検出可能なプローブとをさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18. 前記第１のプライマーが、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号１５～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号２４～２６及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のキット。
  19. 前記第１のプライマーが、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記第２のプライマーが、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含み、前記検出可能なプローブが、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項１１～１５のいずれか一項に記載のキット。
  20. サンプル中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、インフルエンザＡ、及びインフルエンザＢを同時に検出するための方法であって、
    － 前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及び／又はインフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢが存在する場合に、前記サンプルを第１のプライマーセット、第２のプライマーセット及び第３のプライマーセットと接触させて１つ以上の増幅産物を産生する増幅ステップを実施するステップであって、前記第１のプライマーセットが前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に増幅産物を産生し、前記第２のプライマーセットが前記サンプル中にインフルエンザＡが存在する場合に増幅産物を産生し、前記第３のプライマーセットが前記サンプル中にインフルエンザＢが存在する場合に増幅産物を産生する、増幅ステップを実施するステップと、
    － 前記増幅産物（複数可）を３つ以上の検出可能なプローブと接触させるハイブリダイズステップを実施するステップであって、前記３つ以上の検出可能なプローブが、前記第１のプライマーセット、前記第２のプライマーセット及び前記第３のプライマーセットの各々の前記増幅産物に特異的な少なくとも１つのプローブを含む、ハイブリダイズステップを実施するステップ；及び前記増幅産物の存在又は非存在を検出するステップであって、前記増幅産物の存在が前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの存在を示し、前記増幅産物の非存在が前記サンプル中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、インフルエンザＡ及び／又はインフルエンザＢの非存在を示す、前記増幅産物の存在又は非存在を検出するステップと
    を含む、方法。
  21. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１～６及び２７～３１、４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマーと、配列番号７～２０及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマーとを含み、前記１つ以上の検出可能なプローブの第１の検出可能なプローブが、配列番号２１～２６、３２及び４２～４３からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１～３、２７～３１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７～１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第１の検出可能なプローブが、配列番号２１～２３及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１又は２７のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第１の検出可能なプローブが、配列番号２１又は４２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第２のプライマーセットが、配列番号３３のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３４のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第３のプライマーセットが、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、第２の検出可能なプローブが、配列番号３５又は４４のオリゴヌクレオチド配列を含み、第３の検出可能なプローブが、配列番号３８又は４５のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びサルベコウイルス亜属由来の他のコロナウイルス標的核酸が存在する場合に増幅産物を産生する第４のプライマーセットと、第４の増幅産物に特異的にハイブリダイズする第４の検出可能プローブとをさらに含む、請求項２０及び２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記第４のプライマーセットが、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第４の検出可能なプローブが、配列番号２４～２６及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記第４のプライマーセットが、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第４の検出可能なプローブが、配列番号２５又は３２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸が存在する場合に増幅産物を産生する第４のプライマーセットをさらに含み、前記第４のプライマーセットが、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第４の検出可能プローブが、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２０及び２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
  29. サンプル中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）の１つ以上の核酸、インフルエンザＡの１つ以上の核酸及びインフルエンザＢの１つ以上の核酸を同時に検出するためのキットであって、
    ａ）前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在する場合に第１の増幅産物を産生する第１のプライマーセット、前記サンプル中にインフルエンザＡが存在する場合に第２の増幅産物を産生する第２のプライマーセット、及び前記サンプル中にインフルエンザＢが存在する場合に第３の増幅産物を産生する第３のプライマーセットと、
    ｂ）前記第１の増幅産物に特異的にハイブリダイズする第１の検出可能なプローブと、前記第２の増幅産物に特異的にハイブリダイズする第２の検出可能なプローブと、前記第３の増幅産物に特異的にハイブリダイズする第３の検出可能なプローブとを含む３つ以上の検出可能なプローブと
    を含む、キット。
  30. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１～６及び２７～３１、４０からなる群から選択される第１のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第１のプライマーと、配列番号７～２０及び４１からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む第２のプライマーとを含み、前記１つ以上の検出可能なプローブの前記第１の検出可能なプローブが、配列番号２１～２６、３２及び４２～４３からなる群から選択される第３のオリゴヌクレオチド配列又はその相補体を含む、請求項２９に記載のキット。
  31. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１～３、２７～３１からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７～１４からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第１の検出可能なプローブが、配列番号２１～２３及び４２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載のキット。
  32. 前記第１のプライマーセットが、配列番号１又は２７のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第１の検出可能なプローブが、配列番号２１又は４２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載のキット。
  33. 前記第２のプライマーセットが、配列番号３３のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３４のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第３のプライマーセットが、配列番号３６のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号３７のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第２の検出可能なプローブが、配列番号３５又は４４のオリゴヌクレオチド配列を含み、前記第３の検出可能なプローブが、配列番号３８又は４５のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のキット。
  34. 前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びサルベコウイルス亜属由来の他のコロナウイルス標的核酸が存在する場合に第４の増幅産物を産生する第４のプライマーセットと、前記第４の増幅産物に特異的にハイブリダイズする第４の検出可能プローブとをさらに含む、請求項２９及び３１～３３のいずれか一項に記載のキット。
  35. 前記第４のプライマーセットが、配列番号４～６からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５～２０からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記第４の検出可能なプローブが、配列番号２４～２６及び３２からなる群から選択されるオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載のキット。
  36. 前記第４のプライマーセットが、配列番号５のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第４の検出可能なプローブが、配列番号２５又は３２のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項３５に記載のキット。
  37. 前記サンプル中にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２標的核酸が存在する場合に第４の増幅産物を産生する第４のプライマーセットをさらに含み、前記第４のプライマーセットが、配列番号４０のオリゴヌクレオチド配列を含むフォワードプライマーと、配列番号４１のオリゴヌクレオチド配列を含むリバースプライマーとを含み、前記増幅産物を検出するための前記第４の検出可能プローブが、配列番号４３のオリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２９及び３１～３３のいずれか一項に記載のキット。
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