KR20220152205A - 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2), 인플루엔자 a 및 인플루엔자 b를 검출하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(sars-cov-2), 인플루엔자 a 및 인플루엔자 b를 검출하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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마린사 헤일
칼야니 망기푸디
치트라 마노하르
라마니 사다난담 라비랄라
크리스토퍼 데이비드 산티니
유진 스파이어
징타오 순
탄 탐
환 쯔엉
미첼 엘리자베스 예
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

생물학적 또는 비생물학적 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 신속하게 검출하는 방법들을 설명한다. 이러한 방법은 증폭 단계, 혼성화 단계, 및 검출 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 또한, SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B를 표적으로 하는 프라이머 및 프로브와 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 검출을 위해 설계된 키트가 제공된다.

Description

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-COV-2), 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 검출하기 위한 조성물 및 방법
발명의 분야
본 발명은 바이러스 진단 분야, 보다 구체적으로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 바이러스(인플루엔자 A) 및 인플루엔자 B 바이러스(인플루엔자 B)의 검출에 관한 것이다.
발명의 배경
코로나비리다에(Coronaviridae)과의 바이러스는 26 내지 32 킬로베이스 길이 범위의 단일 가닥 양성-센스 RNA 게놈을 가지고 있다. 코로나바이러스는 여러 조류 숙주, 뿐만 아니라 낙타, 박쥐, 흰코 사향고양이, 생쥐, 개, 고양이를 포함한 다양한 포유동물에서 확인된 바 있다. 이제 신종 포유류 코로나바이러스는 정기적으로 확인된다. 예를 들어 박쥐 기원의 HKU2-관련 코로나바이러스는 2018년 돼지에서 치명적인 급성 설사 증후군을 유발했다.
인간에게 병원성인 여러 코로나바이러스 중 대부분은 임상 증상이 경미하지만 다음 두 가지 주목할만한 예외가 있다: 2002년 11월 중국 남부 광둥에서 발생한 신종 베타 코로나바이러스로서 2002-03년 동안 37개국에서 8000명 이상의 감염과 774명의 사망을 초래한 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 코로나바이러스 (SARS-CoV); 및 2012년 사우디아라비아에서 처음 발견되어 2012년 9월 이후 실험실에서 확인된 2494명의 감염 사례와 한국에 한 번 유입된 후 38명이 사망한 것을 포함하여 858명의 사망을 유발한 중동 호흡기 증후군(MERS) 코로나바이러스 (MERS-CoV).
2019년 12월 말, 바이러스성 폐렴 환자 여러 명이 중국 후베이성 우한의 한 시장과 역학적으로 관련이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이 시장에서는 발병 전 조류 및 토끼와 같은 수많은 비수생 동물들 또한 판매 중이었다. 처음에 2019 신종 코로나바이러스(2019-nCoV)로 명명된 신종 인간 감염 코로나바이러스는 차세대 시퀀싱을 사용하여 확인되었다. 이 신종 코로나바이러스는 코로나바이러스, 베타코로나바이러스 속 및 사르베코바이러스 아속으로 분류되며 Lu, R. 등의 문헌 [“characterization and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding”에 설명되어 있다. 국제 바이러스 분류 위원회(ICTV)는 이 바이러스의 정식 명칭을 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)로 발표했다. 2020년 3월 1일 현재 중국에서 거의 80,000건의 확인된 사례와 2,800명 이상의 사망자가 보고되었으며 SARS-CoV-2는 미국을 포함하여 국제적으로 최소 60개 지역에서 검출되었다. 따라서, SARS-CoV-2를 검출하기 위한 신속하고, 신뢰할 수 있고, 특이적이고 민감한 방법이 당업계에 필요하다.
인플루엔자 또는 독감은 오르토믹소비리다에 계통의 전염성이 높은 바이러스성 호흡기 질환이다. 독감 감염은 언제든지 발생할 수 있지만 일반적으로 각 반구에서 겨울철에 계절 변동성 발병을 특징으로 한다. 증상은 환자마다 심각도가 다양하지만 일반적으로 기침, 발열, 콧물 또는 코막힘, 인후통, 몸살, 피로 중 하나 이상을 포함한다. 독감은 누구에게나 감염될 수 있지만 노인과 아주 어린 아이들, 면역 능력이 저하되어 있고 특정 기저 질환이 있는 사람들에게 특히 위험하다.
인플루엔자 바이러스에는 4가지 유형이 있으며 인플루엔자 바이러스 A부터 D로 표시된다. 인간은 인플루엔자 바이러스 A, B, C에 감염될 수 있으나 인간의 인플루엔자 D 감염 사례는 보고되지 않았다. 사람을 감염시키는 가장 흔한 유형은 인플루엔자 A이고 그 다음이 인플루엔자 B이다. 인플루엔자 A는 바이러스 입자의 외부 표면에서 발견되는 헤마글루티닌(H) 및 뉴라미니다제(N)의 두 가지 단백질의 변이에 기초한 혈청형들로 세분된다. 헤마글루티닌 변이체 H1-H3, 뉴라미니다제 변이체 N1 및 N2는 계절성 발병 중에 발생하는 가장 흔한 혈청형을 형성한다. 몇 년 동안 A형 인플루엔자 발생은 전 세계에 치명적인 영향을 미치고 독감 대유행을 초래했다. 예를 들어, 1918년 스페인 독감 대유행으로 1,700만에서 5,000만 명이 사망한 것으로 추정된다. 1957년 아시아 독감 대유행과 1968년 홍콩 독감 대유행으로 각각 100만 명 이상이 사망했다. 인플루엔자 A H1N1 혈청형은 1918년 스페인 독감의 원인이 되었으며 H2N2 및 H3N2 혈청형은 각각 아시아 독감과 홍콩 독감 대유행의 원인이었다.
인플루엔자 B와 인플루엔자 C는 사람을 감염시킬 수 있지만 훨씬 덜 위험하다. B형 인플루엔자는 단일 혈청형을 가지므로 이 바이러스에 대한 집단 면역을 확립하고 유지하는 것이 더 쉽다. 그럼에도 불구하고, 어린이와 청소년의 심각한 감염, 심지어 국소적인 전염병이 이 바이러스와 함께 발생할 수 있다. 인플루엔자 C는 사람을 감염시킬 수 있지만 인플루엔자 B보다 훨씬 덜 위험하며 환자는 경미한 증상만 보인다.
따라서 SARS-CoV-2 자체를 검출하기 위한 빠르고, 신뢰할 수 있고, 특이적이고, 민감한 방법의 필요성 이상으로, 호흡기 감염이 의심되는 개체에서 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 감염의 신속하고 정확한 진단 및 판별도 중요하다. SARS-CoV-2와 인플루엔자의 계절 변동 범위는 중복되며 두 질병의 임상 증상은, 대부분의 개체에서 무증상 또는 경미한 "인플루엔자 유사" 질병에서부터 더 심각하고 생명을 위협하는 질병에 이르기까지 유사할 수 있다. 그러나 두 바이러스 유형들은, SARS-CoV-2 환자가 증상이 없는 동안 감염을 퍼뜨릴 수 있는 반면, 인플루엔자 환자는 증상이 더 빨리 발생하고 증상이 없는 동안 바이러스를 흘리지 않는다는 점에서 다르다. 결과적으로 SARS-CoV-2와 인플루엔자의 신속하고 정확한 검출 및 판별은 시간이 중요한 의료 의사 결정에 정보를 제공하고, 감염 통제 노력을 촉진하고, 효율적인 자원 조달을 촉진하고, 표적 치료제 및 항균제의 사용을 최적화하고, 보조 테스트 또는 절차를 감소시킴에 도움을 줄 수 있다. 따라서, SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B를 검출하고 판별하기 위한 신속하고, 신뢰할 수 있고, 특이적이고, 민감한 방법이 당업계에 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 생물학적 또는 비생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 신속하게 검출하는 방법, 예를 들어, 단일 시험관 또는 단일 웰에서 정성적 또는 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 SARS-CoV-2의 다중 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 생물학적 또는 비생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B의 존재 또는 부재를 동시에 신속하게 검출하는 방법, 예를 들어, 단일 시험관 또는 단일 웰에서 정성적 또는 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의한 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B의 다중 검출 방법을 제공한다. 실시형태는 역전사 단계, 및 증폭 단계와 혼성화 단계를 포함할 수 있는 적어도 한 번의 사이클링 단계를 수행하는 것을 포함하는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 검출 방법을 포함한다. 또한, 실시형태에는 단일 시험관 또는 단일 웰에서 SARS-CoV-2의 검출 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 다중 검출을 위해 설계된 프라이머, 프로브 및 키트가 포함된다. 이러한 검출 방법은 각 표적 게놈의 다양한 영역들을 표적으로 하도록 설계된다. 예를 들어, 이 방법들은 구조적 외피 (E) 영역, 및/또는 비-구조적 오픈 리딩 프레임 (ORF1a 폴리단백질 및 ORF1a/b 폴리단백질을 코딩하는 ORF1a/b 유전자) 영역을 인코딩하는 SARS-CoV-2 게놈 영역을 표적하도록 설계된다. 이 방법은 또한 SARS-CoV-2 게놈의 다른 영역들, S 유전자(세포 수용체에 대한 결합을 담당하는 스파이크 단백질을 코딩), ORF3ab, E 유전자(외피 단백질을 코딩), 및 M 유전자(막 단백질을 코딩)를 단독으로 또는 조합하여 표적하도록 설계될 수도 있다. 또한, SARS-CoV-2 게놈의 5' 말단의 비-코딩 영역의 265개 염기 및 3' 말단의 비-코딩 영역의 229개 염기가 존재하며, 이들 또한 표적이 될 수 있다.
인플루엔자 A 및 B와 관련하여 상기 방법은 게놈을 구성하는 8개 세그먼트 내의 임의의 유전자 또는 비-코딩 영역을 표적하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 A의 경우, 상기 방법은 인플루엔자 A 세그먼트 7 매트릭스 단백질 2(M2) 및 매트릭스 단백질 1(M1) 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있다. 인플루엔자 B의 경우, 상기 방법은 인플루엔자 B 세그먼트 8 핵 방출 단백질(NEP) 및 비구조 단백질 1(NS1) 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있다.
단일 시험관 또는 단일 웰에서 RT-PCR에 의해 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 동시에 검출하는 방법은 단일 시험관 또는 단일 웰에서 RT-PCR에 의해 사람, 특히 상기도에서 호흡기 질환을 일으킬 수 있는 추가 바이러스들을 동시에 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 바이러스의 예에는 다음이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다: 코로나바이러스(229E, NL63, OC43, HKU1), 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 아데노바이러스(B,E,U,C), 엔테로바이러스, 라이노바이러스 및 인간 파라인플루엔자 바이러스(1, 2, 3, 4).
한 실시형태에서, 샘플 내 SARS-CoV-2를 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은, SARS-CoV-2가 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 프라이머 세트와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 단계를 수행하는 단계; 증폭 생성물을 하나 이상의 검출가능한 프로브와 접촉시키는 것을 포함하는 혼성화 단계를 수행하는 단계; 및 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 증폭 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타내고 증폭 생성물의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 부재를 나타내고; 이때 프라이머 세트는 서열 번호: 1-20, 27-31, 및 40-41로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이들로 이루어지며; 하나 이상의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시형태에서, 샘플 내 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 다중 방법이 제공되며, 이 방법은, SARS-CoV-2가 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제1 프라이머 세트 및 SARS-CoV-2가 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제2 프라이머 세트와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 단계를 수행하는 단계; 제1 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브 및 제2 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 제2 검출가능한 프로브와 접촉시키는 것을 포함하는 혼성화 단계를 수행하는 단계; 및 증폭된 생성물(들)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 증폭 생성물(들)의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타내고 증폭 생성물의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 부재를 나타내고; 이때 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3, 및 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 정방향 프라이머 올리고뉴클레오타이드 서열, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 역방향 프라이머 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 그리고 제2 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 정방향 프라이머 올리고뉴클레오타이드 서열 및 서열 번호: 15-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 역방향 프라이머 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고; 그리고 이때 제1 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23, 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어지고 그리고 제2 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26, 32, 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, 제1 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 이를 증폭시키고, 제2 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 표적 핵산에 혼성화하여 증폭시킨다. 일부 실시형태에서 제2 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 표적 핵산 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산에 혼성화하여 이를 증폭시킨다. 일부 실시형태에서, 제1 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브는 SARS-CoV-2 표적 핵산에 특이적으로 혼성화한다. 일부 실시형태에서, 제2 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브는 SARS-CoV-2 표적 핵산에 혼성화한다. 일부 실시형태에서, 제2 프라이머 쌍에 의해 생성된 증폭 생성물에 혼성화하는 적어도 하나의 검출가능한 프로브는 SARS-CoV-2 표적 핵산 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산에 혼성화한다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1-6, 27-31, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물을 검출하기 위한 하나 이상의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-26, 32, 42, 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3, 및 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물을 검출하기 위한 하나 이상의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23, 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 특이적으로 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 40의 제1 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 41의 제2 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물을 검출하기 위한 하나 이상의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물을 검출하기 위한 하나 이상의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태에서 프라이머 쌍은 SARS-CoV-2 표적 핵산 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산의 증폭에 적합하다.
또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머, 그리고 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 검출가능한 프로브를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 27 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7, 8, 또는 9의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머, 그리고 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 검출가능한 프로브를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 2의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 9, 10, 또는 11의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머, 그리고 서열 번호: 22의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 검출가능한 프로브를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 검출가능한 프로브는 서열 번호: 25 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 6의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 18의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 그리고 검출가능한 프로브는 서열 번호: 26의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1-6 및 27-31, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함한다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3 및 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 서열 번호: 1의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 제2 프라이머를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 27 및 30으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 6의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 18의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또한 또 다른 실시양태에서, 제1 프라이머는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적을 증폭하기 위한 프라이머 세트는 복수의 제1 프라이머, 복수의 제2 프라이머, 및 복수의 검출가능한 프로브를 포함하고, 이때 복수의 제1 프라이머는 서열 번호: 1 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머와 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머의 조합이고; 이때 복수의 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머와 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머의 조합이고; 복수의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브와 서열 번호 25: 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 조합이다. 또한 또 다른 실시형태에서, 복수의 제1 프라이머는 서열 번호: 1 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호: 6의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머의 조합이고; 이때 복수의 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 및 서열 번호: 18의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머의 조합이고; 복수의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 서열 번호 25: 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 및 서열 번호: 26의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 조합이다. 또한 또 다른 실시형태에서, 복수의 제1 프라이머는 서열 번호: 27의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머와 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머의 조합이고; 복수의 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머와 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머의 조합이고; 그리고 복수의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 42의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브와 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 조합이다.
또 다른 양상에서, 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B를 동시에 검출하는 방법이 제공되며, 이 방법은 SARS-CoV-2 및/또는 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B가 샘플에 존재하는 경우 하나 이상의 증폭 생성물을 생성하는 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 및 제3 프라이머 세트와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 단계를 수행하는 단계; 이때 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는 경우 제1 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고, 샘플에 인플루엔자 A가 존재하는 경우 제2 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고, 샘플에 인플루엔자 B가 존재하는 경우 제3 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고; 증폭 생성물(들)을 3개 이상의 검출가능한 프로브와 접촉시키는 것을 포함하는 혼성화 단계를 수행하는 단계, 이때 3개 이상의 검출가능한 프로브는 제1, 제2, 및 제3 프라이머 세트 각각의 증폭 생성물들에 특이적인 적어도 하나의 프로브를 포함하고; 및 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 증폭 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및/또는 인플루엔자 B의 존재를 나타내고, 증폭 생성물의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B의 부재를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 제4 프라이머 세트 및 제4 검출가능한 프로브를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 여기서, 제4 프라이머 세트는, SARS-CoV-2 또는 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성할 수 있으며, 제4 검출가능한 프로브는 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이때 증폭된 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2 또는 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산의 존재를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 제4 프라이머 세트는 SARS-CoV-2가 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성할 수 있으며, 제4 검출가능한 프로브는 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하고, 이때 증폭된 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법(들)에서 사용되는 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3 및 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고; 제2 프라이머 세트는 서열 번호: 33의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 34의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고; 제3 프라이머 세트는 서열 번호: 36의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 37의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23, 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 제2 검출가능한 프로브는 서열 번호: 35 또는 44의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, 및 제3 검출가능한 프로브는 서열 번호: 38 또는 45의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트를 제공하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태들에서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15-20 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고; 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26, 32 및 43으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시형태들에서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고, 그리고 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26, 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태들에서, SARS-CoV-2 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 제4 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트; 그리고 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브를 추가로 포함하고, 이때 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함한다.
한 실시형태에서, SARS-CoV-2가 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 27의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21 또는 42의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산이 샘플 내 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 5 또는 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15 또는 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진 역방향 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 32 또는 43의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 서열 번호: 1-45로부터 선택된 뉴클레오타이드의 서열, 또는 이의 상보체를 포함하거나 이로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 제공하며, 이러한 뉴클레오타이드는 100개 이하의 뉴클레오타이드를 가진다. 추가로, 본 발명은 서열 번호: 1-45 중 하나 또는 이의 상보체에 적어도 70% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 등)을 갖는 핵산을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 제공하며, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 100개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는다. 일반적으로, 이들 올리고뉴클레오타이드는 이들 실시형태들에서 프라이머 핵산, 프로브 핵산 등일 수 있다. 특정 양상에서, 올리고뉴클레오타이드는 40개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들어, 35개 이하의 뉴클레오타이드, 30개 이하의 뉴클레오타이드, 25개 이하의 뉴클레오타이드, 20개 이하의 뉴클레오타이드, 15개 이하의 뉴클레오타이드 등)를 갖는다. 일부 양상에서, 올리고뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드에 비해 예를 들어 핵산 혼성화 안정성을 변경하기 위한 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 선택적으로, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지 및 선택적으로 적어도 하나의 소광제 모이어티를 포함한다. 일부 양상에서, 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 보존적으로 변형된 변이를 포함한다. 특정 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이" 또는 간단히 "보존적 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 지칭하고, 또는, 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 인코딩되는 서열에서 단일 뉴클레오타이드 또는 작은 백분율의 뉴클레오타이드(전형적으로 5% 미만, 보다 일반적으로 4%, 2% 또는 1% 미만)를 변경, 부가 또는 결실시키는 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 이러한 변경으로 아미노산을 결실, 아미노산을 부가, 또는 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우 "보존적으로 변형된 변이"임을 당업자는 알고 있을 것이다.
한 양상에서, 증폭은 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제 효소를 이용할 수 있다. 따라서, 공여체 형광 모이어티 및 수용체 모이어티, 예를 들어, 소광제는 프로브의 길이를 따라 서로 5 내지 20개 이하의 뉴클레오타이드 (예를 들어, 8 또는 10개 이내의 뉴클레오타이드) 일 수 있다. 또 다른 양상에서, 프로브는 2차 구조 형성을 허용하는 핵산 서열을 포함한다. 이러한 2차 구조 형성은 제1 및 제2 형광 모이어티 사이에 공간적 근접성을 초래할 수 있다. 이 방법에 따르면, 프로브 상의 제2 형광 모이어티는 소광제가 될 수 있다.
한 양상에서, 특정 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 프로브는 리포터 역할을 하는 형광 염료로 표지될 수 있다. 프로브에는 소광제 역할을 하는 제2의 염료가 있을 수도 있다. 리포터 염료는 정의된 파장에서 측정되므로 증폭된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 표적을 검출하여 식별할 수 있다. 온전한 프로브의 형광 신호는 소광제 염료에 의해 억제된다. PCR 증폭 단계 동안 특정 단일 가닥 DNA 템플릿에 프로브를 혼성화하면, 이는 DNA 폴리머라제의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어, 리포터 및 소광제 염료가 분리되고 형광 신호를 생성한다. 각 PCR 사이클마다 절단된 프로브의 양이 증가하고 리포터 염료의 누적 신호가 동시에 증가한다. 선택적으로 하나 이상의 추가 프로브(예를 들어, 내부 참조 대조군 또는 기타 표적화된 프로브(예를 들어, 기타 바이러스 핵산))는 또한 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 프로브와 관련된 형광 염료 표지와 구별되는 그리고 독특한 리포터 형광 염료로 표지될 수도 있다. 이러한 경우, 특정 리포터 염료는 정의된 파장에서 측정되기 때문에, 증폭된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 표적과 하나 이상의 추가 프로브의 동시 검출 및 식별이 가능하다.
본 발명은 또한 개체의 생물학적 샘플 내 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 개체의 생물학적 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 핵산(들)의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 진단 테스트에 사용되는 비인두(NSP) 및 구인두 면봉 샘플에서 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 핵산의 존재 또는 부재를 검출하는데 사용될 수 있다. 또한, 당업자는 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 핵산(들)을 검출하는 다른 샘플 유형들을 평가하기 위해 동일한 테스트를 사용할 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 역전사 단계, 및 증폭 단계 및 염료 결합 단계를 포함하는 적어도 한 번의 사이클링 단계를 수행하는 것을 포함한다. 전형적으로, 증폭 단계는 핵산 분자가 샘플에 존재하는 경우 복수의 올리고뉴클레오타이드 프라이머 쌍과 샘플을 접촉시켜 하나 이상의 증폭 생성물을 생성하는 것을 포함하고, 염료-결합 단계는 증폭 생성물을 이중 가닥 DNA 결합 염료와 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 방법은 또한 증폭 생성물에 대한 이중 가닥 DNA 결합 염료의 결합의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하며, 이때 결합의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 /또는 인플루엔자 B 핵산(들)의 존재를 나타내고, 이때 결합의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 핵산(들)의 부재를 나타낸다. 대표적인 이중 가닥 DNA 결합 염료는 에티듐 브로마이드이다. 다른 핵산 결합 염료에는 DAPI, Hoechst 염료, PicoGreen®, RiboGreen®, OliGreen®, 및 시아닌 염료, 예를 들어, YO-YO® 및 SYBR® Green이 포함된다. 또한, 이러한 방법은 증폭 생성물과 이중 가닥 DNA 결합 염료 사이의 용융 온도를 측정하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 용융 온도로 SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 /또는 인플루엔자 B 핵산(들)의 존재 또는 부재를 확인한다.
추가 실시형태에서, SARS-CoV-2의 하나 이상의 핵산을 검출하기 위한 키트가 제공된다. 키트는 유전자 표적의 증폭에 특이적인 하나 이상의 프라이머 세트; 및 증폭 생성물의 검출에 특이적인 하나 이상의 검출가능한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 샘플 내 SARS-CoV-2의 하나 이상의 핵산, 인플루엔자 A의 하나 이상의 핵산 및 인플루엔자 B의 하나 이상의 핵산을 동시에 검출하기 위한 키트가 제공된다. 이러한 키트는 SARS-CoV-2 유전자 표적, 인플루엔자 A 유전자 표적 및 인플루엔자 B 유전자 표적의 증폭에 특이적인 하나 이상의 프라이머 세트, 뿐만 아니라 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B에 대한 증폭의 검출에 특이적인 하나 이상의 검출가능한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함할 수 있다.
한 양상에서, 이러한 키트는 공여체 및 상응하는 수용체 모이어티, 예를 들어, 또 다른 형광 모이어티 또는 암 소광제로 이미 표지된 프로브를 포함할 수 있거나, 프로브를 표지하기 위한 형광단 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 핵산 폴리머라제, 및 핵산 폴리머라제의 기능에 필요한 완충액을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한 프라이머, 프로브 및 형광 모이어티를 사용하여 샘플 내 SARS-CoV-2 핵산 또는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B 핵산(들)의 존재 또는 부재를 검출하는 것에 관한 사용 설명서 및 지침서를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 또한, 재료, 방법 및 실시예들은 단지 설명을 위한 것이며 제한을 하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태들에 관한 세부내용은 첨부된 도면 및 하기 상세한 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 그 외 다른 특징, 목적 및 이점들은 상세한 설명과 도면 및 청구범위로부터 명확해 질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 SARS-CoV-2 (본원에서 Wuhan-Hu-1로 표지) 및 SARS-CoV의 게놈 구성 그리고 본 발명의 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브들의 표적 영역들의 위치를 보여준다. E: 외피 단백질 유전자; M: 막 단백질 유전자; N: 뉴클레오캡시드 단백질 유전자; ORF1a/b: 비-구조적 유전자의 ORF; S: 스파이크 단백질 유전자; 앰플리콘 아래의 숫자는 Wuhan-Hu-1, GenBank MN908947에 따른 게놈 위치이다.
도 2는 nCoV1 분석을 위한 프라이머 및 프로브를 다양한 농도의 선형화된 SARS-CoV-2 DNA 템플릿에 대해 테스트한 실험의 PCR 성장 곡선을 보여준다.
도 3은 nCoV1 분석을 위한 프라이머 및 프로브를 다양한 농도의 선형화된 SARS-CoV-2의 RNA 전사체에 대해 테스트한 실험의 PCR 성장 곡선을 보여준다.
도 4는 범-사르베코-2 분석을 위한 프라이머 및 프로브를 다양한 농도의 선형화된 SARS-CoV-2 DNA 템플릿에 대해 테스트한 실험의 PCR 성장 곡선을 보여준다.
도 5는 합성 시험관 내 전사체들을 사용하여 표시된 수준 (1e+8 내지 1e+1) 전반에 걸쳐 테스트한 nCoV1 분석 (상단) 및 범-사르베코바이러스-1 분석 (하단)에 관한 실시예 5에서 설명한 다중 PCR 테스트에서 성장 곡선 (왼쪽) 및 동적 범위를 표시한 Ct 도표 (오른쪽)를 보여준다.
도 6은 도 5에 도시된 실험 데이터로부터 얻은 검출 한계(LOD) 데이터의 요약을 도시한다.
도 7은 nCoV1 분석(왼쪽) 및 범-사르베코바이러스-1 분석(오른쪽)을 포함하는 다중 PCR 테스트에서 표본 희석제(SD)에 희석시킨 표시된 수준의 환자 샘플에서 단리된 게놈 RNA를 사용한 SARS-CoV-2 테스트에서 생성된 성장 곡선을 보여준다.
도 8은 nCoV1 분석(왼쪽) 및 범-사르베코바이러스-1 분석(오른쪽)을 포함하는 다중 PCR 테스트에서 비인두 샘플 용출액 (NSP)에 희석시킨 표시된 수준의 환자 샘플에서 단리된 게놈 RNA를 사용한 SARS-CoV-2 테스트에서 생성된 성장 곡선을 보여준다.
도 9: 도 9A는 SARS-CoV-2 (본원에서 Wuhan-Hu-1로 표지) 및 SARS-CoV의 게놈 구성 그리고 SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 분석을 위한 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브들의 표적 영역들의 위치를 보여준다. 도 9B는 SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 분석을 위한 인플루엔자 A 프라이머 및 프로브의 표적 영역의 위치를 보여준다. 도 9C는 SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 분석을 위한 인플루엔자 B 프라이머 및 프로브의 표적 영역의 위치를 보여준다.
도 10은 합성 시험관 내 전사체들을 사용하여 표시된 수준 (1e+9 내지 5e+0) 전반에 걸쳐 테스트한 FluA 분석 (상단, 필터 =1) 및 nCoV1 분석 (하단, 필터 =2)에 관한, 실시예 11에 설명한 다중 PCR 테스트 성장 곡선을 보여준다.
도 11은 합성 시험관 내 전사체들을 사용하여 표시된 수준 (1e+9 내지 5e+0) 전반에 걸쳐 테스트한 범-사르베코바이러스-1 분석 (상단, 필터 =3) 및 FluB 분석 (하단, 필터 =4)에 관한, 실시예 11에 설명한 다중 PCR 테스트 성장 곡선을 보여준다.
도 12는 도 10 및 11에 도시된 성장 곡선에 대한 복합 선형성 플롯(동적 범위를 표시한 Ct 도표)을 보여준다.
도 13은 실시예 12에 설명된 바와 같이 설계된 비인두 매트릭스에서의 다중 PCR 테스트 성장 곡선을 나타낸다.
발명의 상세한 설명
핵산 증폭에 의한 SARS-CoV-2 감염의 진단은 바이러스 감염을 신속하고, 정확하고, 확실하게, 특이적으로, 민감하게 검출하는 방법을 제공한다. 비생물학적 또는 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 실시간 역전사효소 PCR 분석을 본원에 기재한다. SARS-CoV-2를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브가 제공되며, 이러한 프라이머 및 프로브를 포함하는 제조 물품 또는 키트도 제공된다. 다른 방법에 비해 SARS-CoV-2의 검출을 위한 실시간 PCR의 특이도 및 민감도 향상, 및 샘플 봉입 및 증폭된 생성물의 실시간 검출을 포함한 실시간 PCR의 특징 개선으로 인해 임상 실험실에서 이러한 기술을 SARS-CoV-2 감염의 관례적인 진단을 위해 적절히 실시할 수 있다. 또한 이 기술은 예후, 뿐만 아니라 시험관내 진단에도 사용할 수 있다. 이러한 SARS-CoV-2 검출 분석은 또한 다른 핵산, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, SARS-CoV, MERS-CoV의 동시 검출을 위한 다른 분석법들과 다중화될 수 있다.
또한, 핵산 증폭을 통한 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 감염의 동시 진단은 이러한 호흡기 바이러스 감염을 신속하고, 정확하고, 확실하게, 특이적으로, 그리고 민감하게 검출하는 방법을 제공한다. 비생물학적 또는 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 검출하고 구별하기 위한 실시간 역전사효소 PCR 분석이 본원에 설명되어 있다. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브가 제공되며, 이러한 프라이머 및 프로브를 포함하는 제조 물품 또는 키트도 제공된다. 다른 방법에 비해 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B의 검출을 위한 실시간 PCR의 특이도 및 민감도 향상, 및 샘플 봉입 및 증폭된 생성물의 실시간 검출을 비롯한 실시간 PCR의 특징 개선으로 인해 임상 실험실에서 이러한 기술을 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B 감염의 관례적인 진단을 위해 적절히 실시할 수 있다. 또한 이 기술은 예후, 뿐만 아니라 시험관내 진단에도 사용할 수 있다. 이러한 SARS-CoV-2 검출 분석은 또한 다른 바이러스 표적, 예를 들어, 인플루엔자 C 바이러스, 인플루엔자 D 바이러스, SARS-CoV, 또는 MERS-CoV의 동시 검출을 위한 다른 분석법들과 추가로 다중화될 수도 있다.
SARS-CoV-2 게놈은 포지티브 센스 단일 가닥 RNA 분자 길이가 29,903개 염기(GenBank 접근 번호 MN908947에 표시됨)이며 유전자들의 순서(5`에서 3`)는 다음과 같다: 복제효소 ORF1ab(바이러스 복제 및 바이러스 조립에 필수적인 16개의 예측된 비구조적 단백질이 있는 21,291개 염기), 스파이크(S 유전자, 세포 수용체에 대한 결합을 담당하는 스파이크 단백질을 코딩하는 3,822개 염기), ORF3ab(828개 염기 길이), 외피(E 유전자, 외피 단백질을 코딩하는 228개 염기), 막(M 유전자, 막 단백질을 코딩하는 669개 염기), 뉴클레오캡시드(N 유전자, 게놈 RNA와 복합체를 형성하는 뉴클레오캡시드 단백질을 코딩하는 1260개 염기). 또한, 5' 말단에 비코딩 영역의 염기가 265개, 3' 말단에 비코딩 영역의 염기가 229개 있다.
인플루엔자 A는 13,588개 염기 길이의 세그먼트화된 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 분자이다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html 참조). 게놈은 균주에 따라 10-14개의 유전자를 인코딩하는 8개의 세그먼트로 구성된다. 가장 긴 것부터 가장 짧은 것까지, 세그먼트 및 이에 인코딩된 유전자는 다음과 같다: 세그먼트 1(RNA 폴리머라제 서브유닛 PB2); 세그먼트 2(RNA 폴리머라제 서브유닛 PB1 및 PB1-F2 단백질); 세그먼트 3(RNA 폴리머라제 서브유닛 PA 및 PA-X 단백질); 세그먼트 4(헤마글루티닌); 세그먼트 5(핵단백질); 세그먼트 6(뉴라미니다제); 세그먼트 7(매트릭스 단백질 M1 및 매트릭스 단백질 M2); 및 세그먼트 8(비구조 단백질 NS1 및 NEP). 헤마글루티닌과 뉴라미니다제는 인플루엔자 비리온의 외부에서 발견되는 대형 단백질이다. 헤마글루티닌(HA)은 표적 세포에 대한 인플루엔자 바이러스 입자의 결합 및 세포 내로의 바이러스 게놈 진입을 담당한다. 뉴라미니다제(NA)는 감염된 세포에서 비리온의 방출을 촉매한다. HA는 16가지 및 NA는 9가지 공지된 아형이 존재하지만, H1, H2와 H3 및 N1과 N2만이 인간에서 일반적으로 발견된다.
인플루엔자 A 게놈과 유사한, 인플루엔자 B 게놈은 14,548개 염기 길이의 8-세그먼트 네거티브 센스 단일 가닥 RNA 분자이다. 인플루엔자 B의 게놈은 몇 가지를 제외하고 인플루엔자 A,의 게놈과 매우 유사하다. 가장 긴 것부터 가장 짧은 것까지, 세그먼트 및 이에 인코딩된 유전자는 다음과 같다: 세그먼트 1(RNA 폴리머라제 서브유닛 PB2); 세그먼트 2(RNA 폴리머라제 서브유닛 PB1 단백질); 세그먼트 3(RNA 폴리머라제 서브유닛 PA); 세그먼트 4(헤마글루티닌); 세그먼트 5(핵단백질); 세그먼트 6 (뉴라미다제 및 매트릭스 단백질 NB); 세그먼트 7 (매트릭스 단백질 M1 및 막 단백질 BM2); 및 세그먼트 8(비구조 단백질 NS1 및 NEP). 인플루엔자 B는 사람에서 인플루엔자 A보다 덜 유행하지만 어린이와 청소년에게 불균형적으로 영향을 미친다.
본 발명은 예를 들어, TaqMan® 증폭 및 검출 기술을 사용하여 SARS-CoV-2를 특이적으로 식별하기 위해 (예를 들어, ORF1ab 유전자 및/또는 E 유전자에서) SARS-CoV-2 게놈에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 형광 표지된 가수분해 프로브를 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 ORF1ab 유전자 및/또는 E 유전자에 특이적으로 혼성화한다. 게놈의 여러 위치에 혼성화하는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 것은 단일 사본 유전자 좌를 표적화하는 것과 비교하여 민감도 개선에 유리하다.
개시된 방법은 역전사 단계 및 하나 이상의 프라이머 쌍을 사용하여 샘플로부터 핵산 분자 유전자 표적의 하나 이상의 부분을 증폭시키는 것을 포함하는 적어도 한 번의 사이클링 단계를 수행하는 것을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "SARS-CoV-2 프라이머(들)"는 SARS-CoV-2 게놈에서 발견되는 핵산 서열에 특이적으로 어닐링하고 적절한 조건 하에서 이들로부터 DNA 합성을 개시하여 각각의 증폭 생성물을 생성하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 지칭한다. SARS-CoV-2 게놈에서 발견되는 핵산 서열의 예에는 ORF1ab 유전자, S 유전자, ORF3ab 유전자, E 유전자, M 유전자 및 N 유전자 및 기타 예상 ORF 영역 내의 핵산이 포함된다. 논의된 각각의 SARS-CoV-2 프라이머는 각 증폭 생성물의 적어도 일부가 표적에 상응하는 핵산 서열을 포함하도록 표적 영역에 어닐링한다. 하나 이상의 핵산이 샘플에 존재하는 경우 하나 이상의 증폭 생성물이 생성되며, 따라서 하나 이상의 증폭 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다. 증폭 생성물은 SARS-CoV-2에 대한 하나 이상의 검출 가능한 프로브에 상보적인 핵산 서열을 포함해야 한다. 본원에 사용된 "SARS-CoV-2 프로브(들)"은 SARS-CoV-2 게놈에서 발견되는 핵산 서열에 특이적으로 어닐링하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 지칭한다. 각 사이클링 단계는 증폭 단계, 혼성화 단계 및 검출 단계를 포함하며, 여기서 샘플은 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 하나 이상의 검출가능한 SARS-CoV-2 프로브와 접촉된다.
유사하게, 본원에서 사용되는 용어 “인플루엔자 A 프라이머(들)”및 “인플루엔자 B 프라이머(들)”은 각각 인플루엔자 A 게놈 및 인플루엔자 B 게놈에서 발현되는 핵산 서열들에 특이적으로 어닐링하여 적절한 조건하에서 이들로부터의 DNA 합성을 개시하여, 각각의 증폭 생성물을 생성하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “인플루엔자 A 프로브(들)”및 “인플루엔자 B 프로브(들)”은 SARS-CoV-2 게놈에서 발견되는 핵산 서열에 특이적으로 어닐링하여, 각각의 표적 증폭 생성물을 검출할 수 있게 하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "증폭"은 템플릿 핵산 분자(예를 들어, SARS-CoV-2 게놈의 핵산 분자)의 가닥 중 하나 또는 둘 모두에 상보적인 핵산 분자를 합성하는 과정을 지칭한다. 핵산 분자를 증폭하는 것은 일반적으로 템플릿 핵산을 변성시키는 것, 프라이머의 용융 온도보다 낮은 온도에서 템플릿 핵산에 프라이머를 어닐링하는 것, 및 프라이머로부터 효소적으로 연장시켜 증폭 생성물을 생성하는 것을 포함한다. 증폭은 일반적으로 데옥시리보뉴클레오사이드 트라이포스페이트, DNA 폴리머라제 효소 (예를 들어, Platinum®Taq) 및 폴리머라제 효소의 최적 활성을 위한 적절한 완충액 및/또는 보조인자 (예를 들어, MgCl2 및/또는 KCl)를 필요로 한다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는 당업자에게 공지되어 있으며 주로 올리고뉴클레오타이드를 지칭하는 올리고머 화합물을 지칭하지만 또한 템플릿-의존성 DNA 폴리머라제에 의해 DNA 합성을 "프라이밍" 할 수 있는 변형된 올리고뉴클레오타이드 또한 지칭한다, 즉, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단은 유리 3'-OH기를 제공하고 이때 또 다른 "뉴클레오타이드"는 3'에서 5'으로의 포스포다이에스터 링키지를 생성하는 템플릿 의존성 DNA 폴리머라제에 의해 부착될 수 있고, 이에 의해 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트가 사용되고 이에 의해 피로포스페이트가 방출된다.
용어 "혼성화"는 하나 이상의 프로브가 증폭 생성물에 어닐링하는 것을 지칭한다. "혼성화 조건"은 일반적으로 프로브의 용융 온도보다 낮지만 프로브의 비특이적 혼성화를 피하는 온도를 포함한다.
용어 "5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성"은 일반적으로 핵산 가닥 합성과 관련된 핵산 폴리머라제의 활성을 말하며, 이에 의해 핵산 가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드가 제거된다.
"열안정성 폴리머라제"라는 용어는 열에 안정한 폴리머라제 효소를 지칭한다, 즉, 이 효소는 템플릿에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 형성을 촉매하고, 이중 가닥 템플릿 핵산의 변성을 일으키는데 필요한 시간 동안 상승된 온도를 거칠 때 비가역적으로 변성되지 않는다. 일반적으로 합성은 각 프라이머의 3' 말단에서 시작되어 템플릿 가닥을 따라 5'에서 3' 방향으로 진행된다. 열안정성 폴리머라제는 써머스 플라부스(Thermus flavus), T. 루버 (T. ruber), T. 써모필루스(T. thermophilus), T. 아쿠아티쿠스(T. aquaticus), T. 락테우스(T. lacteus), T. 루벤스(T. rubens), 바실루스 스테아로써모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 및 메타노써무스 페르비두스(Methanothermus fervidus)로부터 단리되었었다. 그럼에도 불구하고, 열안정성이 없는 폴리머라제는 필요한 경우 효소가 보충된다면 PCR 분석에서도 사용할 수 있다.
용어 "이의 상보체"는 주어진 핵산과 길이가 동일하고 정확히 상보적인 핵산을 지칭한다.
핵산과 관련하여 사용될 때 용어 "연장" 또는 "신장"은 추가의 뉴클레오타이드(또는 다른 유사한 분자)가 핵산에 통합되는 경우를 지칭한다. 예를 들어, 핵산은 핵산의 3' 말단에 뉴클레오타이드를 일반적으로 추가하는 폴리머라제와 같은 생체 촉매를 통합한 뉴클레오타이드에 의해 선택적으로 연장된다.
2개 이상의 핵산 서열과 관련하여 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 최대 대응을 위해 비교되고 정렬될 때, 예를 들어, 당업자가 이용가능한 서열 비교 알고리즘들 중 하나를 사용하여 또는 육안 검사로 측정시, 동일한 뉴클레오타이드들을 특정 백분율로 가지는 또는 동일한 둘 이상의 서열 또는 서열들을 지칭한다. 퍼센트 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기에 적합한 예시적인 알고리즘은 BLAST 프로그램들로서, 이들은 예를 들어, 문헌들 [Altschul et al. (1990) “Basic local alignment search tool” J. Mol. Biol. 215:403-410, Gish et al. (1993) “Identification of protein coding regions by database similarity search” Nature Genet. 3:266-272, Madden et al. (1996) “Applications of network BLAST server” Meth. Enzymol. 266:131-141, Altschul et al. (1997) “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs” Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 및 Zhang et al. (1997) “PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation” Genome Res. 7:649-656]에 기재되어 있다.
올리고뉴클레오타이드와 관련하여 "변형된 뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드 서열의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 원하는 특성을 올리고뉴클레오타이드에 제공하는 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 변경을 지칭한다. 본원에 기재된 올리고뉴클레오타이드에서 치환될 수 있는 예시적인 변형된 뉴클레오타이드에는 예를 들어 t-부틸 벤질, C5-메틸-dC, C5-에틸-dC, C5-메틸-dU, C5-에틸-dU, 2,6-디아미노퓨린, C5-프로피닐-dC, C5-프로피닐-dU, C7-프로피닐-dA, C7-프로피닐-dG, C5-프로파길아미노-dC, C5-프로파길아미노-dU, C7-프로파길아미노-dA, C7-프로파길아미노-dG, 7-데아자-2-데옥시잔토신, 피라졸로피리미딘 유사체, 슈도-dU, 니트로 피롤, 니트로 인돌, 2'-O-메틸 리보-U, 2'-O-메틸 리보-C, N4-에틸-dC, N6-메틸-dA 등이 포함된다. 올리고뉴클레오타이드에서 치환될 수 있는 많은 다른 변형된 뉴클레오타이드는 본원에서 언급되거나 당업계에 공지되어 있다. 특정 실시형태들에서, 변형된 뉴클레오타이드 치환은 상응하는 비변형된 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도와 비교하여 올리고뉴클레오타이드의 용융 온도(Tm)를 변형시킨다. 추가로 설명하자면, 특정한 변형된 뉴클레오타이드 치환은 일부 실시형태들에서 비-특이적 핵산 증폭을 감소시키고 (예를 들어, 프라이머 이량체 형성 등을 최소화), 의도한 표적 앰플리콘의 수율을 증가시킬 수 있다. 이러한 유형의 핵산 변형의 예는 예를 들어 미국 특허 제 6,001,611에 기재되어 있다. 다른 변형된 뉴클레오타이드 치환이 올리고뉴클레오타이드의 안정성을 변경하거나 다른 바람직한 특징을 제공할 수 있다.
SARS-CoV-2의 증폭 및 검출
본 발명은 예를 들어, SARS-CoV-2 핵산 서열의 일부를 증폭함으로써 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다. SARS-CoV-2의 핵산 서열을 이용할 수 있다(예를 들어, GenBank 접근 번호 MN908947). 구체적으로, SARS-CoV-2 핵산 분자 표적을 증폭 및 검출하기 위한 프라이머 및 프로브가 본 발명의 실시형태들에 의해 제공된다.
SARS-CoV-2의 검출을 위해 SARS-CoV-2를 증폭시키는 프라이머와 프로브가 제공된다. 본원에 예시된 것 이외의 SARS-CoV-2 핵산 또한 샘플 내 SARS-CoV-2를 검출하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체는 당업자가 관례적인 방법을 사용하여 특이성 및/또는 민감도에 대해 평가할 수 있다. 대표적인 기능적 변이체는 예를 들어 본원에 개시된 SARS-CoV-2 핵산 내 하나 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 올리고뉴클레오타이드의 실시형태들은 각각 서열 1-32 및 39-43으로부터 선택된 서열을 갖는 핵산, 실질적으로 동일한 이의 변이체 (이때, 변이체는 서열 번호: 1-32 및 39-43 중 하나에 적어도, 예를 들어, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가짐), 또는 서열 번호: 1-32 및 39-43 및 이들 변이체의 상보체를 포함한다.
표 1: SARS-CoV-2 정방향 프라이머
Figure pct00001
표 2: SARS-CoV-2 역방향 프라이머
Figure pct00002
표 3: SARS-CoV-2 프로브
Figure pct00003
한 실시형태에서, SARS-CoV-2를 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 검출을 제공하기 위해 상기 기재된 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브 세트가 사용된다(표 1-3) . 프라이머 및 프로브 세트는 서열 번호: 1-32 및 39-43의 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 SARS-CoV-2 핵산 서열에 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있다. 또 다른 실시형태에서, SARS-CoV-2 표적에 대한 프라이머 및 프로브는 서열 번호 1-32 및 39-43의 프라이머 및 프로브 중 어느 하나의 기능적 활성 변이체를 포함하거나 이로 이루어진다.
서열 번호: 1-32 및 39-43의 프라이머 및/또는 프로브 중 어느 하나의 기능적 활성 변이체는 상기 개시된 방법에서 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여 식별될 수 있다. 서열 번호: 1-32 및 39-43 중 어느 하나의 프라이머 및/또는 프로브의 기능적 활성 변이체는 서열 번호: 1-32 및 39-43의 각 서열과 비교하여 상기 기재된 방법 또는 키트에서 유사하거나 더 높은 특이성 및 민감성을 제공하는 프라이머 및/또는 프로브에 관한 것이다.
변이체는, 예를 들어, 서열 번호: 1-32 및 39-43의 서열과 하나 이상의 뉴클레오타이드 부가, 결실, 또는 치환, 예를 들어, 서열 번호: 1-32 및 39-43의 각 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 하나 이상의 부가, 결실, 또는 치환 만큼 다를 수 있다. 상기 상세히 설명한 바와 같이, 프라이머(및/또는 프로브)는 화학적으로 변형될 수 있다, 즉, 프라이머 및/또는 프로브는 변형된 뉴클레오타이드 또는 비-뉴클레오타이드 화합물을 포함할 수 있다. 이때 프로브(또는 프라이머)는 변형된 올리고뉴클레오타이드이다. "변형된 뉴클레오타이드"(또는 "뉴클레오타이드 유사체")는 일부 변형에 의해 천연 "뉴클레오타이드"와 다르지만 여전히 염기 또는 염기 유사 화합물, 펜토퓨라노실 당 또는 펜토퓨라노실 당 유사 화합물, 포스페이트 부분 또는 포스페이트-유사 부분, 또는 이들의 조합으로 이루어진다. 예를 들어, "표지"는 "뉴클레오타이드"의 염기 부분에 부착될 수 있으며, 이로써 "변형된 뉴클레오타이드"를 얻는다. "뉴클레오타이드"의 천연 염기는 또한 예를 들어 7-데사자퓨린으로 대체될 수 있으며, 이로써 "변형된 뉴클레오타이드"도 얻는다. 용어 "변형된 뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드 유사체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "변형된 뉴클레오사이드"(또는 "뉴클레오사이드 유사체")는 "변형된 뉴클레오타이드"(또는 "뉴클레오타이드 유사체")에 대해 상기 약술한 바와 같은 방식의 일부 변형에 의해 천연 뉴클레오사이드와 상이하다.
SARS-CoV-2 표적을 인코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 SARS-CoV-2의 대체 부분을 인코딩하는 핵산을 증폭하는 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들어, 컴퓨터 프로그램, 가령, OLIGO (Molecular Biology Insights Inc., Cascade, Colo.)를 사용하여 설계될 수 있다. 증폭 프라이머로 사용할 올리고뉴클레오타이드를 설계할 때 중요한 특징에는 (예를 들어, 전기영동에 의한) 검출을 용이하게 하는 적절한 크기의 증폭 생성물, 프라이머 쌍의 구성원들에 대한 유사한 용융 온도, 및 각 프라이머의 길이 (즉, 프라이머는 서열 특이성으로 어닐링하고 합성을 시작하기에 충분히 길어야 하지만 올리고뉴클레오타이드 합성 중에 충실도가 감소할 정도로 길지 않아야 함)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 8 내지 50개 길이의 뉴클레오타이드이다(예를 들어, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 또는 50개 뉴클레오타이드 길이).
프라이머 세트 이외에도, 상기 방법은 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하기 위하여 하나 이상의 프로브를 사용할 수 있다. 용어 "프로브"는 합성 또는 생물학적으로 생산된 핵산(DNA 또는 RNA)을 지칭하며, 이는, 설계 또는 선택에 의해, 정해진 예정된 엄격도 하에서 “표적 핵산”에, 본 발명의 경우, SARS-CoV-2 (표적) 핵산에 특이적으로 (즉, 우선적으로) 혼성화 할 수 있게 하는 특이적 뉴클레오타이드 서열들을 포함한다. "프로브"는 표적 핵산을 검출하는 것을 의미하는 "검출 프로브"로 지칭될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 상기 SARS-CoV-2 프로브는 적어도 하나의 형광 표지로 표지될 수 있다. 한 실시형태에서, SARS-CoV-2 프로브는 공여체 형광 모이어티, 예를 들어, 형광 염료, 및 상응하는 수용체 모이어티, 예를 들어, 소광제로 표지될 수 있다. 한 실시형태에서, 프로브는 형광 모이어티를 포함하거나 이로 이루어지고 핵산 서열은 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43을 포함하거나 이로 이루어진다.
프로브로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 설계는 프라이머의 설계와 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 실시형태들은 증폭 생성물의 검출을 위해 단일 프로브 또는 한 쌍의 프로브를 사용할 수 있다. 이러한 실시형태에 따라, 프로브(들) 사용은 적어도 하나의 표지 및/또는 적어도 하나의 소광제 모이어티를 포함할 수 있다. 프라이머와 마찬가지로, 프로브는 일반적으로 유사한 용융 온도를 가지며, 각 프로브의 길이는 서열 특이적 혼성화가 일어나기에 충분해야 하지만 합성 중에 충실도가 감소될 정도로 길지 않아야 한다. 올리고뉴클레오타이드 프로브는 일반적으로 15 내지 40개(예를 들어, 16, 18, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개) 길이의 뉴클레오타이드이다.
구조체들은 SARS-CoV-2 프라이머들 및 프로브 핵산 분자들 중 하나를 각각 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 구조체는 예를 들어 대조군 템플릿 핵산 분자로 사용될 수 있다. 사용하기에 적합한 벡터는 시중에서 구입가능하고 및/또는 당업계에서 통상적인 재조합 핵산 기술 방법에 의해 생산된다. SARS-CoV-2 핵산 분자는 예를 들어 화학적 합성, SARS-CoV-2로부터의 직접 클로닝 또는 핵산 증폭에 의해 얻을 수 있다.
상기 방법에 사용하기에 적합한 구조체들은 전형적으로, SARS-CoV-2 핵산 분자(예를 들어, 서열 번호: 1-32 및 39-43 중 하나 이상의 서열을 함유하는 핵산 분자)에 더하여, 원하는 구조체 및/또는 형질전환체를 선별하기 위한 선별가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성 유전자)를 인코딩하는 서열, 및 복제 원점을 포함한다. 벡터 시스템의 선택은 일반적으로 숙주 세포의 선택, 복제 효율성, 선별성, 유도성 및 복구 용이성을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 여러 요인에 따라 달라진다.
SARS-CoV-2 핵산 분자를 포함하는 구조체들은 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 숙주 세포는 원핵세포 및 진핵세포, 예를 들어, 효모, 식물 및 동물 세포를 포함하는 것을 의미한다. 원핵 숙주에는 대장균, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)가 포함될 수 있다. 진핵 숙주에는 효모, 예를 들어, S. 세레비시아에(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 포유동물 세포, 예를 들어, COS 세포 또는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포, 예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 및 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)이 포함된다. 구조체는 당업자에게 일반적으로 공지된 임의의 기술을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 칼슘 포스페이트 침전, 전기천공, 열 충격, 리포펙션, 미세주입 및 바이러스 매개 핵산 전달은 핵산을 숙주 세포에 도입하는 일반적인 방법이다. 또한, 네이키드 DNA는 세포에 직접 전달될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제 5,580,859 및 5,589,466 참조).
인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 증폭 및 검출
본 발명은 또한 SARS-CoV-2 핵산 서열의 일부, 인플루엔자 A 핵산 서열의 일부, 및 인플루엔자 B 핵산 서열의 일부를 증폭시킴으로써 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 동시에 검출하는 방법을 제공한다. SARS-CoV-2 핵산 분자 표적을 증폭하고 검출하기 위한 프라이머 및 프로브는 전술한 섹션에서 설명하였다. 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 핵산 서열은 각각 GenBank 접근 번호 KC781450 (A/Michigan/01/2010(H1N1) 및 KM654608 (B/Connecticut/Flu103/2013)로 이용가능하다. 구체적으로, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 핵산 분자 표적을 증폭 및 검출하기 위한 프라이머 및 프로브가 본 발명의 실시형태들에 의해 제공된다. 도 9B 및 9C는 인플루엔자 A 프라이머 및 프로브 (세그먼트 7 M1 및 M2 유전자들을 표적하는 서열 번호: 33-35 및 44)에 의해 그리고 인플루엔자 B 프라이머 및 프로브 (세그먼트 8 NEP 및 NS1 유전자를 표적하는 서열 번호: 36-38 및 45)에 의해 표적되는 위치들을 보여준다.
보다 구체적으로, 뉴클레오타이드의 실시형태들 각각은 인플루엔자 A의 경우 서열 번호: 33-35 및 44, 실질적으로 동일한 이의 변이체 (이때 이러한 변이체는, 서열 번호: 33-35 및 44 중 하나에 적어도, 예를 들어, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가짐) 또는 서열 번호: 33-35, 및 44 및 이러한 변이체의 상보체로부터 선택된 서열; 또는 인플루엔자 B의 경우 서열 번호: 36-38 및 45, 실질적으로 동일한 이의 변이체 (이때 이러한 변이체는 서열 번호: 36-38 및 45 중 하나에 적어도, 예를 들어, 80%, 90%, 또는 95% 서열 동일성을 가짐), 또는 서열 번호: 36-38 및 45, 및 이러한 변이체의 상보체로부터 선택된 서열을 가지는 핵산을 포함한다.
표 4: 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 프라이머 및 프로브
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폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)
미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호 및 제4,965,188호는 통상적인 PCR 기술을 개시하고 있다. PCR은 일반적으로 선택된 핵산 템플릿(예를 들어, DNA 또는 RNA)에 결합하는 2개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한다. 일부 실시형태들에서 유용한 프라이머는 기재된 SARS-CoV-2 핵산 서열(예를 들어, 서열 번호: 1-20, 27-31, 40-41) 내부에 핵산 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 프라이머는 통상적인 방법에 의해 제한 분해물로부터 정제될 수 있거나 합성적으로 생성될 수 있다. 프라이머는 증폭 효율을 최대화하기 위해 단일 가닥인 것이 바람직하지만 프라이머는 이중 가닥일 수도 있다. 이중 가닥 프라이머는 먼저 변성된다, 즉, 가닥이 분리되도록 처리된다. 이중 가닥 핵산을 변성시키는 한 가지 방법은 가열하는 것이다.
템플릿 핵산이 이중 가닥인 경우 PCR에서 템플릿으로 사용하기 전에 두 가닥을 분리해야 한다. 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 포함하는 임의의 적합한 변성 방법에 의해 달성될 수 있다. 핵산 가닥을 분리하는 한 가지 방법은 핵산이 대부분 변성될 때까지(예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상 변성) 핵산을 가열하는 것을 포함한다. 템플릿 핵산을 변성시키는 데 필요한 가열 조건은 예를 들어 완충염 농도 및 변성되는 핵산의 길이 및 뉴클레오타이드 조성에 따라 달라지지만, 일반적으로 반응의 특징, 예를 들어, 온도 및 핵산 길이에 따라 일정 시간 동안 약 90°C 내지 약 105°C 범위이다. 변성은 전형적으로 약 30초 내지 4분(예를 들어, 1분 내지 2분 30초, 또는 1.5분) 동안 수행된다.
이중 가닥 템플릿 핵산이 열에 의해 변성되면 각 프라이머의 그 표적 서열에 대한 어닐링을 촉진하는 온도로 반응 혼합물을 냉각시킬 수 있다. 어닐링 온도는 일반적으로 약 35℃ 내지 약 65℃예를 들어, 약 40℃내지 약 60℃약 45℃내지 약 50℃이다. 어닐링 시간은 약 10초 내지 약 1분(예를 들어, 약 20초 내지 약 50초; 약 30초 내지 약 40초)일 수 있다. 그 다음, 반응 혼합물은 폴리머라제의 활성이 촉진되거나 최적화되는 온도, 즉, 어닐링된 프라이머로부터 연장이 일어나 템플릿 핵산에 상보적인 생성물을 생성하기에 충분한 온도로 조정된다. 온도는 핵산 템플릿에 어닐링된 각 프라이머로부터 연장 생성물을 합성하기에 충분해야 하지만, 상보적 템플릿으로부터 연장 생성물을 변성시킬 만큼 높아서는 안 된다 (예를 들어, 연장을 위한 온도는 일반적으로 약 40℃내지 약 80℃(예를 들어, 약 50℃내지 약 70℃약 60℃범위이다). 연장 시간은 약 10초 내지 약 5분(예를 들어, 약 30초 내지 약 4분; 약 1분 내지 약 3분; 약 1분 30초 내지 약 2분)일 수 있다.
SARS-CoV-2 및 기타 플라비바이러스와 같은 레트로바이러스 또는 RNA 바이러스의 게놈은 리보핵산, 즉 RNA로 구성된다. 이러한 경우, 템플릿 핵산인 RNA는 먼저 효소 역전사효소의 작용을 통해 상보적 DNA(cDNA)로 전사되어야 한다. 역전사효소는 RNA 템플릿과 RNA의 3' 말단에 상보적인 짧은 프라이머를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA의 합성을 유도한 다음 폴리머라제 연쇄 반응을 위한 템플릿으로 바로 사용될 수 있다.
PCR 분석은 RNA 또는 DNA(cDNA)와 같은 SARS-CoV-2 핵산을 사용할 수 있다. 템플릿 핵산은 정제할 필요가 없다; 이는 인간 세포에 포함된 SARS-CoV-2 핵산과 같은 복잡한 혼합물의 작은 부분일 수 있다. SARS-CoV-2 핵산 분자는 생물학적 샘플로부터 문헌[Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications (Persing et al. (eds), 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.)]에 설명된 것과 같은 관례적인 기술에 의해 추출될 수 있다. 핵산은 수많은 출처, 예를 들어, 플라스미드 또는 박테리아, 효모, 바이러스, 세포 소기관 또는 식물이나 동물과 같은 고등 유기체를 포함한 천연 출처로부터 얻을 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 프라이머(예를 들어, 서열 번호: 1-20, 27-31, 40-41)는 프라이머 연장을 유도하는 반응 조건 하에 PCR 시약과 조합된다. 예를 들어, 사슬 연장 반응은 일반적으로 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM MgCl2, 0.001% (w/v) 젤라틴, 0.5-1.0 μg 변성 템플릿 DNA, 각 올리고뉴클레오타이드 프라이머 50 pmole, 2.5 U의 Taq 폴리머라제, 및 10% DMSO를 포함한다. 이러한 반응은 일반적으로 각각 150~320μM의 dATP, dCTP, dTTP, dGTP 또는 이들의 하나 이상의 유사체를 포함한다.
새로 합성된 가닥은 반응의 다음 단계에서 사용할 수 있는 이중 가닥 분자를 형성한다. 가닥 분리, 어닐링 및 신장 단계는 표적 SARS-CoV-2 핵산 분자에 해당하는 원하는 양의 증폭 생성물을 생성하는데 필요한 만큼 자주 반복될 수 있다. 반응의 제한 요인은 반응에 존재하는 프라이머, 열안정성 효소 및 뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 양이다. 사이클링 단계(즉, 변성, 어닐링 및 연장)는 바람직하게는 적어도 한 번 반복된다. 검출에 사용함에 있어, 사이클링 단계의 횟수는 예를 들어 샘플 특성에 따라 달라질 것이다. 샘플이 핵산의 복잡한 혼합물인 경우 검출에 충분한 표적 서열을 증폭하기 위해 더 많은 사이클링 단계가 필요하다. 일반적으로 사이클링 단계는 적어도 약 20회 반복되지만 40, 60 또는 100회까지 반복될 수 있다.
형광 공명 에너지 전달 (FRET)
FRET 기술(예를 들어, 미국 특허 제 4,996,143, 5,565,322, 5,849,489 및 6,162,603 참조)은 공여체 형광 모이어티와 이에 상응하는 수용체 형광 모이어티가 서로 일정 거리 이내에 위치할 때, 이러한 두 형광 모이어티들 사이에서 에너지 전달이 발생하고 이를 가시화 또는 그 외 다른 방법으로 검출 및/또는 정량화할 수 있다는 개념에 기초한다. 공여체는 일반적으로 공여체가 적절한 파장의 광 복사에 의해 여기될 때 에너지를 수용체로 전달한다. 수용체는 일반적으로 전달된 에너지를 다른 파장의 광 복사 형태로 다시 방출한다. 특정 시스템에서, 비형광 에너지는 실질적으로 비형광 공여체 모이어티를 포함하는 생체분자를 통해 공여체와 수용체 모이어티 사이에서 전달될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,741,467 참조).
한 예에서, 올리고뉴클레오타이드 프로브는 공여체 형광 모이어티 (예를 들어, HEX) 및, 형광일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는, 전달된 에너지를 빛 이외의 형태로 소산시키는 이에 상응하는 소광제 (예를 들어, BlackHole Quenchers™(BHQ))를 포함할 수 있다. 프로브가 온전할 때, 에너지 전달은 일반적으로 공여체와 수용체 모이어티 사이에서 발생하여, 공여체 형광 모이어티로부터의 형광 방출이 수용체 모이어티에서 소광된다. 폴리머라제 연쇄 반응의 연장 단계 동안, 증폭 생성물에 결합된 프로브는 예를 들어 Taq 폴리머라제의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의해 절단되어 공여체 형광 모이어티의 형광 방출이 더 이상 소광되지 않는다. 이러한 목적을 위한 예시적인 프로브는 예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,994,056호 및 제6,171,785호에 기재되어 있다. 일반적으로 사용되는 공여체-수용체 쌍에는 FAM-TAMRA 쌍이 포함된다. 일반적으로 사용되는 소광제는 DABCYL 및 TAMRA이다. 일반적으로 사용되는 암 소광제(dark quenchers)에는 BlackHole Quenchers™(BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ 650 (BBQ-650), (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)가 포함된다.
또 다른 예에서, 각각 형광 모이어티를 함유하는 2개의 올리고뉴클레오타이드 프로브는 SARS-CoV-2 표적 핵산 서열에 대한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 상보성에 의해 결정된 특정 위치에서 증폭 생성물에 혼성화할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 적절한 위치에서 증폭 생성물 핵산에 혼성화되면 FRET 신호가 생성된다. 혼성화 온도는 약 10초 내지 약 1분 동안 약 35℃내지 약 65℃의 범위일 수 있다.
형광 분석은 예를 들어 광자 계수 에피형광 현미경 시스템(특정 범위에서 형광 방출을 모니터링하기 위한 적절한 이색 거울 및 필터 포함), 광자 계수 광전자증배관 시스템 또는 형광계를 사용하여 수행할 수 있다. 에너지 전달을 시작하거나 형광단을 직접 감지하기 위한 여기는 아르곤 이온 레이저, 고강도 수은(Hg) 아크 램프, 제논 램프, 광섬유 광원 또는 기타 원하는 범위에서 여기를 위해 적절하게 필터링된 고강도 광원을 사용하여 수행될 수 있다.
공여체 및 상응하는 수용체 모이어티와 관련하여 본원에 사용된 "상응하는"은 공여체 형광 모이어티의 방출 스펙트럼과 중첩되는 흡광 스펙트럼을 갖는 수용체 형광 모이어티 또는 암소광제를 지칭한다. 수용체 형광 모이어티의 방출 스펙트럼의 최대 파장은 공여체 형광 모이어티가 여기 스펙트럼의 최대 파장보다 적어도 100 nm 커야 한다. 따라서, 효율적인 비방사성 에너지 전달이 이들 사이에서 생성될 수 있다.
형광 공여체 및 상응하는 수용체 모이어티는 일반적으로 (a) 고효율 Foerster 에너지 전달; (b) 큰 최종 스토크스 이동 (>100 nm); (c) 가시 스펙트럼의 적색 부분으로 가능한 한 멀리 방출 이동(>600 nm); 및 (d) 공여체 여기 파장에서 여기에 의해 생성된 라만수 형광 방출보다 더 높은 파장으로 방출 이동을 위해 선택된다. 예를 들어, 레이저 라인(예를 들어, 헬륨-카드뮴 442nm 또는 아르곤 488nm) 근처에서 최대 여기를 갖는 공여체 형광 모이어티, 높은 흡광 계수, 높은 양자 수율 및 그 형광 방출과 상응하는 수용체 형광 모이어티의 여기 스펙트럼의 우수한 중첩을 갖는 공여체 형광 모이어티를 선택할 수 있다. 높은 흡광 계수, 높은 양자 수율, 공여체 형광 모이어티의 방출과 그 여기의 우수한 중첩 및 가시 스펙트럼(>600 nm)의 빨간색 부분에서 방출을 갖는 상응하는 수용체 형광 모이어티를 선택할 수 있다.
FRET 기술에서 다양한 수용체 형광 모이어티와 함께 사용할 수 있는 대표적인 공여체 형광 모이어티에는 플루오레세인, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), B-피코에리트린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 옐로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아네이토스틸벤-2,2'-다이설포닉 애시드, 7-디에틸아미노-3-(4'-이소티오시아네이토페닐)-4-메틸쿠마린, 숙신이미딜 1-피렌부티레이트, 및 4-아세트아미도-4'-이소티오시아네이토스틸벤-2,2'-다이설포닉 애시드 유도체가 포함된다. 대표적인 수용체 형광 모이어티는, 사용된 공여체 형광 모이어티에 따라, LC Red 640, LC Red 705, Cy5, Cy5.5, Lissamine 로다민 B 설포닐 클로라이드, 테트라메틸 로다민 이소티오시아네이트, 로다민 x 이소티오시아네이트, 에리트로신 이소티오시아네이트, 플루오레세인, 디에틸렌트리아민 펜타아세테이트 또는 란탄족 이온의 기타 킬레이트(예를 들어, 유로퓸 또는 테르븀)가 포함된다. 공여체 및 수용체 형광 모이어티는, 예를 들어, Molecular Probes사 (Junction City, Oreg.) 또는 Sigma Chemical Co.사 (St. Louis, Mo.)로부터 수득될 수 있다.
공여체 및 수용체 형광 모이어티는 링커 암(linker arm)을 통해 적절한 프로브 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 링커 암이 공여체와 수용체 형광 모이어티 사이의 거리에 영향을 미치기 때문에 각 링커 암의 길이가 중요하다. 링커 암의 길이는 뉴클레오타이드 염기로부터 형광 모이어티까지의 거리(옹스트롬(Å))일 수 있다. 일반적으로 링커 암은 약 10Å 내지 약 25Å이다. 링커 암은 WO 84/03285에 기재된 종류일 수 있다. WO 84/03285는 또한 링커 암을 특정 뉴클레오타이드 염기에 부착하는 방법, 및 또한 형광 모이어티를 링커 암에 부착하는 방법을 개시한다.
LC Red 640과 같은 수용체 형광 모이어티는 아미노 링커(예를 들어, ABI(Foster City, CA) 또는 Glen Research(Sterling, VA)에서 구입가능한 C6-아미노 포스포르아미다이트)를 함유하는 올리고뉴클레오타이드와 결합되어, 예를 들어, LC Red 640-표지된 올리고뉴클레오타이드를 생산할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드에 플루오레세인과 같은 공여체 형광 모이어티을 커플링하기 위해 자주 사용되는 링커에는 티오우레아 링커 (Glen Research 또는 ChemGene사 (Ashland, Mass.)의 FITC-유래, 예를 들어, 플루오레세인-CPG), 아미드-링커 (BioGenex (San Ramon, Calif.)의 플루오레세인-NHS-에스터-유래, 예를 들어, CX-플루오레세인-CPG), 또는 올리고뉴클레오타이드 합성 후 플루오레세인-NHS-에스터의 커플링을 필요로 하는 3'-아미노-CPG가 포함된다.
증폭 생성물의 검출
본 발명은 생물학적 또는 비생물학적 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 제공된 방법은 샘플 오염, 거짓 음성 및 거짓 양성 문제를 방지한다. 이 방법은 역전사 단계 및 SARS-CoV-2 프라이머의 하나 이상의 쌍을 사용하여 샘플로부터 SARS-CoV-2 표적 핵산 분자의 일부를 증폭하는 것을 포함하는 적어도 한 번의 사이클링 단계, 및 FRET 검출 단계를 수행하는 것을 포함한다. 여러 번의 사이클링 단계는 바람직하게는 써모사이클러(thermocycler)에서 수행된다. SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브를 사용하여 이러한 방법을 수행하여 SARS-CoV-2의 존재를 검출할 수 있으며, SARS-CoV-2의 검출은 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타낸다.
본원에 기재된 바와 같이, 증폭 생성물은 FRET 기술을 이용하는 표지된 혼성화 프로브를 사용하여 검출될 수 있다. 한 FRET 형식은 TaqMan®기술을 활용하여 증폭 생성물의 존재 또는 부재, 그리하여, SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출한다. TaqMan®기술은 예를 들어 하나의 형광 염료(예를 들어, HEX)와 하나의 소광제(예를 들어, BHQ)로 표지된 하나의 단일 가닥 혼성화 프로브를 활용하며, 이는 형광이거나 그렇지 않을 수 있다. 첫 번째 형광 모이어티가 적절한 파장의 빛으로 여기되면 흡수된 에너지는 FRET의 원리에 따라 두 번째 형광 모이어티 또는 암 소광제로 전달된다. 두 번째 모이어티는 일반적으로 소광제 분자이다. PCR 반응의 어닐링 단계 동안, 표지된 혼성화 프로브는 표적 DNA(즉, 증폭 생성물)에 결합하고 후속 신장 단계 동안 예를 들어, Taq 폴리머라제의 5'에서 3'으로의 뉴클레아제 활성에 의해 분해된다. 그 결과, 형광 모이어티와 소광제 모이어티가 서로 공간적으로 분리된다. 결과적으로, 소광제의 부재 하에 첫 번째 형광 모이어티의 여기시, 첫 번째 형광 모이어티로부터의 형광 방출이 검출될 수 있다. 예를 들어, ABI PRISM®7700 서열 검출 시스템(Applied Biosystems)은 TaqMan®기술을 사용하고 샘플에서 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 검출하기 위해 본원에 설명된 방법을 수행하는 데 적합하다.
실시간 PCR 방법을 사용하여 증폭 생성물의 존재를 검출하기 위해 분자 비콘을 FRET와 함께 사용할 수도 있다. 분자 비콘 기술은 첫 번째 형광 모이어티와 두 번째 형광 모이어티로 표지된 혼성화 프로브를 사용한다. 두 번째 형광 모이어티는 일반적으로 소광제이고 형광 표지는 일반적으로 프로브의 각 끝에 위치한다. 분자 비콘 기술은 2차 구조 형성(예를 들어, 헤어핀)을 허용하는 서열을 갖는 프로브 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. 프로브 내에서 2차 구조를 형성한 결과로서, 두 형광 모이어티는 프로브가 용액에 있을 때 공간적으로 근접해 있다. 표적 핵산(즉, 증폭 생성물)에 혼성화한 후, 프로브의 2차 구조가 파괴되고 형광 모이어티들이 서로 분리되어 적절한 파장의 빛으로 여기된 후 첫 번째 형광 모이어티의 방출이 검출될 수 있다.
FRET 기술의 또 다른 일반적인 형식은 두 개의 혼성화 프로브를 사용한다. 각 프로브는 다른 형광 모이어티로 표지될 수 있으며 일반적으로 표적 DNA 분자(예를 들어, 증폭 생성물)에서 서로 매우 근접하게 혼성화하도록 설계된다. 공여체 형광 모이어티, 예를 들어, 플루오레세인은, LightCycler®기기의 광원에 의해 470 nm에서 여기된다. FRET 동안, 플루오레세인은 에너지를 LightCycler®640(LC Red 640) 또는 LightCycler®705(LC Red 705)와 같은 수용체 형광 모이어티로 전달한다. 그러면 수용체 형광 모이어티가 더 긴 파장의 빛을 방출하며, 이는 LightCycler®기기의 광학 검출 시스템에 의해 검출된다. 효율적인 FRET는 형광 모이어티가 직접적으로 국부적으로 근접할 때 그리고 공여체 형광 모이어티의 방출 스펙트럼이 수용체 형광 모이어티의 흡수 스펙트럼과 중첩될 때에만 발생할 수 있다. 방출된 신호의 강도는 최초 표적 DNA 분자의 수(예를 들어, SARS-CoV-2 게놈의 수)와 상관관계가 있을 수 있다. SARS-CoV-2 표적 핵산의 증폭이 발생하고 증폭 생성물이 생성되는 경우, 혼성화 단계는 프로브 쌍의 구성원 간의 FRET에 기초한 검출가능한 신호를 생성한다.
일반적으로 FRET의 존재는 샘플에 SARS-CoV-2가 있음을 나타내고, FRET가 없으면 샘플에 SARS-CoV-2가 없음을 나타낸다. 그러나 부적절한 표본 수집, 운송 지연, 부적절한 운송 조건 또는 특정 수집 면봉(알긴산칼슘 또는 알루미늄 샤프트)의 사용은 모두 테스트 결과의 성공 및/또는 정확성에 영향을 줄 수 있는 조건이다.
이러한 방법들을 실시하는 데 사용될 수 있는 대표적인 생물학적 샘플에는 호흡기 표본(비인두 및 구인두 면봉), 소변, 대변 표본, 혈액 표본, 혈장, 피부 면봉, 상처 면봉, 혈액 배양, 피부 및 연 조직 감염이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 생물학적 샘플의 수집 및 저장 방법은 당업자에게 알려져 있다. 생물학적 샘플은 (예를 들어, 당업계에 알려진 핵산 추출 방법 및/또는 키트에 의해) 처리되어 SARS-CoV-2 핵산을 방출할 수 있고, 또는 일부 경우에 생물학적 샘플은 PCR 반응 성분 및 적절한 올리고뉴클레오타이드와 직접 접촉될 수 있다.
용융 곡선 분석은 사이클링 프로파일에 포함될 수 있는 추가 단계이다. 용융 곡선 분석은 DNA 이중체의 절반이 단일 가닥으로 분리되는 온도로 정의되는 용융 온도(Tm)라는 특징적 온도에서 DNA가 녹는다는 사실을 기반으로 한다. DNA의 용융 온도는 주로 뉴클레오타이드 조성에 따라 달라진다. 따라서 G 및 C 뉴클레오타이드가 풍부한 DNA 분자는 A 및 T 뉴클레오타이드가 풍부한 DNA 분자보다 Tm이 더 높다. 신호가 사라지는 온도를 감지하여 프로브의 용융 온도를 결정할 수 있다. 마찬가지로 신호가 생성되는 온도를 검출하여 프로브의 어닐링 온도를 결정할 수 있다. SARS-CoV-2 증폭 생성물의 SARS-CoV-2 프로브의 용융 온도(들)는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 확인시켜 줄 수 있다.
각 써모사이클러 실험 안에서 대조군 샘플도 사이클링될 수 있다. 양성 대조군 샘플은 예를 들어 대조군 프라이머 및 대조군 프로브를 사용하여 표적 핵산 대조군 템플릿 (설명된 표적 유전자의 증폭 생성물 제외)을 증폭할 수 있다. 양성 대조군 샘플은 또한 예를 들어 표적 핵산 분자를 함유하는 플라스미드 구조체를 증폭할 수 있다. 이러한 플라스미드 대조군은 의도한 표적의 검출에 사용된 것과 동일한 프라이머 및 프로브를 사용하여 환자의 샘플과 동시에 실험되는 별도의 샘플에서 또는 내부적으로(예를 들어, 샘플 내부에서) 증폭될 수 있다. 이러한 대조군은 증폭, 혼성화 및/또는 FRET 반응의 성공 또는 실패를 나타내는 지표이다. 각 써모사이클러 실험에는 예를 들어, 표적 템플릿 DNA가 없는 음성 대조군도 포함될 수 있다. 음성 대조군은 오염을 측정할 수 있다. 이렇게 하면 시스템과 시약들이 거짓 양성 신호를 발생시키지 않을 것이다. 따라서 제어 반응은 예를 들어, 서열 특이성에 따라 어닐링하여 신장을 개시하는 프라이머의 능력, 뿐만 아니라 서열 특이성에 따라 혼성화하고 FRET를 발생시키는 프로브의 능력을 쉽게 결정할 수 있다.
한 실시형태에서, 이들 방법은 오염을 피하기 위한 단계들을 포함한다. 예를 들어, 써모사이클러 실행과 다음 실행 사이의 오염을 줄이거나 제거하기 위한 우라실-DNA 글리코실라제를 사용하는 효소적 방법이 미국 특허 제 5,035,996, 5,683,896 및 5,945,313에 설명되어 있다.
기존의 PCR 방법을 FRET 기술과 함께 사용하여 이들 방법을 실행할 수 있다. 한 실시형태에서, LightCycler®기기가 사용된다. 다음 특허 출원들은 LightCycler®기술에서 사용되는 실시간 PCR을 설명한다: WO 97/46707, WO 97/46714, and WO 97/46712.
LightCycler®는 PC 워크스테이션을 사용하여 작동할 수 있으며 Windows NT 운영 체제를 사용할 수 있다. 기계가 광학 장치 위에 모세관을 순차적으로 배치할 때 샘플들의 신호가 수득된다. 소프트웨어는 각 측정 직후 실시간으로 형광 신호를 표시할 수 있다. 형광 획득 시간은 10-100밀리초(msec)이다. 각 사이클링 단계 후 형광 대 사이클 수의 정량적 표시는 모든 샘플에 대해 지속적으로 업데이트될 수 있다. 생성된 데이터는 추가 분석을 위해 저장될 수 있다.
FRET의 대안으로, 형광 DNA 결합 염료(예를 들어, SYBR®Green 또는 SYBR®Gold(Molecular Probes))와 같은 이중 가닥 DNA 결합 염료를 사용하여 증폭 생성물을 검출할 수 있다. 이중 가닥 핵산과의 상호작용 시, 이러한 형광 DNA 결합 염료는 적절한 파장의 빛으로 여기된 후 형광 신호를 방출한다. 핵산 삽입 염료와 같은 이중 가닥 DNA 결합 염료도 사용할 수 있다. 이중 가닥 DNA 결합 염료를 사용하는 경우 증폭 생성물의 존재를 확인하기 위해 일반적으로 용융 곡선 분석이 수행된다.
당업자는 다른 핵산- 또는 신호-증폭 방법 또한 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 방법의 예에는, 제한 없이, 분지형 DNA 신호 증폭, 고리 매개 등온 증폭(LAMP), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 자기 부양 염기서열 복제(3SR), 가닥 이탈 증폭(SDA) 또는 스마트 증폭 프로세스 버전 2(SMAP 2)가 포함된다.
본 발명의 실시형태들은 하나 이상의 시중에서 구입가능한 기기들의 구성에 의해 제한되지 않는 것으로 이해된다.
제조 물품/키트
본 발명의 실시형태들은 SARS-CoV-2를 검출하기 위한 제조 물품 또는 키트를 추가로 제공한다. 제조 물품에는 SARS-CoV-2 유전자 표적을 검출하는 데 사용되는 프라이머 및 프로브가 적절한 포장재와 함께 포함될 수 있다. SARS-CoV-2 검출을 위한 대표적인 프라이머 및 프로브는 SARS-CoV-2 표적 핵산 분자에 혼성화할 수 있다. 또한, 키트에는 고체 지지체, 완충액, 효소 및 DNA 표준과 같은 DNA 고정화, 혼성화 및 검출에 필요한 적절하게 포장된 시약 및 물질이 포함될 수 있다. 프라이머 및 프로브의 설계 방법이 본원에 개시되어 있으며, SARS-CoV-2 표적 핵산 분자를 증폭 및 혼성화하는 프라이머 및 프로브의 대표적인 예가 제공된다.
제조 물품은 또한 프로브를 표지하기 위한 하나 이상의 형광 모이어티를 포함할 수 있거나, 대안적으로 키트에 제공된 프로브는 표지될 수 있다. 예를 들어, 제조 물품은 SARS-CoV-2 프로브를 표지하기 위한 공여체 및/또는 수용체 형광 모이어티를 포함할 수 있다. 적합한 FRET 공여체 형광 모이어티 및 상응하는 수용체 형광 모이어티의 예가 상기 제공되어 있다.
제조 물품은 또한 샘플 내 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브를 사용하는 것에 관한 지침이 있는 사용 설명서 또는 포장 라벨을 포함할 수 있다. 제조 물품은 본원에 개시된 방법을 수행하기 위한 시약들(예를 들어, 완충액, 폴리머라제 효소, 보조 인자 또는 오염을 방지하기 위한 제제)을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 시약들은 본원에 설명된 상업적으로 이용 가능한 기기 중 하나에 대해 특이적일 수 있다.
본 발명의 실시형태들은 다음의 실시예에서 보다 상세히 설명될 것이며, 이러한 실시예는 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예
다음의 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그 진정한 범위는 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 사상에서 벗어나지 않고 제시된 절차에서 수정이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: SARS-CoV-2 분석 설명
실시간 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR) 테스트는 cobas® 6800/8800 시스템에서 개발된 것으로서, CDC 임상 기준을 충족하는 환자의 비인두(NSP) 및 구인두 면봉 샘플에서 SARS-CoV-2의 핵산을 정성적으로 검출할 수 있다. 본 분석은 다음을 검출한다: (i) 한 채널에서 SARS-CoV-2 게놈에 있는 비-구조적 오픈 리딩 프레임 (ORF1a/b)의 특이적 핵산 서열들 및 (ii) 다른 채널에서 SARS-CoV-2를 비롯한 모든 사르베코바이러스들에 공통적인 구조적 외피 (E) 유전자 위치에서 보존된 서열들. 결과는 감염의 급성기 동안 비인두 및 구인두 면봉 샘플에서 검출 가능한 SARS-CoV-2 RNA의 특이적 검출에 대한 것이다.
환자 샘플의 핵산과 추가된 RNA-내부 대조군 분자(기존 RNA QS 시약과 동일)를 동시에 추출한다. 샘플에 단백분해효소(proteinase) 및 용해 시약을 첨가하여 바이러스 핵산을 방출시킨다. 방출된 핵산은 첨가된 자성유리 입자들의 실리카 표면에 결합한다. 결합되지 않은 물질 및 불순물, 예를 들어, 변성된 단백질, 세포 파편 및 잠재적인 PCR 억제제는 후속 세척 시약 단계에서 제거되고 정제된 핵산은 상승된 온도에서 용리 완충액을 사용하여 자성 유리 입자로부터 용리된다.
실시예 2: SARS CoV-2 분석 설계 전략
진단 테스트는 코로나바이러스 과, 베타코로나바이러스 속 및 사르베코바이러스 아속으로 분류되는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 검출을 위해 설계되었다 (Lu et al, Lancet, 2020, (20) 30251-8). 이 코로나바이러스는 신종이며 어떤 영역이 변이 또는 재조합의 대상이 되는지는 알려져 있지 않다. 이 바이러스에 대한 지식이 초기임을 감안할 때, FAM 채널에서 SARS-CoV-2 그리고 HEX 채널에서 SARS-CoV-2를 포함하는 사르베코바이러스 아속 계열의 핵산 서열들의 특이적인 검출을 위해 단일 분석물 이중 표적 분석이 설계되었다. SARS-CoV-2는 게놈이 유사한 SARS-CoV와 밀접한 관련이 있다.
서열들은 NCBI 및 전 세계 조류인플루엔자 데이터 공유 이니셔티브 (GISAID) 데이터베이스로부터 다운로드되었다. GISAID 데이터베이스에서 7개의 서열들을 다운로드했다.
사르베코바이러스 아속의 서열들 (분류 ID 2509511)은 NCBI 데이터베이스에서 다운로드되었다. >200개 염기 길이의 1,094개 서열들이 존재하였다. 이 때 NCBI는 SARS-CoV-2를 '우한 수산시장 폐렴 바이러스'로 분류했으며, 할당된 분류 ID는 없었다. SARS-CoV-2에 대한 포괄 그룹을 생성하기 위해 이러한 사르베코바이러스 서열을 검사하여 바이러스들을 식별하고 "우한 해산물 시장 폐렴 바이러스"로 표지하였다. 7개의 서열을 사용할 수 있었고 이들을 사용하여 중첩되지 않는 6개 영역에서 7개의 표적 영역을 식별하였다. 다른 사르베코바이러스와 비교한 다음 SARS-CoV-2에 고유한 ORF1a 비구조적 영역의 영역들을 선택하여 해당 영역의 보존된 특성을 평가했다. 범-사르베코바이러스(pan-Sarbecovirus) 검출을 위해, 구조 단백질 외피 E-유전자의 보존된 영역과 보존된 ORF1a/b 영역이 선택되었다. 범-사르베코바이러스 검출 세트는 신종 SARS-CoV-2 바이러스도 검출할 수 있다. 이러한 신종 바이러스의 서열 이용가능성 제한 및 시간 경과에 따른 제한된 안정성으로 인해 이러한 이중 표적 설계 전략이 단일 표적을 대체하였다. RNA 내부 대조군의 선택적 증폭은 코로나바이러스 게놈과 상동성이 없는 비경쟁적 서열 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 달성되었다. 열안정성 DNA 폴리머라제 효소를 증폭에 사용하였다.
NCBI 및 GISAID 데이터베이스를 모니터링하여 새로 이용가능한 서열들을 다운로드하고, 분류 ID, 국가 및 샘플 수집 및 사용 가능한 경우 시퀀스 기탁 일자를 캡처하였다. 이 서열은 중국, 미국, 영국, 호주, 일본, 이탈리아, 독일, 핀란드, 프랑스, 네팔, 대만, 싱가포르 및 한국에서 수집되었다. 두 데이터베이스 사이에는 175개의 서열들이 존재했으며, SARS-CoV-2 분석 표적 영역들에서 1개를 제외한 모든 바이러스 서열들에 대한 서열들은 동일했다. MT039890은 프로브 혼성화 부위의 3'-말단 근처에 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)을 가지고 있으며, 이는 분석 성능에 영향을 미치지 않아야 한다.
실시예 3: SARS-CoV-2 프라이머 및 프로브 올리고뉴클레오타이드 선택
코로나바이러스 유형 SARS-CoV-2, 사르베코바이러스 아속 구성원 및 RNA 내부 대조군 핵산 각각에 대해 특이적인 검출 프로브를 포함하는 마스터 믹스가 제공되었다. 코로나바이러스 및 RNA 내부 대조군 검출 프로브는 각각 고유한 형광 염료로 표지되어 리포터로 작용한다. 각 프로브에는 소광제 역할을 하는 두 번째 염료도 포함되어 있다. 관심 영역을 증폭하기 위한 PCR 프라이머는 관심 영역에서 SNPS가 보고되지 않게 하기 위하여 설계되었다. 따라서 높은 수준의 견고성을 제공하기 위해 다음을 사용하여, SARS-CoV-2를 검출하는 단일 웰 분석 설계로 연구들을 시작하였다: (i) 한 채널 (FAM)에서 SARS-CoV-2의 게놈 내 비-구조적 오픈 리딩 프레임 (ORF1a/b)의 특이적 핵산 서열 (nCoV1 분석) 및 (ii) 상이한 채널 (HEX)에서 2개의 범-사르베코바이러스 분석 (pan-1 및/또는 pan-2)을 사용한 SARS-CoV-2를 포함하는 모든 다른 사르베코바이러스들에 공통적인 구조적 외피 (E) 유전자 위치 및 ORF-1에서의 보존 서열들. SARS-CoV 게놈 상의 앰플리콘 표적의 위치와 비교한 SARS-CoV-2 게놈 상의 앰플리콘 표적의 상대적인 위치는 도 1에 도시되어 있다. 성능에 대한 초기 분석을 스크리닝하기 위해 공정 제어의 검출에 사용되는 GIC 올리고뉴클레오타이드와 다중화될 수 있는 SARS-CoV-2 분석의 생물정보학 분석을 수행하였다. 프라이머와 프로브의 선택 조합 세트를 표 5에 나타낸다.
표 5: 분석 및 스크리닝된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00005
실시예 4: PCR 분석 시약 및 조건
SARS-CoV-2의 실시간 PCR 검출은 cobas® 6800/8800 시스템 플랫폼(Roche Molecular Systems, Inc., Pleasanton, CA)을 사용하여 수행되었다. 증폭 시약의 최종 농도를 아래에 나타낸다:
표 6: PCR 증폭 시약
Figure pct00006
다음 표는 PCR 증폭 반응에 사용되는 일반적인 열 프로파일을 보여준다:
표 7: PCR 열프로파일
Figure pct00007
예비-PCR 프로그램은 RNA 템플릿의 역전사를 위해 초기 변성 및 55°C, 60°C 및 65°C에서의 인큐베이션으로 구성되었다. 3가지 온도에서 인큐베이션하면, 낮은 온도에서는 약간 미스매치되는 표적 서열(예를 들어, 유기체의 유전적 변이체)도 전사되는 반면 높은 온도에서는 RNA 2차 구조의 형성이 억제되어 보다 효율적인 전사를 유도하는 유리한 효과가 결합되게 된다. PCR 사이클링은 두 가지 측정으로 나뉘며 두 측정 모두 한-단계 설정(어닐링 및 연장 결합)을 적용한다. 55°C에서의 처음 5회 사이클은 약간 미스매치되는 표적 서열을 사전 증폭하여 포함성을 증가시키는 반면, 2차 측정의 45회 사이클은 58°C의 어닐링/연장 온도를 사용하여 증가된 특이성을 제공한다.
실시예 5: SARS-CoV-2 테스트의 성능 평가
SARS-CoV-2 테스트를 위한 구성 요소, 작업 흐름 및 분석 시약의 평가는 cobas® 6800 시약을 사용하여 수행되었다. 선형화된 재조합 플라스미드를 분석 올리고뉴클레오타이드로 테스트하여 성능을 평가했다. 합성 RNA를 사용한 분석의 성능을 평가하기 위해 시험관 내 전사체를 또한 생성하였다. 핵산 정량은 DNA 및 RNA 표준과 함께 Qubit을 사용하여 수행되었다. 플라스미드 DNA 및 전사체를 멀티프렙 표본 희석 완충액 (벌크 일반 표본 희석액으로도 공지)에 연속 희석시켜 분석 성능 연구에 사용하였다. 내부 대조군 올리고뉴클레오타이드(일반 내부 대조군, GIC)는 선형화된 DNA 및 RNA 전사체 둘 모두의 평가에 포함되었다. 실험은 cobas® 6800 일반 열사이클링 프로파일을 사용하여 cobas® 6800 필터에 장착 및 보정된 Roche LC480 사이클러에서 수행되었다. 응집된 면봉을 사용하여 상부 호흡기 증상을 나타내는 환자로부터 비인두(NSP) 샘플을 얻었으며 유니버셜 바이러스 수송용 배지(3mL)에 수집하였다. 수정된 샘플 준비 작업 흐름(Process and Elute, PnE)을 cobas® 6800 시스템에서 사용하였으며, 이때 300 또는 400 μL의 NSP 샘플이 처리되어 핵산 용출액이 준비되었다. 이러한 용출액에는 cobas® 6800에서의 동일한 NSP 샘플 준비 과정을 따르고 내부 샘플 처리 대조군으로 기능하는 gIC Armored RNA(QS RNA 대조군)가 포함되어 있다. 그런 다음 용출액을 LC480 및/또는 cobas® 6800 분석 사이클러에서 증폭 및 검출하는 SARS-CoV-2 분석 연구에 사용했다.
분석 올리고뉴클레오타이드를 단일체 분석에서 먼저 평가하였다. PCR 반응 당 1.0E+8 사본 (cp)으로부터 1.0E+01 cp까지의 표적 서열을 갖는 선형화 재조합 플라스미드를 이용한 nCoV1 단일체 분석 (서열 번호: 1, 7, 21)의 성능을 성장 곡선 및 평균 CT (n=3 반복)으로 나타내어 표 2에 도시한다. nCov1 분석은 PCR 반응당 10개 이하의 표적 서열 사본을 검출하여 우수한 민감도를 나타냈다. 상기 분석을 또한 시험관내 전사체로 평가하였고 데이터를 도 3에 나타낸다. 여기에서, 상기 분석은 합성 RNA 전사체를 사용한 PCR 효율 및 허용가능한 동적 범위를 갖는 gIC 분석 유무에 관계없이 PCR 반응당 100개 이하의 표적 전사체 사본을 검출하여 우수한 민감도를 나타냈다. 다음으로 선형화된 플라스미드 DNA 및 전사체를 사용하여 범-사르베코-2 분석(서열 번호: 6, 18, 26)을 평가하여 분석의 민감도를 결정하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
이어서 nCoV1 분석의 프라이머 및 프로브 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 1, 7, 21), Pan-1 분석의 프라이머 및 프로브 올리고뉴클레오타이드(서열 번호: 5, 15, 25)를 단일 반응으로 테스트하는 다중 PCR 분석을 수행하였다. SARS-CoV-2 및 사르베코바이러스 표적 영역(즉, 각각 ORF 1a/b 및 외피 유전자)을 포함하는 재조합 플라스미드를 사용하여 시험관내 전사체(250 및 261개 염기)를 생성했다. RNA는 분석에 제공된 RNA 표준을 사용하여 Qubit 형광측정기에서 정량화되었다. 넓은 동적 범위를 다루기 위해 전사체 스톡의 연속 희석액을 담체 RNA를 내포하는 표본 희석액 (SD=트리스 완충액) 내 1e8 내지 1e1개 사본(cp)/PCR의 10배 농도 수준으로 준비하고 10회 반복으로 테스트하였다. PCR은 cobas® 6800/8800 필터가 장착된 LightCycler®480(LC480) 써모사이클러에서 증폭 및 검출이 가능한 테스트 프라이머 및 프로브가 추가된 일반 cobas® 6800/8800 마스터믹스를 사용하여 수동으로 설정되었다. 성장 곡선 및 Ct 도표를 도 5에 도시하며, 이 도표에는 합성 시험관내 전사체들을 사용하여 테스트된 수준들 전반에 걸쳐 2개의 표적들에 대한 동적 범위가 플롯되어 있다.
이 데이터는 넓은 동적 범위 전반에 걸쳐 우수한 성장 곡선 및 PCR 효율을 나타내는데, 두 표적 모두에서 전사체들은 PCR 반응 당 10개 이하의 사본들을 검출하였다. 초기 검출 한계(LOD) 연구 데이터가 도 6에 요약되어 있으며, 이는 표본 희석액 샘플에서 10개 이하의 사본/PCR 반응의 수준에서 100% 히트율을 보여준다.
실시예 6: 환자 샘플 단리물을 사용한 SARS-CoV-2 테스트의 분석 성능
전체 게놈 바이러스 RNA는 BEI SARS-CoV-2 단리물 USA-WA1/2020(2.8E+5 TCID50/mL)로부터 Qiagen 바이러스 샘플 준비 프로토콜을 사용하여 단리되었다. 용출액에서 100% 게놈 RNA 회수를 가정하고, 2.8E+5 TCID50/mL로부터 2.80E-02 TCID50/mL까지 연속 10배 희석액 (7개 수준)을 준비하였다. 5 μL의 정제된 RNA를 20 μL의 다음과 같은 2개 매트릭스 중 하나에 스파이킹하여 최종 희석액을 제조하였다(~5.6e+3, 5.6e+2, 5.6e+1, 5.6e+0, 5.6e-1, 5.6e-2, 5.6e-3 TCID50/mL): a) 하위 수준에서 10회 반복 및 상위 3개 수준에서 3회 반복한 cobas® 표본 희석 완충액/트리스 완충액 (SD), 및 b) 상기도 감염 증상이 있는 대상체의 임상 비인두 면봉 표본, (NSP) 비인두 면봉 표본 용출액(NSP)으로부터 2회 반복으로 준비된 cobas® 6800/8800 시스템 용출액. cobas® SD의 RNA 전사체들은 대조군으로 포함되었다.
nCov1 분석(서열 번호: 1, 7, 21)와 범-사르베코바이러스-1 분석(서열 번호: 5, 15, 25)의 프라이머/프로브 세트를 이용하여 환자 샘플로부터 단리된 게놈 RNA에 대해 다중 PCR 테스트를 수행하고 SD 및 NSP 매트릭스에서 생성된 성장 곡선을 각각 도 7 및 도 8에 도시한다. 이 실험에서 결정된 Ct 값을 표 8에 요약한다.
표 8: 인공 샘플의 게놈 바이러스 RNA 테스트 데이터 요약
Figure pct00008
# 증폭 관찰되지 않음
NSP = 비인두 면봉 표본 용출액 및 SD = 표본 희석액
표본 희석액에서 SARS-CoV-2 단리물 USA-WA1/2020 게놈 RNA를 테스트한 결과 SARS-CoV-2 테스트는 5.6E-03 TCID50 당량 입력값(100% 추출 효율 가정)까지 검출할 수 있었다. 게놈 RNA 데이터를 합성 전사체 사본 수 데이터와 비교하면 이는 ~10개 사본의 표적 템플릿 검출에 해당하는 것으로 해석된다. 또한, 이러한 결과는 SARS-CoV-2 테스트가 비인두 매트릭스(인공 NSP 시스템)에서 단리물 USA-WA1/2020 게놈 RNA를 검출할 수 있음을 입증했다.
실시예 7: SARS-CoV-2 테스트의 배타성/교차 반응성 연구
SARS-CoV-2 테스트는 MERS와 4개의 코로나바이러스(229E, OC43, HKU1, NL63)를 포함한 다른 호흡기 바이러스에 대한 배타성/교차 반응성에 대해 평가되었다. 평가된 모든 바이러스 핵산 용출액의 목록을 표 9에 나타낸다. SARS-CoV-2와의 상호작용은 관찰되지 않았으며, 이는 이 테스트의 특이성을 입증한다.
표 9: 배타성 연구에서 테스트한 유기체 목록
Figure pct00009
실시예 8: SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A/B 분석 설명
SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A/B 테스트는 다음 4개의 상이한 채널들을 사용하여 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스 RNA 게놈 서열들을 검출하는 다중 단일 웰 분석이다: SARS-CoV-2는 (i) 한 채널에서 SARS-CoV-2의 게놈 내 비-구조적 오픈 리딩 프레임 (ORF1a/b)으로부터의 특이적 핵산 서열 및 (ii) 제2 채널에서 SARS-CoV-2를 포함하는 모든 사르베코바이러스들에 공통인 구조적 외피 (E) 유전자 위치에서 보존된 서열을 이중 표적하고; 제3 채널은 인플루엔자 A 세그먼트 7 매트릭스 단백질 2 (M2) 및 매트릭스 단백질 1 (M1) 서열들을 검출하고, 그리고 인플루엔자 B 세그먼트 8 핵 방출 단백질 (NEP) 및 비구조적 단백질 1 (NS1) 서열은 제4 채널에서 검출된다. 결과는 SARS-CoV-2의 특이적 검출에 대한 것이며, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스 RNA 게놈 서열들은 감염의 급성기 동안 비인두 및 구인두 면봉 샘플에서 검출가능하다.
SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 테스트는 cobas® 6800/8800 시스템 에서 실행될 수 있는데, 이는 샘플 준비 (핵산 추출 및 정제) 후 PCR 증폭 및 검출을 위해 다양한 진단 테스트에서 사용하도록 FDA 승인/허가를 받은 완전 자동화 시스템이다. 샘플에서 표적 핵산의 선택적 증폭은 표적 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 달성된다. 마스터 믹스에는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B에 특이적인 프로브, 및 RNA 내부 대조군 핵산이 포함되어 있다. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 RNA 내부 대조군 검출 프로브는 리포터로서 작용하는 독특한 형광 염료로 각각 표지된다. RNA 내부 대조군의 증폭은 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및 인플루엔자 B 게놈과 상동성이 없는 비경쟁적 서열 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 달성된다. 열안정성 DNA 폴리머라제 효소가 증폭에 사용된다. 각 프로브에는 소광제 역할을 하는 두 번째 염료도 있다. 작업흐름은 시판 cobas® 일반 시약 (MGP 카세트, 용해 완충액, 표본 희석액, 세척 완충액)과 기존 단백분해효소, 용리 완충액, MMX R1 (보고인자) 및 내부 대조군이 있는 기존 시약 카세트를 함께 사용하여, 전술한 새로이 개발된 시약들과 함께 사용될 예정이다. 환자 샘플의 핵산과 추가된 RNA-내부 대조군 분자(기존 RNA QS 시약과 동일)를 동시에 추출한다. 외부 대조군(양성 및 음성)은 각 SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 실험과 동일한 방식으로 처리된다.
실시예 9: SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A/B 분석 설계 전략
진단 테스트는 2019 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2), 인플루엔자 A, 인플루엔자 B의 검출 및 판별을 위해 설계되었다. SARS-CoV-2 분석의 경우 한 채널(FAM)의 SARS-CoV-2와 다른 채널(HEX)의 SARS-CoV-2도 포함하는 사르베코바이러스 아속 계열의 검출을 위한 이중 표적 분석이 설계되었다. 또한, 분석은 제3 채널(COU)에서 인플루엔자 A 서열을 그리고 제4 채널(JA270)에서 인플루엔자 B 서열을 검출하도록 설계되었다. SARS-CoV-2 분석에는 6개의 올리고뉴클레오타이드가 있다: 각각 2개의 게놈 영역에 대해 1개의 역전사(RT) 프라이머, 각각 1개의 비-RT 프라이머 및 각각 FAM 및 HEX 형광단으로 표지된 1개의 프로브. 인플루엔자 A 분석은 RT 프라이머 1개, 비 RT 프라이머 1개, COU 형광단으로 표지된 프로브를 포함한다. 이것은 인플루엔자 A 세그먼트 7 매트릭스 단백질 2(M2) 및 매트릭스 단백질 1(M1) RNA 서열을 검출한다. B형 인플루엔자 분석은 B/야마가타(Yamagata) 및 B/빅토리아(Victoria)의 두 가지 인플루엔자 B 계통을 포함하여 모든 일반적인 인플루엔자 B 균주를 검출하기 위한 범-Flu B 분석으로도 설계되었다. 이 분석에는 RT 프라이머 1개, 비 RT 프라이머 1개 및 JA270 형광단으로 표지된 프로브가 포함된다. 이것은 인플루엔자 B 세그먼트 8 핵 방출 단백질 (NEP) 및 비구조 단백질 1(NS1) 서열을 검출한다.
실시예 10: SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A/B 분석 프라이머 및 프로브 선택
마스터 믹스에는 각각 고유한 형광단을 가진, 코로나바이러스 유형 SARS-CoV-2, 사르베코바이러스 아속 구성원들에 특이적인 검출 프로브, 및 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B에 대한 검출 프로브, 및 RNA 내부 대조군 핵산이 포함되어 있다. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 게놈 상의 앰플리콘 표적의 상대적 위치는 각각 도 9A, 9B 및 9C에 도시되어 있다. 프라이머 및 프로브의 선택 조합 세트는 표 10에 나타낸다.
표 10: 분석 및 스크리닝된 올리고뉴클레오타이드
Figure pct00010
실시예 10: SARS-CoV-2 & 인플루엔자 A/B 테스트의 성능 평가
SARS-CoV-2 및 인플루엔자 A/B 결합 테스트에 대한 구성요소들 (표 10에 표시된 프라이머 및 프로브의 선택 조합 포함), 작업흐름 및 분석 시약의 타당성 평가는 cobas® 6800 시약을 사용한 연구에 의한 실험 평가에 기반한다. 선형화된 재조합 플라스미드를 분석 올리고뉴클레오타이드로 테스트하여 성능을 평가했다. 합성 RNA를 사용한 분석의 성능을 평가하기 위해 시험관 내 전사체도 생성되었다. 핵산 정량은 DNA 및 RNA 표준과 함께 Qubit을 사용하여 수행되었다. 플라스미드 DNA와 전사체를 MultiPrep 표본 희석 완충액(MPSD, BGSD라고도 함)에 연속 희석하여 분석 성능 연구에 사용했다. 내부 대조군 올리고뉴클레오타이드(일반 내부 대조군, GIC)는 선형화된 DNA 및 RNA 전사체 둘 모두를 사용하는 평가에 포함되었다. 실험은 실시예 4에 설명된 cobas® 6800 일반 열사이클링 프로파일을 사용하여 cobas® 6800 필터에 장착 및 이를 이용하여 보정된 6800 필터 사이클러가 있는 Roche Z480에서 수행되었다.
비인두(NPS) 샘플을 응집된 면봉을 사용하여 상부 호흡기 증상을 나타내는 환자로부터 얻었으며 범용(Universal) 바이러스 수송 배지 (3 mL)에 수집하였다. 이들 샘플은 자체 개발한 PCR 분석으로 특성화되었으며 PCR 생성물의 MiSeq 시퀀싱에 의해 다음 바이러스가 제외된 것으로 나타났다: FluA, FluB, RSV, HMPV, AdV, EV/RV 및 HPIV1, HPIV2, HPIV3, HPIV4 및 인간 코로나바이러스 (229E, NL63, HKU1 및 OC43). 이 NPS 샘플들은 -70°C에서 냉동 보관하고 필요에 따라 해동하여 실험에 사용했다. 수정된 샘플 준비 작업흐름(Process and Elute, P&E)이 cobas® 6800 시스템에서 사용되었으며, 이때 300 또는 400μL의 NPS 샘플이 처리되어 핵산 용출액이 준비되었다. 이들 용출액에는 cobas® 6800 시스템에서와 동일한 NPS 샘플 준비 과정을 따르고 내부 샘플 처리 대조군으로 기능 하는 gIC Armored RNA(QS RNA 대조군)가 포함되어 있다. 그런 다음 용출액은 6800 필터 사이클러 및/또는 cobas® 6800 분석 사이클러가 있는 Z480에서 증폭 및 검출이 포함된 SARS-CoV-2 분석 연구에 사용되었다.
실시예 11: 클린 시스템에서 전사체를 사용한 선형성과 검출 한계
표 10에 나열된 프라이머와 프로브의 조합 세트를 사용하여 처음에 클린 시스템(BGSD)을 사용하여 각 표적 분석 영역에 해당하는 합성 전사체로 실험을 수행했다. 4개의 전사체를 높은 사본 수준에서 풀링하고 여러 희석 수준에서 6800에서 테스트했다 (낮은 수준에서 더 많은 반복). 도 10, 도 11, 도 12 및 표 11의 결과는 범-사르베코바이러스 및 FluB 분석에 대해 높은 입력 수준에서 우수한 재현성, 낮은 입력 수준에서 낮은 표준 편차 및 5 cp/PCR에서 각각 단 하나의 누락(dropout)을 보여준다. PCR의 넓은 동적 범위 (1E+9 내지 1E+1cp)에서 우수한 민감도가 입증되었다. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 표적들에 대해 우수한 선형성 및 106% 내지 112% 범위의 높은 PCR 효율이 관찰되었다.
표 11: 각 전사체에 대한 히트율 및 각 분석에 대한 표준 편차
Figure pct00011
실시예 12: 고안된 비인두 매트릭스에서 바이러스 배양을 사용한 선형성
시판 바이러스 배양물에서 얻은 3개의 게놈 RNA 용출액을 높은 사본 수준에서 풀링하고 cobas® 6800 시스템에서 여러 희석 수준(수준 당 n=2)으로 테스트했다. 표 12 및 도 13의 결과는 8개-로그 동적 범위 전체에 걸쳐 우수한 성능을 나타내며 모든 수준에서 우수한 검출가능한 신호를 생성한다. 각 바이러스 로트의 TCID50에 대한 액적 디지털 PCR 사본 수 추정치를 사용하여, PCR 1회 당 하한 검출 결과는 인플루엔자 A, SARS-CoV-2 및 인플루엔자 B에 대해 각각 < 2개 사본, < 10개 사본 및 < 30개 사본으로 계산된다.
표 12: 선형성 연구를 위한 바이러스 용출액 입력량
Figure pct00012
전술한 발명은 명료함과 이해를 위해 일부 상세하게 설명되었지만, 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있다는 것은 본원를 읽으면 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 설명한 모든 기술 및 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH Roche Molecular Systems, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTING SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS 2 (SARS-COV-2), INFLUENZA A AND INFLUENZA B <130> P35962-WO-HS <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-1F.A <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> t-butylbenzyl dA <400> 1 tgattgttac gatggtggct gta 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-2F <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> t-butylbenzyl dA <400> 2 ttcatccgga gttgttaatc cagta 25 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-3F.A <220> <221> modified_base <222> (20)..(20) <223> t-butylbenzyl dA <400> 3 cccatgcttc agtcagctga 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer SARBV-1F.A <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> t-butylbenzyl dA <400> 4 tcttgctttc gtggtattct tgcta 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer SARBV-1F2.A <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> t-butylbenzyl dA <400> 5 gaacttatgt actcattcgt ttcggaa 27 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer SARBV-2F.A <220> <221> modified_base <222> (19)..(19) <223> t-butylbenzyl dA <400> 6 ccgtctgcgg aatgtggaa 19 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-1R.A <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> t-butylbenzyl dA <400> 7 agtgcatctt gatcctcata actca 25 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-1R1.A <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> t-butylbenzyl dA <400> 8 gcatcttgat cctcataact cattgaatca 30 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-1R2.A <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> t-butylbenzyl dA <400> 9 actcattgaa tcataataaa gtctagcctt a 31 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-2R <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> t-butylbenzyl dA <400> 10 acgaatgagt acataagttc gtactca 27 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-2R1.A <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> t-butylbenzyl dA <400> 11 tctcttccga aacgaatgag taca 24 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-2R2.A <220> <221> modified_base <222> (23)..(23) <223> t-butylbenzyl dA <400> 12 cctgtctctt ccgaaacgaa tga 23 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-3R1.A <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> t-butylbenzyl dA <400> 13 gcaaaaccag ctactttatc attgtaga 28 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-3R2.A <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> t-butylbenzyl dA <400> 14 tcattgtaga tgtcaaaagc cctgtata 28 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-1R.A <220> <221> modified_base <222> (26)..(26) <223> t-butylbenzyl dA <400> 15 ctcacgttaa caatattgca gcagta 26 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-1R1.A <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> t-butylbenzyl dA <400> 16 aactcacgtt aacaatattg cagca 25 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-1R2.A <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> t-butylbenzyl dA <400> 17 ttttactaga ctcacgttaa caatattgca 30 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-2R.A <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> t-butylbenzyl dA <400> 18 acttacaccg caaacccgtt ta 22 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-2R1.A <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> t-butylbenzyl dA <400> 19 gtgccgcacg gtgtaaga 18 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer SARBV-2R2.A <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> t-butylbenzyl dA <400> 20 gtgtaagacg ggctgcactt a 21 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe WUHAN-4P <220> <221> misc_feature <223> 5` FAM <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> BHQ-2 Quencher <400> 21 tcatcgtcaa caacctagac aaatcagctg gttttc 36 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe NCOV-2P <220> <221> misc_feature <223> 5` FAM <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> BHQ-2 Quencher <400> 22 cgacgacgac tactagcgtg cctttgtaag c 31 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe NCOV-3P8Q <220> <221> misc_feature <223> 5` FAM <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> BHQ-2 Quencher <400> 23 cgtgcggcac aggcactagt actgatgtcg 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe SARBV-P1 <220> <221> misc_feature <223> 5` HEX <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> BHQ-2 Quencher <400> 24 agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe SARBV-P1_6Q.P <220> <221> misc_feature <223> 5` HEX-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Phosphate <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> BHQ-2 Quencher <400> 25 agccatcctt actgcgcttc gattgtgtgc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe SARBV-P2 <220> <221> misc_feature <223> 5` HEX-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> BHQ-2 Quencher <400> 26 atggctgtag ttgtgaccaa ctccgcgaac 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-1-FN1.A <220> <221> modified_base <222> (30)..(30) <223> t-butylbenzyl dA <400> 27 ctttgattgt tacgatggtg gctgtattaa 30 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-1-FN3.A <220> <221> modified_base <222> (28)..(28) <223> t-butylbenzyl dA <400> 28 tactttgatt gttacgatgg tggctgta 28 <210> 29 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-2-FN2.A <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> t-butylbenzyl dA <400> 29 tactttgatt gttacgatgg tggctgtatt a 31 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-4-FN4.A <220> <221> modified_base <222> (29)..(29) <223> t-butylbenzyl dA <400> 30 ttgttacgat ggtggctgta ttaatgcta 29 <210> 31 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-4-FN5.A <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> t-butylbenzyl dA <400> 31 gatggtggct gtattaatgc taaccaa 27 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe SARBV-P1-N2_6Q.C3 <220> <221> misc_feature <223> 5` HEX-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (7)..(8) <223> BHQ-2 Quencher <400> 32 atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgta 29 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer FLUAF M1 121 146 <220> <221> modified_base <222> (25)..(25) <223> t-butylbenzyl dA <400> 33 gctctcatgg aatggctaaa gacaa 25 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer FLUA_RP4_A <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> t-butylbenzyl dC <400> 34 tggacaaagc gtctacgc 18 <210> 35 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe FLUAP.H.C3_M1_212_181.6COU1.C <220> <221> misc_feature <223> 5` Coumarin <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> BHQ-2 Quencher <400> 35 cactgggcac ggtgagcgtg aacacaaatc c 31 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer FLUBF NS1.749 770 <220> <221> modified_base <222> (22)..(22) <223> t-butylbenzyl dA <400> 36 aagatggcca tcggatcctc aa 22 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer FLUBR_NS1.865_842 <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> t-butylbenzyl dA <400> 37 ggtgctcttg accaaattgg gata 24 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe FLUB_PRB2_11Q_JA270.C3 <220> <221> misc_feature <223> 5` JA270-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> BHQ-2 Quencher <400> 38 cattcaaagc caattcgagc agctgaaact gc 32 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-F.core <400> 39 ttgttacgat ggtggctgta 20 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer NCOV-N3-F3.A <220> <221> modified_base <222> (31)..(31) <223> t-butylbenzyl dC <400> 40 ttttacactt aaaaacacag tctgtaccgt c 31 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer NCOV-N3-R1.A <220> <221> modified_base <222> (27)..(27) <223> t-butylbenzyl dA <400> 41 aacccgttta aaaacgattg tgcatca 27 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe NCOV-4P-JA270-Q10.P <220> <221> misc_feature <223> 5` JA270-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (10)..(11) <223> BHQ-2 Quencher <400> 42 tcatcgtcaa caacctagac aaatcagctg gttttc 36 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe NCOV-N3-JA <220> <221> misc_feature <223> 5` JA270-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (12)..(13) <223> BHQ-2 Quencher <400> 43 tccgcgaacc catgcttcag tcagctgat 29 <210> 44 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe FLUAP.H.C3_M1_212_181.6 <220> <221> misc_feature <223> 5` HEX-Thr <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> BHQ-2 Quencher <400> 44 cactgggcac ggtgagcgtg aacacaaatc c 31 <210> 45 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe FLUB_THRBP2_K77 <220> <221> misc_feature <223> 5` BHQ-2 Quencher <220> <221> misc_feature <223> 3` Spacer-C3 Blocker <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> D-Locked Nucleic Acid <220> <221> misc_feature <222> (9)..(10) <223> DBCO-Thr <400> 45 cattcaaagc caattcgagc agctgaaact gc 32

Claims (37)

  1. 샘플 내 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)를 검출하는 방법으로서, 이 방법은 다음 단계들을 포함하고:
    - 핵산이 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 프라이머들의 세트와 샘플을 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 단계를 수행하는 단계;
    - 증폭 생성물을 하나 이상의 검출가능한 프로브와 접촉시키는 것을 포함하는 혼성화 단계를 수행하는 단계; 및
    - 증폭 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계, 이때 증폭 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재를 나타내고 증폭 생성물의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 부재를 나타내며;
    이때 프라이머들의 세트는 서열 번호: 1-6 및 27-31, 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머를 포함하고; 및
    하나 이상의 검출가능한 프로브의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 이때:
    혼성화 단계는 증폭 생성물을 공여체 형광 모이어티 및 상응하는 수용체 모이어티로 표지된 검출가능한 프로브와 접촉시키는 것을 포함하고; 그리고
    검출 단계는 상기 프로브의 공여체 형광 모이어티와 수용체 모이어티 사이의 형광 공명 에너지 전달 (FRET)의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하고, 이때 형광의 존재 또는 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2의 존재 또는 부재를 나타내는, 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 증폭 단계는 5'에서 3'로의 뉴클레아제 활성을 가지는 폴리머라제 효소를 이용하는, 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 비인두 샘플 또는 구인두 샘플로부터 선택된 생물학적 샘플인, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 다른 바이러스로부터 핵산을 동시에 검출하는 방법을 추가로 포함하고, 이때 하나 이상의 다른 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 박쥐-코로나바이러스, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS) 코로나바이러스(SARS-CoV) 및 중동 호흡기 증후군(MERS) 코로나바이러스(MERS-CoV), 코로나바이러스(229E, NL63, OC43, HKU1), 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 아데노바이러스(B,E,U,C), 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 인간 파라인플루엔자 바이러스(1, 2, 3, 4) 및 상기의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 1-3 및 27-31로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 서열 번호: 4-6, 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호: 15-20, 및 41, 또는 이의 상보체로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호: 24-26, 32 및 43으로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 검출가능한 프로브를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 증폭용 프라이머 세트는 복수의 제1 프라이머, 복수의 제2 프라이머, 및 복수의 검출가능한 프로브를 포함하고,
    이때 복수의 제1 프라이머는 서열 번호: 1 및 27로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머와 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 프라이머의 조합이고;
    이때 복수의 제2 프라이머는 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머와 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 프라이머의 조합이고; 그리고
    이때 복수의 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브 및 서열 번호: 25 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브의 조합인, 방법.
  10. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 방법.
  11. SARS-CoV-2의 핵산 검출을 위한 키트로서:
    - 서열 번호: 1-6 및 27-31, 및 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머;
    - 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머; 및
    - 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 검출가능하게 표지된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 상보체를 포함하고, 이때 검출가능하게 표지된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열은 제1 프라이머 및 제2 프라이머에 의해 생성된 앰플리콘에 혼성화하도록 구성되는, SARS-CoV-2의 핵산 검출을 위한 키트.
  12. 청구항 11에 있어서, 검출가능하게 표지된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열은 공여체 형광 모이어티 및 상응하는 수용체 모이어티를 포함하는, 키트.
  13. 청구항 11 및 12 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 비인두 샘플 또는 구인두 샘플로부터 선택된 생물학적 샘플인, 키트.
  14. 청구항 11 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오사이드 트라이포스페이트, 핵산 폴리머라제, 및 핵산 폴리머라제의 기능에 필요한 완충액을 추가로 포함하는 키트.
  15. 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 올리고뉴클레오타이드 서열 중 적어도 하나는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것인 키트.
  16. 청구항 11 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 1-3 및 27-31로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 키트.
  17. 청구항 16에 있어서, 서열 번호: 4-6, 및 40으로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머; 서열 번호: 15-20, 및 41로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머; 및 서열 번호: 24-26, 32 및 43으로 이루어진 군에서 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 검출가능한 프로브를 추가로 포함하는, 키트.
  18. 청구항 11 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군에서 선택되는 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 키트.
  19. 청구항 11 내지 15 중 어느 한 항에 있어서, 제1 프라이머는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하고; 제2 프라이머는 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하고; 검출가능한 프로브는 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는, 키트.
  20. 샘플 내 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2), 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 동시에 검출하는 방법으로서, 이 방법은:
    - SARS-CoV-2 및/또는 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B가 샘플에 존재하는 경우 하나 이상의 증폭 생성물을 생성하는, 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 및 제3 프라이머 세트와 샘플을 접촉시키는 단계; 이때 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는 경우 제1 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고, 샘플에 인플루엔자 A가 존재하는 경우 제2 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고, 샘플에 인플루엔자 B가 존재하는 경우 제3 프라이머 세트가 증폭 생성물을 생성하고;
    - 증폭 생성물(들)이 3개 이상의 검출가능한 프로브와 접촉되는 혼성화 단계를 수행하는 단계, 이때 3개 이상의 검출가능한 프로브는 제1, 제2, 및 제3 프라이머 세트 각각의 증폭 생성물들에 특이적인 적어도 하나의 프로브를 포함하고; 및 증폭된 생성물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하고, 이때 증폭된 생성물의 존재는 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 및/또는 인플루엔자 B의 존재를 나타내고, 증폭된 생성물의 부재는 샘플 내 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B의 부재를 나타내는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-6 및 27-31, 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머를 포함하고; 그리고 하나 이상의 검출가능한 프로브의 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3, 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23, 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1 또는 27의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고, 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21 또는 42의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  24. 청구항 20 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트는 서열 번호: 33의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 34의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 제3 프라이머 세트는 서열 번호: 36의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 37의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 이때 제2 검출가능한 프로브는 서열 번호: 35 또는 44의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 검출가능한 프로브는 서열 번호: 38 또는 45의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  25. 청구항 20 및 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트 및 제4 증폭 생성물에 특이적으로 혼성화하는 제4 검출가능한 프로브를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26, 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 25 또는 32의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  28. 청구항 20 및 22 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트; 그리고 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브를 추가로 포함하고, 이때 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 방법.
  29. 샘플 내 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 하나 이상의 핵산, 인플루엔자 A의 하나 이상의 핵산 및 인플루엔자 B의 하나 이상의 핵산을 동시에 검출하기 위한 키트로서, 이 키트는:
    a) 샘플에 SARS-CoV-2가 존재하는 경우 제1 증폭 생성물을 생성하는 제1 프라이머 세트, 샘플에 인플루엔자 A가 존재하는 경우 제2 증폭 생성물을 생성하는 제2 프라이머 세트, 및 샘플에 인플루엔자 B가 존재하는 경우 제3 증폭 생성물을 생성하는 제3 프라이머 세트;
    b) 제1 증폭 생성물에 특이적으로 혼성화하는 제1 검출가능한 프로브, 제2 증폭 생성물에 특이적으로 혼성화하는 제2 검출가능한 프로브, 및 제3 증폭 생성물에 특이적으로 혼성화하는 제3 검출가능한 프로브를 포함하는 3개 이상의 검출가능한 프로브를 포함하는, 키트.
  30. 청구항 29에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-6 및 27-31, 40으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제1 프라이머, 및 서열 번호: 7-20, 및 41로 이루어진 군으로부터 선택된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 상보체를 포함하는 제2 프라이머를 포함하고; 그리고 하나 이상의 검출가능한 프로브의 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-26, 32, 및 42-43으로 이루어진 군으로부터 선택된 제3 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체를 포함하는, 키트.
  31. 청구항 30에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1-3, 27-31로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7-14로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21-23, 및 42로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  32. 청구항 31에 있어서, 제1 프라이머 세트는 서열 번호: 1 또는 27의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 7의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제1 검출가능한 프로브는 서열 번호: 21 또는 42의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  33. 청구항 29 내지 32 중 어느 한 항에 있어서, 제2 프라이머 세트는 서열 번호: 33의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 34의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 제3 프라이머 세트는 서열 번호: 36의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 37의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 제2 검출가능한 프로브는 서열 번호: 35 또는 44의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 제3 검출가능한 프로브는 서열 번호: 38 또는 45의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  34. 청구항 29 및 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 또는 SARS-CoV-2 및 사르베코바이러스 아속의 다른 코로나바이러스 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 제4 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트 및 제4 증폭 생성물에 특이적으로 혼성화하는 제4 검출가능한 프로브를 추가로 포함하는, 키트.
  35. 청구항 34에 있어서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 4-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15-20으로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고, 그리고 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 24-26, 및 32로 이루어진 군으로부터 선택된 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  36. 청구항 35에 있어서, 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 5의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 15의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하고; 그리고 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브는 서열 번호: 25 또는 32의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 키트.
  37. 청구항 29 및 31 내지 33 중 어느 한 항에 있어서, SARS-CoV-2 표적 핵산이 샘플에 존재하는 경우 제4 증폭 생성물을 생성하는 제4 프라이머 세트; 그리고 서열 번호: 43의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 증폭 생성물 검출을 위한 제4 검출가능한 프로브를 추가로 포함하고, 이때 제4 프라이머 세트는 서열 번호: 40의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 정방향 프라이머, 및 서열 번호: 41의 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 키트.
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