DE69738605T2 - Behälter zum Durchführen und Beobachten biologischer Prozesse - Google Patents

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Description

  • Hintergrund
  • 1. Erfindungsumfeld:
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf eine Vorrichtung zum Durchführen von biologischen Verfahren, wie der Polymerasekettenreaktion. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung Behälter zum Aufbewahren von biologischem Material, während dieses einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird, und deren Verwendungen.
  • 2. Technischer Hintergrund
  • In zahlreichen Bereichen von Industrie, Technologie und Forschung besteht das Bedürfnis zuverlässig und nachvollziehbar Proben einem zyklischen Temperaturwechselprozess zu unterziehen. Die Notwendigkeit eine Probe einem wiederholten zyklischen Temperaturwechselprozess zu unterziehen, ist insbesondere bei biotechnologischen Anwendungen akut. Im biotechnologischen Umfeld ist es oft erstrebenswert, kleine Materialproben während einer kurzen Zeitspanne wiederholt zu erwärmen und zu kühlen. Einer dieser biologischen Prozesse, der regelmäßig ausgeführt wird, ist die zyklische DNS Vervielfältigung (Amplifikation).
  • Die zyklische DNS Vervielfältigung, bei der eine temperaturstabile DNS Polymerase benutzt wird, ermöglicht die automatische Vervielfältigung von primerspezifischer DNS, die im allgemeinen als "Polymerasekettenreaktion" oder "PCR" bekannt ist. Die Automation dieses Prozesses erfordert einen kontrollierten und präzisen zyklischen Temperaturwechsel der Reaktionsmischungen, die gewöhnlich in mehreren Behältern enthalten sind. In der Vergangenheit war der bevorzugte Behälter ein Standard-Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff.
  • Kommerziell programmierbare metallische Heizblöcke wurden in der Vergangenheit dazu verwendet, den Temperaturwechsel der Proben in den Mikrozentrifugeröhrchen entsprechend dem Temperatur-gegen-Zeit-Sollprofil durchzuführen. Jedoch stellte sich das Unvermögen, die Temperatur der Heizblöcke über einen großen Temperaturbereich innerhalb einer kurzen Zeitspanne schnell und genau anzupassen, für die Verwendung der heizblockartigen Gerätetypen für ein Wärmesteuersystem als nicht erwünscht heraus, wenn Abläufe wie die Polymerasekettenreaktion ausgeführt werden.
  • Darüber hinaus haben auch die im Allgemeinen verwendeten Mikrozentrifugenröhrchen Nachteile. Das Material der Mikrozentrifugenröhrchen, ihre Wandstärke, und die Geometrie der Mikrozentrifugenröhrchen stellen ein Hindernis beim schnellen Erwärmen und Kühlen der darin enthaltenen Probe dar. Das Kunststoffmaterial und die Wandstärke der Mikrozentrifugenröhrchen wirken wie eine Isolierung zwischen der darin enthaltenen Probe und dem umgebenden Medium, wodurch ein Transfer der Wärmeenergie behindert wird. Außerdem bietet die Geometrie des Mikrozentrifugenröhrchens dem beliebigen zum Wärmeenergieübertrag benutzten Medium nur einer kleinen Oberfläche. Die kontinuierliche Verwendung der Mikrozentrifugenröhrchen mit ihrer suboptimalen Geometrie im Stand der Technik zeigt, dass die Vorzüge einer verbesserten Wärmeenergieübertragung (die sich durch eine vergrößerte Oberfläche des Probenbehälters für eine Probe konstanten Volumens einstellt) bis jetzt noch nicht erkannt worden sind.
  • Weiterhin wurden Vorrichtungen, die Wasserbäder mit Fluidaustausch (oder mechanischem Transfer) als zyklische Temperaturwechsler (Thermocycler) für die Polymerasekettenreaktion verwendet. Auch wenn Wasserbäder für das zyklische Durchlaufen einer Polymerasekettenreaktionsmischung entlang einem Temperatur-gegen-Zeit-Sollprofil, das für das Stattfinden der Reaktion nötig ist, verwendet wurden, wirkt die hohe thermisch wirksame Masse des Wassers (und die niedrige Wärmeleitfähigkeit der Kunststoffmikrozentrifugenröhrchen) signifikant einschränkend, soweit das Betriebsverhalten des Geräts und die Spezifizität der Reaktion betroffen ist.
  • Geräte mit Wasserbädern sind in ihrem Betriebsverhalten eingeschränkt. Der Grund liegt darin, dass die thermisch wirksame Masse des Wassers den maximalen Temperatur-gegen-Zeit-Gradienten, der damit erreicht werden kann, signifikant einschränkt. Außerdem zeigt sich, dass das Wasserbadgerät aufgrund seiner Größe, der Zahl der Wasser führenden Schläuche, und der externen Temperatursteuervorrichtung für das Wasser sehr schwerfällig ist. Darüber hinaus ist das Erfordernis der strengen periodischen Wartung und Inspektion der Wasseranschlüsse, um Lecks in dem Wasserbadgerät zu detektieren, mühsam und zeitaufwändig. Zu guter Letzt ist es schwierig, mit dem Wasserbadgerät die Temperatur der Probenröhrchen mit der erforderlichen Genauigkeit zu steuern.
  • Das US Patent Nr. 3,61 6,264 von Ray zeigt ein thermisches Gebläseluftgerät für die Luftzirkulation, um biologische Proben auf eine konstante Temperatur zu erwärmen oder zu kühlen. Auch wenn Rays Gerät durchaus effektiv ist, eine konstante Temperatur innerhalb einer Luftkammer zu halten, wird das Erfordernis eines schnellen Anpassens der Temperatur in zyklischer Art entsprechend einem Temperatur-gegen-Zeit-Profil, wie für biologische Anwendungen wie der Polymerasekettenreaktion nötig sind, nicht angesprochen.
  • Das US Patent Nr. 4,420,679 von Howe und das US Pat. Nr. 4,286,456 von Sisti et al. offenbaren jeweils Gaschromatographieöfen. Die in den Patenten von Howe und Sisti et al. offenbarten Vorrichtungen sind dafür geeignet, ein gaschromatografisches Verfahren auszuführen, sind aber nicht dafür geeignet, einen zyklischen Temperaturwechsel durchzuführen, der wesentlich schneller ausgeführt werden soll, als mit einem der vorher beschriebenen Geräte. Ein schneller zyklischer Temperaturwechsel ist für die Ausführungen vieler Prozesse nützlich. Geräte, wie in den Patenten von Howe und Sisti et al. beschrieben werden, sind nicht geeignet, solche Reaktionen effizient und schnell auszuführen.
  • Die US 5,455,175 offenbart eine Vorrichtung für zyklische Temperaturwechsel, in der eine dünnwandige Kapillarröhre verwendet wird. Die Kapillarröhren umfassen keinen trichterartig geformten Abschnitt.
  • Die US 3,219,412 offenbart eine Vorrichtung für eine automatisierte chemische Sequentierbehandlung. Die in dem Dokument offenbarten Kapillarröhren können einen Trichter umfassen und sind an beiden Enden der Kapillarröhre offen. Die Kapillarröhre wird in der Vorrichtung zum Transport einer Probe zu einem Aufnahmenapf verwendet.
  • Insbesondere die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine für die moderne Molekularbiologie essenzielle grundlegende Vervielfältigungstechnik. Trotz ihrer Nützlichkeit und Popularität ist das bisherige Verständnis der PCR nicht weit fortgeschritten. Die Vervielfältigungsmethoden müssen durch "trial and error" optimiert werden, und Protokolle werden oft blindlings befolgt. Das begrenzte Verständnis der PCR, wie es im Stand der Technik zu finden ist, ist ein gutes Beispiel dafür, dass Fachleute sich damit zufrieden geben, eine leistungsfähige Technik ohne Reflexion und Verstand zu verwenden.
  • Biologische Prozesse wie die PCR benötigen einen zyklischen Temperaturwechsel der Proben. Im Stand der Technik wird ein solcher Temperaturwechsel, wie oben beschrieben, nur langsam ausführt. Der Stand der Technik ignoriert außerdem die zu Grunde liegenden Prinzipien, die es der PCR ermöglichen, zu funktionieren, und die dazu verwendet werden könnten, die PCR noch nützlicher zu gestalten. Es wäre deshalb ein großer Fortschritt in der Technik, Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, die insbesondere dafür ausgelegt sind, eine PCR schnell auszuführen und die währenddessen stattfindende Reaktion zu analysieren, insbesondere wenn eine solche Reaktion während ihres Stattfinden – also in Echtzeit – analysiert wird.
  • Kurze Zusammenfassung und Aufgaben der Erfindung
  • Im Hinblick auf den oben beschriebenen Stand der Technik bezieht sich die vorliegende Anmeldung auf die Erfüllung der folgenden Aufgaben.
  • Es ist eine Aufgabe, ein Gerät bereitzustellen, das die Temperatur von biologischen Proben genau steuert.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein Gerät bereitzustellen, das eine biologische Probe einem schnellen Temperaturwechsel unterziehen kann, wobei die Luft als Wärme übertragendes Medium verwendet wird.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein System und ein Verfahren bereitzustellen, um eine PCR schnell durchzuführen und zudem die Reaktion während ihres Ablaufs kontinuierlich zu überwachen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe, ein System und ein Verfahren bereitzustellen, um eine PCR schnell durchzuführen und zudem die Reaktionsparameter während des Ablaufs der Reaktion einzustellen.
  • Diese und andere Aufgaben und Vorteile werden aus der Beschreibung und den folgenden Ansprüchen noch klarer werden oder können durch die Anwendung der Erfindung gelernt werden.
  • Gemäß einem Aspekt wird ein Gerät ist bereitgestellt, das insbesondere dafür geeignet ist, biologische Proben einem schnellen Temperaturwechselprozess zu unterziehen, um einen oder mehrere einer Vielzahl von Abläufen oder Prozessen auszuführen.
  • Die Erfindung stellt zur Verfügung:
    Einen Kunststoff/Glas-Behälter zur Aufbewahrung einer fluiden biologischen Probe, während diese einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird, wobei der Behälter, der ein optisch klares Material umfasst, zur Aufbewahrung einer Probe von maximal 1 ml ausgestaltet ist und ferner umfasst:
    • a) einen Kapillarröhrchenabschnitt, der an einem Ende geschlossen ist,
    • b) einen Reservoirabschnitt (450C), der ein trichterartig geformter Abschnitt ist, der mit dem offenen Ende des Kapillarröhrchenabschnitts verbunden ist; und
    • c) eine Konstruktion zum Versiegeln des Kapillarröhrchenabschnitts,
    wobei der trichterartig geformte Abschnitt aus Kunststoff hergestellt ist.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt zur Verfügung:
    Eine Vielzahl an wie in Anspruch 5 definierten Kunststoff/Glas-Behältern.
  • Die Erfindung stellt darüber hinaus zur Verfügung:
    Eine Verwendung eines Kunststoff/Glas-Behälters gemäß der Erfindung gemäß Anspruch 8 für eine Echtzeit-PCR, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter zur Aufbewahrung einer fluiden biologischen Probe in der Lage ist, während diese einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird, wobei der Behälter, der ein optisch klares Material umfasst, zur Aufbewahrung einer Probe von maximal 1 ml ausgestaltet ist
  • Gemäß einem anderen Aspekt offenbart die vorliegende Anmeldung Verfahren und ein Gerät zur Überwachung einer DNS Vervielfältigung, um so den Fortschritt derartiger Abläufe aufzuzeichnen. Im Speziellen offenbart sie Verfahren und ein Gerät für eine kontinuierliche Fluoreszenz Überwachung des Polymerasekettenreaktionsablaufs bereit, vorzugsweise optische Komponenten, kombiniert mit Elementen, die einen schnellen Temperaturenwechsel ermöglichen, um kontinuierlich die DNS Vervielfältigung mit mehreren unterschiedlichen Fluoreszenztechniken zu überwachen. Glaskapillarprobenbehälter und Probenbehälter aus einem Kunststoff/Glas-Verbund erlauben einen schnellen Wärmetransfer von einem bevorzugten Wärme übertragenden Medium (es sind 30 Vervielfältigungszyklen in weniger als 15 Minuten möglich, wenn ein Gas, wie beispielsweise Luft, als Wärme übertragendes Medium benutzt wird) und das simultane Überwachen der Reaktion.
  • Es werden optische Techniken dazu benutzt, den Fortgang der Reaktion während ihres Ablaufs zu überwachen. In einigen bevorzugten Ausführungsbeispielen werden Fluoreszenzsonden dem Redaktionsgemisch zugegeben und die Fluoreszenz kann mindestens einmal während eines Temperaturübergangs überwacht werden, und vorteilhafterweise wird die Fluoreszenz entweder von einer einzigen Probe oder von mehreren Proben zwei oder mehrmals während eines Temperaturübergangs aufgenommen. In einigen bevorzugten Ausführungsformen ist ein sich drehendes Karussell vorhanden, um die Proben sequenziell eine nach der anderen an eine Überwachungsposition zu bewegen, wobei alle Proben simultan einem schnellen zyklischen Temperaturwechsel unterzogen werden. Wünschenswerterweise findet die Überwachung der Fluoreszenz einmal pro Vervielfältigungszyklus statt, oder die Überwachen von Temperatur, Zeit und Fluoreszenz findet während jedes Vervielfältigungszyklus kontinuierlichen statt.
  • Mit Hilfe der vorliegenden Offenbarung kann eine dreidimensionale Darstellung der Temperatur, Zeit und Fluoreszenz erreicht werden. Fluoreszenz-gegen-Temperatur-Diagramme der Hybridisierungssonden unterscheiden zwischen dem kumulativen, irreversiblen Signal der exonukleasen Spaltung, und der temperaturabhängigen, reversiblen Hybridisierung angelagerter Komponenten. Hybridisierungssonden sind nützlicher als Hydrolysesonden, da ihre Temperaturabhängigkeit von der Fluoreszenz überwacht werden kann, und dazu benutzt werden kann, Veränderungen in der Produktsequenz, d. h. Polymorphismen und Mutationen, zu detektieren. Durch die Verwendung von Farbstoffen, die in der Gegenwart der Doppelstrang-DNS fluoreszieren, kann die Produktdenaturierung, die Wiederanlagerung (Reannealing), und die Verlängerung (Extension) innerhalb jedes Zyklus überwacht werden. Vorliegende Erfindung stellt ein Gerät und ein Verfahren zum schnellen Durchführen von DNS Vervielfältigungsreaktionen bereit, die Vervielfältigung und Analyse der Reaktionen in 15 Minuten, vorteilhafterweise in unter 15 Minuten, und am vorteilhaftesten in unter zehn Minuten, aneinanderreihen.
  • Kurze Figurenbeschreibung
  • Um besser würdigen zu können, wie die oben beschriebenen und andere Vorteile und Aufgaben der Erfindung erreicht werden, wird im Folgenden eine genaue Beschreibung der oben kurz beschriebenen Ausführungsformen gegeben, indem auf die in den beigefügten Zeichnungen veranschaulichten speziellen Ausführungsform davon Bezug genommen wird. Die Zeichnungen stellen jedoch lediglich typische Ausführungsformen der Erfindung dar und sind daher nicht dazu gedacht, den Schutzbereich zu beschränken, und die Erfindung wird durch die Verwendung der beiliegenden Zeichnungen mit zusätzlichen Spezifikationen und Details beschrieben.
  • 1 zeigt eine perspektivische Ansicht des zyklischen Temperaturwechselgeräts, das dazu ausgelegt ist eine biologische Probe einem Temperaturzyklus zu unterziehen und speziell für den Gebrauch bei einer zyklischen DNS Vervielfältigung mit den Behältern der Erfindung ausgebildet ist.
  • 2 ist eine seitliche Aufrissansicht des Fluidkammerteils des Geräts von 1.
  • 3 ist eine innere Grundrissansicht des Fluidkammerteils des in 1 dargestellten Geräts.
  • 4 ist eine innere Grundrissansicht der Fluidkammer einer anderen Ausführungsform zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung.
  • 5 zeigt ein optimiertes Temperatur-gegen-Zeit-Profil für die Polymerasekettenreaktion, die einen zyklischen Temperaturwechsler der vorliegenden Erfindung verwendet.
  • 6 zeigt graphisch den Effekt der Denaturierungszeit auf die Ergiebigkeit der Polymerasekettenreaktion bei Verwendung eines zyklischen Temperaturwechslers der vorliegenden Erfindung.
  • 7 zeigt graphisch den Effekt der Anlagerungszeit auf die Spezifizität und die Ergiebigkeit der Polymerasekettenreaktion bei Verwendung eines zyklischen Temperaturwechslers.
  • 8A–B zeigen die perspektivische bzw. Aufriss-Ansicht eines Querschnitts eines anderen bevorzugten Ausführungsbeispiels für eine Verwendung mit der vorliegenden Erfindung.
  • 8C ist die Diagrammdarstellung der Beziehung zwischen wärmeerzeugendem Element und den Kapillarröhrchen, die die biologische Proben in der Ausführungsform, das in den 8A–B dargestellt ist, aufbewahren.
  • 9A zeigt das Ergebnis von vier verschiedenen Temperatur-Zeit-Profilen (A–D) und deren resultierendes Vervielfältigungsprodukt nach 30 Zyklen (A–D).
  • 9B zeigt einen Zyklus eines weiteren bevorzugten Temperatur-Zeit-Profils, das von der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • 9C–G zeigen beispielhafte Zyklen anderer bevorzugter Temperatur-Zeit-Profile, die von der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • 10 stellt einen Schaltplan eines Temperaturgefälle-Steuerschaltkreises gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 10A ist die graphische Darstellung des Effekts der Temperaturübergangsgeschwindigkeit von der Produktdenaturierungstemperatur zu der Primeranlagerungstemperatur auf die Spezifizität des Reaktionsprodukts.
  • 11 ist die schematische Ansicht eines bevorzugten schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion.
  • 11A ist eine Temperatur-gegen-Zeit Diagramm, das eine bevorzugte Funktionsweise des Geräts von 11 zeigt.
  • 12 ist eine Darstellung eines 3D Diagramms von Temperatur, Zeit und Fluoreszenz während der Vervielfältigung eines Hepatitis B DNS Fragments in Gegenwart von SYBR Green I.
  • 12A–C sind Darstellungen von 2D Diagrammen von Temperatur-gegen-Zeit, Fluoreszenz-gegen-Zeit und Fluoreszenz-gegen-Temperatur, die in zusammen in dem 3D Plot von 12 gezeigt sind.
  • 13 ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Temperatur während der Vervielfältigung eines 536 Basenpaarfragments des menschlichen β-Globin Gens in der Gegenwart von SYBR Green I.
  • 14 ist das Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zykluszahl.
  • 14A ist die Legende zu 14 und zu den nachfolgenden Figuren, die verschiedene Anfangszahlen für die Vorlagenkopien anzeigt.
  • 15 ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zykluszahl.
  • 16 ist ein Fluoreszenzverhältnis-gegen-Temperatur-Diagramm.
  • 17 ist ein Fluoreszenzverhältnis-gegen-Temperatur-Diagramm.
  • 18A ist ein Diagramm, das ein gleichgewichtiges PCR Paradigma darstellt.
  • 18B ist ein Diagramm, das ein kinetisches PCR Paradigma darstellt.
  • 18C ist ein Diagramm, das unterschiedliche Zeit-Temperatur-Profile im Bereich der Anlagerungstemperatur darstellt.
  • 19 stellt eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar, die dazu ausgebildet ist, die Probe kontinuierlich zu überwachen.
  • 19A–19D sind Darstellungen verschiedener Probenbehälterausbildungen.
  • 19E ist eine Graphik, die den Effekt der unterschiedlichen Probenbehälterausbildungen aus den 19A–D auf das Temperaturverhalten der Probe selbst darstellt.
  • 19F und 19G ist eine Seiten bzw. Bodenansicht eines bevorzugten Probenbehälters gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 19H und 19I zeigen entsprechend zwei mögliche Ausrichtungen eines rechteckigen Kapillarröhrchens beim Detektieren der Fluoreszenz der Probe.
  • 20 zeigt den optischen Aufbau einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, um ein kontinuierliches Überwachen der Probe, die einer DNS Vervielfältigung unterzogen wird bereitzustellen.
  • 21 ist die schematische Darstellung einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eines schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion an der Spitze des Probenbehälters.
  • 21A–D zeigen aus Kunststoff/Glas zusammengesetzte Behälter, in welche biologische Proben eingefüllt werden.
  • 22 zeigt nützliche Temperatur-gegen-Zeit Abschnitte für die Fluoreszenzhybridisierungsüberwachung.
  • 22A zeigt graphisch die Effektivität der Lichtführung, wenn eher die Spitze als die Seite der Kapillarprobenbehälter beobachtet wird.
  • 22B zeigt graphisch die Effektivität der Lichtführung anhand zweier unterschiedlicher Größen von Kapillarprobenröhrchen.
  • 22C ist ein Blockdiagramm mit hohem Niveau, das die Aufgaben zeigt, die von einem erfindungsgemäßen bevorzugten Ausbildungsbeispiel durchgeführt werden, wobei die Erfindung einen schnellen zyklischen Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion umfasst.
  • 22D ist ein Diagramm der Temperatur-gegen-Zeit für eine PCR Reaktion, wobei ein Fluoreszenzfeedback benutzt wurde, um die Reaktionsparameter zu steuern.
  • 22E ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zeit für eine PCR Reaktion, bei welcher ein Fluoreszenzfeedback benutzt wurde, um die Reaktionsparameter zu steuern.
  • 23 ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zeit, das die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz darstellt.
  • 24 ist ein Diagramm von Temperatur-gegen-Zeit, das die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz darstellt.
  • 25 ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Temperatur für drei verschiedene PCR Produkte in Gegenwart von SYBR Green I, das bei einem 0,2 Grad pro Sekunde Temperaturübergang durch die Produktschmelztemperatur erzeugt wurde.
  • 26 ist ein Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zeit, das die Produktanlagerung für verschiedene Konzentrationen von PCR Produkten in Gegenwart von SYBR Green I zeigt.
  • 27A und 27B sind schematische Querschnittsansichten des in 28 dargestellten Ausführungsbeispiels in einem Ablaufzustand bzw. einem Bestückungszustand.
  • 28 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eines schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion an der Spitze des Probenbehälters, der Positionen für die Fluoreszenzdetektion in zwei Dimensionen aufweist, um die Detektion zu optimieren.
  • 29 ist eine perspektivische Ansicht des Äußeren der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche die in der schematischen Darstellung der 28 dargestellten Komponenten einschließt.
  • 30A–30V sind detaillierte schematische Diagramme der elektrischen Komponenten einer bevorzugten Ausführungsform.
  • 31A und 31B sind die perspektivische bzw. die Querschnitts-Ansicht des Probenhandhabungssystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 32 ist eine schematische Darstellung eines anderen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung, das mehrere Probenhandhabungsscheiben beinhaltet.
  • Detaillierte Beschreibung der vorteilhaften Ausführungsbeispiele
  • Im Folgenden werden die Figuren beschrieben, wobei die gleichen Strukturen die gleichen Bezugszeichen tragen.
  • Wie in 1 dargestellt, umfasst das vorteilhafte Ausführungsbeispiel der zyklischen Temperaturwechselvorrichtung 10 eine Kammer mit einem geschlossenen Fluidkreislauf (am vorteilhaftesten ist Luft), die im allgemeinen mit 11 bezeichnet wird, und dazu ausgelegt ist, Proben, die dem Zyklus unterzogen werden sollen, durch die Lüftungsklappe 14 zu empfangen. Die Kammer 11 mit dem geschlossenen Fluidkreislauf beinhaltet mehrere Unterteilungen, die jeweils kurz beschrieben werden. Die Vorrichtung 10 weist außerdem eine Steuervorrichtung 12 auf, die mittels Eingabetasten 25 und einem Display 26 programmiert werden kann, um eine Abfolge von Temperaturen über eine vorgegebene Zeit zyklisch zu durchlaufen. Der zyklische Temperaturwechsel der Kammer 11 kann dazu verwendet werden, mehrere Abläufe auszuführen und ist insbesondere, wie weiter unten erklärt werden wird, für die Vervielfältigung von primerspezifischen DNS-Proben, die ein Reaktionsgemisch enthalten, geeignet.
  • Die Kammer 11 mit dem geschlossenen Fluidkreislauf ist im allgemeinen in einem schachtelförmigen Gehäuse 13 aufgenommen. Gebläsebefestigungsplatten 16 können, falls gewünscht, derart angeordnet sein, dass sie einen kleineren rechteckigen Bereich der Kammer 11 abtrennen und dazu dienen ein im allgemeinen zylinderförmiges unteres Gehäuse 15 zu tragen und daran zu befestigen. Alternativ kann der Ventilator des Gebläses 28 integral in dem Kammergehäuse 13 angeordnet sein.
  • Das Innere des Gebläsegehäuses 15 umfasst die Flügel und die Antriebswelle des Gebläses. Der Gebläsemotor (nicht dargestellt) ist außerhalb des Gebläsegehäuses 15 angeordnet, und deshalb auch außerhalb der umschlossenen Kammer 11. In dieser Konfiguration sind die Flügel und die Antriebswelle die einzigen Teile des Gebläses, die dem zirkulierenden heißen Fluid in der Kammer 11 ausgesetzt werden. Es wäre unvorteilhaft den Motor innerhalb der Kammer zu befestigen, der dann den Temperaturänderungen ausgesetzt werden würde und zudem die thermisch wirksame Masse des Motors derjenigen hinzufügt, die dem Erwärmen und Kühlen ausgesetzt werden soll. Die Verringerung der thermisch wirksamen Masse, die dem Fluid in der Kammer 11 ausgesetzt wird, ist wünschenswert für das gesamte Betriebsverhalten der Vorrichtung 10 in seiner Funktion, bei der die Proben in der Vorrichtung platziert und einem Temperatur-gegen-Zeit-Sollprofil unterzogen werden, wobei entweder ein vorgegebenes Profil verwendet wird, oder, wie weiter unten detailliert beschrieben werden wird, eine oder mehrere Reaktionsparameter während des Reaktionsablaufs verändert werden.
  • Das Gebläse 28 ist ein wohlbekannter Gebläsetyp, der gewöhnlich als "in line" Gebläsetyp identifiziert wird, der vorzugsweise einen propellerartigen Ventilator, bedingt durch seine im allgemeinen niedrige thermisch wirksame Masse, oder, falls gewünscht, einen Käfigläuferartigen Ventilator aufweist, wobei der Ventilator vorzugsweise eine Kapazität von 75 ft3/min aufweist.
  • Die Solenoidplatte 17 weist ein daran befestigtes Solenoid 18 auf. Der Solenoidanker 19 ist an dem oberen Ende 21 eines Stabs 20 befestigt, der wiederum fest mit der Lüftungsklappe 14 verbunden ist und drehbar an Punkten oberhalb und unterhalb der Lüftungsklappe 14 an dem Gehäuse 13 befestigt ist. Der Stab 20 ermöglicht es deshalb, dass sich die Lüftungsklappe 14 relativ zu dem Gehäuse 13 um die Längsachse des Stabs 20 frei drehen kann.
  • Eine Feder 22 ist an ihrem einen Ende an dem Gehäuse 13 durch einen Tragpfosten 23 befestigt. Das gegenüberliegende Ende der Feder 22 ist mit dem oberen Ende 21 des Stabs 20, direkt neben der Verbindung mit dem Solenoidanker 19, verbunden. Die Feder 22 ist zwischen den zwei Befestigungspunkten gespannt. Deshalb tendiert die Feder 22 dazu, das obere Ende 21 in Richtung des Tragpfostens 23 zu ziehen, wodurch die Lüftungsklappe dazu tendiert, sich in ihre geschlossene Position zu drehen. Wenn das Solenoid 18 betätigt wird, tendiert der Anker 19 dazu, das obere Ende 21 des Stabs 20 in Richtung des Solenoids 18 zu ziehen, was der Zugrichtung der Feder 22 entgegenwirkt, und die Lüftungsklappe 14 tendiert dazu, sich zu öffnen.
  • Die Steuervorrichtung, im Allgemeinen mit 12 bezeichnet, ist elektrisch mit der Kammer 11 mittels eines Übertragungskabels 24 verbunden. Das Kabel 24 stellt außerdem Energie für den Gebläsemotor (nicht dargestellt) und die Heizwendel 31 bereit. Weiterhin ist die Steuervorrichtung auch mit einem Thermoelementsensor 35 zum Empfangen von den Temperaturdaten entsprechenden Signalen und dem Solenoid 18 zum Triggern des Solenoidankers verbunden.
  • Die Steuervorrichtung 12 kann ein wohlbekannter Typ von Temperatursteuereinheit sein, die dazu programmierbar ist, die Heizwendel 31, die Lüftungsklappe 14 und das Gebläse derart anzusteuern, dass eine vorgegeben Temperatur als Funktion der Zeit in der Kammer 11 herrscht, und die dazu programmiert werden kann, einen Relaisausgang zum Ansteuern des Solenoids zu vorgegebenen Zeitperioden und Kammertemperaturniveaus zu aktivieren. Eine vorteilhafte Temperatursteuervorrichtung 12 für die Ausführungsbeispiele der 1 bis 3 ist eine Partlow MIC-6000 Proportional Temperatursteuervorrichtung, die von Omega Engineering Inc., Stanford, Connecticut, unter der Modellnummer CN8600 Process Controller bezogen werden kann.
  • Wie in den 2 und 3 dargestellt, ist das Innere der Kammer 11 in 4 Hauptabschnitte unterteilt. Der Gebläseabschnitt 28 wird durch das Gebläsegehäuse 15 und die Gebläsebefestigungsplatten 16 gebildet. Die Gesamtheit des Gebläseabschnitts 28 ist mit dem Ventilator und den Antriebswellenteilen des Gebläses, wie oben beschrieben ausgefüllt. Das Gebläse kann eines der mehreren wohlbekannten Designs, wie oben beschrieben, aufweisen, und ist deshalb in 3 zum Zweck der Klarheit weggelassen worden. Es ist für die vorliegende Erfindung ausreichend, zu verstehen, dass der in dem Gebläseabschnitt 28 angeordnete Ventilator das Fluid durch die Einlassöffnung 36 in den Gebläseabschnitt 28 zieht und durch die Auslassöffnung 37 hinausdrückt.
  • Es ist vorteilhaft, dass das Fluid durch das Gebläse mit einer Geschwindigkeit von mindestens 75 ft3/min vorangetrieben wird. Es ist für die vorliegende Erfindung jedoch bedeutend, zu realisieren, dass das in der Kammer 11 vorhandene Fluid nur den Ventilator und einen Teil der Antriebswelle des Gebläses kontaktiert, der Gebläsemotor selbst ist außerhalb des Gebläsegehäuses 15 angeordnet, so dass ein Kontakt mit dem Fluid in der Kammer 11 vermieden wird. Diese Überlegung trägt zu der Arbeitsgeschwindigkeit der Erfindung bei, um das Material, das das Fluid innerhalb der Kammer 11 kontaktiert, zu minimieren und dadurch die thermisch wirksame Masse des Materials, das während des Zyklusablaufs erwärmt bzw. abgekühlt werden muss, zu minimieren. Durch die Minimierung der thermisch wirksamen Masse, die durch das Fluid erwärmt oder abgekühlt werden muss, wird die Reaktionszeit, die nötig ist, um die Teile der Kammer 11 auf eine einheitliche Temperatur zu bringen, um ein Vielfaches verringert.
  • Das den Gebläseabschnitt 28 durch die Auslassöffnung 37 verlassende Fluid tritt in den Heizabschnitt 29 ein. Das den Heizabschnitt 29 durchströmende Fluid muss die Heizwendeln 31 passieren. Wenn die Heizwendeln 31 heißer werden als das in den Heizabschnitt 29 gelangende Fluid, wird das Fluid, während es durch den Heizabschnitt 29 geblasen wird, erwärmt. Die Heizwendel ist vorzugsweise eine 1000 Watt (125 VAC) Nichrome-Drahtwendel, die um einen Mikroträger gewickelt ist. Trotzdem kann jede andere Heizeinheit, die geeignet ist, die Art des in der Kammer vorhandenen Fluids zu erwärmen, verwendet werden. Die speziell in dem Ausführungsbeispiel der 1 bis 3 verwendete Heizwendel ist von Johnstone Supply, Portland, Oregon, hergestellt.
  • Die Heizwendel 31 wird durch ein in der Steuervorrichtung 12 beinhaltetes Ausgangsrelais aktiviert. Das bevorzugte Relais ist ein 25A, 125 VAC Festkörperrelais, das von Omega Engineering Inc., Stanford, Connecticut, unter der Modell Nr. Omega SSR 240 D25 hergestellt wird.
  • Das den Heizabschnitt 29 passierende Fluid fällt auf die Einbauten 32 und 33, bevor es in den Reaktionsabschnitt 30 gelangt. Die Einbauten 32 und 33 tendieren dazu, eine laminare Strömung zu unterbrechen und erzeugen eine Turbulenz, um das Fluid effektiv zu mischen, so dass es mit einer homogenen Temperatur in dem Reaktionsabschnitt 30 ankommt.
  • Der Thermoelementsensor 35 stellt ein elektrisches Eingangssignal an der Steuervorrichtung 12 bereit, das der Fluidtemperatur in dem Reaktionsabschnitt entspricht. Die Temperaturüberwachung während des Betriebs der zyklischen Temperaturwechselvorrichtung 10 wird vorteilhafterweise durch ein 30-Gauge-Eisen-Konstantan "J-type" Thermoelement erreicht. Die Steuervorrichtung verwendet die Information, um die Heizwendel 31 gemäß dem vorgegebenen darin gespeicherten Temperatur-gegen-Zeit-Profil zu steuern, und das Solenoid 18 zu betätigen, wie in Kürze erklärt werden wird.
  • Das von dem Reaktionsabschnitt 30 in den Luftrückführabschnitt 34 strömende Fluid muss durch den Probenabschnitt 27 (dargestellt durch gestrichelte Linien) strömen. Der Probenabschnitt 27 wird ebenfalls in Kürze erläutert werden.
  • Das sich in dem Rückführabschnitt 34 befindende Fluid ist, bedingt durch die Wärmeübertragung an die in der Probenkammer angeordneten Proben, leicht gekühlt worden. Das Fluid in dem Rückführabschnitt 30 wird durch die Einlassöffnung 36 in den Gebläseabschnitt 28 gezogen, woraus es dann wieder, aufgrund des Ventilators, aus der Auslassöffnung in den Heizabschnitt 39 geblasen wird. Deshalb ist die Fluidkammer 11, wenn sie mit geschlossener Lüftungsklappe 14 betrieben wird, eine Fluidkammer mit geschlossenem Fluidkreislauf, in der das Fluid entlang eines geschlossenen Schleifenwegs kontinuierlich durch jeden der Abschnitte zirkuliert, um die darin angeordneten Teile auf eine konstante Temperatur zu bringen. Die kontinuierliche Zirkulation der Luft in der Luftkammer 11 ermöglicht es, dass die Proben in dem Probenabschnitt 27 so schnell wie möglich auf eine vorgegebene Temperatur gebracht werden, und dann, wenn gewünscht, auf dieser Temperatur gehalten werden.
  • Wenn die Vorrichtung 10 nicht nur dafür verwendet werden soll, das in dem Reaktionsabschnitt 27 angeordnete Material zu erwärmen, sondern nachfolgend auch so schnell wie möglich auf eine Temperatur an oder oberhalb der Umgebungsfluidtemperatur (Lufttemperatur) zu kühlen, kann die Steuervorrichtung 12 programmiert werden, das Solenoid 18 zu betätigen, um die Lüftungsklappe 14 zu öffnen und große Mengen Umgebungsfluid unverzüglich in die Kammer 11 strömen zu lassen, während das darin vorhandene erwärmte Fluid simultan entweicht.
  • Die Deaktivierung der Heizwendel 31, während der kontinuierlichen Aktivierung des Gebläses bei geöffneter Lüftungsklappe 14, zieht das Umgebungsfluid in den Rückführabschnitt 34 und von dort aus in den Gebläseabschnitt 28. Das Gebläse drückt dann das Umgebungsfluid durch den Heizabschnitt 29, von wo es direkt, ohne von der Heizwendel 31 erwärmt zu werden, in den Reaktionsabschnitt 30 gelangt. Das Umgebungsfluid passiert dann den Probenabschnitt 27 und entweicht aus der Kammer 11 durch die Lüftungsklappe 14. Bedingt durch die minimale thermisch wirksame Masse des in der Kammer 11 angeordneten Materials, und der Wirkung des Gebläseventilators, werden große Mengen Umgebungsfluid an dem Probenabschnitt vorbei geblasen, und von dort aus aus der Kammer 11. Dadurch wird ein schnelles Kühlen der Proben und des in dem Probenabschnitt 27 angeordneten Materials erreicht.
  • Der Probenabschnitt 27 ist so dimensioniert, dass mehrere Proben, wie beispielsweise hohle längliche eine Probe enthaltende Glasröhrchen, leicht in voneinander räumlich getrennter Ausrichtung angeordnet werden können, so dass sich das Fluid gleichmäßig um jede Probe verteilen kann. Falls gewünscht, kann der Probenabschnitt 27 derart dimensioniert und ausgebildet sein, dass ein Einbringen eines Gestells, einer Gondel oder etwas Ähnlichem, das für die Aufnahme mehrerer räumlich getrennt angeord neter Proben geeignet ist, möglich ist, so dass ein einfaches Beladen der Proben in den Probenabschnitt 27 möglich ist.
  • Der Zugang zu dem Probenabschnitt 27 wird durch Drehung der Lüftungsklappe 14 in ihre geöffnete Position möglich. Ist die Lüftungsklappe 14 einmal um ca. 90° aus ihrer geschlossenen Position gedreht, ist der Probenabschnitt 27 dort hindurch leicht zugänglich. Demnach verursacht, wie aus den 1 bis 3 leicht ersichtlich ist, eine Drehung der Lüftungsklappe 14 um ca. 90° aus ihrer geschlossenen Position, dass der Rückführabschnitt 34 im Wesentlichen von dem Reaktionsabschnitt 30 abgeschlossen ist. Demnach wird, wenn die Vorrichtung 10 der vorliegenden Erfindung in einem "Kühlzustand" ist, Umgebungsfluid direkt in den Rückführabschnitt 34 geleitet und durch den Gebläseabschnitt 28, den Heizabschnitt 29, den Reaktionsabschnitt 30 und den Probenabschnitt 27 im wesentlichen entlang des gleichen Wegs, wie dem oben beschriebene geschlossenen Fluidkreislaufweg, geblasen. Das Fluid wird dann aus der Luftkammer 11 geblasen und an dem Rückeintritt in den Luftrückführabschnitt 34 durch die Positionierung der Lüftungsklappe 14 zwischen dem Probenabschnitt 27 und dem Rückführabschnitt 34 gehindert.
  • Demnach ermöglicht die Lüftungsklappe 14 nicht nur den Eintritt von Umgebungsluft in die Kammer 11, sie kann auch das Fluid daran hindern, in schleifenförmiger Art durch die Kammer zu zirkulieren. Stattdessen wird das Fluid gezwungen, den Probenabschnitt 27 zu passieren und dann die Kammer 11 zu verlassen, um das schnelle Kühlen der Probeninhalte und der Kammer 11 zu unterstützen.
  • Wenn die Vorrichtung 10 für die zyklische DNS Vervielfältigung verwendet wird, ist ein wiederholter Zyklus über verschiedene Temperaturen erforderlich. Proben mit einer Reaktionsmischung für die Polymerasekettenreaktion müssen ungefähr 30-mal zyklisch die Temperaturwechsel durchlaufen, die den Denaturierungs-, Anlagerungs- und Verlängerungsphasen des Vervielfältigungsprozesses entsprechen.
  • Die Vorrichtung 10 ist, bedingt durch ihre neuartigen oben beschriebenen Eigenschaften, dazu fähig, Proben, in, im Vergleich mit dem Stand der Technik, signifikant kürzerer Zeit zyklisch zu behandeln. Beispielsweise kann die in den Figuren dargestellt DNS Vervielfältigungsanwendung einen Temperatur-gegen-Zeit-Profilzyklus in 30 bis 60 Sekunden (vgl. 5) durchlaufen. Der gleiche Zyklus würde mit einer aus dem Stand der Technik bekannten Vorrichtung 5- bis 10-mal so lange dauern. Diese geringe Zykluszeit vergrößert nachweislich die Ausbeute und die Spezifizität der Polymerasenkettenreaktion gegenüber dem dem Stand der Technik entsprechenden Zyklus.
  • Beispiel 1
  • Die Polymerasekettenreaktion wurde in einem 10 μl Volumen mit 50 ng Vorlage-DNS aus dem menschlichen Genom, 0,5 mM von jedem Desoxynukleotid, 500 ng von jeweils zwei oligonukleotiden Primern GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG (SEQ ID Nr. 5) und GCTCACTCAGTGTGGCAAAG (SEQ ID Nr. 6) in einem Reaktionspuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 25°C), 3,0 mM Magnesiumchlorid, 20 mM KCl, und 500 μg/ml Serumalbumin vom Rind laufen gelassen. Die Thermus aquatis DNS Polymerase (0,4 μl) wurde zugegeben, die Proben in ein 8 cm langes, dünnwandiges Kapillarröhrchen (hergestellt von Kimble, Kimax 46485-1) gegeben, und die Enden mit einem Laborgasbrenner verschweißt, so dass eine Luftblase an beiden Enden jedes Röhrchens vorhanden war.
  • Die Kapillarröhrchen wurden dann vertikal in einen Halter aus 1 mm dickem "prepunched perfboard" (hergestellt von Radio Shack) gestellt. Die Mischung durchlief den Zyklus aus Denaturierung (90–92°C), Anlagerung (50–55°C), und Verlängerung (72–75°C) 30 mal, um das in 5 dargestellte Temperatur-gegen-Zeit-Profil zu ergeben. Die Temperaturüberwachung der Kapillarröhrchen wurde mittels eines Miniaturthermoelements (IT-23, Sensortek, Clifton, NJ) durchgeführt, das in 10 μl destilliertem Wasser angeordnet und mit einem Thermoelementmonitor (BAT-12, Sensortek) verbunden war. Die Vervielfältigungsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,5%-igen Agarosegel aufgetrennt. Die spezifischen Vervielfältigungsprodukte wurden mit guter Ausbeute erhalten.
  • Bedingt durch die Tatsache, dass die Vorrichtung 10 der vorliegenden Erfindung Luft statt Wasser als Wärme übertragendes Medium verwendet, besteht der Vorteil, dass der Wärmeübertrag über ein Medium (Luft) mit niedriger Wärmekapazität, das sehr schnell erwärmt werden kann, erfolgt.
  • Die Reaktionszeit für das Probenkühlen ist sehr kurz, da dünnwandige Glaskapillarröhrchen zum Enthalten der Proben, statt Mikrozentifugenröhrchen aus Kunststoff, die bei aus dem Stand der Technik bekannten Abläufen benutzt werden, verwendet werden, und da die thermisch wirksame Masse des in der Kammer 11 (siehe 5) angeordneten Materials minimiert wurde. Diese Reaktionszeiten können eine Optimierung der Zeit- und Temperaturanforderungen für die Denaturierungs-, Anlagerungs-, und Verlängerungsschritte der Polymerasenkettenreaktion ermöglichen.
  • Darüber hinaus werden kürzere "ramp times" erzielt, d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um die Probentemperatur von einem Temperaturlevel auf das nächste, den Phasen im Vervielfältigungsprozess entsprechende Temperaturlevel zu bringen, wird verkürzt. Dies verkürzt die Zeit, die für eine komplette Vervielfältigung nötig ist, und ermöglicht spezifische Studien der Anlagerungs-, Denaturierungs-, und Verlängerungskinematik in einem Poylmerasenkettenreaktionsprotokoll.
  • Die Einbauten 32 und 33 (wie in 3 gezeigt) können, wenn gewünscht, dazu verwendet werden, eine bessere Temperaturhomogenität in dem Probenabschnitt 27 zu erhalten. Wie in dieser Ausführungsform gezeigt, verringern die Einbauten 32 und 33 die Temperaturunterschiede in dem Reaktionsabschnitt 30 von ungefähr 10°C auf ungefähr 2°C. Falls ge wünscht, können weitere (oder komplexere) Einbauten verwendet werden, um die Temperaturunterschied in dem Reaktionsabschnitt 30 weiter zu verringern. Alternativ kann ein Ventilator, wie in 4 gezeigt, stromabwärts von der Heizwendel 31 aus, aber vor dem Probenabschnitt 27 angeordnet sein, um eine gleichmäßigere Mischung zu erhalten.
  • Die Vervielfältigungsprodukte, die durch die Verwendung der Vorrichtung 10 erhalten werden, sind quantitativ und qualitativ mindestens genauso erstrebenswert wie die, die durch das manuelle Wasserbad Zyklusverfahren gewonnen werden. Trotzdem sind mit der schnellen Wärmesteuerung der Reaktionsmischung Vorzüge in der Spezifizität und der Ausbeute möglich.
  • 6 zeigt die Auswirkung des in 5 dargestellten Temperatur-gegen-Zeit-Profils auf die Spezifizität (d. h. die eine spezifische Produktausbeute im Gegensatz zu mehreren ähnlichen oder sog. "shadow"-Produkten), wenn das Temperaturwechselgerät 10 verwendet wird. Wie zu sehen ist, ist die Produktspezifizität umso größer, je kürzer die die "ramp" und die Anlagerungszeiten sind. Die schnelle Temperaturreaktion des Geräts 10 ermöglicht eine verbesserte Spezifizität und Ausbeute, die mit Systemen aus dem Stand der Technik nicht möglich sind.
  • 7 zeigt die Auswirkung des Variierens der Denaturierungszeit des in 5 dargestellten Temperatur-gegen-Zeit-Profils auf die DNS Vervielfältigungsausbeute, wenn das erfindungsgemäße Temperaturwechselgerät verwendet wird. Die helleren vertikalen Linien entsprechen jeweils einer bestimmten Zeit bei einer Denaturierungstemperatur. Wie zu sehen ist, ist die Ausbeute bei den kürzest möglichen Denaturierungszeiten am größten. Solch ein Resultat wäre mit den Systemen aus dem Stand der Technik nicht möglich.
  • Wie gezeigt wurde, kann durch die Verringerung der Wärmekapazität (thermisch wirksame Masse) des Geräts 10 das Verfahren die Gesamtzeit, die für das Durchlaufen der Polymerasekettenreaktion nötig ist, bemerkenswert verringern. Außerdem verkürzt die Verwendung von kleinen Proben volumina die Zeit, die für die Reaktion nötig ist, weiter und reduziert zudem die Menge von teuren Reagenzien, die verwendet werden müssen, um bis zu 90%, wodurch die Kosten zum Durchführen des Verfahrens unter Verwendung der vorliegenden Erfindung weiter reduziert werden. Beispielsweise können, wenn gewünscht, in de in den 1 bis 3 dargestellten Ausführungsform Kapillarröhrchen verwendet werden, die einen inneren Durchmesser im Bereich von ungefähr 0,25 mm bis ungefähr 1,0 mm aufweisen. In einigen Anwendungen können erstrebenswerterweise auch Kapillarröhrchen verwendet werden, die einen inneren Durchmesser im Bereich von ungefähr 0,02 mm bis ungefähr 0,1 mm aufweisen.
  • Das Gerät 10 ist für die DNS Vervielfältigung aus beliebigen Quellen einsetzbar. Auch wenn spezielle Konfigurationen und Anordnungen der vorliegenden Erfindung in Verbindung mit den spezifischen Ausführungsformen des zyklischen Temperaturwechselgeräts 10 diskutiert wurden, können auch andere Anordnungen und Konfigurationen verwendet werden. Beispielsweise können alternativ andere Fluide als Luft, mit im Allgemeinen geringer thermisch wirksamer Masse, Verwendung finden.
  • Eine weitere Ausführungsform ist in den 8A–C dargestellt. 8A ist eine perspektivische Ansicht und 8B ist eine Querschnitts-Aufrissansicht eines zusätzlichen Ausführungsbeispiels. Es ist selbstverständlich, dass viele der im Vorhergehenden erläuterten Komponenten und Lehren ihre Anwendung auch in der in den 8A–C dargestellten Ausführungsform finden. Demnach werden nur die relevanten zusätzlichen Informationen bezüglich der Ausführungsform im Folgenden dargestellt. Wichtig ist, dass in der in den 8A–C dargestellten Ausführungsform das wärmeerzeugende Element neben den biologischen Probenbehältern angeordnet ist, wodurch, wie weiter unten erläutert werden wird, ein schnelleres Erwärmen und Kühlen der biologischen Proben ermöglicht wird.
  • Wie in Kürze klar werden wird, stellt das in den 8A–C dargestellte Gerät eine noch größere Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik im Hinblick auf die Schnelligkeit mit der der Temperaturwechsel vollzogen werden kann dar, beispielsweise dauern 15 oder 30 Zyklen der DNS Vervielfältigung nur noch 30, 15, 10 oder noch weniger Minuten. Darüber hinaus stellt das Gerät 100 eine bessere, als vorher mögliche, Wärmehomogenität überall in den Proben bereit.
  • In 8A ist die allgemeine Konfiguration des Gehäuses 102 der Ausführungsform gezeigt. Das Gehäuse 102 ruht auf Füßen 104 (am besten in 8B zu sehen) und dient dazu, die anderen beschriebenen Strukturelemente an ihrem Platz zu halten und die Strukturelemente, die heiß werden, von ihrer umgebenden Umgebung zu isolieren. In der in 8A gezeigten Ausführungsform 100 sind Eingabetasten 25 und ein Monitor 26, wie vorher bei dem Gerät 10 beschrieben, enthalten. Die vorher beschriebenen Steuerstrukturelemente können ohne weiteres modifiziert werden, oder als Muster für eine Steuervorrichtung, die in der in den 8A–C dargestellten Ausführungsform benutzt werden kann, verwendet werden.
  • Wie am besten in der Querschnittsansicht von 8B dargestellt, ist die Probenkammer durch eine Klammer 106 bezeichnet. Ein Deckel 138, der durch ein Scharnier 131 mit dem Gehäuse 102 verbunden ist, kann geöffnet werden, um den Zugang zu der Probenkammer 106 zu ermöglichen. Die Probenkammer 106 weist vorzugsweise eine zylindrische Form auf, kann aber jede andere Form oder Größe, die von der speziellen Anwendung gefordert wird, aufweisen.
  • Die Probenkammer 106 ist vorzugsweise mit einem schwarzen Schaummaterial 110 ausgekleidet, dessen Oberfläche lichtabsorbierende Eigenschaften aufweist, wobei aber der Großteil der Schaumdicke isolierende Eigenschaften aufweist. Das schwarze Schaummaterial kann eines sein, das bereits im Stand der Technik vorhanden ist, oder es ist eines, das aus einem Kunststoffmaterial hergestellt ist. Der Schaum ist vorzugsweise ein Material, das bereits durch die darüber streichende Luft gekühlt wird, d. h. das Material weist eine niedrige Wärmeleitfähigkeit und eine poröse Fläche auf.
  • Die dunkle oder schwarze poröse Fläche des Materials konvertiert die auf die Oberfläche treffende Strahlung kürzerer Wellenlänge in langwellige Strahlung d. h. Wärme, die in die Probenkammer abgestrahlt wird.
  • Der Schaum 110 dient dazu, die Probenkammer thermisch gegenüber dem umgebenden Luftraum in dem Gehäuse zu isolieren, und auch dazu, das von der Lampe 112 emittierte Licht in Wärmeenergie umzuwandeln. Der Schaum 110 kann auch an anderen Strukturelementen angeordnet sein. Beispielsweise kann ein Material mit einer schwarzen, dunklen oder sonstigen nichtreflektierenden Oberfläche, wie beispielsweise einer dünnen Folie Polycarbonat mit einer schwarz gestrichenen Oberfläche, an der Rückseite eines Isoliermaterials, wie beispielsweise Fiberglas oder ein Schaumstoffmaterial, angebracht sein. Die schwarze oder dunkle Oberfläche, die auf mehrere verschiedene Substanzen gestrichen sein kann, konvertiert kurzwellige auftreffende Strahlung in Wärmestrahlung, während das Isoliermaterial die Probenkammer von der Umgebung thermisch isoliert. Demnach können, entsprechend der bereitgestellten Lehre, Fachleute viele verschiedene Materialien und Strukturen zum Auskleiden der Probenkammer verwendet.
  • Die Lampe 112 ist vorzugsweise eine 500 W Halogenlampe. Falls angemessene Steuervorrichtungen verwendet werden, ist es auch möglich, Lampen mit einer höheren Leistung oder mehrere Lampen, wie beispielsweise vier 500 W Halogenlampen, zu verwenden. Eine Lampenfassung 112A ist an dem Gehäuse 102 mittels einer Tragvorrichtung 1128 angebracht. Die Lampe 112 ist dazu fähig, die Probenkammer 106 schnell und gleichmäßig auf die Solltemperatur zu erwärmen. Andere Wärmequellen, d. h. Infrarotstrahlung, wie beispielsweise durch das vorher beschrieben Nichrome-Drahtelement, können innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung genauso verwendet werden.
  • In 8B sind zwei dünnwandige, wie vorher beschriebene, Kapillarröhrchen, dargestellt. Auch wenn nur zwei dünnwandige Kapillarröhrchen dargestellt sind, kann die Probenkammer 106 viele solcher Röhrchen aufnehmen. Die dünnwandigen Kapillarröhrchen haben einige wichtige Vorteile gegenüber den vorher beschriebenen Vorrichtungen, und dienen, zusammen mit der Probenkammer 106, als das gegenwärtig bevorzugte Beispiel für eine Vorrichtung zum Aufnehmen von biologischen Proben.
  • Es ist klar, dass viele andere Strukturen, die äquivalente oder ähnliche Funktionen haben, ebenfalls verwendet werden können. Die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 werden vorzugsweise so hinterlassen, dass sie aus der Probenkammer durch Öffnungen 140 hinaus ragen, um einen leichten Zugang zu ihnen zu gewährleisten, aber sie können auch vollständig in der Probenkammer 106 beinhaltet sein, wie es zahlreiche Fluid enthaltende Strukturen sind, die für bestimmte Anwendungen geeignet sind. Die vorteilhaften dünnwandigen Kapillarröhrchen haben eine Aufnahmefähigkeit von ungefähr 10 μl. Es ist selbstverständlich, dass das Volumen der Probe klein gehalten werden sollte, und die Oberfläche der die Probe enthaltenden Struktur relativ groß sein sollte, und dass sie zusammen eine relativ kleine thermisch wirksame Masse aufweisen. Es ist auch vorteilhaft, dass die die Probe enthaltenden Strukturen Volumina irgendwo zwischen 1 pl bis 10.000 μl beinhalten können, aber den Fachleute ist klar, dass auch andere Probenvolumina innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, sofern die unterschiedliche thermisch wirksame Masse der Struktur berücksichtigt wird.
  • Die Lampe 112 und der Isolierschaum 110 stellen zusammen eine schnelle und gleichmäßige Erwärmung der in den dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 enthaltenen Probe und der in der Probenkammer 106 beinhalteten Luft bereit. Ein Thermoelement 134 ist in der Probenkammer 106 angeordnet, um die Temperatur in der Kammer zu messen und wird dazu verwendet, die Solltemperatur in der Kammer, wie vorher beschrieben, aufrecht zu erhalten.
  • Das Thermoelement ist vorzugsweise eines das im Stand der Technik erhältlich ist, dessen Thermalreaktion im Wesentlichen der Thermalreaktion der biologischen Probe und dem diese enthaltenden Behälter entspricht. Solche Thermoelemente können kommerziell von Bezugsquellen, wie beispielsweise den Idaho Labs, die eine Reihe von Thermoelementen, die als Metallummantelte J-Typ-Thermoelemente bezeichnet werde, herstellen, bezogen werden. Das Anpassen der Thermalreaktion des Thermoelements an die Thermalreaktion der biologische Probe und des Behälters kann vorzugsweise dadurch durchgeführt werden, dass ein Mikrothermoelement, wie beispielsweise das im Stand der Technik bekannte von PhysiTemp beziehbare Thermoelement Model IT-23, in eine typische biologische Probe, die in dem gewählten Behälter enthalten ist, eingebracht wird, und die Probe und das Thermoelement einem Test mit den gleichen Temperaturänderungen unterzogen werden. Das getestete Thermoelement, oder einige Außenkriterien, können geändert werden, bis die Thermalreaktion des Thermoelements an die Thermalreaktion der Probe und ihres Behälters angemessen angepasst ist.
  • Die in der 8B dargestellte Anordnung stellt eine gleichmäßigere Erwärmung und Kühlung der Probe als die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen bereit. In den früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen wurde der Wärmetransfer über die gesamte Probe selbst durch Konvektion in der Probe durchgeführt. Die durch die Konvektion induzierte Bewegung innerhalb der Probe in egal welcher die Probe enthaltenden Struktur wird durch die Temperaturgradienten oder -unterschiede in den im Allgemeinen kleinen biologischen Proben (d. h. 10–100 μl) verursacht.
  • Die Auswirkung der Temperaturgradienten in der Probe macht sich stärker bemerkbar und ist schwieriger zu kontrollieren, wenn sich die Zykluszeit für eine Probe verringert. Das Vorhandensein von ungleichen Temperaturen innerhalb einer Probe, und speziell das sich Verlassen auf das Mischen durch Konvektion in der Probe, auf das sich die Vorrichtungen aus dem Stand der Technik verlassen haben, verlängert im Allgemeinen die Zykluszeit für eine Probe und hat gerne schädliche Auswirkungen auf die biologische Probe. Das Gerät 100 ist dazu fähig, für ein derartiges Erwärmen und Kühlen zu sorgen, dass die Temperaturunterschiede in einer 10 μl Probe in einem Bereich nicht größer als ±1°C ist, während der gesamten Zeit der 30 Zyklen gehalten werden können.
  • Um für ein gleichmäßiges Erwärmen und Kühlen zu sorgen, ist es vorteilhaft, dass die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108, zumindest irgendwie, gleichweit von der Wärmequelle, beispielsweise der Lampe 112 in Gerät 110, entfernt sind. 8C stellt schematisch eine Aufsicht auf die Lampe 112 und die mehreren dünnwandigen Kapillarröhrchen 108, wie sie in dem in den 8A–B dargestellten Gerät 100 angeordnet sind, dar.
  • In der in 8C dargestellten Anordnung, sind die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108, die am weitesten von der Lampe 112 entfernt sind (wie durch die Linie F angezeigt), vorteilhafterweise nicht mehr als im wesentlichen 40%, und noch vorteilhafterweise nicht mehr als im wesentlichen 25%, weiter von der Lampe 112 entfernt sind als den Abstand zwischen der Lampe 112 und den dünnwandigen Kapillarröhrchen 108, die der Lampe 112 (angezeigt durch die Linie N) am nächsten sind. Beispielsweise kann der durch die Linie N angezeigt Abstand ungefähr 7,3 cm betragen, während der durch die Linie F angezeigte Abstand ungefähr 8,5 cm beträgt.
  • Es sollte klar sein, dass die Anordnung der dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 anders sein kann, als in den Figuren dargestellt, beispielsweise kreis- oder halbkreisförmig. Außerdem ist klar, dass sich der Punkt, von dem der Abstand zwischen dem wärmeerzeugenden Element und den Probenbehältern gemessen wird, ändern kann, wenn sich die Art oder die Größe des wärmeerzeugenden Elements ändert. Zum Beispiel kann das wärmeerzeugende Element mehrere Lampen oder mehrere elektrische Widerstandselemente umfassen, die sich in Form und Größe unterscheiden. In einigen Ausführungsbeispielen kann es auch wichtig werden, den Abstand von der Kammerwand, an der die Probenbehälter angeordnet sind zu berücksichtigen. In der dargestellten Ausführungsform dienen die Öffnungen 140 (vgl. 8A) als Vorrichtung zum Halten der Probenbehälter, es kann aber jeder andere Aufbau, der äquivalente Funktionen erfüllt, gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.
  • Das Gerät 100 kühlt zudem die in den Kapillarröhrchen 108 enthaltenen Proben sehr schnell und gleichmäßig. Um die Probenkammer 106 zu kühlen, wird Luft von außerhalb des Gehäuses durch ein unteres Gehäuseportal 114 mittels eines Ventilators 116 gezogen, wobei der Ventilator 114 mit einer von einem Motor 128 angetriebenen Motorwelle 122 verbunden ist. Da ein schnelles Kühlen der Probenkammer erstrebenswert ist, ist es vorteilhaft, dass, wie in Kürze erläutert werden wird, die Kombination aus Motor 128 und Ventilator 116 ein ausreichendes Luftvolumen in die Probenkammer 106 blasen und dann die Luft innerhalb der Probenkammer 106 verteilen kann. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung können auch andere Anordnungen als der in 8B dargestellte Motor 118 und Ventilator 116 verwendet werden.
  • Die Verwendung von Luft als Wärme übertragendes Medium hat, im Gegensatz zu anderen Gasen oder Flüssigkeiten, den Vorteil, dass sie günstig, relativ leicht zu beschaffen, und einfach mischbar ist und keine Verunreinigung verursacht. Im Fall der beschriebenen Ausführungsbeispiele sorgt das große Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis der die Probe enthaltenden Kapillarröhrchen für einen schnellen Wärmeübertrag, wobei Luft als Wärme übertragendes Medium verwendet wird.
  • Während des Kühlabschnitts des Temperaturzyklus, zieht die Betätigung des Ventilators 116 Luft mit Raumtemperatur in das Gehäuse 102. Eine Lüftungsklappe 128, die durch ein Scharnier 129 befestigt ist, ist vorgesehen. Die Lüftungsklappe 128 wird automatisch mit Hilfe eines Sole noids 132 geöffnet, so dass das Innere des Gehäuses 102 von dem oberen Gehäuseportal 130 abgeriegelt ist. In einigen Ausführungsbeispielen ist vorteilhafterweise das Solenoid 132 durch einen wohlbekannten Schrittmotor ersetzt. Die Verwendung eines Schrittmotors ermöglicht es, die Lüftungsklappe 128 genau und inkrementell entsprechend den Anforderungen an das Wärmen oder Kühlen der Proben, zu öffnen und zu schließen. Die Fachleute sind fähig einen entsprechenden Steuermechanismus für den Gebrauch eines Schrittmotors abzuleiten, wie beispielsweise eine wohlbekannte SC-149 Schrittmotorsteuervorrichtung (erhältlich bei Alpha Products), wobei die hier dargelegten Informationen verwendet werden.
  • Bedingt durch die Anordnung des unteren Probenkammerportals 120, des größeren Querschnittsbereichs und der Position des oberen Probenkammerportals 126, wird die Luft mit Umgebungstemperatur in der Probenkammer 106 bewegt, darin verteilt und innerhalb der Kammer mit einem Flügel 124, der mit der Motorwelle 122 verbunden ist, gemischt. Der Flügel 124 sollte sich mit einer relativ hohen Geschwindigkeit drehen, beispielsweise schnell genug, um Luftgeschwindigkeiten von vorzugsweise ungefähr 250 m/min, besser von ungefähr 500 m/min, und am besten von ungefähr 1000 m/min in der Probenkammer 106 zu erzeugen. Mit dem sich sehr schnell drehenden Flügel 124, der ein Einzel- oder Mehrblattflügel sein kann, wird die Luft in die Probenkammer 106 bewegt, oder gezogen, und entlang des durch die gestrichelte Linie 136 gezeigten Wegs aus der Probenkammer 106 geblasen. Die Drehung des Flügels unterstützt außerdem die Vermischung der in die Probenkammer 106 geleiteten Luft und stellt den effizientesten Wärmeenergietransfer von der Fläche der dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 an die durch die Probenkammer 106 geleitete Luft sicher. Es ist klar, dass auch andere Aufbauten, als die hier dargestellten, die äquivalenten Funktionen ausführen können.
  • Da das Solenoid 132 betätigt werden kann, um die Lüftungsklappe 128 zu öffnen, wird die gesamte in die Probenkammer 106 geleitete Luft mit Umgebungstemperatur durch das obere Probenkammerportal 126 und dann durch das obere Gehäuseportal 130 ausgestoßen, wobei sie die Wärme der Probenkammer 106 in die umgebende Atmosphäre trägt. Das schnelle Mischen der Luft, die durch die Probenkammer 106 durchströmt und sich in ihr verteilt, resultiert in einem schnellen und gleichmäßigen Kühlen der Proben.
  • Beispiel 2
  • 9A zeigt die Ergebnisse von vier verschiedenen Temperatur-Zeit-Profilen (A–D) und deren resultierende Vervielfältigungsprodukte nach 30 Zyklen (A–D). Die Profile A und B in 9A wurden durch die Verwendung einer heizblockartigen Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik gewonnen, wobei die Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Stand der Technik benutzt wurden. Wie in 9A zu sehen ist, sind die Übergänge zwischen den Temperaturen langsam, und viele nichtspezifische Bande sind in den Profilen A und B gegenwärtig. Profil B zeigt eine Verbesserung, da (im Gegensatz zu Profil A) einige nichtspezifische Banden dadurch eliminiert wurden, dass die Zeit, die jede Probe auf jeder Temperatur bleibt, limitiert wurde, wodurch wieder gezeigt wurde, dass kürzere Zeiten erstrebenswertere Resultate liefern.
  • Die Profile C und D wurden mittels des in den 8A–B gezeigten Geräts erzeugt. Wie in 9A zu sehen ist, ist die Vervielfältigung spezifisch und auch wenn die Ausbeute in Profil C (60 Sekunden Verlängerungszeit) maximal ist, ist sie auch noch, insgesamt betrachtete, annehmbar in Profil D (10 Sekunden Verlängerungszeit).
  • Die optimalen Zeiten und Temperaturen für ein 536 bp Fragment von β-Globin der menschlichen Genom-DNS wurden ebenfalls bestimmt. Die Vervielfältigungsausbeute und die Produktspezifizität waren optimal, wenn die Denaturierung (93°C) und die Anlagerung (55°C) weniger als 1 Sekunde gedauert haben. Längere Denaturierungs- oder Anlagerungszeiten ergeben keine Vorteile. Die Ausbeute steigt mit längeren Verlängerungszei ten (77°C), aber es gibt wenig Veränderung bei längeren Verlängerungszeiten als 10 bis 20 Sekunden. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass die bis jetzt zur Verfügung stehenden Vorrichtungen für die DNS Vervielfältigung die Bedingungen, die für eine Optimierung der physikalischen und enzymatischen Erfordernisse der Reaktion nötig sind, nicht maximiert wurden.
  • Weitere Information können erhaltern werden aus: Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B. und Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF50B Locus", 39 Clinical Chemistry 804 (1993), und Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., and Rire, Kirk M., "Rapid DNS Amplification", The Poymerase Chain Reaktion 174 (1994).
  • Aus der in 9A bereitgestellten Information ist ersichtlich, dass die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die darin angeordneten Proben einem schnellen zyklischen Temperaturwechsel unterzieht, wobei die Temperatur der Probe mit einer Geschwindigkeit, die vorzugsweise mindestens 0,5°C/s groß ist, erhöht oder erniedrigt wird. Im Fall der vorliegenden Erfindung, die eine Polymerasekettenreaktion ausführt, wird die Temperaturänderung vorzugsweise in einem ungefähren Bereich von 30°C bis 50°C ausgeführt. Es ist vorteilhaft, dass der zyklische Temperaturwechsel schnell genug ausgeführt wird, um zumindest 30 Zyklen in 40 Minuten, oder noch vorteilhafter 30 Zyklen in 20 Minuten, oder am vorteilhaftesten 30 Zyklen in 10 Minuten zu komplettieren.
  • Das Gerät 100 erhöht oder erniedrigt vorteilhafterweise die Temperatur der Probe mit einer Geschwindigkeit von mindestens 1,0°C/s, noch vorteilhafter mit einer Geschwindigkeit von mindestens 4,0°C/s, und am vorteilhaftesten mit einer Geschwindigkeit von 10,0°C/s. Problematischerweise muss die biologische Probe, und nicht nur das Umgebungsmedium und/oder der Probenbehälter, die spezifische Temperaturänderung ausführen. Die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen, die zudem den Nachteil haben, dass sie nicht fähig sind, die Temperaturwechsel so schnell wie die vorliegende Erfindung durchzuführen, erkannten das Problem des schnellen und gleichmäßigen zyklischen Temperaturwechsels der Probe, und nicht nur des Temperaturwechsels des umgebenden Mediums und Behälters, nicht.
  • Unter Bezugnahme auf das Diagramm von 9B kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung erstrebenswerterweise einen Temperaturzyklus mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10°C/s erreichen, noch vorteilhafter mit einer Geschwindigkeit von 20°C/s, über einen Temperaturbereich von ungefähr 20°C, noch vorteilhafterweise über einen Temperaturbereich von ungefähr 30°C, und am vorteilhaftesten über einen Temperaturbereich von ungefähr 40°C. 9B zeigt die Temperatur der biologischen Probe in °C, nicht nur der Umgebungstemperatur oder des Behälters, während die biologische Probe dem Temperaturzyklus unterzogen wird. 9B zeigt eine PCR Probe, die bei 74°C beginnt und für 2 Sekunden auf die Denaturierungstemperatur, angezeigt durch D, von ungefähr 92°C erwärmt wird. Die Probe wird dann für 2 Sekunden auf eine Anlagerungstemperatur, angezeigt durch A, von ungefähr 55°C abgekühlt. Der Übergang zwischen der Denaturierungstemperatur und der Anlagerungstemperatur umfasst einen Bereich von 37°C in unter 4 Sekunden, was eine Geschwindigkeit von 10°C/s darstellt. Die Probe wird dann für 5 Sekunden auf eine Verlängerungstemperatur von 74°C erwärmt, wie durch E in der 9B angezeigt ist. Das zyklische Durchlaufen der Proben von Denaturierungs-, Anlagerungs-, und Verlängerungstemperatur wird 30 mal oder so oft wie gewünscht wiederholt.
  • Die 9C–G zeigen Beispielszyklen anderer bevorzugter Temperatur-Zeit-Profile. Es ist für die Fachleute klar, dass die dargestellten Temperatur-Zeit-Profile verändert werden können, um spezielle Prozesse gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen. Die Fachleute verstehen außerdem, dass die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren, wie die Vorrichtung, die über einen Festkörper oder eine Flüssigkeit Wärme zu oder von der Probe leitet, die hier dargestellten resultieren den Temperatur-Zeit-Profile nicht bereitstellen können. Darüber hinaus werden von den früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren die hier vorgestellten Temperatur-Zeit-Profile weder vorgeschlagen noch gelehrt. Des weiteren ist verständlich, dass die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren, die die Luft als Transfermedium verwenden, beispielsweise die früher zur Verfügung stehenden Chromatographieöfen, die hier beschriebenen und bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung erhaltenen Temperatur-Zeit-Profile weder bereitstellen können, noch diese vorschlagen oder lehren.
  • Um die kürzeste Temperaturzykluszeit bereitzustellen, ist es vorteilhaft, dass die Lampe (mit 112 in den 8A und 8B bezeichnet) eine Leistung von 2000 Watt aufweist, oder mehrer Lampen vorgesehen sind, die eine ähnliche Ausgangsleistung bereitstellen. Es ist außerdem bevorzugt, einen Temperaturgefälle-Steuerschaltkreis vorzusehen, der in 10 in Verbindung mit einem A-Bus-Steuerungs-/Aufnahmesystem dargestellt ist, wobei ein 8052 micro controller board mit einer Uhr und einem Hochsprachen-Programm-Interpreter, erhältlich von Alpha Products (Modell Nr. SP-127), Darian, Connecticut, verwendet wird. Ein beispielhafter Programmcode, der in Verbindung mit dem beschriebenen Microcontroller verwendet wird, ist im Programmcodeanhang A beinhaltet, der beiliegt und Teil der Anmeldung ist. Der in Anhang A vorgestellte Programmcode ist eine BASIC52 Datei zum seriellen Herunterladen in einen Microcontroller und stellt eine beispielhafte Temperaturverlaufsteuerung während des Temperaturzyklus bereit. Die Verwendung einer 2000 Watt wärmeerzeugenden Vorrichtung und die beschriebenen Steueraufbauten ermöglichen Temperaturzyklusgeschwindigkeiten von 20°C/s, was erstrebenswerterweise erreicht wird.
  • Die bevorzugte Anordnung für den in der 10 dargestellten Temperaturgefälle-Steuerschaltkreis wird erläutert werden, wobei klar ist, dass die nicht explizit in 10 dargestellten zusätzlich nötigen Komponenten ohne Weiteres von den Fachleuten bereitgestellt werden können.
  • Der in 10 dargestellte Temperaturgefälle-Steuerschaltkreis beinhaltet ein Thermoelement 200, das, wie vorher beschrieben, an die Probentemperaturreaktion angepasst wurde. Das Thermoelement 200 ist mit einem integrierten Schaltkreis 206 verbunden, der vorteilhafterweise einer der bekannten aus dem Stand der Technik, wie beispielsweise ein AD595, ist, dessen Ausgang zu einem Tiefpassfilter vierter Ordnung 208 mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz und zu einem 12 bit Analog/Digital-Konverter 210, dessen Ausgang dazu benutzt wird, eine digitale Darstellung der Temperatur bereitzustellen, führt.
  • Der Ausgang des Schaltkreises 206 ist außerdem zu einem Gefälle-Messschaltkreis geleitet. Der Gefälle-Messschaltkreis 212 beinhaltet vorzugsweise einen 353-Operationsverstärker 218, ein 100 kΩ Potentiometer 214, ein 1 MΩ Potentiometer 230 und einen 22 μF Kondensator. Der Gefälle-Messschaltkreis 212 gibt ein Signal an den invertierenden Eingang eines 353-Operationsverstärkers 246 aus.
  • Ein Gefälle-Festlegschaltkreis 222 beinhaltet einen Digital/Analog Konverter 226 zum Festlegen eines positiven Gefälles und einen Digital/Analog Konverter 224 zum Festlegen eines negativen Gefälles. Die Digital/Analog Konverter 224 und 226 sind vorzugsweise 8-bit Digital/Analog Konverter, die im Stand der Technik mit DA147 bezeichnet werden. Der Gefälle-Festlegschaltkreis kann vorzugsweise Anweisungen von anderen digitalen Vorrichtungen (nicht in 19 dargestellt), wie beispielsweise einem PC empfangen. Die Ausgabe des Gefälle-Festlegschaltkreises 228 ist mit einem Summier-Schaltkreis 240 verbunden.
  • Der Summier-Schaltkreis 240 beinhaltet vorzugsweise 100 kΩ Widerstände 236, 238 und 244 und einen 353-Operationsverstärker 242. Die Ausgabe des Summier-Schaltkreises 240 wird in den nicht-invertierenden Eingang des Operationsverstärkers 246 geleitet und stellt das Sollgefälle für die Temperaturänderung dar. Die Ausgabe des Operationsverstärkers 246 wird an einem Transistor 248 bereitgestellt, der einen Energie-An/Ausschalt-Schaltkreis 262 umfasst.
  • Der Energie-An/Ausschalt-Schaltkreis 262 beinhaltet ein 5 VDC Netzteil, das einen Strom an dem Transistor 248 bereitstellt. Der Transistor 248 weist einen mit einem 3010-Schaltkreis 254 mit Hilfe eines Widerstands 252, vorzugsweise einem 300 Ω Widerstand, verbundenen Emitter auf. Der 3010-Schaltkreis 254 beinhaltet einen Ausgang, der in Reihe mit einem Widerstand 256, der vorzugsweise ein 180 Ω Widerstand ist, verbunden ist. Ein Zweiwegethyristor 258 wird vorzugsweise dazu benutzt, den der Lampe 262 oder einer anderen wärmeerzeugenden Vorrichtung von einer Gleichstromquelle 260 gelieferten Strom, zu steuern.
  • Der in 10 dargestellte Temperaturgefälle-Steuerschaltkreis, gemeinsam mit den anderen beschriebenen Systemkomponenten, stellt einen zyklischen Temperaturwechsel von biologische Proben von 20°C/s über einen Temperaturbereich von 30°C, und noch vorteilhafter über einen Bereich von 40°C, bereit, wobei die Homogenität über die gesamte biologische Probe aufrechterhalten wird.
  • Es ist verständlich, dass die hierin beschriebenen Systeme auf einfache Weise für viele verschiedene Anwendungen verwendet werden können, einschließlich: einem Polymerase-Kettenreaktionsprozess, einem zyklischen Sequentieren und anderen Verstärkungsprotokollen wie der Ligase-Kettenreaktion. Die vorliegende Erfindung stellt auch auf vorteilhafte Weise eine Vorrichtung für eine genaue Steuerung der Temperatur von Proben, die sich in der Probenkammer befinden, und zum schnellen und genauen Variieren der Temperatur der Proben, die sich in einer Kammer befinden, gemäß einem vorbestimmten Temperatur-gegenüber-Zeit-Profil zur Verfügung.
  • Wie vorher gezeigt, und im Gegensatz zu den Lehren des Stands der Technik, kann die Polymerasekettenreaktion schnell durchgeführt werden. Mit Hilfe der hierin beschriebenen Verfahren und Geräten kann die nötige Anzahl der Temperaturzyklen in weniger Zeit durchgeführt werden, beispielsweise in 15 Minuten, als mit den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik möglich ist. Durch Minimierung der Denaturierungs- und Anlage rungszeiten werden zudem die Spezifizität und Ausbeute der schnell zyklisch durchlaufenen Vervielfältigung in einem bisher nicht möglichen Maß verbessert. Darüber hinaus, zusätzlich zu der vereinfachten schnellen Wärmeübertragung, ermöglicht, gemäß der vorliegenden Erfindung, die Verwendung von optisch klaren Probenbehältern, wie beispielsweise klaren Kapillarröhrchen, eine kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung der DNS Vervielfältigung.
  • 10A zeigt graphisch die Auswirkung der Temperaturübergangsgeschwindigkeiten auf die PCR Spezifizität und die Ausbeute unter Verwendung einer Vorrichtung der vorliegenden Erfindung. Die Ergebnis aus 10A wurden mit Hilfe eines 536 bp Fragments des β-Globin Gens erhalten, das aus 50 ng der menschlichen Genom-DNS mit 50 mM Tris, pH 8,3, 2 mM MgCl2, 50 μg/ml Serumalbumin vom Rind, 0,5 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jeder dNTP, und 0,4 U native Taq DNS Polymerase in einer 10 μl Reaktionsflüssigkeit. Die menschlichen β-Globin Primer RS42 und KM 29 (536 Basenpaare) werden beschrieben in: C T. Wittwer, G. C. Fillmore and D. R. Hillyard "Automated Polymerase Chain Reaktion in Capillar Tubes with Hot Air" Nucl. Acid Res. 17: 4353–4357. Die Temperaturzyklusparameter waren 94°C für 0 Sekunden, 55°C für 0 Sekunden, und 72°C für 10 Sekunden. 35 Vervielfältigungszyklen wurden mit den angegebenen Geschwindigkeiten zwischen allen Temperaturen durchgeführt. Die Proben wurden danach einer Elektrophorese auf einem 1,5%-igen Agarosegel unterzogen und mit 0,5 μg/ml Ethidiumbromid eingefärbt. Spezifizität und Ausbeute verringerten sich, wenn sich die Temperaturübergangsgeschwindigkeiten verringerten.
  • Fluoreszenzsonden können verwendet werden, um die DNS Vervielfältigung zu detektieren und zu überwachen. Wie den Fachleuten bekannt ist, beinhalten nützliche Sonden Doppelstrang-DNS-spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden. Mit dem interkalierten Ethidiumbromid steigt die UV-angeregte rote Fluoreszenz nach der Vervielfältigung an. Während Mikrozentrifugenröhrchen als Probenbehälter für die DNS Ver vielfältigung verwendet wurden, wurden in den hier beschriebenen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung vorteilhafterweise Probenbehälter mit vielen Struktureigenschaften benutzt, die hier als Kapillarröhrchen bezeichnet werden.
  • Die Verwendung der hier beschriebenen Probenbehälter ermöglicht die Fluoreszenzdetektion, während die Probe in dem Behälter enthalten ist, wie in Kürze vollständiger erklärt werden wird. Für die Fachleute ist klar, dass mehrere unterschiedliche Arten der Fluoreszenzdetektion der DNS-Vervielfältigung, die zum jetzigen Zeitpunkt zur Verfügung stehen, verwendbar sind. Beispielsweise ist ohne weiteres eine sequenzspezifische Fluoreszenzdetektion möglich, wobei die vorliegende Erfindung und oligonukleotide Hybridisierungssonden verwendet werden. Als weiteres Beispiel können die dualmarkierte Fluorescein/Rhodamin Sonden während der Polymeraseverlängerung durch die 5'-exonuklease Aktivität geschnitten werden, wobei die Fluorophore separiert werden und die Fluorescein/Rhodamin Fluoreszenzrate ansteigt.
  • Beim Verwenden der im Folgenden beschriebenen Ausführungsbeispielen der vorliegenden Erfindung kann die Fluoreszenz nachdem der Temperaturzyklus komplettiert ist, einmal pro Zyklus als eine Überwachung der Produktakkumulation, zwei- oder mehrmals während eines Temperaturübergangs, oder kontinuierlich in jedem Zyklus gemessen werden. Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung durchlaufen die früher zur Verfügung stehenden Verfahren den Zyklus relativ langsam und lehrten weder die Aufnahme noch die Analyse von Fluoreszenz während der Temperaturänderungen.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt eine Zyklus-für-Zyklus Überwachung der Vervielfältigung der Kopienzahl der Anfangsvorlage. Um eine solche Zyklus-für-Zyklus Überwachung auszuführen, wird die Fluoreszenz während der Verlängerungs- oder der kombinierten Verlängerungs-/Anlagerungsphase in jedem Zyklus aufgenommen und mit der Produktkonzentration in Relation gesetzt. Beispielsweise ist eine quantitative Reihenuntersuchung der Hepatitis C RNA unter Verwendung des interkalierenden YO-PRO-1TM im Stand der Technik bekannt und kann in Verbindung mit vorliegender Erfindung verwendet werden. Für weitere Information vgl.: Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki, and Y. Mitoma, 1995, "Homogenous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater", Anal. Biochem. 229: 207–213. Vor der vorliegenden Erfindung wurde eine kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung in jedem Zyklus während den Temperaturübergängen nicht versucht.
  • Eine hierin offenbarte Ausführungsform ist ein schneller zyklischer Temperaturwechsler mit integrierter 2-Farbenfluoreszenzoptik zur Bereitstellung einer kontinuierlichen Fluoreszenzüberwachung. Wie im Folgenden vollständiger diskutiert werden wird, werden hier unterschiedliche vorteilhafte Fluoreszenztechniken zum Überwachen der DNS Vervielfältigung bereitgestellt. Die Fachleute sind mit der Verwendung von Ethidiumbromid in den Fluoreszenztechniken vertraut, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In einer weiter unten beschriebenen derzeit bevorzugten Ausführungsform, wird bevorzugt SYBR® Green I, das im Stand der Technik wohlbekannt ist und von Molecular Probes, Eugene, Oregon, bezogen werden kann, als Doppelstrang-spezifischer Farbstoff verwendet.
  • In einer derzeit bevorzugten Ausführungsform werden Zeit, Temperatur, und Fluoreszenz alle 200 ms während der Vervielfältigungsreaktion aufgenommen. Beim regelmäßigen Aufnehmen der Daten während der Reaktion, deckt die Datenaufnahme feine Details der Produktdenaturierung, -wiederanlagerung, und -verlängerung auf, die mit früher zur Verfügung stehenden Geräten und Verfahren nicht zugänglich waren.
  • Wie von den Fachleuten verstanden werden wird, ist die einmal-pro-Zyklus Überwachung von mehreren Proben, die einer DNS Vervielfältigung unterzogen werden, ein leistungsfähiges quantitatives Werkzeug. Wichtigerweise kann, wie sich durch das Verständnis dieser Offenlegung zeigt, die kontinuierliche Überwachung in einem Zyklus die Natur der Sondenfluores zenz identifizieren, wodurch Einblicke in die DNS Vervielfältigungsmechanik, die früher im Stand der Technik nicht zur Verfügung standen, Zugang zu PCR Produkten, und Sondenschmelzkurven bereitgestellt werden, um die Vervielfältigungsprodukte und Mutationen zu identifizieren.
  • Unter Bezugnahme auf die 11 ist eine schematische Ansicht eines vorteilhaften Temperaturwechsels mit Fluoreszenzdetektion, der im allgemeinen mit dem Bezugszeichen 300 versehen ist, bereitgestellt. Eine Heißluftgebläsequelle 302 ist vorzugsweise vorgesehen. Die Heißluftgebläsequelle 302 ist vorzugsweise eine kommerziell erhältliche Vorrichtung mit einer 1600 W Heizwendel und einem Ventilator. Eine Kaltluftgebläsequelle 304 ist ebenfalls vorteilhafterweise vorgesehen. Die Kaltluftgebläsequelle 304 ist vorzugsweise ein Spaltpolgebläse mit 2200 Umdrehungen/min, das von Dayton, Niles, Illinois, Modell Nr. 4C006B, bezogen werden kann. Es ist vorteilhaft, dass die Kaltluftgebläsequelle 304 Luft mit Raumtemperatur bereitstellt, aber es liegt auch im Schutzbereich der Erfindung, dass eine Vorrichtung verwendet wird, die ein Fluid bereitstellt, das eine niedrigere Temperatur als die Raumlufttemperatur aufweist.
  • In dem Ausführungsbeispiel von 11 verbinden Kanäle 306 und 308 die Heißluftgebläsequelle 302 bzw. die Kaltluftgebläsequelle 304 mit der Probenkammer 310. Die Kanäle 306 und 308 sind vorzugsweise geriffelte schwarze Nylonröhren mit einem Durchmesser von 2,5 cm. Der Kanal 306 ist über den Anschluss 306A mit der Probenkammer 310 verbunden und der Kanal 308 ist über den Anschluss 308A mit der Probenkammer 310 verbunden. Ein Belüftungs- (312) und ein Ausstoß-(314)Ventilator dienen dazu, Luft aus der Probenkammer 310 zu bewegen. Darüber hinaus ist eine Vorrichtung zum Abschotten des Inneren der Probenkammer 310 vom Umgebungslicht integral mit der Probenkammer 310 vorgesehen.
  • Die Temperatur der Proben in der Probenkammer 310 wird vorzugsweise von einem röhrenförmigen, Metall ummantelten Thermoelement, das von Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho, Modell Nr. 1844, bezogen werden kann, überwacht, das an die Temperaturreaktion der in den bevorzug ten Probenbehältern wie beispielsweise Kapillarröhrchen enthaltenen Proben angepasst ist. Wichtig ist, dass die Temperaturhomogenität in der Probenkammer 310 durch das Vermischen der Luft in der Probenkammer 310 erreicht wird. Es ist vorteilhaft, dass ein solches Mischen der Luft in der Probenkammer 310 durch einen zentralen Probenkammerventilator 318 durchgeführt wird. Der Probenkammerventilator 318 beinhaltet vorzugsweise einen 1,7 × 11 cm großen Ventilatorflügel, der bei Idaho Technology, Modell Nr. 1862, erhältlich ist, und einen Motor, der auch bei Idaho Technology, Modell Nr. 1861, erhältlich ist, und erzeugt eine Luftgeschwindigkeit von mindestens 800 bis 1000 m/min in der Probenkammer 310. Solche schnellen Luftgeschwindigkeiten müssen nicht in allen Anwendungsbereichen der vorliegenden Erfindung nötig sein, aber schnelle Luftgeschwindigkeiten fördern ein intensives Mischen und die Temperaturhomogenität in der Probenkammer 310.
  • In der Probenkammer 310 sind mehrere Proben in Kapillarröhrchen enthalten, von denen einige mit 320 bezeichnet sind, und in vertikaler Ausrichtung in einem drehbaren Karussell 322 platziert sind. Das Karussell 322 hat vorzugsweise 14 cm im Durchmesser und wird durch einen Schrittmotor, der durch ein Mikroschrittantriebsmodul 326 gesteuert wird, mit 400 Schritt pro Umdrehung gedreht. Der Schrittmotor 324 ist vorzugsweise einer, der von New England Affiliated Technologies, Lawrence, Massachusetts, unter der Modell Nr. 2198364 bezogen werden kann, und das Mikroschrittantriebsmodul 326 ist vorzugsweise eines, das ebenfalls von New England Affiliated Technologies, Lawrence, Massachusetts, unter der Modell Nr. MDM7 micro stepping drive module bezogen werden kann, das 12.800 Schritte pro Rotation des Karussells 322 bereitstellt.
  • Immer noch unter Bezugnahme auf die 11, wird eine Fluoreszenz-Anregungsquelle 328 bereitgestellt. Eine bevorzugte Anordnung für den Anregungsweg gemäß der vorliegenden Erfindung wird jetzt beschrieben werden, wobei eine bevorzugte Anordnung für den erfindungsgemäßen Auffangweg danach beschrieben werden wird. Die Fluoreszenz-Anregungs quelle 328 beinhaltet vorteilhafterweise eine 75 W Xenon Lichtbogenquelle 328A, die mit einem elliptischen Reflektor 328B fokussiert wird. Die Xenon Lichtbogenquelle 328 mit einem f/2,5 elliptischen Reflektor 328B ist vorzugsweise bei Photon Technology Internation, South Brunswick, New Jersey, unter der Modell Nr. A1010 erhältlich. Das Energienetzteil und andere erforderliche Komponenten, um die Fluoreszenz-Anregungsquelle 328 zu betreiben, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Alternativ kann eine lichtemittierende Diode als Fluoreszenz-Anregungsquelle verwendet werden. Die Fachleute werden verstehen, dass viele verschiedene Anregungsquellen im Rahmen des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Die Strahlung, die von der Fluoreszenz-Anregungsquelle 328 emittiert wird, wird mit einer justierbaren Iris 334, wie beispielsweise in der Industrie bei Rolyn, Covina, Californien, Modell Nr. 75.0125 erhältlich ist, auf ungefähr 2 mm fokussiert. Das von der Fluoreszenz-Anregungsquelle 328 emittierte Licht fällt auf einen kalten Spiegel 330, der vorzugsweise bei Rolyn unter der Modell Nr. 60.440 erhältlich ist, und führt dann durch ein Wärme absorbierendes Glas 332, das vorzugsweise auch eines von Rolyn unter der Modell Nr. 65.3130 erhältliches ist. Nach der Kollimation durch eine plankonvexe Linse 336, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modell Nr. 10.0260 erhältlich ist, einen 450–490 nm Bandpass-Interferenzfilter 338, der vorzugsweise bei Omega Optical, Brattleboro, Vermont unter der Modell Nr. 470RDF40 erhältlich ist, eine fokussierende plankonvexe Linse 340, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modell Nr. 10.0260 erhältlich ist, und ein 1 mm Siliziumdioxidfenster 342, um eine Kondensation auf den gerade beschriebenen optischen Komponenten während des Temperaturwechsels zu verhindern, wird ein 5–7 mm großer Bereich eines der Kapillarröhrchen 320A illuminiert, wobei der beschrieben Anregungsweg benutzt wird.
  • Unter weiterer Bezugnahme auf die 11 wird als nächstes der Auffangweg zum Auffangen der von der Probe 320A emittierten Fluores zenz beschrieben. Die Optik des Auffangwegs beinhaltet ein 1 mm dickes Fenster aus Siliziumdioxid, das in dem optischen Weg angeordnet ist, um die Kondensation auf den anderen optischen Komponenten zu verhindern. Zwei einander gegenüberliegende asphärische Linsen 346A und B, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modell Nr. 17.1175 erhältlich sind, dienen dazu, die emittierte Fluoreszenz auf einen 2 × 10 mm großen Spalt 348 zu fokussieren. Der Spalt 348 kann vorzugsweise durch das Schneiden eines ausgestellten Röntgenstrahlenfilms hergestellt werden und der Spalt 348 dient als räumlicher Filter. Nach dem Spalt 348 (der als räumlicher Filter wirkt) wird die emittierte Fluoreszenz auf eine elektronische 35 mm Blende 350 geführt, die mittels einer elektronischen Blendensteuervorrichtung 352 betätigt wird. Die elektronische 35 mm Blende ist vorzugsweise ein Uniblitz Blendenmodell Nr. VS35 und die elektronische Blendensteuervorrichtung 352 ist vorzugsweise ein Treiber mit der Modell Nr. D122, die beide von Vincent Associates, Rochester, New York, bezogen werden können, Darüber hinaus ist auch eine asphärische Sammellinse 354, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modell Nr. 17.1175 erhältlich ist, vorgesehen.
  • Ein Filter 356 ist auch dann beinhaltet, wenn eine Detektion einer Emission von SYBR® Green I gewünscht ist. Der Filter 256 ist vorzugsweise ein 520–580 nm Bandpassfilter, der bei Omega unter der Modell Nr. 550RDF60 erhältlich ist, der vorzugsweise für eine Aufnahme einer einzelnen Wellenlänge verwendet wird. Für die Detektion anderer Emissionen, kann beispielsweise eine Kombination eines dichroitischen Filters 358 und der Wellenlängenfilter 358A und 358B verwendet werden. Zum Beispiel besteht der dichroitische Filter 358 für die Separation der Fluorescein- und Rhodaminemission aus einem 560 nm dichroitischen Filter, der vorzugsweise von Omega unter der Modell Nr. 560 DRLP erhältlich ist, einem 520–550 nm Bandpassfilter (358A) für die Detektion von Fluorescein, der von Omega unter der Modell Nr. 535DF30 erhältlich ist, und einem 580–620 nm Bandpassfilter (538B) für die Detektion von Rhodamin, der von Omega unter der Modell Nr. 600DF40 erhältlich ist. Für die Separation von Fluores cein- und Cy5TM-Emissionen ist der dichroitische Filter 358 vorzugsweise ein 590 nm dichroitischer Filter, der von Omega unter der Modell Nr. 590DRLP erhältlich ist, und die Filter 358A und B bestehen vorzugsweise aus einem 520–550 nm Bandpassfilter (358A) für die Detektion von Fluorescein, der von Omega unter der Modell Nr. 535DF30 erhältlich ist, und einem 660–680 nm Bandpassfilter (358B) für die Detektion von Cy5TM, der von Omega unter der Modell Nr. 670DF20 erhältlich ist. Den Fachleuten erschließt sich problemlos, dass die Verwendung anderer Komponenten einfach implementiert werden kann, wobei die hier dargelegten Informationen benutzt werden können, um andere Fluoreszenzwellenlängen aufzufangen.
  • Immer noch wird auf die 11 Bezug genommen, wobei die emittierte Fluoreszenz, nachdem sie den Filtern 358A und 358B unterzogen wurde, durch zwei plankonvexe Linsen 360A und 360B, die vorzugsweise bei Edmund, Barrington, New Jersey, unter der Modell Nr. 32970 erhältlich sind, auf zwei Photomultiplierröhren 362A bzw. 362B fokussiert wird. Die Photomultiplierröhren ("PMT") 362A und 362A sind vorzugsweise bei Hamamatsu, Middlesex, New Jersey, unter der Modell Nr. R928 erhältlich, und sind jeweils von einem geeigneten Gehäuse mit einer entsprechenden Schaltkreistechnik mit analogen Aufnahmefähigkeiten umschlossen, das vorzugsweise von Photon Technology International unter der Modell Nr. 714 erhältlich ist. Ein PMT- und Daten-Aufnahmesteuermodul 364 ist außerdem vorteilhafterweise vorgesehen. Manuelle aus dem Stand der Technik bekannte PMT Blenden 366A und 366B sind zusätzlich vorgesehen.
  • Die im Vorhergehenden beschriebenen optischen Komponenten sind vorzugsweise 5 cm im Durchmesser und in einer fünf Zentimeter universellen Linsenbefestigung angebracht, wie der die unter der Modell Nr. 90.0190 von Rolyn erhältlich ist. Wie von den Fachleuten ausgeführt werden kann, können viele der nötigen Konstruktionskomponenten aus schwarzem DelrinTM mit den in der Industrie bekannten Techniken hergestellt werden.
  • Für die Fachleute ist klar, dass der schnelle zyklische Temperaturwechsler mit Fluoreszenzdetektion 300 vorteilhafterweise auch mit lichtemit tierenden Dioden (LEDs) und Photodioden statt der in 11 dargestellten ähnlich funktionierenden Komponenten aufgebaut werden kann. Demnach kann die Funktion der Fluoreszenz-Anregungsquelle 328 von einer lichtemittierenden Diode übernommen werden. Die Photomultiplierröhren 362A und 362B können durch Photodioden ersetzt werden. Zusätzliche Informationen bezüglich geeigneter lichtemittierender Dioden und Photodioden werden später hier bereitgestellt. Es ist klar, dass die Sensitivität der Technik durch die Hintergrundfluoreszenz begrenzt ist, wovon die meiste von den Sonden und nicht von dem Detektionssystem kommt. Kennzeichnenderweise ist die Stabilität aber im Allgemeinen wichtiger als die absolute Sensitivität.
  • Den Fachleuten ist klar, dass der in 11 dargestellte schnelle zyklische Temperaturwechsler mit Fluoreszenzdetektion 300 die zuträglichen Eigenschaften einer Fluorometervorrichtung mit schneller Temperaturwechselsteuerung beinhaltet, eine Kombination die nirgends im Stand der Technik vorgeschlagen oder gelehrt wird. Die PCR kann innerhalb der 10 bis 20 Minuten des Temperaturzyklus durchgeführt und analysiert werden. Die vorliegende erfindungsgemäße Kombination aus 1) Fluoreszenzüberwachung innerhalb jedes Temperaturzyklus und 2) Analyse der Temperatur- und Zeitabhängigkeit der Hybridisierung stellt Vorteile bereit, die anderweitig nicht erhältlich wären.
  • Es ist möglich Einzel-Farb-Fluoreszenz-Verfahren zu verwenden, um die Produktreinheit zu überwachen und die Vorlagen während der PCR mengenmäßig zu bestimmen. Farbstoffe, die den DNS-Strangzustand überwachen, werden zu den PCR Reaktionen für die Überwachung während des Temperaturwechselns dazu gegeben, wobei die erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele benutzt werden.
  • Es werden nun bestimmte Beispiele, bei denen das in der 11 dargestellte Gerät verwendet wurde, vorgestellt. Die DNS Vervielfältigung wurde, wenn nicht in den folgenden Beispielen anders angegeben, in 50 mM Tris, pH 8,3 (25°C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Serumalbumin vom Rind, 0,5 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem Desoxynukleotid Triphosphat und 0,2 U Taq Polymerase pro 5 μl Probe durchgeführt. Zudem wurde in den folgenden Beispielen als DNS Vorlage die menschliche Genom-DNS (denaturiert bei 1 min Kochen) oder ein gereinigtes Vervielfältigungsprodukt verwendet. Das gereinigte Vervielfältigungsprodukt wurde durch Phenol/Chloroform Extraktion und Ethanol Ausfällung (siehe D. M. Wallace 1987, Large- and small-scale Phenol extraction and preciptitation of nucleic acids und beschrieben auf den Seiten 33–48 bei S. L. Berger und A. R. Kimmel (Hrsg.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), Academic Press, Orlando), gefolgt von der Entfernung der Primer durch wiederholtes Auswaschen durch einen Centricon 30 Mikro Konzentrator (erhältlich bei Amicon, Danvers, Massachusetts) erhalten. Die Vorlagenkonzentration wurde durch die Absorption bei 260 nm bestimmt. Das A260/A290 Verhältnis der Vorlagen war größer als 1,7.
  • In diesen Beispielen wurden die Primer durch die aus dem Stand der Technik bekannte Standard-Phosphoramidit-Chemie synthetisiert, wobei der Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey) verwendet wurde. Das 180 Basenpaar Fragment des Hepatitis B Oberflächen Antigen Gens wurde mittels der Primer 5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (Sequenz ID Nr. 1) und 5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (Sequenz ID Nr. 2) (Genbank Sequenz HVHEPB) vervielfältigt. Der SYBR® Green I Farbstoff wurde von Molecular Probes (Eugene, Oregon) bezogen. Die β-Aktin Primer und die Fluorescein/Rhodamin Dualsonden wurden von Perkin Elmer (Foster City, Californien) (Nr. N808-0230) bezogen. Die menschlichen β-Globin Primer RS42/KM29 (536 Basenpaare) und PC03/PC04 (110 Basenpaare) sind beschrieben in: C. T. Wittwer, G. C. Fillmore, and D. R. Hillyard, "Automated Polymerase Chain Reaktion in Capillary Tubes with Hot Air", Nucl. Acids Res. 17: 4353–4357, welches hierin durch Verweis mitaufgenommen wird. Die einzelmarkierten Sonden:
    5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-Fluorescein-3' (Sequenz ID Nr. 3) und
    5'-Cy5TM-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-Phosphat-3' (Sequenz ID 4)
    wurden mittels eines Fluorescein-Phosphoramidit (erhältlich bei Glen Research, Sterlin, Virginia, Nr. 10-1963), einem Cy5TM-Phosphoramidit (erhältlich bei Pharmacia Nr. 27-1801-02), und einem chemischen Phosphorilierungsreagenz (erhältlich bei Glen Research, Nr. 10-1900) synthetisiert. Die angrenzenden Sonden hybridisieren intern an dem PC03/PC04 β-Globin Primerpaar auf dem gleichen DNS Strang und sind durch ein Basenpaar getrennt. Die Sonden wurden durch umgekehrte C-18 Phase Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt, und ihre Homogenität wurde durch Polyacrylamid-Elektrophorese und Absorption (A260 und die Absorptionsmaxima der Fluorophore) überprüft. Die Hybridisierungssonden (β-Aktin und β-Globin) wurden jeweils mit 0,2 mM verwendet.
  • In den relevanten, hier beschriebenen Beispielen, werden Vervielfältigungsproben mit 5 μl in Kapillarröhrchen, von denen einige in der 11 durch das Bezugszeichen 320 dargestellt sind, gefüllt. Die bevorzugten Kapillarröhrchen sind solche, die bei Idaho Technology, unter der Modellnummer 1705 erhältlich sind, mit einer Abmessung von 1,02 mm im Außendurchmesser und 0,56 mm im Innendurchmesser. Einmal befüllt werden die Kapillarröhrchen durch eine Butanflamme versiegelt. Die Oberfläche des Kapillarröhrchens wurde mit optischem Qualitätsmethanol gereinigt, bevor es in das Karussell 322 des schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion 300 geladen wurde.
  • Die Steuerung der in der 11 dargestellten Komponenten wurde mit Hilfe einer graphische Programmiersprache, die als LabView bekannt ist (erhältlich bei National Instruments, Austin, Texas), und einer 12-bit Multifunktions-Eingangs/Ausgangs-Karte 368A (erhältlich bei National Instruments unter der Bezeichnung AT-MIO-E2) in einem PC kompatiblen Computer 368, der einen Intel® 80486 Mikroprozessor mit einer Taktfrequenz von 120 MHz verwendet, ermöglicht. Die Analogausgangskanäle der Eingangs-/Ausgangs-Karte 368A wurden dazu verwendet, die Sensitivität, d. h. die PMT Spannung, jeder Photomultiplierröhre 362A bzw. 362B zu steuern. Die analogen Eingangskanäle auf der Eingangs-/Ausgangs-Karte 368A empfangen die Signale von der jeweiligen Photomultiplierröhre 362A bzw. 362B. Der PC kompatible Computer 368 steuert durch die Eingangs-/Ausgangs-Karte 368A die Position, die Geschwindigkeit und die Richtung der Bewegung des Karussells 322. Zum Beispiel positioniert das Karussell 322, wenn viele Kapillarröhrchen aufgenommen sind, jedes Kapillarröhrchen schnell nacheinander für eine 10–100 ms dauernden Aufnahmezeitspanne an einer Überwachungsposition (die Position ist durch das Kapillarröhrchen 320A gekennzeichnet). Für ein kontinuierliches Überwachen eines einzelnen Kapillarröhrchens, verbleibt das Kapillarröhrchen an der Überwachungsposition, während vorzugsweise alle 200 ms Daten aufgenommen werden, aus denen nach bekannten Verfahren der Durchschnitt gebildet wird. Die Zeit, die Temperatur und vorzugsweise zwei Fluoreszenzkanäle werden kontinuierlich als Fluoreszenz-gegen-Zykluszahl und Fluoreszenz-gegen-Temperatur Diagramme auf einem Monitor 368B dargestellt, der mit dem Computer 368 verbunden ist.
  • Das Karussell 322 sollte dort positioniert werden, wo die maximale Fluoreszenz und die Signale aufgenommen werden. Wenn ein einziges Kapillarröhrchen, wie beispielsweise das Kapillarröhrchen 320A überwacht wird, werden die Signale alle 200 ms aufgenommen, wobei eine Integrationszeitkonstante an der Photomultiplierröhre 362A oder 362B, oder an beiden, auf 50 ms gesetzt wird. Für mehrere Probenröhrchen wird die Zeitkonstante auf 0,5 ms gesetzt und das Karussell wird einmal gedreht, um an der genauen Position angeordnet zu sein, wo jedes Kapillarröhrchen 320 an jedem der beiden Kanäle die maximale Fluoreszenz bereitstellt. Nachdem das Kapillarröhrchen 320A an der Position mit der maximalen Fluoreszenz positioniert ist, wird die Sensitivität jeder Photomultiplierröhre 362A und 362B justiert und das Karussell wieder gedreht, um die Position aller Kapil larröhrchen 320 in dem Karussell 322 zu zählen und zu lokalisieren. Wenn nur eine Signalfluoreszenzaufnahme einmal pro jedem Vervielfältigungszyklus während der Verlängerung gewünscht ist, wird jedes Kapillarröhrchen 320 auf dem Karussell nacheinander an der Überwachungsposition für 100 ms positioniert. Die kontinuierliche Aufnahme bei mehreren Röhrchen kann auch durch ein kontinuierliches Drehen des Karussells 322 erreicht werden. Die Temperatursteuerprogrammierung ist basiert auf und modifiziert von einem kommerziell erhältlichen schnellen zyklischen Temperaturwechsler, der von Idaho Technology unter dem Markenname RapidcyclerTM bezogen werden kann, mit einem 8051 cross compiler, der von Systronics, Salt Iake City, Utah unter der Bezeichnung BCI51 erhältlich ist, und einem Dallas Development System (ebenfalls bei Systronics unter der Bezeichnung DPB2 erhältlich).
  • In der Praxis ist die Temperaturreaktion des schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion 300 ähnlich zu der Reaktion der in den 8A und 8B dargestellten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wobei 20–30 Sekundenzyklen (30 Zyklen in 10–15 Minuten) ermöglicht werden, wie in dem Temperatur-gegen-Zeit Diagramm von 11A gezeigt ist (welches einige Zyklen eines bevorzugten Temperaturprofils zeigt). Wenn ein Doppelstrang-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff während der Vervielfältigung vorhanden ist, erhöht sich die Fluoreszenz im Allgemeinen, wenn mehr von dem Doppelstrangprodukt hergestellt wird. Vgl. dazu R. Higuchi, G. Dollinger, P. S. Walsh, and R. Griffith, 1992, "Simultaneous Amplification and Detection of specific DNS Sequences", Bio/Technology 10: 413–417.
  • Darüber hinaus ist klar, dass Doppelstrang-spezifische Farbstoffe, wie Ethidiumbromid oder SYBR® Green I als generische Indikatoren der Vervielfältigung benutzt werden können. Der SYBR® Green I Farbstoff ist dem Ethidiumbromid in vielen Anwendungen vorzuziehen, da er ein Anregungsmaximum in der Nähe des Anregungsmaximums von Fluorescein auf weist und oft ein stärkeres Signal für die DNS bereitstellt, als bei der Anregung von Ethidiumbromid zu beobachten ist.
  • Die Fluoreszenz hängt zudem von der Temperatur ab, ein verwirrender Effekt während des Temperaturzyklus, der gewöhnlich dadurch eliminiert wird, dass die Fluoreszenz einmal pro Zyklus bei einer konstanten Verlängerungszeit betrachtet wird. Dennoch, wenn Temperatur, Zeit und Fluoreszenz alle 200 ms während der schnellen zyklischen Vervielfältigung aufgenommen werden, zeigt sich auf dem Monitor 368B eine wie in 12 dargestellte dreidimensionale Spirale. Das in 11 dargestellte dreidimensionale Diagramm wurde in 12A auf ein zweidimensionales Diagramm von Temperatur-gegen-Zeit, in 12B auf ein zweidimensionales Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Zeit, und in 12C auf ein zweidimensionales Diagramm von Fluoreszenz-gegen-Temperatur projiziert. Die Temperatur-gegen-Zeit Projektion von 12A wiederholt jeden Zyklus und stellt im Wesentlichen die gleiche Information, die in 11A dargestellt ist, bereit. Da sich die Fluoreszenz invers mit der Temperatur ändert, ist die in 12B dargestellte Fluoreszenz-gegen-Zeit Projektion bei frühen Zyklen ein skaliertes Spiegelbild des Temperatur-gegen-Zeit Diagramms. Wenn das Produkt anwächst, steigt die Fluoreszenz bei allen Temperaturen, bei denen das Doppelstrang-Produkt anwesend ist. Trotzdem kehrt die Fluoreszenz bei der Denaturierungstemperatur auf ihren Ausgangswert zurück, da dann nur eine Einzelstrang-DNS vorhanden ist.
  • Die in 12C gezeigte Fluoreszenz-gegen-Temperatur Projektion des Doppelstrang-Farbstoffs eliminiert die Zeitachse und zeigt die Temperaturabhängigkeit des Strangzustands während der Vervielfältigung. Die Projektion Fluoreszenz-gegen-Zeit aus 12C ist von dem 180 Basenpaarfragment der Hepatitis B Virus DNS.
  • Eine andere Fluoreszenz-gegen-Zeit Projektion ist in 13 gezeigt. Die in 13 dargestellte Projektion ist von einem 536 Basenpaarfragment der menschlichen β-Globin DNS. Frühe in 13 dargestellte Zyklen erscheinen identisch mit einem nichtlinearen Anstieg der Fluores zenz bei niedrigen Temperaturen. Wenn die Vervielfältigung fortschreitet, erscheinen spätere Zyklen als sich zwischen den Anlagerungs- und Denaturierungstemperaturen erhebende Schleifen, die eine signifikante Hysterese zeigen. Das kommt daher, dass die beobachtete Fluoreszenz während der Erwärmung größer ist als während dem Kühlen. Wenn die Probe erwärmt wird, ist die Fluoreszenz solange hoch bis die Denaturierung einsetzt (sichtbar durch den scharfen Abfall in der Fluoreszenz). Wie aus 13 ersichtlich ist, steigt die Fluoreszenz während der Verlängerung weiter, während die Temperatur konstant gehalten wird.
  • Doppelstrang-spezifische Farbstoffe können auch im Bezug auf verschiedene Aspekte vorliegender Erfindung verwendet werden. Der Strangzustand der PCR Produkte kann mit den Farbstoffen, die in Gegenwart von Doppelstrang-DNS fluoreszieren, nachvollzogen werden. Wenn SYBR® Green I während der Vervielfältigung anwesend ist, erhöht sich die Fluoreszenz, wenn mehr Doppelstrang-DNS hergestellt wird. Trotzdem führt der Temperaturzyklus einen verwirrenden Effekt ein, da die Fluoreszenz, wie in den 26A und 26B gezeigt wird, umgekehrt proportional zur Temperatur ist. Wenn sich das Produkt vermehrt, steigt die Fluoreszenz an, außer bei der Denaturierungstemperatur, bei der die Fluoreszenz zu ihrem Ausgangswert, wie in 12C gezeigt ist, zurückkehrt.
  • Wenn mehrere Proben überwacht werden, wobei der schnelle zyklischen Temperaturwechsler mit Fluoreszenzdetektion 300 verwendet wird, kann, einmal pro Zyklus mit SYBR® Green I, ein 107–108 Bereich der Anfangsvorlagenkonzentration, wie in 14 dargestellt, unterschieden werden. 14A stellt eine Legende für die Indizes der verschiedenen Graphen von 14, und für die Anfangsvorlagen-Kopienzahl in den nachfolgenden Figuren bereit. Wenn die Daten auf Prozent der maximalen Fluoreszenz jedes Kapillarröhrchens 320 normalisiert wurden, sind 100 Anfangskopien klar von 10 Kopien zu unterscheiden. Trotzdem ist der Unterschied zwischen 1 und 10 Kopien marginal, und es kann kein Unterschied zwischen 0 und 1 Durchschnittskopien pro Kapillarröhrchen 320 beobachtet werden.
  • Doppelstrang-Farbstoffe hängen von der den Vervielfältigungsprimern innewohnenden Spezifizität ab. Wie den Fachleuten klar ist, kann die nichtspezifische Vervielfältigung bei hohen Zyklenzahlen die Detektionssensitivität auf ungefähr 100 Anfangsvorlagen-Kopien (siehe 14) limitieren. Mit dem durch die vorliegende Erfindung gelehrten schnellen Zyklus wird eine Verbesserung der Vervielfältigungsspezifizität erreicht, wodurch wiederum die Gesamtdurchführung der DNS Vervielfältigung verbessert wird.
  • Der mengenmäßige Nachweis mit sequenzspezifischen Sonden weist einen ähnlich dynamischen Bereich wie der der Doppelstrang-DNS-Farbstoffe auf, aber scheint, wie in den 15A und 15B gezeigt ist, auch eine einzelne Anfangsvorlagenkopie von negativen Kontrollen zu unterscheiden.
  • Wenn eine Detektion und ein mengenmäßiger Nachweis von wenigen Kopienzahlen nötig ist, wird eine zusätzliche Spezifizität von Fluoreszenzsonden bereitgestellt, die für die Signalerzeugung eine Hybridisierung benötigen. Das Schneiden einer dual-markierten Exonuklease-Sonde ist eine Technik, die dazu fähig ist, eine einzelne Vorlagenkopie von einer Negativkontrolle, wie in 15 gezeigt wird, zu unterscheiden. 15 zeigt, entsprechend der Legende von 14A, ein Diagramm des Fluoreszenzverhältnisses gegen die Zykluszahl für verschiedene Zahlen von Anfangsvorlagenkopien.
  • Die Signalerzeugung mit 5'-Exonuklease-Sonden ist nicht nur von der DNS Synthese abhängig, sondern erfordert auch eine Hybridisierung und eine Hydrolyse zwischen den Fluorophoren der dual-markierten Sonde. Die Hydrolyse reduziert das sich gegenseitige Auslöschen und das Fluoreszenzverhältnis der Emission Fluorescein-gegen-Rhodamin steigt. Für weitere Informationen bezüglich dieser Technik vgl. L. G. Lee, C. R. Connell, and W. Bloch, 1993, "Allelic Discrimination by Nick-translation PCR with Fluorogenic Probes", Nucl. Acids Res. 21: 3761–3766 und Livak, K. J., S. J. A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti, and K. Deetz, 1995, "Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Opposite Ends Provide a Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Products and Nucleic Acid Hybridization", PCR Meth. Appl. 4: 357–362.
  • 25 zeigt die Fluoreszenz-PCR-Ergebnisse von einer Sonde mit 5 zwischen den Fluorescein- und Rhodaminmarkern liegenden Basen. Die 45 Vervielfältigungszyklen waren in 20 Minuten vollendet, wobei der schnelle zyklische Temperaturwechsler mit Fluoreszenzdetektion 300 aus 11 verwendet wurde. Beim Überwachen des Fluoreszenzverhältnisses einmal pro Zyklus konnte ein 109-facher Bereich der Anfangsvorlagenkonzentration unterschieden werden. Die Vervielfältigungskurven sind ungefähr um 3–4 Zyklen für jede 10-fache Änderung der Anfangsvorlagenkonzentration verschoben.
  • Auch wenn das Fluoreszenz-Endsignal verringert ist, wenn weniger Kopienzahlen vervielfältigt werden (vermutlich aufgrund der verringerten Vervielfältigungseffizienz), ist ein mengenmäßiger Nachweis von 1 bis 100 Kopien ohne Weiteres möglich. Das von den Exonukleasesonden erzeugte Signal ist kumulativ und steht nur indirekt mit der Produktkonzentration in Relation. Deshalb steigt das Fluoreszenzsignal, auch nachdem der Produktbetrag ein Plateau erreicht hat, weiter an. Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, können die Fachleute angemessene Standards für die Steuerung der Effizienz der Vervielfältigung und des Schneidens formulieren, um einen absoluten mengenmäßigen Nachweis durchzuführen.
  • Die Fluoreszenz-gegen-Temperatur Graphen der 5'-Exonuklease-Sonden bestätigen, dass die Sondenhydrolyse der Mechanismus der Signalerzeugung ist. In 16 ist ein Fluoreszenz-gegen-Temperatur Diagramm mit zwei Temperaturzyklen von der β-Aktin Exonuklease-Sonde gezeigt. In jedem Zyklus ändert sich das Fluoreszenzverhältnis linear mit der Temperatur und es gibt, wenn überhaupt, nur eine kleine Hysterese.
  • Das Signal verstärkt sich in jedem Zyklus während der Anlagerungs-/Verlängerungsphase, wenn die Sondenhydrolyse auftaucht. Auch wenn sich die Fluoreszenz von beiden, dem Fluorescein und dem Rhodamin, mit der steigenden Temperatur verringert (diese Daten sind nicht in den Figuren gezeigt), ist die Änderungsrate für Rhodamin größer, was in einem ansteigenden Verhältnis bei ansteigender Temperatur resultiert. Bei der 5'-Exonuklease-Sonde können keine temperaturabhängigen Hybridisierungseffekte beobachtet werden.
  • Im Gegensatz dazu zeigen, wenn das Fluoreszenzsignal nur von der Hybridisierung abhängt, die Fluoreszenzverhältnis-gegen-Temperatur Graphen während des Zwei-Temperaturzyklus ein unterschiedliches Muster mit einer Hysterese, wie in 17 dargestellt ist. Die Graphen von 17 stellen die Ergebnisse dar, die erhalten werden, wenn zwei benachbarte Hybridisierungssonden benutzt werden, die im vorliegenden Beispiel eine mit Fluorescein markierte 3'-upstream-Sonde und eine mit Cy5TM markierte 5'-downstream-Sonde sind. Die Sonden sind durch einen 1 Basenpaarspalt separiert. Während der Anlagerungs-/Verlängerungsphase der Reaktion hybridisieren die Sonden, was in einer Vermehrung des Produkts resultiert und darin, dass das Cy5TM-zu-Fluorescein Fluoreszenzverhältnis ansteigt. Während des Erwärmens des Produkts auf die Denaturierungstemperaturen, wobei die Sonden zwischen 65°C und 75°C dissoziieren, kehrt das Fluoreszenzverhältnis auf seinen Ausgangswert zurück. Die Änderung im Fluoreszenzverhältnis während der Hybridisierung ist zum großen Teil durch einen Anstieg der Cy5TM-Fluoreszenz aufgrund des Resonanzenergietransfers bedingt. Die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung kann dazu verwendet werden, Mutationen durch eine Verschiebung in der Schmelzkurve zu entdecken. Benachbarte Hybridisierungssonden sind, wie in 15B gezeigt, außerdem für den mengenmäßigen Nachweis sehr nützlich.
  • Aus der vorhergehenden Diskussion wird deutlich, dass die Fluoreszenzüberwachung während der DNS Vervielfältigung eine außerordentlich leistungsfähige analytische Technik ist. Durch die Verwendung des schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Fluoreszenzdetektion 300 kann eine produktive und kosteneffiziente Echtzeit-Überwachung, eine sequenzspezifische Detektion und ein mengenmäßiger Nachweis, abhängig von der Anzahl der vorliegenden Anfangsvorlagenkopien, in 5 bis 20 Minuten erreicht werden.
  • Darüber hinaus sind das System und die in den 11 bis 17 dargestellten Ergebnisse insbesondere für eine kontinuierliche Überwachung einer biologischen Reaktion mit Fluoreszenzfarbstoffen geeignet. Zum Beispiel kann, mit einer präzisen Temperatursteuerung und mit Doppelstrang-spezifischen Farbstoffen, die Produktreinheit aus den Schmelzkurven abgeschätzt werden. Mit der erfindungsgemäßen schnellen zyklischen Temperatursteuerung kann die absolute Produktkonzentration aus der Wiederanlagerungskinetik bestimmt werden. Die vorliegende Erfindung stellt vorteilhafterweise schnelle Temperaturänderungen und eine strenge Temperaturhomogenität innerhalb der Probe bereit, welche im Stand der Technik nicht zur Verfügung steht. Im Gegensatz zum Stand der Technik, werden in der vorliegenden Erfindung Probenbehälter mit einem hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis verwendet (zum Beispiel durch die Verwendung der in 11 dargestellten bevorzugten Kapillarröhrchen 320) und es wird Luft als Wärme übertragendes Medium verwendet, wodurch eine schnelle Steuerung der Probentemperatur bereitgestellt wird, die anderweitig nicht erreichbar ist. Zum Beispiel zeigen Probentemperatur-gegen-Zeit-Diagramme, die erhalten werden, wenn Proben in den Probenbehältern der vorliegenden Erfindung bearbeitet werden, scharfe Spitzen bei den Denaturierungs- und den Anlagerungstemperaturen (was eine schnelle Temperaturreaktion anzeigt), im Gegensatz zu den konischen Kunststoffröhrchen aus dem Stand der Technik, die einige Sekunden brauchen, damit in allen Proben ein thermisches Gleichgewicht erreicht ist. Darüber hinaus stellen die erfindungsgemäßen Probenröhrchen verbesserte Ergebnisse gegenüber den als Probenbehälter benutzten geätzten Silizium- oder Glasschnitzel bereit, da die Temperaturzykluszeiten und die Wärmehomogenität der vorliegenden Erfindung, den Temperaturzykluszeiten und der Wärmehomogenität, die mit solchen anderen Strukturen nur möglich sind, überlegen sind.
  • Durch die Verwendung der Verfahren und Vorrichtung werden viele Aspekte der DNS Vervielfältigung, die bis dato nur wenig verstanden wurden, wahrnehmbar. Zum Beispiel entsteht die Produktdenaturierung in weniger als 1 Sekunde, dennoch verlangte der Stand der Technik nach einer Denaturierungszeit von 10 Sekunden bis 1 Minute. Die Beobachtung der Produktschmelze mittels Echtzeit-Fluoreszenzüberwachung mit Doppelstrangfarbstoffen gemäß vorliegender Erfindung (vgl. die 12 und 13) zeigt, dass die Verwendung kürzerer Denaturierungszeiten sehr effektiv ist. Als weiteres Beispiel: Viele Ursachen des bekannten "Plateaueffekts" wurden vorgeschlagen, aber es standen wenige Daten zu Verfügung, um zwischen den Alternativen zu unterscheiden. Wie in 13 gezeigt, erfolgt die Produktanlagerung sehr schnell. Tatsächlich wird, während den späteren Vervielfältigungszyklen, ein Großteil des Produkts bei jedem Zyklus während der Abkühlung, noch bevor die Primeranlagerungstemperatur erreicht ist, wieder angelagert. Dies passiert bei Kühlgeschwindigkeiten von 5–10°C/s, wie sie bei der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. Die Wiederanlagerung des Produkts bei den langsameren aus dem Stand der Technik bekannten Temperaturwechslern ist noch größer, da noch mehr Zeit für den Übergang zwischen Denaturierungs- und Anlagerungstemperatur nötig ist. Dieser unerwünschte Effekt begrenzt die Produktausbeute, und ist der Hauptgrund für den aus dem Stand der Technik bekannten "Plateaueffekt".
  • Darüber hinaus stellt die offenbarte Vorrichtung ein günstiges Gerät bereit, das in kommerziellen Anwendungen verwendet werden kann und das die Fluoreszenz während der schnellen zyklischen Vervielfältigung kontinuierlich überwacht. Der erfindungsgemäße zyklische Temperaturwechsler ist dazu fähig, die DNS Vervielfältigung in nicht mehr als 10 bis 20 Minuten auszuführen, und die optischen und die Detektions-Komponenten der vorliegenden Erfindung unterscheiden ein, zwei, drei und mehr Fluorophore. Die bevorzugten Ausführungsbeispiele überwachen eine ganze Anzahl von individuelle Proben, zum Beispiel 24 Proben (die Kapillarröhrchen 320 in 11), einmal alle paar Sekunden, vorteilhafterweise einmal pro Sekunde und noch vorteilhafter 10 Mal pro Sekunde.
  • Es liegt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, Proben herzustellen für eine Verarbeitung unter Verwendung der bekannten Vorrichtungen mit 96 Vertiefungen, und der Kapillarprobenröhrchen 320, die dann für ein zyklisches Temperaturwechseln und eine Analyse in eine der bevorzugten Ausführungsformen gegeben werden, beispielsweise den schnellen zyklischen Temperaturwechsler mit Fluoreszenzdetektion (300 in 11).
  • Es ist von Vorteil, wenn die bevorzugten Ausführungsbeispiele ein Fluoreszenzfeedback für die Echtzeitsteuerung und die Optimierung des biologischen Prozesses, wie beispielsweise der DNS Vervielfältigung, verwenden, wenn der Prozess stattfindet. Demnach wird bei den hier offenbarten bevorzugten Ausführungsbeispielen die detektierte Fluoreszenz dazu verwendet, den Temperaturzyklus zu steuern. Bei der Verwendung der hier offenbarten Ausführungsbeispiele und bei der Verwendung der bevorzugten kontinuierlichen Überwachungstechniken mit Doppelstrang DNS spezifischen Farbstoffen, wird die Verlängerung nach dem jeweiligen Temperaturzyklus abgebrochen, nachdem die detektierte Fluoreszenz aufgehört hat, anzusteigen. Weiterhin werden erfindungsgemäß die Denaturierungsbedingungen auch dadurch gesteuert, dass die Temperatur nur soweit erhöht wird, bis das Produkt komplett geschmolzen ist. Darüber hinaus wird erfindungsgemäß die Primeranlagerung durch den Resonanzenergietransfer zwischen Fluorescein- und den Cy5TM-markierten Oligonukleotiden überwacht. Außerdem werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung die Temperaturzyklen der Probe automatisch abgebrochen, nachdem ein bestimmter Betrag des Produkts hergestellt ist.
  • Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Geräts ist es möglich, das schnelle zyklische Temperaturwechseln mit den minimalen Anlagerungs- und Denaturierungszeiten zu erzeugen, welche beide die quantitative PCR verbessern und die Unterscheidbarkeit der allelen spezifischen Vervielfältigung vergrößern. Das schnelle zyklische Durchlaufen der Zyklussequenz reduziert Sequenzdoppeldeutigkeiten und minimiert "Shadow-Banden" in wiederholten Vervielfältigungen von Di-Nukleotiden. Gemäß vorliegender Erfindung verbessert sich für die lange PCR, bis zu 35 kb, die Ausbeute, wenn die Probe so wenig wie möglich den hohen Denaturierungstemperaturen ausgesetzt ist.
  • Im Gegensatz zu den früheren Ansätzen in der PCR, die die PCR als drei Reaktionen-Denaturierung, Anlagerung, Verlängerung, wobei jede bei drei unterschiedlichen Temperaturen auftritt (wie in 18 dargestellt)-behandelten, sieht ein Aspekt vorliegender Erfindung vor, dass ein kinetisches Paradigma für die PCR wichtige Verbesserungen leistet. Durch das kinetische Paradigma (wie in 18B dargestellt), besteht die Temperatur-gegen-Zeit Kurve aus kontinuierlichen Übergängen zwischen den sich überlappenden Reaktionen. Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße Gerät sind besonders effizient beim Ausführen der PCR unter dem kinetischen Paradigma. 18C ist ein Graph, der verschiedene Zeit/Temperatur-Profile in der Umgebung der Anlagerungstemperatur von 55°C darstellt. In 18C zeigt die durchgängige Linie eine zentral angeordneten "Spitze", die die Temperaturreaktion einer 10 μl Probe darstellt. Im Gegensatz dazu, stellen die als kurze oder lange Linienabschnitte gezeigten Linien in 18C die Temperaturreaktionen von Proben dar, die durch die Verwendung von Geräten mit Heizblock erhalten wurden. Wie aus 18C ersichtlich, produzieren die erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele Anlagerungssegmentspitzen, mit den hier diskutierten Vorteilen, statt der Temperaturplateaus gemäß den herkömmlichen Erkenntnissen aus dem Stand der Technik.
  • Die früher zur Verfügung stehenden für die Detektion benutzten Instrumente wiesen viele Nachteile auf. Ein schneller präziser Temperaturwechsel wird durch das hier beschriebene erfindungsgemäße System bereitgestellt, im Gegensatz zu den früher zur Verfügung stehenden Instrumenten, die 5 bis 10 Mal langsamer waren. Mit der kontinuierlichen Fluoreszenzüberwachung, die auch durch das erfindungsgemäße System bereitgestellt wird, kann die Temperaturabhängigkeit der Hybridisierung verfolgt werden. Durch das Verfolgen der Hybridisierung während der Temperaturwechsel, kann die Anzahl der erforderlichen Sonden und/oder der erforderlichen Spektralfarben minimiert werden. Das bedeutet, dass verschiedene Produkte und Mutationen durch ihre charakteristischen Schmelzeigenschaften detektiert werden können, statt dass man den Aufwand unternimmt, verschiedene Fluor-markierte Sonden für jede zu detektierende DNS Spezies synthetisieren zu müssen.
  • Um eine Ausführungsformbereitzustellen, die am kostengünstigsten ist, wird eine lichtemittierende Diode mit hoher Intensität, anstelle einer Xenon Lichtbogenquelle oder einem Laser für die Probenillumination und von Photodioden für die Detektion verwendet. Die Proben werden in Glaskapillarröhrchen, oder alternativ in zusammengesetzte Probenbehälter aus Glas/Kunststoff (siehe 21A–D) in einem Format mit 96 Vertiefungen, das keine Wärmeversiegelung benötigt, gefüllt. Die vorliegende Erfindung stellt somit auf kostengünstige Weise eine Echtzeit-Fluoreszenzanalyse zur Verfügung. Die Echtzeit-Fluoreszenzsteuerung der Temperaturzyklen verbessert die Vervielfältigungsqualität. Zum Beispiel, wenn die Temperatur der Probe nur bis zum Auftreten der Denaturierung erhöht wird, wird das den hohen Temperaturen Aussetzen der Probe minimiert. Dies erhöht die Ausbeute, indem Produkt- und Enzym-Degradation limitiert werden, und erhöht die Spezifizität, indem die Vervielfältigung von Produkten mit einer hohen Schmelztemperatur begrenzt wird.
  • Als nächstes wird auf die 19 Bezug genommen, die eine diagrammartige Darstellung einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für das kontinuierliche Überwachen einer einzelnen Probe bereitstellt. Es sollte dennoch klar sein, dass die in 19 und 20 dargestellten Konstruktionen auch in ein System eingebaut werden können, das automatisch mehrere Proben bearbeitet, wie beispielsweise durch das in 11 dargestellte Gerät und wie in Kürze hier erklärt werden wird. In der Ausführungsform von 19 ist ein einzelner Probenhalter 402 in einem Probenträger angeordnet, der an dem Schnittpunkt von einem die Temperatur kontrollierenden Luftstrom und einem linearen optischen Pfad positioniert ist. Der Probenhalter 402 beinhaltet ein Röhrchen 402A, das die vielen wünschenswerten Eigenschaften eines Kapillarröhrchens aufweist. Gemäß der vorliegenden Erfindung können verschiedene Ausgestaltungen des Kapillarröhrchens verwendet werden und das Röhrchen 402A hat bevorzugt einen rechteckigen Querschnitt. Die biologische Probe ist vorzugsweise am unteren Ende des Probenröhrchens 402A, wie durch das Bezugszeichen 402B bezeichnet, angeordnet. Eine Kappe 402C ist ebenfalls vorzugsweise an dem Probenhalter 402 vorhanden.
  • Als nächstes wird Bezug genommen auf die 19A bis 19E, die die Auswirkungen der verschiedenen Ausgestaltungen der Probenbehälter auf die Temperaturreaktion der Probe selbst vergleichen. Die in 19E gezeigten Temperatur-Zeit-Linien entsprechen der Reaktion, die erhalten wird, wenn die in den 19A bis 19C bezeigten Ausgestaltungen der Probenbehälter verwendet werden. 19D zeigt den am wenigsten für die vorliegende Erfindung bevorzugten Probenbehälter und ist nur für den Vergleich aufgenommen. Mittels der hier offenbarten Information, können Fachleute optimale Ausgestaltungen der Probenbehälter für spezielle Anwendungen der vorliegenden Erfindung erreichen. Weitere Informationen bezüglich jeder der in den 19A bis 19D dargestellten Ausgestaltungen der Probenbehälter wird weiter unten dargelegt.
    Figur Oberflächenbereich (mm2/10 μl) Fluidsäulenlänge mm Probenvolumen Quelle
    19A 77 47 10 µl Kimble KIMAX #46485-1
    19B 42 13,8 34 µl Kimble KIMAX #46485-15
    19C 32 8 59 µl Kimble KIMAX #34500-99
    19D 18 N/A 10 µl MicrocampTM tube des Perkin-Elmer Cetus GeneAmp PCR Systems 9600
  • In dem Gerät von 19 ist eine Anregungsstrahlungsquelle 418, vorteilhafterweise eine LED und noch vorteilhafter eine blaue LED, bereitgestellt, um den Probenhalter 402 zu beleuchten. Die von der Anregungsstrahlungsquelle 418 emittierte Strahlung verläuft durch asphärische fokussierende Linsen 420 und einen Anregungs-Bandpassfilter 422, und die Strahlung wird auf den Probenhalter 402 fokussiert.
  • Die in 19 illustrierten optischen Komponenten sind vorzugsweise in einem optischen Gehäuse 412 beinhaltet. Darüber hinaus ist auch ein Gehäuse 406 vorhanden. Ein Ventilator 408 ist vorgesehen, um die Luft durch einen Luftkanal 414 und über den in dem Probenträger 404 gehaltenen Probenhalter 402 zu bewegen. Eine Temperatureinheit 410 ist in dem Luftstromweg angeordnet, um ein Erwärmen oder eine Erwärmen und Kühlen der Luft, die über den Probenträger 404 streicht, bereitzustellen. Ein Rüssel 416 führt die Luft effektiv über den Probenträger 404.
  • Die Emissionen, die von der Probe abgegeben werden, passieren noch zwei asphärische Linsen 420 und einen Emissions-Breitbandfilter 424, und werden von einem Photodetektor 426, der vorzugsweise eine Photodiode ist, empfangen. Die Fachleute können ohne Probleme die Steuerkomponenten, die vorteilhafterweise für das in 19 dargestellte Gerät benötigt werden, durch die hier dargelegten Informationen bereitstellen.
  • Die 19F und 19G ist die Seiten- bzw. Endansicht eines bevorzugten Probenbehälters 403, der ein rechteckiges Probenröhrchen 403A benutzt. Das Kapillarröhrchen 403A ist vorzugsweise bei Vitro Dynamics Inc. erhältlich, und weist folgende Abmessungen auf: 1 mm × 3 mm × 50 mm. Ein erstes Kappenelement 403B und ein zweites Kappenelement 403C sind durch eine Schraube 403D zusammengehalten, wobei die Schraube 403D auch als Halter für das Kapillarröhrchen 403A fungiert.
  • Die 19H und 19I zeigen entsprechend zwei mögliche Orientierungen des rechteckigen Kapillarröhrchens 403A, wenn die Fluoreszenz der darin enthaltenen Probe detektiert wird. 19H zeigt das rechteckige Kapillarröhrchen derart ausgerichtet, dass seine Kanten in einer Linie mit der optischen Achse der Anregung und der Detektionsoptik ("Kantenanregung und Detektion") sind. 19I zeigt das rechteckige Kapillarröhrchen 403A derart ausgerichtet, dass seine Breitseiten in einer Linie mit der optischen Achse der Anregung und der Detektionsoptik ("Breitseitenanregung und Detektion") sind. Überraschenderweise ist das Fluoreszenzsignal, das von der in 19H gezeigten Kantendetektions-Ausrichtung erhalten wird, 3- bis 5-fach höher ist als das von der in der 19I gezeigten Breitseitendetektions-Ausrichtung erhaltene. Die erstrebenswerten Eigenschaften der Verwendung der in der 19H gezeigten Kantendetektions-Ausrichtung sind zumindest teilweise durch die innere Totalreflexion, die in dem Kapillarröhrchen 403A stattfindet, bedingt, die das Fluoreszenzsignal auf den Rand des Kapillarröhrchens konzentriert.
  • 20 zeigt die optischen Komponenten einer anderen bevorzugten Ausführungsform gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung. Die in 20 dargestellten optischen Komponenten sind vorzugsweise in die in 21 dargestellte zyklische Temperaturwechsler- und Probenhandhabungskonstruktion eingebaut, was in Kürze noch genauer beschrieben werden wird, aber können auch in vielen verschiedenen Anordnungen, die eine Überwachung (am vorteilhaftesten eine kontinuierliche Überwachung) einer Probe, die einer Polymerasekettenreaktion unterzogen wird, bereitstellen, verwendet werden.
  • Im Gegensatz zu den vorherigen hier offenbarten Anordnungen, sind der optische Anregungsweg und der Detektionsweg in der Ausführungsform der 20 und 21 kombiniert, und werden hier mit Epifluoreszenz-Weg statt linearem Weg bezeichnet. In der Ausführungsform der 21 und 22, folgen die Anregungs- und die Emissionsstrahlung dem gleichen optischen Weg zwischen Kapillarröhrchen und dem in dem Anregungsweg benutztem dichroiden Element. Ein Kapillarröhrchen ist speziell für die Verwendung in dem Beispiel der 21 und 22 ausgebildet, bedingt durch die totale innere Reflexion (auch als "Lichtführung" bezeichnet) entlang der Länge des Kapillarröhrchens, die dazu benutzt wird, sowohl die Anregungs- als auch die Emissionsintensitäten zu verstärken.
  • In den Ausführungsbeispielen der 20 und 21 ist, um eine maximale Lichtleitung zu erreichen, die optische Achse parallel zu der Länge des Kapillarröhrchens (paraxial) ausgerichtet, wobei die Spitze des Kapillarröhrchens an dem Brennpunkt positioniert ist. Unter der Annahme eines Brechungsindex von 1,33 für die zu detektierende Probe, werden ungefähr 12,3% des emittierten Lichts in die Spitze geleitet. Es ist klar, dass das Zentrifugieren dazu benutzt werden kann, die Probe in die Spitze des Kapillarröhrchens zu bewegen.
  • 22A zeigt in einem Diagramm die Effektivität der Lichtleitung, wenn die Fluoreszenz an der Spitze des Kapillarröhrchens detektiert werden soll und zeigt eine 10-fache Verstärkung der Signalintensität, wenn die Spitze (ausgefüllte Rauten) statt der Seite (unausgefüllte Kreise) des kapillaren Probenbehälters betrachtet wird. Zudem wurden, wie 22B zeigt, die Ergebnisse, die bei der Verwendung von zwei Kapillarröhrchen unterschiedlicher Größe erhalten werden, und die auf zwei unterschiedliche Längen mit Doppelstrang DNS, die mit SYBR® Green I eingefärbt ist, befüllt ist, dargestellt. Wie aus den 22A und 22B vermutet werden kann, steigt die beobachtete Epifluoreszenz, wenn mehr Probe in das Röhrchen zugegeben wird, obwohl sich die Fluoreszenz Effizienz verringert.
  • Die optischen Eigenschaften der Emission von dem Kapillarröhrchen, wurden durch stimulierende Fluoreszenz in einem mit einer Fluoresceinlösung befüllten Kapillarröhrchen bei 470 nm untersucht. Die Emission von dem stumpfen Ende des Kapillarröhrchens wurde als homogen über die Breitseite des Kapillarröhrchens beobachtet, im Gegensatz zu der konzentrierten Emission im Glas, die erwartet werden würde, wenn die Emission das Ergebnis einer Evaneszent-Wellen-Fluoreszenz sein würde.
  • Die in der 20 dargestellten optischen Komponenten führen eine paraxiale epifluoreszierende Bestrahlung der Spitze des Kapillarröhrchens aus, die vorteilhafte nicht anders zu erhaltende Ergebnisse bereitstellt. In 20 ist die Anregungsstrahlungsquelle 464 vorzugsweise eine blaue LED, wie sie beispielsweise in der Industrie als superhelle LED bekannt ist und von LEDtronics bezogen werden kann. Die emittierten Fluoreszenzsignale werden von den Photodetektoren 466A und 4666 aufgenommen. Die Anregungsstrahlungsquelle 468 und die Photodetektoren 466A und 4666 werden von einer Befestigungsplatine 468 gehalten, die auch die notwendigen Schaltkreise beinhaltet und die Filter in die Photodetektoren 466A und 4668 integriert. Eine bevorzugte Befestigungsplatine ist bei Ealing Electrooptics erhältlich und beinhaltet einen 0,5 inch Interferenzfilter mit Hochleistungssiliziumphotodioden in TO5 Gehäusen. Die Anregungs- und Detektionskomponenten werden direkt von der Befestigungsplatine 468 mit der verbundenen Elektronik getragen. Es ist von Vorteil, wenn die optischen Komponenten vorzugsweise ≤ 1,0 inch im Durchmesser aufweisen. Eine Sammellinse 454, zwei dichroide Filter 456A und 4566, ein Spiegel 458, Interferenzfilter 460A–C, und asphärische fokussierende Linsen 462A–C leiten die Strahlung zur der Probe und von der Probe weg.
  • Während die in 20 dargestellte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung nur zwei Farben/Wellenlängen beim Durchführen der Analyse verwendet, können die Fachleute das Ausführungsbeispiel problemlos anpassen, damit drei oder mehr Farben analysiert werden können. Um eine Drei- oder Mehrfarbenanalyse bereitzustellen, kann das in
  • 20 dargestellte Gerät mit zusätzlichen dichroiden Filtern und Photodetektoren ausgestattet werden. Darüber hinaus ist vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung umfasst, dass eine simultane Aufspaltung der Wellenlängen auf einen linearen Photodetektoraufbau, wie er in der Industrie erhältlich ist, für eine Mehrfarbenaufnahme möglich ist. Wenn gemäß der vorliegenden Erfindung ein linearer Photodetektorenaufbau benutzt wird, ist es vorteilhaft, dass ein Prisma oder ein Strichgitter zusammen mit einer Linse und einem Photodetektoraufbau oder CCD für die Detektion der mehrere Wellenlängen verwendet werden. Ein bevorzugter linearer Photodetektoraufbau, der industriell erhältlich ist, sammelt 15–30 Wellenlängenbereiche von 10 bis 20 nm, die jeweils zwischen 500 und 800 nm liegen. Verschiedene Konfigurationen der optischen Komponenten, beispielsweise die Littrow Autokollimationskonfiguration für Gitter, die hauptsächlich in Monochrometern verwendet wird, können durch die hier dargelegten Informationen ausgebildet werden, um die beste Anpassung zwischen Sammeleffizienz, spektraler Auflösung und räumlichen Vorgaben zu erzielen. Das Gerät aus 20 wird im Folgenden weiter beschrieben, wobei es in einen in 21 dargestellten automatischen zyklischen Temperaturwechsler eingebaut ist.
  • 21 stellt eine schematische Darstellung einer anderen derzeit bevorzugten Ausführungsform 400 bereit, die Komponenten für das schnelle zyklische Temperaturwechseln, Komponenten für die Probenhandhabung, und die in 20 dargestellten optischen Komponenten beinhaltet, die alle zusammenwirken, um eine Fluoreszenzdetektion an der Spitze des Probenbehälters (Epifluoreszenz) bereitzustellen. Der in 21 dargestellte schnelle zyklische Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 hat bestimmte Vorteile. Es ist klar, dass das beschrieben Ausführungsbeispiel ausschließlich beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist, und dass die Fachleute viele unterschiedliche Anordnungen zum Ausführen der hier beanspruchten Erfindung erreichen können.
  • In der in 21 dargestellten Ausführungsform, wird Luft durch eine Öffnung 470 eingesaugt und folgt im Allgemeinen dem durch die Linien 472 angezeigten Strömungsweg. Die Temperatur der Luft und demnach die Temperatur des Kunststoff/Glas-Probenbehälters 450 wird vorzugsweise dadurch angepasst, dass eine 400 Watt Heizkartusche 474, die vorzugsweise eine bei Reheat Inc. erhältliche ist, verwendet wird. Die Heizkartusche 474 ist innerhalb eines zentralen Kanals 476 angeordnet. Ein Ventilator 498 ist vorgesehen, um die Luft in dem angezeigten Weg 472 zu bewegen. Der Ventilator wird durch eine Antriebswelle 496 und einen Motor 494 angetrieben. Der Motor 494 ist vorzugsweise ein Gleichstrom-Seltenerd-Bremsmotor, der vorzugsweise bei Escap AG erhältlich ist und eine maximale Drehzahl von 15.000 Upm aufweist. Wenn die Kunststoff/Glasprobenröhrchen 450 erwärmt werden, wird die Heizkartusche proportional angesteuert und der Ventilator läuft mit relativ geringer Geschwindigkeit (12 V, 0,5 A), um eine Temperaturhomogenität für alle Kunststoff/Glasröhrchen 450 bereitzustellen. Wenn die Kunststoff/Glas-Probenbehälter gekühlt werden, ist die Heizkartusche ausgeschaltet und der Motor 494 läuft mit einer hohen Geschwindigkeit (beispielsweise mit der oben erwähnten bevorzugten Maximalgeschwindigkeit, die durch Anlegen von 27 V und 1,4 A erreicht wird). Der Ventilator 498 bläst die Luft in die Öffnung 470 und aus dem Auslassanschluss 471.
  • In dem bevorzugten schnellen zyklischen Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 ist es vorteilhaft, dass 24 Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 (von denen zwei in 21 dargestellt sind) symmetrisch um die Heizkartusche 474 und den zentralen Kanal 476 angeordnet sind. Die Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 werden von einer Hülse 451 aufgenommen, die (bedingt durch ihre versetzte Konstruktion) ein präzises Justieren der Position jedes einzelnen individuellen Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 in einem kreisförmigen Karussell 480 ermöglicht. Die Hülsen 451 sind vorzugsweise aus Messing hergestellt. Die von der Achse versetzte Konstruktion der Hülse 451 ermöglicht es, dass jede Hülse 451 so ausgerichtet werden kann, dass die Spitze der Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 sowohl lateral als auch longitudinal genau auf dem optischen in 21 dargestellten Brennpunkt ausgerichtet ist, zu dem Zeitpunkt zu dem der schnelle zyklische Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 hergestellt wird.
  • Das Karussell 480 wird von einem Lager 482 über einem Gehäuse 490 getragen. Das Karussell 480 wird durch einen Schrittmotor 488 positioniert, der mit einem Antriebsgetriebe 484, das mit dem Motor 488 über eine Antriebswelle 486 verbunden ist, ausgestattet ist. Der Schrittmotor 488 ist ein Mirkoschrittmotor (wobei eine Steuerung (nicht explizit in 21 dargestellt) von New England Affiliated Technology verwendet wird), um über 10.000 Schritte pro Drehung des Karussells 480 bereitzustellen, wodurch eine genaue Positionierung jeder Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 bereitgestellt wird. Das Innere des Gehäuses 490 ist mit einem Isoliermaterial 492, vorzugsweise entsprechend dem vorher beschriebenen Isoliermaterial, ausgestattet. Die Einbauten 476 dienen dazu, den Auslassanschluss 471 zu bilden und das Umgebungslicht abzuschotten.
  • Die 21A bis 21D stellen zusätzliche detaillierte Ansichten der Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 bereit und es wird auf sie Bezug genommen werden, um das bevorzugte Verfahren für ihre Verwendung zu erläutern. Der Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 beinhaltet einen Kapillarröhrchenabschnitt 450B, der an einem Ende verschlossen ist. Der Kapillarröhrchenabschnitt 450B kann verschiedene Ausgestaltungen aufweisen und ist nicht nur auf die Kapillarröhrchen-artige Struktur limitiert. Es ist jedoch vorteilhaft, dass das in dem Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 enthaltene Fluid nicht mehr als 1 ml ist, um eine Probentemperaturhomogenität und ein schnelles zyklisches Temperaturwechseln zu fördern. Zum Beispiel ist es von Vorteil, dass das Material, aus dem der Kapillarröhrchenabschnitt 450B hergestellt ist, eine Wärmeleitfähigkeit im Bereich von unge fähr 20 bis 35 aufweist, gemäß der Formel (cal cmcm²s°C ) × 10. Weitere Informationen bezüglich der Wärmeleitfähigkeit verschiedener Gläser können erhalten werden von: R. C. Weast & M. J. Astle, Handbook of Chemistry and Physics, Seite E-6 (1982) (CRC Press), welches hiermit durch Verweis mitaufgenommen wird. Die Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 sind außerdem mit einem Reservoirabschnitt 450C ausgestattet, der vorzugsweise aus einem geeigneten Kunststoff hergestellt ist und mit dem offenen Ende des Kapillarröhrchenabschnitts 450B verbunden ist. Während viele unterschiedliche Materialien für den Reservoirabschnitt 450C verwendet werden können, ist es vorteilhaft, dass ein Kunststoffmaterial in einer Trichterform ausgebildet wird und an dem Kapillarröhrchenabschnitt 450B befestigt wird.
  • Eine Probe S wird in den zusammengesetzten Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 mittels einer Pipette P, oder einem anderen geeigneten Instrument, entweder manuell oder in einem automatisierten Ablauf eingefüllt. Es ist vorteilhaft, dass das Volumen der Probe in einem Bereich von ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 10.000 µl, noch vorteilhafter in einem Bereich von ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 100 µl, und am vorteilhaftesten in einem Bereich von ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 10 µl liegt, wobei ungefähr 5 µl das am meisten bevorzugte Volumen ist. Sobald einmal eine Probe in jeden Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 gegeben ist, werden die Kunststoff/Glas-Probenbehälter mit geringer Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Proben in der Spitze des verschlossenen Endes des Kapillarröhrchenteils 450B anzuordnen, so dass die Probe eine 0,2 bis 2,0 cm lange Fluidsäule 450A, wie am besten in 21B zu sehen ist, bildet. Ein Stopper 450D (der vorteilhafterweise als Kunststoffstöpsel ausgebildet ist) wird dann in den Reservoirabschnitt 450C gesetzt, um den Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450, wie am besten in 21C gezeigt ist, zu versiegeln, und der Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 wird dann in die Hülse 451 in dem schnellen zyklischen Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 gesetzt. Es liegt ebenfalls innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung, andere Konstruktionen zum Versiegeln des Kapillarröhrchenabschnitts 450B bereitzustellen.
  • Der Kapillarröhrchenabschnitt 450B des Kunststoff/Glas-Probenbehälters 450 ist vorzugsweise ein Glaskapillarröhrchen, das in der Industrie erhältlich ist und einen inneren Durchmesser von 0,8 mm und einen äußeren Durchmesser von 1,0 mm aufweist, und das an dem einen Ende geschlossen/versiegelt ist und sich an dem anderen Ende trichterförmig erweitert, um das Kunststoffreservoir 450C aufzunehmen. Die Kunststoff/Glas Probenbehälter 450 können problemlos und wirtschaftlich hergestellt werden. Die Form der Spitze 450E des Kapillarröhrchenabschnitts 450B ist für die optische Effizienz optimiert. Flache Spitzen sind genauso wie Spitzen mit unterschiedlicher äußerer und innerer Krümmung auch vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Fachleute können die effizienteste Ausgestaltung für die Spitze auswählen.
  • Wie aus den 21A bis 21D erkennbar ist, stellt der Zusatz einer Befüllvorrichtung aus Kunststoff und von Versiegelungskonstruktionen für die Kapillarröhrchen aus Glas große Vorteile bereit und ermöglicht eine effiziente Verwendung der Kapillarröhrchen aus Glas, wobei deren erstrebenswerte thermalen Eigenschaften erhalten bleiben. Es ist offensichtlich, dass es innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegt, dass die Proben zu den Kunststoff/Glas-Probenbehältern 450 gegeben werden und die Proben in einem Format mit 96 Vertiefungen einem Zentrifugieren unterzogen werden. Darüber hinaus liegt es innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung, dass die Kunststoff/Glas-Probenbehälter einzeln in den schnellen Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 geladen werden, und es liegt ebenfalls innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung, dass eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Laden der Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 in ein Format mit 96 Vertiefungen oder ein beliebiges anderes Format bereitgestellt wird.
  • Vorteilhafterweise stellen die zusammengesetzten Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 einen praktischen und kostengünstigen Probenhalter bereit. In der Ausführungsform von 21 ist es vorteilhaft, dass die Fluoreszenz von einer einzelnen Probe ein- bis zehnmal pro Sekunde aufgenommen wird. Wenn die Fluoreszenz von multiplen Proben mit der vorteilhaften Geschwindigkeit aufgenommen werden soll, müssen die Proben durch eine Drehung des Karussells 480 relativ schnell in Position bewegt werden. Mit dem vorteilhaften Schrittmotor 488 und den entsprechenden Steuervorrichtungen (die mit Hilfe der hier bereitgestellten Information gewählt werden können) kann jede der 24 Proben schnell und genau an die in 21 dargestellt Überwachungsposition bewegt werden.
  • Wenn das Fluoreszenzsignal von jeder Probe für 100 ms aufgenommen wird, beträgt die Signalvariation (mit Repositionierung) weniger als 1% (< 1%). Es wird verständlich sein, dass es innerhalb des Schutzbereichs vorliegender Erfindung liegt, die Signalaufnahmezeit zu verringern, die Übergangsgeschwindigkeiten zu vergrößern, und auch die Variationskoeffizienten durch wiederholte Stichproben zu beobachten. Wenn 24 Proben abgearbeitet werden, und das Karussell ohne Stopp mit einer Geschwindigkeit zwischen 1 bis 10 Umdrehungen pro Sekunde gedreht wird, stehen jeder Probe 0,37 bis 3,7 ms für Anregung und Detektion zur Verfügung.
  • Durch Verwendung der hier erläuterten Informationen, kann ein Fachmann auswählen, ob das Fluoreszenzsignal mittels Software oder Hardware integriert wird. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird eine graphische Programmsprache in Verbindung mit dem schnellen Temperaturwechsler mit Epifluoreszenzdetektion 400 verwendet, die beispielsweise in der Industrie als LabView (erhältlich von National Instruments) bekannt ist, und die Unterprogramme für die Signaldetektion und -Integration aufweist. In einem anderen bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Integration durch die Hardware mit variabler Integrationszeit (Benutzerjustierbare Sensitivitätssteuerung) durchgeführt, so dass die Signale ein Level erreichen, das optimal für eine Analog-zu-Digital Konvertierung ist.
  • Aufgrund der Verwendung des in 21 dargestellten schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Epifluoreszenzdetektion 400, ermöglicht die kontinuierliche Überwachung der Probe, während die Reaktion stattfindet, eine Festlegung des Temperaturzyklusanforderungen während der Vervielfältigung, die auf der kontinuierlichen Überwachung von Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung basieren. Dies steht im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem alle Zyklusparameter festgelegt und programmiert sind, bevor die Vervielfältigung anfängt. Gemäß dem Stand der Technik wird, wenn komplementäre Oligonukleotide, die äquivalent zu dem bei der geringsten Temperatur schmelzenden Primer sind, verwendet werden, die Anlagerungseffizienz auch während der frühen Zyklen kontrolliert. In vielen Fällen können Verlängerung und Denaturierung mit Doppelstrang DNS Farbstoffen nur während späterer Zyklen, wenn genügend Produkt hergestellt ist, überwacht werden. Signifikanterweise ist eine solche Anforderung gewöhnlich nicht das Problem, da Denaturierungs- und Verlängerungsbedingungen ausreichend zugänglich gemacht wurden, um die meisten Produkte zu vervielfältigen, und die Daten aus der ersten Vervielfältigung können dazu benutzt werden, die nachfolgenden Durchlaufe zu optimieren.
  • Es wird weiter auf 21 Bezug genommen; eine Benutzeroberfläche und eine Instrumentensteuerung 500 können hergestellt werden, wobei die in Verbindung mit 11 dargelegten Informationen verwendet werden. Als ein bevorzugtes Beispiel einer Benutzeroberfläche und Instrumentensteuerung, stellt ein PENTIUMTM Mikrocomputer, der die LabView Programmsprache mit einer 12-bit Multifunktions-Eingangs-/Ausgangskarte (erhältlich bei National Instruments) betreibt, die Datenaufnahme und Steuerung bereit. Es ist vorteilhaft, dass die analogen Ausgangssignale dazu verwendet werden, die mit den Photodetektoren 466A und 466B in Verbindung stehenden Verstärker zu justieren. Die analogen Eingangska näle messen sowohl die Temperatur der Probe mit Hilfe des Thermoelements 499 als auch die von der Probe durch die Photodioden detektierte Fluoreszenz. Die in der 21 dargestellte Benutzeroberfläche und Instrumentensteuerung stellt auch eine digitale Eingangs-/Ausgangssteuerung der Anregungsstrahlungsquelle 468, der Richtung des Schrittmotors 488, der Heizkartusche 474, und des Ventilators 498 bereit.
  • Wenn eine kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung der PCR Proben, die den Doppelstrang DNS Farbstoff SYBR® Green I oder fluoreszierend markierte Oligonukleotide beinhalten, stattfindet, können Sonden dazu verwendet werden, die Hybridisierung und das Schmelzen, während der einzelnen Vervielfältigungszyklen zu überwachen. Diese Information kann für verschiedene Ausgestaltungen der Benutzeroberfläche und Instrumentensteuerung 500 verwendet werden, um verbesserte und kundengerechte Temperaturzyklusbedingungen bereitzustellen. Die Vorteile des Verwendens der Hybridisierungs-Informationen für den Temperaturzyklus beinhalten:
    • (A) Das Sicherstellen, dass eine vollständige Denaturierung des PCR Produkts bei jedem Zyklus auftritt, wobei: das den exzessiven hohen Denaturierungstemperaturen Aussetzen minimiert wird, wodurch hitzebedingte Schäden an den Vervielfältigungsprodukten und der Polymerase vermieden die Reaktionsspezifizität gesteigert wird, indem die Denaturierungstemperatur minimiert wird, was Produkte mit einem höheren Tm als das beabsichtigte Vervielfältigungsprodukt gusselektiert.
    • (B) Das Maximieren der Vervielfältigungseffizienz, indem eine angemessene Zeit für die Produktverlängerung in jedem Zyklus sichergestellt ist, wobei: der Zeitbetrag, der für die Vervielfältigung erforderlich ist, minimiert wird, indem die Vervielfältigung nicht länger als für die vollständige Produktverlängerung nötig ist, zugelassen wird; die Reaktionsspezifizität verbessert wird, indem längere Produkte als das beabsichtigte Vervielfältigungsprodukt ausselektiert werden.
    • (C) Das Maximieren der Vervielfältigungseffizienz, indem eine angemessene Zeit für die Produktverlängerung in jedem Zyklus sichergestellt wird, wobei: der für die Vervielfältigung nötige Zeitbetrag minimiert wird, indem die Vervielfältigung als nicht länger als für die vollständige Produktverlängerung zugelassen wird; Die Reaktionsspezifizität verstärkt wird, indem Produkte, die länger als das beabsichtigte Vervielfältigungsprodukt sind, gusselektiert werden. Dies würde mehr Zeit erfordern, als Zeit zugeteilt ist, um die Produktverlängerung zu vervollständigen.
    • (D) Das Initiieren der thermalen Zyklusänderungen abhängig von dem Level der erhaltenen Fluoreszenz oder der gegenwärtigen Effizienz der Vervielfältigung. Zum Beispiel, können Über-Vervielfältigung und nicht-spezifische Reaktionsprodukte dadurch minimiert werden, dass der Temperaturzyklus beendet wird, wenn die Effizienz unter ein bestimmtes Level fällt. Wie in einem anderen Beispiel, kann der Temperaturzyklus modifiziert werden, um langsamere Temperaturrampen für die Schmelzkurvenaufnahme zu initiieren, wenn die Fluoreszenz detektierbar wird, Dies spart Zeit, da die langsameren Rampen nicht in früheren Zyklen verwendet werden müssen. Andere erstrebenswerte Änderungen werden evident durch das regelmäßige Verwenden der Erfindung.
    • (E) Das Minimalisieren der Über-Vervielfältigungs-Schäden an dem PCR Produkt und/oder Initiieren der Schmelzkurvenaufnahme, bevor die Über-Vervielfältigung den Hintergrund der nicht-spezifischen Reaktionsprodukte vergrößert hat.
  • Die Benutzeroberfläche und die Instrumentensteuerung 500 können vorprogrammierten Zeit/Temperatur-Sollwerten folgen, und/oder können, vorteilhafterweise, detektierte Fluoreszenzwerte aufnehmen und die aufgenommenen Fluoreszenzwerte dazu verwenden, einen oder mehrere Reaktionsparameter in Echtzeit zu ändern oder anzupassen, um die erhaltenen Resultate zu optimieren. Wie hier verwendet wird, beinhaltet, aber ist nicht darauf beschränkt, der Begriff "Reaktionsparameter" jeden Parameter, der als Basis für das Steuern einer Reaktion verwendet wird. Diese Reaktionsparameter beinhalten, sind aber nicht darauf beschränkt, die Denaturierungstemperatur und -zeit, die Primeranlagerungstemperatur und -zeit, die Sondenanlagerungstemperatur und -zeit, die Enzymverlängerungstemperatur und -zeit, und die Anzahl der Zyklen. Im Allgemeinen ist die Steuerung der Reaktion anfänglich auf einer Abschätzung der Reaktionsparameter aus den Fluoreszenzdaten basiert. Die ursprünglichen Fluoreszenzdaten werden entweder als Änderung der Fluoreszenz über die Zeit (Temperaturspezifische Raten der Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung), oder als Änderung der Fluoreszenz über die Temperatur (Produkt- oder Sonden Tm), oder als Änderung im Umfang der Vervielfältigung (Vervielfältigungsausbeute und -effizienz) aufgenommen. Diese Geschwindigkeiten, Tms, und ihre ersten und zweiten Ableitungen werden dazu verwendet, die optimalen Reaktionsparameter, wie Denaturierungstemperatur und -zeit, Primeranlagerungstemperatur und -zeit, Sondenanlagerungstemperatur und -zeit, Enzymverlängerungstemperatur und -zeit und Anzahl der Zyklen festzulegen.
  • Wie in dem hochwertigen Blockdiagramm von 22C gezeigt ist, werden die Aufgaben aufgeteilt zwischen denen, die von einem Teil der Benutzeroberfläche und Instrumentensteuerung 500 (was vorzugsweise eine IBM kompatibler Computer sein kann, der eine auf den hier dargelegten Lehren basierende Programmierung verwendet) (die Blöcke 500A bis 500E in 22C) ausgeführt werden, und denen, die von den verbleibenden Komponenten (Blöcke 500A und 500G bis 500S in 22C) des schnellen zyklischen Temperaturwechslers mit Epifluoreszenzdetektion 400 ausgeführt werden. Es sollte klar sein, dass das Blockdiagramm von 22C lediglich beispielhaft ist und dass viele verschiedene Anordnungen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Als ein Beispiel für die Vorteile des in 22C gezeigten Aufbaus, wird die Steuerung des Produktschmelzens diskutiert. Ein Schmelzsignal-Fluoreszenzwert wird für das beabsichtigte PCR Produkt aufgenommen und eine Ausgangswert-Fluoreszenz wird für die Probe, die das Reaktionsgemisch enthält, bei der Temperatur, bei der sichtbar ist, dass das Produkt vollständig geschmolzen ist, aufgenommen. Jeder Zyklus der Reaktion benutzt diesen Fluoreszenzwert als Zielwert. Der in diesem Beispiel beschriebene Ansatz verwendet zwei Stufen, um eine Zeitverzögerung bereitzustellen, um der Anforderung zu entsprechen, den Fluoreszenzwert an einen separaten PC Computer zu schicken. Mit jedem Produktschmelzschritt, wird die Temperatur erhöht bis die Fluoreszenz einen Zwischenwert erreicht, dann wird die an die Heizvorrichtung angelegte Leistung reduziert, so dass eine Temperaturrampe von ungefähr 3°C pro Sekunde ausgeprägt wird, damit der PC Computer genügend Zeit hat, die Fluoreszenz zu analysieren und an die anderen Komponenten zu übermitteln, dass eine Produktdenaturierung aufgetreten ist. Das resultierende Zeit/Temperatur-Diagramm ist in 22D gezeigt. 22D zeigt einen charakteristischen Anstieg in der Schmelztemperatur nach 20 Zyklen, da die Konzentration des Vervielfältigungsprodukts wächst. Dies ist bedingt durch die Tatsache, dass die Produkt Tm eine Funktion der Produktkonzentration ist.
  • Als ein Beispiel der weiteren Vorteile des in 22C gezeigten Arrangements wird die Produktanlagerung/-verlängerung diskutiert, Während eines ausgedehnten Haltens auf einer kombinierten Anlagerungs-/Verlängerungstemperatur, wird die Fluoreszenz der Probe aufgenommen, und die Information wird dazu verwendet, dass eine angemessene, aber nicht übermäßige Zeit für die Produktverlängerung zugelassen wird. Die Fluoreszenz wird in 10 Sekunden Intervallen aufgenommen, und, wenn die Fluoreszenz mehr steigt als ein vorher festgelegtes Verhältnis (typischerweise 1,0 bis 1,05), wird der Anlagerungs-/Verlängerungsschritt fortgesetzt.
  • Andererseits wird der nächste Produktschmelzschritt initiiert. Das Intervall von 10 Sekunden ist so gewählt, dass ein Minimum von 20 Sekunden auf der kombinierten Anlagerungs-/Verlängerungstemperatur garantiert wird.
  • 22E zeigt ein Fluoreszenz/Zeit Diagramm, das einen charakteristischen Anstieg in der Verweildauer auf der kombinierten Anlagerungs-/Verlängerungstemperatur, wenn die Konzentration des Vervielfältigungsprodukts wächst, darstellt. Dies ist bedingt durch die Tatsache, dass, da die Primerkonzentration und die Polymerase begrenzt werden, mehr Zeit benötigt wird, um die Produktvervielfältigung mit jedem Zyklus zu vollenden.
  • Als noch ein anderes Beispiel der Vorteile der in 22C gezeigten Anordnung wird das Vervielfältigungs-"Plateau" diskutiert. Am Ende jedes Anlagerungs-/Verlängerungsschritts, wird der Fluoreszenzwert aufgenommen und gespeichert. Wenn dieser Wert auf das 1,2-fache des niedrigsten Endzyklus-Fluoreszenzwerts ansteigt und dann unter einem Benutzer definierbaren Verhältnis (typischerweise 1,0 bis 1,02) aufhört zu Wachsen, wird der Temperaturzyklus abgebrochen. Alternativ wird ein Schmelzkurven-Aufnahmeschritt initiiert, indem eine langsame Temperaturrampe von 0,1°C/s–0,2°C/s durch das Produkt Tm eingegeben wird und die Fluoreszenz kontinuierlich überwacht wird. Das in 22D gezeigte resultierende Fluoreszenz/Zeit-Diagramm zeigt, dass nach 25 Vervielfältigungszyklen das Verhältnis des Zyklus – für Zyklus Fluoreszenzwachstums unter 1,0 fällt und die Reaktion abgebrochen wird. Es ist verständlich, dass dieser Ansatz dazu verwendet werden kann, für jede Probe eine hoch aufgelöste Schmelzkurve aufzunehmen. Wenn eine Probe sein Vervielfältigungs-"Plateau" erreicht, kann eine Schmelzkurve für diese Probe aufgenommen werden, dann kann der reguläre Temperaturzyklus wieder aufgenommen werden, bis eine andere Reaktion ihr Vervielfältigungs-"Plateau" erreicht.
  • 22E zeigt nützliche Temperatur-gegen-Zeit Abschnitte für die Fluoreszenz-Hybridisierungs-Überwachung. Die Produktschmelzkurven werden während eines langsamen Temperaturanstiegs auf die Denaturie rung erhalten. Indem die Temperatur nach der Denaturierung schnell auf eine konstante Temperatur erniedrigt wird, können Produkt-, Sonden-, oder Primeranlagerung detektiert werden. Die Probenschmelzkurven werden durch ein langsames Erwärmen rund um die Temperatur der Sonden-Tm erhalten. Die Fachleute können ohne Weiteres das in 21 dargestellte System dazu verwenden, die nötige Analyse während des Temperaturzyklus bereitzustellen, wenn gewünscht in Echtzeit, um bis dahin die nicht zugänglichen Informationen der Eigenschaften des Produkts, der Sonde und des Primers bereitzustellen, wobei die hier beschriebene Hardware und Software benutzt wird.
  • Der absolute mengenmäßige Nachweis des Produkts wird ebenfalls vorteilhafterweise ausgeführt. Das kontinuierliche Überwachen der Doppelstrang DNS-Bildung erlaubt einen direkten, absoluten mengenmäßigen Nachweis der DNS durch die Wiederanlagerungskinetiken. Die Probentemperatur wird schnell von der Denaturierungstemperatur verringert und auf einer niedereren Temperatur, die aber noch hoch genug ist, um eine Anlagerung der Primer zu verhindern, konstant gehalten. Die dann folgende Wiederanlagerungsgeschwindigkeit des Produkts folgt einer Kinetik zweiter Ordnung. Wenn verschiedene DNS-Konzentrationen getestet werden, ist die Form der Wiederanlagerungskurve charakteristisch für die DNS-Konzentration (vgl. 26). Für jedes beliebige gestellte PCR Produkt und jede Temperatur, kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Ist die Geschwindigkeitskonstante einmal bekannt, kann jede unbekannte DNS-Konzentration aus den experimentellen Wiederanlagerungsdaten bestimmt werden. Die Kurven können durch eine nichtlineare Fehlerquadratregressionsmethode während des Temperaturzyklus in Echtzeit angepasst werden, indem die LabView Programmierumgebung (vorher erläutert) verwendet wird. Das Kühlen erfolgt nicht instantan, und es tritt ein wenig Wiederanlagerung auf, bevor eine konstante Temperatur erreicht wird, aber gemäß vorliegender Erfindung berücksichtig dies die Regressionsanalyse. Die Technik erfordert ein reines PCR Produkt, aber dies kann verifiziert werden, indem die Schmelzkurven auch während des Temperaturzyklus aufgenommen werden. Der mengenmäßige Nachweis durch die Wiederanlagerungskinetik ist unabhängig von einem Signallevel und wird nicht durch Unterschiede in dem Probenvolumen beeinflusst.
  • 28 ist eine schematische Darstellung einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die mehrere in dem Ausführungsbeispiel von 21 beinhaltete Strukturen aufweist. Um eine knappe Beschreibung des Ausführungsbeispiels von 28 bereitzustellen, werden nur die signifikanten Unterschiede zwischen den in 21 dargestellten Komponenten und den in 28 dargestellten Komponenten erläutert, wobei es selbstverständlich ist, dass ein Fachmann ohne Weiteres die hier dargelegten Informationen dazu verwenden kann, die erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiele herzustellen. 27A und 27B sind schematische Querschnittsansichten des in 28 dargestellten Ausführungsbeispiels in einem Betriebs- bzw. einem Beladezustand.
  • Das in 28 dargestellte Ausführungsbeispiel ist ein schneller zyklischer Temperaturwechsler, der im allgemeinen mit 502 bezeichnet wird, mit Fluoreszenzdetektion an der Spitze der Probenbehälter, wobei die Probenbehälter automatisch in zwei Dimensionen ausgerichtet werden, was das Fluoreszenzsignal, das von der Probe erhalten wird, verbessert. 29 ist eine perspektivische Ansicht des Äußeren der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die die in der schematischen Darstellung von 28 illustrierten Komponenten beinhaltet.
  • Wie in de 28 und 29 zu sehen ist, hält ein entfernbares kreisförmiges Tablett 483 zweiunddreißig Proben. Das entfernbare kreisförmige Tablett 483 wird dann in den schnellen zyklischen Temperaturwechsler 502 gesetzt, so dass es mit einem Karussell 481, das durch einen Motor 488 angetrieben wird, in Eingriff geht. Wenn sich das Karussell 481 dreht, wird ein Halleffekt-Positions-Lokalisator verwendet, um das Karussell 481 genau zu positionieren, so dass jede Probe exakt über einem Fluorimeteraufbau 459 positioniert wird. Der Fluorimeteraufbau 459 beinhaltet vorzugsweise eine LED-Quelle 459A, drei Photodioden 459B, fokussierende Linsen 459C, und ein Filteraufbau 459D. Der Fluorimeteraufbau 459 ähnelt in Konstruktion und Funktion dem in 20 dargestellten.
  • Besonders vorteilhafterweise ist das Fluorimeter auf einem Schlittenlager 493, das durch einen lateralen Schrittmotor 491 bewegt wird, angebracht. Wenn sich das Karussell 481 dreht, werden die zusammengesetzten Kunststoff/Glas-Probenbehälter 450 genau über dem Fluorimeteraufbau 459 in Richtung des Karussells positioniert und die Position wird durch das Gerät mittels eines Halleffekt-Positions-Lokalisators 495 festgestellt, während der laterale Schrittmotor 491 die Position des Fluorimeteraufbau 459 in einer zweiten Dimension justiert, und die Position feststellt. Demnach stellt der zyklische Temperaturwechsler 502 eine verbesserte Platzierung der mehreren Proben in dem Gerät bereit, wobei ein entfernbares Probentablett 483 benutzt wird, und stellt damit eine verbesserte Detektion eines Fluoreszenzsignals von der Probe bereit.
  • In den 30A bis 30V sind detaillierte schematische Diagramme bereitgestellt, die die bevorzugten Konfigurationen der elektrischen Komponenten des in den 29 und 30 dargestellten schnellen zyklischen Temperaturwechslers 502 zeigen. Es ist selbstverständlich, dass die Diagramme in den 30A bis 30V lediglich einen bevorzugten Aufbau für das Ausführen der bestimmten Aspekte vorliegender Erfindung darstellen, und die Diagramme nicht beabsichtigen, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung einzuschränken. Um die Klarheit der Diagramm zu verbessern, wurden die Bezeichnungen, die in der Industrie gewöhnlich verwendet werden, in diesen Diagrammen beibehalten und werden in der unten aufgeführten Liste der entsprechenden Teile aufgeführt.
    Teilelist-Mainboard
    Artikel Anzahl Bezugszeichen Teil
    1 1 BT1 3V Lithium
    2 9 C1, C2, C3, C8, C9, C13, C18, C24, C26 1UF
    3 7 C4, C5, C10, C12, C14, C15, C17 1UF
    4 2 C7, C6 100UF
    5 6 C11, C16, C19, C20, C21, C22 18pF
    6 1 C23 47UF
    7 2 C25, C:21 22UF
    8 2 C28, C29 10UF
    9 1 F1 1A
    10 1 IC1 AD594
    11 2 IC2, IC3 DS5000FP
    12 1 IC4 LM324
    13 8 IC5, IC7, IC10, R13, R17, R18, R21, R22 10K
    14 2 IC6, IC8 MS62256
    15 2 IC9, IC10 DS2003
    16 1 IC11 TLC1451
    11 1 IC12 7432
    18 1 IC13 PT5101
    19 1 IC14 PT5102
    20 1 IC15 7404
    21 1 IC16 PIC16C54
    22 1 IC17 MAX232
    23 1 IC18 LM4040
    24 1 IC19 LTC1293
    25 1 IC20 LTC1286
    26 1 IC21 LM385 1.2
    27 1 IC22 LTC1144
    28 2 IC23, IC24 PVG612S
    29 1 JP1 HALL SENSOR
    30 1 JP2 FLO1
    31 1 JP3 FLO3
    32 1 JP4 FLO2
    33 1 JP5 MAIN HEADER
    34 1 J1 CON2
    35 1 LED1 STEP
    36 1 LED2 TEMP
    37 2 LED3, LED4 Rot/Grün LED
    38 1 P1 SERIAL CONNECTOR
    39 1 Q1 2N5484
    40 10 Q2, Q3, Q4; Q5, Q6, Q7, Q8, Q9, Q10, Q11 NDS351
    41 1 R1 4.87K 1%
    42 4 R2, R4, R5, R6 10K 1%
    43 1 R3 2.74K 1%
    44 1 R7 200
    45 8 RS, R9, R10, R11, R19, R20, R28, R29 470
    46 2 R15, R12 100
    47 3 R14, R16, R23 1K
    48 4 R24, R25, R26, R27 4.7K
    49 1 S1 TYPE J
    50 1 Y1 20.0000
    51 2 Y3, Y2 14.745600
    Teileliste-POWER BOARD
    Artikel Anzahl Bezugszeichen Teil
    1 3 C1, C5, C6 330UF
    2 1 C2 47UF
    3 1 C3 1000UF
    4 1 C4 22UF
    5 1 C7 1000F
    6 1 C8 220UF
    7 5 C9, C10, C11, C12, C13 .1UF
    8 2 C15, C16 10UF
    9 2 DR1, DR2 IM481H
    10 1 D1 IN5232
    11 2 D2, D4 IN4756
    12 2 D5, D3 11DQ06
    13 1 F1 2A
    14 4 IC1, IC2, IC3, IC4 HCPL2630
    15 1 IC5 LM2574hv8
    16 2 IC7, IC6 PVG612S
    17 1 IC8 MOC3020
    18 1 IC9 TLC1451
    19 1 IC10 LM324
    20 1 IC11 BRIDGE
    21 1 IC12 LTC 1144
    22 1 JP1 HEADER 14
    23 2 JP2, JP3 4 HEADER
    24 1 JP4 HEADER 12
    25 2 L2, L1 330UH
    26 1 Q1 4008
    27 9 R1, R2, R4, R5, R3, R7, R8, R9, R10 470
    28 1 R3 360
    29 7 R11, R13, R14, R16, R17, R18, R19 10K
    30 1 R12 4.7K
    31 1 R15 1K
    32 1 R20 261
    33 1 R21 866
    34_ 1 R22 650
    35 1 R23 180
    36 2 S1, S2 110/220
    37 1 T1 TRANSFORMER FLAT COMPACT
    38 1 VR1 LM2575
    Teileliste-INTEGRATOR
    Artikel Anzahl Bezugszeichen Teil
    1 2 C1, C2 1UF
    2 1 C3 .01
    3 1 IC1 ACF2101
    4 1 IC2 OPT301
    5 1 IC3 OPA627
    6 1 IC4 REF200
    7 1 J1 CON6
    8 1 P1 500
    9 1 R1 30M
    10 1 R2 100K
    11 2 R3, R4 10K
    12 2 R5, R6 100
    Teileliste-HALL EFFEKT
    Artikel Anzahl Bezugszeichen Teil
    1 1 IC1 HAL115
    2 1 J1 CON3
    3 1 R1 10K
  • Der beispielhafte Programmcode, der in Verbindung mit den Komponenten aus den 28, 29 und 30A bis 30V verwendet wurde, ist im Programmcodeanhang B beschrieben, der beiliegt und hiermit durch Verweis mitaufgenommen wird.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Handhabungssystem bereitgestellt, um kleinvolumige Probenbehälter mit flüssigen Proben zu befüllen, insbesondere Proben, die durch die Detektion der emittierten Fluoreszenz analysiert werden. Die Probenbehälter weisen typischerweise ein Volumen von weniger als 1 ml auf, und können in Form eines Röhrchens (d. h. ein Kapillarröhrchen) oder einer "flachen Kapillare", bei der der Kapillarraum durch zwei voneinander beabstandete, an ihren Kanten versiegelte Platten oder Blätter definiert wird, vorliegen. Die Probenbehälter weisen typischerweise ein Volumen-zu-Außenfläche Verhältnis von ungefähr 1 mm, noch typischerweise von weniger als 0,5 mm auf. Die Kapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von weniger als 1 mm weisen ein Verhältnis Volumen-zu-Oberfläche von weniger als 0,25 mm auf. Das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Behältnis ist vorzugsweise aus einem optisch transparenten Material gebildet. Bevorzugte Materialien sind optisch durchlässig für Licht mit einem Wellenlängenbereich von ungefähr 400 nm bis ungefähr 800 nm. Die Verwendung solcher Materialien ermöglicht die Detektion eines Fluoreszenzsignals, das in einer in dem Behälter enthaltenen flüssigen Probe erzeugt wird. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von Behältern mit einem niedrigen Volumen – zu Oberfläche Verhältnis für die Analyse der Fluores zenz von einer fluoreszierenden Probe eine effizientere Detektion der Fluoreszenz bedingt durch die verbesserte innere Totalreflexion.
  • Behälter mit einer großen Oberfläche-zu-Volumen Verhältnis (oder andersherum einem niedrigen Volumen-zu-Oberfläche Verhältnis) können schwierig mit einer flüssigen Probe zu befüllen sein. Vorteilhafterweise hilft das Probenhandhabungssystem der vorliegenden Erfindung dabei, diese Schwierigkeiten zu überwinden. Gemäß einer Ausführungsform wird ein Behälter mit einem hohen Verhältnis Oberfläche-zu-Volumen und einem offenen Ende mit einer trichterförmigen Kappe, die auf das offene Ende des Behälters passt, ausgestattet, um das Einfüllen der flüssigen Proben in den Behälter zu erleichtern. Die trichterförmige Kappe beinhaltet eine erste Probenaufnahmeöffnung und eine zweite Probentransferöffnung und eine Vorrichtung zum lösbaren Befestigen der trichterförmigen Kappe an dem Behälter, so dass die Probentransferöffnung der trichterförmigen Kappe und das offenen Ende des Behälters zueinander ausgerichtet sind. In einer Ausführungsform ist die trichterförmige Kappe eine Kunststoff- oder Gummikonstruktion und ist derart ausgebildet, dass der innere Durchmesser der Probentransferöffnung einen Reibschluss mit dem äußeren Durchmesser des Behälters in der Nähe von dessen offenem Ende eingeht. Dem Fachmann sind jedoch auch andere Vorrichtungen zum aneinander Koppeln der trichterförmigen Kappe und des Behälters bekannt, die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegen und die die Verwendung von Klebstoff, Klammern, Spangen und ähnlichem umfassen. In einer Ausführungsform umfasst das Probenhandhabungssystem ferner einen Stöpsel für eine zu versiegelnde Reibschlussverbindung mit der Probenaufnahmeöffnung der trichterförmigen Kappe. Dennoch kann jede Vorrichtung oder jedes Material, das dazu geeignet ist, die Öffnung der trichterförmigen Kappe effektiv zu versiegeln, mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine Kontamination oder Verdunstung der eingefüllte Probe zu verhindern.
  • Vorteilhafterweise können die Behälter der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zum Verbessern der Detektion und Effizienz der Fluoreszenzaufnahme in einer einen Fluorophor umfassenden Probe verwendet werden. Das Verfahren umfasst den Schritt des Platzierens einer Probe in einem Behälter mit Wänden, die aus einem optisch transparenten Material bestehen und ein Volumen mit zumindest erster und zweiter Abmessung definiert. Die erste Abmessung ist kleiner als die zweite Abmessung und das Verhältnis von Volumen-zu-Außenfläche des Behälters beträgt weniger als 1 mm. Die verbesserte Detektion und Effizienz der Aufnahme der Fluoreszenz, die von der Probe erzeugt wird, wird durch das Detektieren der Fluoreszenz entlang einer Achse, die im Wesentlichen parallel zu einer Wand entlang der zweiten Abmessung des Behälters ist, erreicht. In einem Ausführungsbeispiel wird die Probenfluoreszenz durch die den Fluorophor anregende Beleuchtung der Proben induziert, wobei die Probe entlang einer Achse beleuchtet wird, die im Wesentlichen parallel zu einer Wand entlang der zweiten Abmessung des Behälters ist. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel, wird die optimale Effizienz der Fluoreszenzaufnahme durch eine den Fluorophor anregende Beleuchtung entlang der Fluoreszenz-Detektionsachse (Epifluoreszenz Detektion) erreicht, und die Fluoreszenz wird entlang einer Achse durch eine Wand des Behälters mit der kleinsten Oberfläche, vorzugsweise entlang einer Achse durch den Boden des Behälters, detektiert.
  • In einer Ausführungsform ist die Fluoreszenz der biologischen Probe temperaturabhängig. Zum Beispiel kann das Gefäß eine Probe mit Nukleinsäuresequenzen enthalten, und die fluoreszierende Einheit kann einen Doppelstrang-spezifischen Farbstoff enthalten. Wenn die Temperatur der Probe auf die Denaturierungstemperatur erhöht wird, verringert sich die Fluoreszenzintensität. Alternativ kann die fluoreszierende Einheit ein Paar der Oligonukleotid-Sonden enthalten, die in benachbarten Bereichen der Zielnukleinsäuresequenz hybridisieren, wobei eine der Sonden mit einem Donor-Fluorophor eines Fluoreszenzenergietransferpaars markiert ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist der Behälter in Form eines Kapillarröhrchens oder einer flachen Kapillare ausgebildet, die vorteilhafterweise in Prozessen, die einen Temperaturzyklus der Probe erfordern, beispielsweise der Vervielfältigung einer Zielnukleinsäuresequenz mittels der Polymerasekettenreaktion, verwendet werden können. In einer Ausführungsform ist der kapillare Behälter derart ausgebildet, dass er in einen Probenhalter einer für den Temperaturzyklus verwendeten Vorrichtung oder einer für die Fluoreszenzdetektion verwendeten Vorrichtung eingeführt werden kann. Der Probenhalter der Vorrichtung kann nur einen einzelnen Behälter enthalten, oder der Probenhalter kann in Form eines Karussells zum Halten mehrerer Probenbehälter ausgebildet sein.
  • Ein für eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignetes Karussell ist in den 31A und 31B dargestellt. Das Karussell 1 ist im Allgemeinen in der Form einer Scheibe 2 mit einer oberen Fläche 3, einer unteren Fläche 4 und einem äußeren Rand 5, der sich dazwischen erstreckt, ausgebildet. Die Scheibe 2 hat in der oberen Fläche mehrere Sätze radial angeordneter Probenaufnahmeöffnungen 6A, 6B, und 6C, im äußeren Rand 5 eine Probenbehälteröffnung 7 und einen Probendurchgang 8, der die Probenaufnahmeöffnungen 6A, 6B, und 6C und die entsprechende Probenbehälteröffnung 7 miteinander verbindet. Das Karussell 1 wird mit befestigten Probenbehältern, von denen einige mit 9 bezeichnet sind, gezeigt. Die Probenbehälteröffnung 7 und der Probendurchgang 8 sind dazu ausgebildet, die Probenbehälter in der Scheibe 2 aufzunehmen und zu fixieren. In einem Ausführungsbeispiel ist der Probenbehälter 9 lösbar an dem Karussell 1 befestigt, um ein Entfernen des Probenbehälters 9 und dessen Ersatz durch einen anderen Probenbehälter zu ermöglichen, um das Karussell 1 für den mehrfachen Gebrauch zuzulassen. In einem alternativen Ausführungsbeispiel sind die Probenbehälter 9 permanent an der Scheibe 2 befestigt, oder als integrale Komponente von ihr ausgebildet. In einem Ausführungsbeispiel ist der Probenbehälter 9 an der Scheibe 2 durch Reibkontakt zwischen dem Probenbehälter 9 und mindestens einem Teil des Probendurchgangs 8 in der Nähe der Probenbehälteröffnung 7 fixiert. Andere herkömmliche Vorrichtungen zum Befestigen des Probenbehälters in Verbindung mit der Probenbehälteröffnung können verwendet werden. Zum Beispiel können komplementäre Schraubengewinde an der Fläche des Probendurchgangs 8 und an der Außenfläche der Probenbehälter 9 ausgebildet sein. Zusätzlich können Klebstoffe oder andere den Fachleuten bekannte Befestigungsmittel im Zusammenhang mit vorliegender Erfindung verwendet werden, um den Probenbehälter 9 an der Scheibe 2 zu befestigen. Die oberen und unteren Flächen des erfindungsgemäßen Karussells sind vorzugsweise derart ausgebildet, dass mehrere Karusselle übereinander gestapelt werden können, so dass ein Stapel von mehreren Karussellen lösbar mit einer Antriebswelle eines Motors in Eingriff gehen kann, und simultan als Einheit, wie in 32 gezeigt wird, gedreht werden kann.
  • Das in 32 gezeigte Ausführungsbeispiel beinhaltet einen Schrittmotor 504 und eine Antriebswelle 506, die dazu dient, die im allgemeinen als 1 bezeichneten Karusselle zu drehen. Ein Kammerventilator 508 wird dazu verwendet, einen Luftstrom, der durch die Pfeile 512 gekennzeichnet ist, zu erzeugen. Eine Heizvorrichtung 510 dient dazu, die Luft, die an den Probebehältern 9 vorbeiströmt, zu erwärmen. Ein Fluorimeteraufbau 514 beinhaltet eine LED Quelle 514A, Photodioden 5148, fokussierende Linsen 514C, und einen Filteraufbau 514D. Ein Fluorimeter-Schrittmotor 516 dient dazu, den Fluorimeteraufbau 514 in Richtung des Pfeils 518 zu bewegen. Der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet kann unter Verwendung der hier aufgezeigten Informationen problemlos Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung herstellen, die entsprechend der in 32 dargestellten Anordnungen gestaltet sind.
  • In einem anderen Ausführungsbeispiel (nicht dargestellt) umfasst das Karussell eine Scheibe mit einer oberen Fläche, einer unteren Fläche, einem sich dazwischen erstreckenden Außenrand, eine Probenaufnahmeöffnung in der oberen Fläche, eine Probenbehälteröffnung in der unteren Flä che und einen Probendurchgang, der die Probenaufnahmeöffnung und die Probenbehälteröffnung miteinander verbindet. Die Probenbehälteröffnung und der Probendurchgang sind dazu ausgebildet, die Probenbehälter in der Scheibe aufzunehmen und zu fixieren. Vorzugsweise werden die Probenbehälter in einem sich radial erstreckenden spitzen Winkel an der unteren Fläche der Scheibe gehalten.
  • In einem Ausführungsbeispiel umfasst der Probendurchgang der Scheibe einen ersten Teil mit einer Mittelachse, die im wesentlichen parallel zu der oberen und unteren Fläche der Scheibe verläuft, und einen zweiten Teil mit einer Mittelachse, die einen spitzen Winkel mit der oberen und unteren Fläche der Scheibe bildet. In diesem Ausführungsbeispiel sind die Probenbehälteröffnung und der Probendurchgang dazu ausgebildet, einen Probenbehälter an der Scheibe aufzunehmen und zu fixieren, so dass sich der Probenbehälter von der Scheibe weg in einem spitzen Winkel relativ zu der unteren Fläche der Scheibe erstreckt.
  • Das Karussell 1 ist weiterhin mit einer Vorrichtung zum Verschließen der Probenaufnahmeöffnungen 6A, 6B, und 6C ausgestattet. Die Verschließvorrichtung kann ein Stöpsel (nicht dargestellt) sein, der in die Probenaufnahmeöffnung 6 passt und in Reibschluss mit den umliegenden Wänden des Probendurchgang geht, oder zum Beispiel ein Band mit einer klebenden Rückseite sein, das an der oberen Fläche angebracht wird, um effektiv die Öffnung der Probenaufnahmeöffnung zu versiegeln, um eine Kontamination oder Verdunstung der eingefüllten Probe zu verhindern. Das Karussell 1 ist lösbar mit einer Antriebswelle für eine Rotation verbunden. Jedes geeignete Verbindungsmittel, das den allgemeinen Fachleuten vertraut ist, kann verwendet werden, inklusive Reibschlussverbindung, oder die Verwendung von Schrauben, Bolzen, Haltestiften oder Klammern. In einem Ausführungsbeispiel ist die Scheibe 2 als Ring mit einem Mittelloch, das dazu ausgebildet ist, die Antriebswelle aufzunehmen (vgl. 506 in 32), ausgebildet. Das Ende der Antriebswelle ist vorzugsweise mit Strukturen, um die Scheibe an Ort und Stelle zu halten, ausgestattet.
  • Das Karussell 1 der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, eine flüssige Probe in einen Probenbehälter 9 zu liefern. In einem Ausführungsbeispiel ist der Probenbehälter ein kapillarer Behälter, der eine vorgemischte Mischung (zum Beispiel eine Reagenzmischung) enthält, die mit einem oder mehreren Komponenten der einführten Probe interagieren. Gemäß einem Ausführungsbeispiel wird eine vorgemischte Mischung in den Probenbehälter zugegeben, bevor ein kapillarer Probenbehälter in der Probenbehälteröffnung positioniert wird. Alternativ ist der Probenbehälter mit einer vorgemischten Probe bereits fertig abgepackt. Die vorgemischte Probe kann ein Reagenz enthalten, das mit der Probe reagiert oder interagiert, um ein detektierbares Signal oder ein Produkt-Derivat zu erhalten.
  • Die Probendurchgänge 8 des Karussells 1 sind vorzugsweise mit einer oder mehreren Barrieren 10 ausgestattet, die verhindern, dass eine durch die Probenaufnahmeöffnungen 6A, 6B, und 6C gelieferte Probe in die Probenbehälteröffnung 7 fließt, ohne dass eine beeinflussende Kraft auf die flüssige Probe wirkt. Die Bezeichnung "Barriere" wird hier verwendet, um jede Konstruktion, die den freien Fluss einer in einer Probenaufnahmeöffnung angelieferten Probe zu der Probenbehälteröffnung behindert, zu umfassen. Beispiele geeigneter Barrieren für die Verwendung in dem Probendurchgang des Karussells der vorliegenden Erfindung beinhalten in dem Probendurchgang ausgebildete Vertiefungen oder Senken, den Probendurchgang verengende Vorsprünge oder ringförmige Ränder, die sich von der Oberfläche des Probendurchgangs erstrecken, poröse Membrane, gerichtete Ventile, oder Klappen, die zu einer geschlossene Position tendieren.
  • Die Barrieren sind derart ausgebildet, dass die flüssige Probe die Barriere überwinden kann, wenn eine beeinflussende Kraft auf eine flüssige Probe, die in dem Probendurchgang vorhanden ist und durch die Barriere blockiert wird, angelegt wird. Das Anlegen einer beeinflussenden Kraft auf die Probe wird vorzugsweise durch eine Zentripetalkraft, die durch die Dre hung des Karussells erzeugt wird, versehen. Deshalb können, in einem Karussell mit mehreren Sätzen von Probenaufnahmeöffnungen 6A, 66 und 6C, in der oberen Fläche, wobei jeder Satz mit einem entsprechenden Probendurchgang und einer entsprechenden Probenbehälteröffnung ausgestattet ist, die Proben individuell den verschiedenen Probenaufnahmeöffnungen zugegeben werden, und die Barriere wird die flüssige Probe lokalisieren und die Proben daran hindern, in die entsprechenden Probenbehälteröffnungen zu fließen. Nachdem alle Proben in den entsprechenden Aufnahmeöffnungen angeliefert sind, wird das Karussell gedreht, um die Proben an die entsprechende Probenbehälteröffnung und in ein damit verbundenen Probenbehälter zu liefern.
  • Gemäß einer Ausführungsform ist jeder Probendurchgang des Karussells mit einer einzelnen Probenbehälteröffnung und mehreren Probenaufnahmeöffnungen verbunden. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel kann der Probendurchgang optional einen Mittelverbindungsweg aufweisen, der sich verzweigt, um sich mit den mehreren Probenaufnahmeöffnungen zu verbinden, oder alternativ, wie in den 31A und 31B gezeigt ist, können die mehreren Probenaufnahmeöffnungen 6A, 6B und 6C entlang einer gemeinsamen Achse, die radial von der Mitte der Scheibe verläuft, ausgerichtet sein, wobei jede der Öffnungen durch den einen Verbindungsweg mit einem Probenbehälter in Verbindung steht, der in der Probenbehälteröffnung aufgenommen ist. Der Probendurchgang kann mit einer oder mehreren Barrieren 9A ausgestattet sein, die eine Probe, die an einer der mehreren Probenaufnahmeöffnungen zugegeben wurde, daran hindern, in die Probenbehälteröffnung zu fließen, wenn keine beeinflussende Kraft auf die flüssige Probe wirkt. Darüber hinaus kann jeder Probendurchgang mit mehreren Barrieren ausgestattet sein, von denen jede einen unterschiedlichen Betrag der beeinflussenden Kraft erfordert, um die Probe über die Barriere zu transferieren. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel können, nachdem die Probe an die entsprechenden Probenaufnahmeöffnung geliefert ist, die individuellen Proben selektiv zu der Probenbe hälteröffnung und in den Probenbehälter transferiert werden, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Karussells gesteuert wird.
  • Zum Beispiel kann eine erste Probe in eine erste Probenaufnahmeöffnung und eine zweite Probe in eine zweite Probenaufnahmeöffnung geliefert werden, wobei die erste und zweite Probenaufnahmeöffnung über einen gemeinsamen Probendurchgang in Verbindung miteinander stehen, und die erste und die zweite Probenaufnahmeöffnung jeweils mit einer Barriere ausgestattet sind, die den Fluss der ersten bzw. zweiten Probe behindert. Die Barrieren ermöglichen, dass die Scheibe als Teil eines Bausatzes mit vorgegebenen Mengen von ausgewählten Reagenzien, Katalysatoren, Enzymen, Ölen, etc, die bereits in den Probendurchgang über die eine oder die mehreren Probenaufnahmeöffnungen vorgefüllt wurden, vorgesehen sein können.
  • In einem Ausführungsbeispiel ist die Barriere für die zweite Probenaufnahmeöffnung derart ausgebildet, dass eine größere beeinflussende Kraft an die Probe, die an der zweiten Probenaufnahmeöffnung angeliefert wurde, angelegt werden muss, damit sie die zugehörige Barriere überwindet, als für eine Probe, die an der ersten Probenaufnahmeöffnung angeliefert wurde, erforderlich ist, um deren zugehörige Barriere zu überwinden. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel, liefert die Drehung des Karussells mit einer ersten Geschwindigkeit die erste Probe an die Probenbehälteröffnung und in den Probenbehälter, während die zweite Probe daran gehindert wird, zu der Probenbehälteröffnung und in den Probenbehälter zu fließen. Die Drehung mit einer erhöhten zweiten Geschwindigkeit wird dann die Zentripetalkraft auf die zweite Probe verstärken, und in der Anlieferung der zweiten Proben an der Probenbehälteröffnung und in dem Probenbehälter resultieren. Basierend auf diesem Prinzip können verschiedene Proben an mehrere Probenaufnahmeöffnungen, die mit einem gemeinsamen Probendurchgang miteinander in Verbindung stehen, geliefert werden, und nachdem alle Proben eingefüllt wurden, können die individuellen Proben eine nach der anderen oder simultan an die Probenbehälteröffnung und in den Probenbe hälter abgegeben werden, indem die Rotationsgeschwindigkeit des Karussells gesteuert wird. In einem Ausführungsbeispiel wird eine erste Probe mit einem Fluorophor einer ersten Probenaufnahmeöffnung zugegeben und eine zweite Probe mit Öl wird an der zweiten Probenaufnahmeöffnung angeliefert. Das Karussell wird dann gedreht, um die erste Probe in den Probenbehälter zu liefern, gefolgt von dem Öl. Das Öl (oder eine andere Flüssigkeit, die effektiv die erste Probe in dem Probenbehälter versiegelt) dient dazu, die Verdunstung der ersten Probe zu verringern und das Risiko der Kontamination der ersten Probe zu reduzieren.
  • In einem Beispiel wird ein Mehrere-Proben-Karussell dazu verwendet, mehrere Proben simultan zu handhaben. Das Karussell ist eine Scheibenförmige Struktur mit einer Vielzahl von Probenaufnahmeöffnungen in der oberen Fläche der scheibenförmigen Struktur und in Fluidverbindung mit den entsprechenden an der Scheibe angebrachten Probenbehältern. Die an den Probenöffnungen zugegebenen Proben werden durch die Rotation des Karussells zu ihren entsprechenden Probenbehältern transferiert. Das Karussell kann auch mehrere Probenaufnahmeöffnungen aufweisen, die mit jeweils einem individuellen Probenbehälter in Verbindung stehen. Die Reagenzien können von einem Benutzer in eine zweite Probenaufnahmeöffnung, die mit dem Probenbehälter in Verbindung steht, platziert werden, um eine weitere Probe, die dem ersten Probenaufnahmeöffnung zugegeben wurde, an den Behälter zu liefern, oder alternativ, können vorgegebene Reagenzien in einer zweiten Probenaufnahmeöffnung durch einen Hersteller angeordnet sein, d. h. bei dem das Karussell, die Probenbehälter und die vorgegebenen Reagenzien bereits in einer verpackten Form sind. Die Reagenzien werden zusammen mit der Probe durch die Rotation des Karussells an den Probenbehälter geliefert. Ein Öl zum Überlagern der wässrigen Probe kann in eine dritte Probenaufnahmeöffnung gegeben werden, die in flüssiger Verbindung mit dem Probenbehälter steht (und den ersten und zweiten Probenaufnahmeöffnungen), oder das Öl kann von dem Hersteller dem Karussell zugegeben sein.
  • Alternativ können eine Probe, Reagenzien und Öl für die Probenüberlagerung an einer einzigen Probenaufnahmeöffnung abgegeben werden. Das Karussell kann gedreht werden, um jede Zusammensetzung oder Probe an den entsprechenden Behälter abzugeben, bevor eine zweite oder nachfolgende Probe oder andere Zusammensetzung an die Probenaufnahmeöffnung abgegeben wird.
  • Ein bevorzugtes Probenbehälterkarussell dieser Erfindung beinhaltet vorzugsweise, aber optional, drei Probenaufnahmeöffnungen, die in radialer Ausrichtung arrangiert sind und in Fluidverbindung mit einem gemeinsamen Probenbehälter stehen. Gemäß diesem Ausführungsbeispiel sind ungefähr 1 bis 5 µl eines Ölüberzugs, der vorzugsweise schwarz gefärbt ist, in der vorverpackten Form vorhanden oder wird an die radial am innersten liegende Probenaufnahmeöffnung abgegeben. Der Ölüberzug umfasst ein Mineralöl und ungefähr 0,01% bis ungefähr 1% eines organischen schwarzen Farbstoffs, wie beispielsweise Waxoline® Black OBP, das von Zenica Inc, Wilmington, DE erhältlich ist. Ungefähr 1 µl bis ungefähr 9 µl einer Reagenzhauptmischung liegen in vorverpackter Form vor oder werden an die radial am äußersten liegende Probenaufnahmeöffnung abgegeben. Die Reagenzhauptmischung umfasst einen Teil der, oder alle nötigen Reaktionskomponenten. Ein flüssige Probe, die eine zu testende Vorlagen-Nukleinsäure enthält, wird manuell oder mit Hilfe eines Roboters in die radial in der Mitte liegende Probenaufnahmeöffnung abgegeben. Die Scheibe wird dann mit einer Geschwindigkeit, die die Probe in den Reagenzabschnitt überführt, aber mit einer Rotationsgeschwindigkeit, die nicht ausreicht, die Probe in den Probenbehälter zu befördern, gedreht. Die Probe und das Reagenz können optional durch schnelle Änderungen der Rotationsgeschwindigkeit der Scheibe gemischt werden. Die Scheibe wird dann mit einer höheren Geschwindigkeit gedreht, damit die Probe und die Reagenzmischung, aber nicht das Öl, sich in den Probenbehälter bewegen. Die Scheibe wird dann mit einer noch höheren Rotationsgeschwindigkeit gedreht, um den Ölüberzug zu dem Probenbehälter zu befördern. Das Öl überlagert die wässrige Probe, da es eine niedrigere Dichte aufweist, und blockiert den Lichteintritt aufgrund seines Farbstoffgehalts. Der selektive Transfer von Öl, Reagenz und Probe durch das Verändern der Rotationsgeschwindigkeit des Karussells wird erreicht durch eine Kombination aus: 1) Variieren des Durchmessers des Fluiddurchgangs; 2) Variieren der Größe oder der Form der physikalischen Barrieren, die in dem Fluiddurchgang vorhanden sind; und 3) durch die Verwendung der Abhängigkeit der Zentrifugalkraft von dem variierenden Abstand (Radius) jeder Probenaufnahmeöffnung von der Mitte der Scheibe.
  • Das Karussell der vorliegenden Erfindung kann lösbar mit einer Antriebswelle und einem Motor (506 bzw. 504 in 32) zum Drehen des Karussells verbunden sein. Des Weiteren können einzelne erfindungsgemäße Karusselle übereinander gestapelt werden und mit einer Antriebswelle für eine simultane Rotation (wie in 32 gezeigt ist) verbunden werden. Gemäß eines anderen Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Vorrichtung bereitgestellt, um die Fluoreszenz der in einem Probenbehälter (vgl. Bezugszeichen 514 in 32) enthaltenen Probe zu überwachen. Der Probenbehälter umfasst ein optisch transparentes Material und weist Wände auf, die ein Volumen mit zumindest einer ersten und einer zweiten Abmessung definieren, wobei die erste Abmessung kleiner ist als die zweite Abmessung, und wobei das Verhältnis von Volumen-zu-Außenflächen des Behälters kleiner als 1 mm ist. In einem Ausführungsbeispiel umfasst das Gerät eine Kammer, einen Probenbehälterhalter, eine lichtemittierende Quelle, die in der Kammer angebracht ist und derart angeordnet ist, dass sie die Probe entlang einer Achse, die im wesentlichen parallel zu einer Wand entlang der zweiten Abmessung des Behälters ist, beleuchtet. Die lichtemittierende Quelle und der Lichtdetektor gemäß dem einen Ausführungsbeispiel sind auf einer Platte angebracht, die angehoben oder abgesenkt werden kann (wie durch die Pfeil 518 in 32 angezeigt ist). In diesem Ausführungsbeispiel können die lichtemittierende Quelle und der Lichtdetektor derart positioniert werden, dass sie die Fluoreszenz der Probenbehälter (entlang einer Achse, die im wesentlichen parallel zu einer Wand entlang der zweiten Abmessung des Geräts ist) der mehreren Karusselle messen, wenn die einzelnen Karussell übereinander gestapelt sind und mit einer Antriebswelle zum simultanen Drehen (vgl. 32) verbunden sind.
  • In einem Ausführungsbeispiel umfasst der Probenbehälterhalter ein Karussell zum Halten mehrerer Kapillarröhrchen, und das Karussell ist drehbar in der Kammer angebracht. Die lichtemittierende Quelle ist derart angeordnet, dass sie das Kapillarröhrchen durch den Boden des Kapillarröhrchens beleuchtet, und der Lichtdetektor ist angebracht, um die Fluoreszenz durch den Boden des Kapillarröhrchens zu detektierten. Zusätzlich ist das Gerät mit einem Schrittmotor zum Drehen des Karussells und einer Vorrichtung zum Koppeln des Karussells an den Motor ausgestattet.
  • Gemäß einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist die Kammer der Fluoreszenz-Detektionsvorrichtung des weiteren mit einer Heizvorrichtung (siehe Bezugszeichen 510 in 32), und einem Ventilator (siehe Bezugszeichen 508 in 32), die in dem Gerät angebracht sind und in Luftströmverbindung mit der Kammer stehen, und einer Steuervorrichtung zum schnellen zyklischen Wechseln der Temperatur der Kammer, wobei, zumindest anfänglich, vorgegebene Zeit- und Temperaturparameter verwendet werden, ausgestattet. Das Gerät ist fähig, eine Polymerasekettenreaktion in den von dem Karussell gehaltenen Probenbehältern durchzuführen. Insbesondere berücksichtigt das Gerät ein verbessertes Verfahren zum Ausführen der PCR-Reaktionen, da der Fortschritt der Reaktion in Echtzeit überwacht werden kann, und ermöglicht deshalb die Justierung der Temperatur- und Zeitparameter während des Ablaufs der Reaktion, um die Ausbeute und Reinheit der vervielfältigen Zielnukleinsäuresequenz zu optimieren.
  • Programmcode Anhang A folgt
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  • Programmcode Anhang B folgt
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  • Figure 01300001

Claims (9)

  1. Behälter aus einem Kunststoff/Glas-Verbund zur Aufbewahrung einer fluiden biologischen Probe, während diese einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird, wobei der Behälter, der ein optisch klares Material umfasst, zur Aufbewahrung einer Probe von maximal 1 ml ausgestaltet ist und ferner umfasst: a) einen Kapillarröhrchenabschnitt, der an einem Ende geschlossen ist, b) einen Reservoirabschnitt (450C), der ein trichterartig geformter Abschnitt ist, der mit dem offenen Ende des Kapillarröhrchenabschnitts verbunden ist; und c) eine Konstruktion zum Versiegeln des Kapillarröhrchenabschnitts, wobei der trichterartig geformte Abschnitt aus Kunststoff hergestellt ist.
  2. Behälter nach Anspruch 1, wobei der Kapillarröhrchenabschnitt eine Spitze mit einer äußeren und/oder einer inneren Krümmung aufweist.
  3. Behälter nach Anspruch 1, wobei die Konstruktion einen Stopper umfasst, der zum Versiegeln des Kunststoff/Glas-Behälters in dem trichterartig geformten Abschnitt platziert ist.
  4. Behälter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine in einen Kapillarröhrchenabschnitt geladene Probe zur Ausbildung einer Fluidsäule von 0,2–2,0 cm in der Lage ist.
  5. Vielzahl an Behältern aus einem Kunststoff/Glas-Verbund, positioniert in einem drehbaren Karussell, wobei die Behälter zur Aufbewahrung einer fluiden biologischen Probe geeignet sind, während diese einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird, wobei jeder Behälter, der ein optisch klares Material umfasst, zur Aufbewahrung einer Probe von maximal 1 ml ausgestaltet ist und jeder Behälter ferner umfasst: a) einen Kapillarröhrchenabschnitt, der an einem Ende geschlossen ist; und b) einen Reservoirabschnitt (450C), der ein trichterartig geformter Abschnitt ist, der mit dem offenen Ende des Kapillarröhrchenabschnitts verbunden ist, wobei der trichterartig geformte Abschnitt aus Kunststoff hergestellt ist.
  6. Vielzahl an Kunststoff/Glas-Behältern nach Anspruch 5, wobei jeder Behälter zur Ausbildung eines Epifluoreszenzanregungs- und -detektionswegs in der Lage ist.
  7. Vielzahl an Kunststoff/Glas-Behältern nach Anspruch 6, wobei der Detektionsweg auf die Spitze des Kapillarabschnitts fokussiert ist.
  8. Verwendung eines Kunststoff/Glas-Behälters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer Vielzahl an Kunststoff/Glas-Behältern gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 für eine Echtzeit-PCR, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter zur Aufbewahrung einer fluiden biologischen Probe in der Lage ist, während diese einer Nukleinsäurevervielfältigung unterzogen wird.
  9. Verwendung eines Kunststoff/Glas-Behälters nach Anspruch 8 für eine Temperaturzyklusreaktion, wobei der Temperaturzyklus mittels heißem und Umgebungsluftfluids erhalten wird.
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