DE69432424T2 - Vorrichtung und verfahren zum nachweis von zielliganden - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich im allgemeinen auf die Detektion von Zielliganden und insbesondere auf eine Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von amplifizierten Ziel-Nucleinsäuren mit Hilfe von Video-Bildverarbeitungstechniken.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Amplifikation von Nucleinsäuren ist für eine Vielzahl von Anwendungen von Nutzen. Zum Beispiel wurden Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren in der klinischen Diagnostik und für die Typisierung und Quantifizierung von DNA und RNA zur Klonierung und Sequenzierung verwendet.
  • Die Vorrichtungen zur Durchführung von Amplifikationsreaktionen von Nucleinsäuren sind im allgemeinen als Thermocycler-Vorrichtungen oder Thermocycler bekannt. Ein Beispiel einer solchen Vorrichtung ist in der PCT Anmeldung WO 92/20778 beschrieben und publiziert. Die Cycling-Vorrichtung der PCT Anmeldung ist für die Durchführung von DNA-Amplifikation mittels verschiedener Techniken verwendbar. Die in der WO 92/20778 beschriebene Vorrichtung enthält einen ringförmigen Halter mit mehreren "wells", zur Aufnahme von Pipettenspitzen, die Proben enthalten. Die Proben sind in den Pipettenspitzen enthalten, denen jeweils ein offenes Ende heißversiegelt wurde. Es werden Mittel zur Aufheizung und Abkühlung des Rings zur Verfügung gestellt, wodurch es der Vorrichtung ermöglicht wird, die Proben in den Pipettenspitzen zyklisch aufzuheizen und abzukühlen. Die Möglichkeit zur Abkühlung des Rings schließt einen Ventilator ein, um kalte Luft über den Ring zu verbreiten, und Kühlrippen, die innerhalb des Rings radial positioniert sind, um die Ausrichtung der kühlen Luft über dem Ring zu unterstützen. Die ganze Offenbarung der PCT Anmeldung WO 92/20778 ist hierin durch die Bezugnahme eingeschlossen.
  • Die Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure-Sequenzen sind im Fachgebiet bekannt. So zum Beispiel verwendet das Polymerasekettenreaktions("PCR")-Verfahren ein Paar von Oligonucleotidsequenzen, "Primer" genannt, und Thermocycling-Techniken, worin ein Zyklus der Denaturierung , des "Annealing" und der Primer-Extension die Verdopplung der interessierenden Zielnucleinsäure als Folge haben. Die PCR – Amplifikation wird weiterhin im U.S. Patent No. 4.683.195 und im U.S. Patent No. 4.683.202 beschrieben.
  • Ein anderes bekanntes Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäure-Sequenzen ist die Ligasekettenreaktion ("LCR"). In der LCR werden zwei primäre Sonden und zwei sekundäre Sonden statt der in der PCR benutzten Primer verwendet. Durch wiederholte Hybridisierungs- und Ligationszyklen wird die Amplifikation des Ziels erreicht. Die ligierten Amplifikationsprodukte sind entweder mit der interessierenden Zielnucleinsäure oder mit ihrem Komplement funktionell äquivalent. Diese Technik wurde in EP-A-320 308 und dann in EP-A-336 731, WO 89/09835, WO 89/12696, und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88 : 189–93 (1991) beschrieben. Veränderungen der LCR werden in EP-a-439-182 und in WO 90/01069 beschrieben.
  • Andere bekannte Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren verwenden isotherme Reaktionen. Die Beispiele von solchen Reaktionen schließen 3SR (Self-Sustained Sequence Replication – sich selbst unterhaltende Reaktion) E. Fahy, D. Y. Kwoh & T. R. Gingeras, in PCR Methods and Applications 1 : 25 (1991); und SDA (Strand Displacement Amplification) G. T. Walker, M. C. Little, J. G. Nadeau & D. D. Shank, in Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 89 : 392 (1992) ein.
  • Die Amplifikation von Nucleinsäuren mit Hilfe solcher Verfahren wird üblicherweise in einem geschlossenen Reaktionsgefäß durchgeführt, wie zum Beispiel einem Röhrchen mit Schnappverschluss oder einer versiegelbaren Pipette, wie in WO 92/20778 offenbart. Nachdem die Amplifikationsreaktion beendet ist, wird das Reaktionsgefäß geöffnet und das amplifizierte Produkt wird in eine Detektionsvorrichtung überführt, wo Standard-Detektionsmethodiken verwendet werden.
  • Typischerweise wird das amplifizierte Produkt detektiert, indem man die doppelsträngigen Amplifikationsprodukte denaturiert und die denaturierten Stränge mit einer oder mehreren Hybridisierungssonden, die an einen detektierbaren Marker gekoppelt sind, behandelt. Die nicht hybridisierten markierten Sonden müssen üblicherweise von der hybridisierten markierten Sonde getrennt werden und dieses benötigt einen zusätzlichen Trennungsschritt. Mit anderen Detektionsverfahren können die Amplifikationsprodukte mit Hilfe von mit Ethidiumbromid gefärbten Gelen detektiert werden. Somit können 32P Tracings, Enzymimmunoassay [Keller et al., J. Clin. Microbioloay, 28 : 1411-6 (1990); Fluoreszenz [Urdea et al., Nucleic Acids Research, 16 : 4937–56 und Chemilumineszenz – Assays und Ähnliches auf eine heterogene Art und Weise [Bornstein und Voyta, Clin. Chem., 35 : 1856–57 (1989); Bornstein et. al., Anal. Biochem., 180 : 95–98 (1989); Tizard et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78 : 4515-18(1990)] oder eine homogene Art und Weise [Arnold et al., U.S. Patent Nr. 4,950,613; Arnold et al., Clin. Chem. 35 : 1588–1589 (1989); Nelson und Kacian, Clinica Chimica Acta, 194 : 73–90 (1990) durchgeführt werden.
  • Diese Detektionsverfahren haben aber beachtliche Nachteile. Bei der Öffnung des Reaktionsgefäßes, das eine relativ hohe Konzentration an amplifiziertem Produkt enthält, wird gewöhnlich ein Spritzer oder ein Aerosol gebildet. Solch ein Spritzer oder ein Aerosol kann der Ursprung einer möglichen Kontamination sein, und die Kontamination von negativen oder noch nicht amplifizierten Nucleinsäuren kann zu falschen Ergebnissen führen.
  • Ähnliche Probleme bezüglich der Kontamination können auch das Arbeitsfeld und die Ausstattung zur Vorbereitung der Proben, zur Vorbereitung der Reaktionsreagenzien, zur Amplifikation und zur Analyse der Reaktionsprodukte betreffen. Solch eine Kontamination kann auch über Kontakttransfer (Verschleppen) oder durch die Generierung von Aerosolen stattfinden. Außerdem sind die vorhin beschriebenen Detektionsverfahren zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Die Sonden-Hybridisierungs techniken benötigen typischer Weise die Denaturierung des Extensionsproduktes, das Annealing der Sonde und, in manchen Fällen, die Trennung der überschüssigen Sonde von der Reaktionsprobe. Die Gelelektrophorese ist ebenfalls von Nachteil, weil sie kein praktisches Verfahren darstellt, falls schnelle Ergebnisse erwünscht sind.
  • Das US Patent 5.229.297 und das entsprechende EP 0 381 501 A2 (Kodak) offenbart eine Küvette zur Durchführung der Amplifikation und der Detektion von Nucleinsäure – Material in einer geschlossenen Umgebung, um die Risiken der Kontamination zu reduzieren. Die Kuvette ist eine geschlossene Vorrichtung, die Kammern hat, welche durch eine Reihe von Durchlässen miteinander verbunden sind. Einige der Kammern sind Reaktionskammern für die Amplifikation von DNA – Strängen, andere der Kammern sind Detektionskammern, mit einer Detektionsseite zur Detektion von amplifizierter DNA. Lagerkammern können ebenfalls bereitgestellt werden, um Reagenzien aufzubewahren. Die Nucleinsäurenmaterial-Proben werden zusammen mit Reagenzien aus den Lagerkammern durch die K in die Reaktionskammern geladen. Die Durchlässe, die von der Lagerkammer kommen, sind mit Einweg-Rückschlagventilen versehen, um zu verhindern, dass amplifizierte Produkte in die Lagerkammer zurückfließen. Die Probe wird in der Reaktionskammer amplifiziert und die amplifizierten Produkte werden durch die verbindenden Durchlässe an Detektions-Stellen in die Detektionskammer überführt, indem man auf die flexiblen Kammerwände einen Druck ausübt, um das amplifizierte Produkt aus den Reaktionskammern durch die Durchlässe in die Detektionskammern zu drücken. Alternativ kann die Kuvette mit einer Kolben-Anordnung versehen sein, um die Reagenzien und/oder die amplifizierten Produkte aus den Reaktionskammern in die Detektionskammer zu pumpen.
  • Obwohl die in der EP 0 381 501 A2 (Kodak) dargestellten Kuvette eine geschlossene Reaktions- und Detektionsumgebung zur Verfügung stellt, hat sie mehrere signifikante Unzulänglichkeiten. Zum Beispiel weisen die multiplen Kammern, multiplen Durchlässe, Rückschlagventile und Pumpmechanismen, wie in den 1 bis 18 der Anmeldung veranschaulicht, eine relativ komplizierte Struktur auf, die einigen Aufwand in der Herstellung benötigen. Ebenfalls erlaubt es die Form und die Konfiguration der in der EP 0 381 501 A2 dargestellten Kuvette nicht, dass diese einfach in konventionelle Thermocycling-Vorrichtungen eingeführt wird. Zusätzlich benötigen die in der Kuvette verwendeten Verfahren zum Transfer von Fluiden eine externe mechanische Druckquelle, wie eine Walzen-Vorrichtung, die an flexible Seitenwände eingesetzt werden oder den Hub von kleinen Kolben. Die konventionellen Thermocycling-Vorrichtungen können nicht leicht umgebaut werden, um solche externe Druckquellen zu enthalten. Schließlich ist die in dieser Referenz beschriebene Vorrichtung ziemlich begrenzt, bezüglich des Durchsatzes der dargestellten Vorrichtungen. Das System stellt nicht die erwünschte Flexibilität in der Herstellung zur Verfügung.
  • Die französische Patentveröffentlichung No. FR 2 672 301 (an Larzul) stellt eine ähnliche hermetisch geschlossene Vorrichtung zur Amplifikation von DNA dar Sie hat ebenfalls multiple Kammern und Durchlässe, durch die Proben und/oder Reagenzien überführt werden können. Die treibenden Kräfte für den Transport von Fluiden werden als hydraulisch, magnetische Verdrängung, passive Kapillarität, thermischer Gradient, peristaltische Pumpe und mechanisch induziertes Druckdifferential (z. B. Zusammenpressen) beschrieben.
  • Die Verfahren zur Durchführung einer homogenen Amplifikation und Detektion wurden auf limitierende Weise beschrieben. Higuchi et al., Bio/Technology, 10; 413–417 (1992) beschreiben ein Verfahren zur Durchführung der PCR Amplifikation und Detektion von amplifizierter Nucleinsäure in einem nicht geöffneten Reaktionsgefäß. Higuchi et al. zeigen, dass die simultane Amplifikation und Detektion durchgeführt wird, indem man in das Reaktionsgefäß und zu den Reaktionsreagenzien Ethidiumbromid hinzufügt. Die in der Amplifikationsreaktion produzierte amplifizierte Nucleinsäure wird dann mit Hilfe der erhöhten Fluoreszenz detektiert, die durch die Bindung des Ethidiumbromids an die ds-DNA produziert wird. Die Autoren berichten, dass die Fluoreszenz dadurch gemessen wird, dass die Anregung durch die Wände des Reaktionsgefäßes vor, nach oder während des Thermocycling gelenkt wird.
  • Das US Patent No. 5.210.015 stellt ebenfalls ein Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Zielnucleinsäure dar, worin die Detektion des Ziels während einer PCR-Amplifikationsreaktion stattfindet. Die Referenz zeigt die Zugabe von markierten Oligonucleotid-Sonden zu der Reaktionsprobe, die in der Lage sind an das Ziel aufzuschmelzen, zusammen mit nicht markierten Olgonucleotid-Primern. Während der Amplifikation werden die markierten Oligonucleotid – Fragmente durch die 5' zu 3' Nuclease-Aktivität einer Polymerase in der Reaktionsprobe freigesetzt. Somit wird das Vorhandensein des Ziels in der Probe durch die Freisetzung von markierten Fragmenten von den hybridisierten Doppelsträngen detektiert.
  • Das ebenfalls in Besitz befindliche EP-717 779, mit dem Titel "Method and Device of Nucleic Acid or Analyte by Total Internal Reflectance" stellt ebenfalls ein Reaktionsgefäß dar, worin Amplifikation und Detektion im gleichen Gefäß durchgeführt werden. Die Amplifikationsprodukte werden auf einem optischen Element aufgefangen, mittels einer spezifischen Bindung an immobilisierte Fangreagenzien. Die Kombination des amplifizierten Produkts mit dem Fangreagens ergibt einen fluoreszenten Marker, innerhalb der Eindringtiefe einer schwindenden Wellen-Aufstellung im optischen Element. Eine Veränderung der Fluoreszenz entsteht durch die Kopplung des fluoreszenten Markers und wird detektiert.
  • Trotz dieser Darstellungen haben weder die geschlossenen Reaktionsgefäße, noch die homogenen Assays eine breite kommerzielle Verwendung gefunden. Somit besteht ein Bedarf für ein Amplifikations- und Detektionssystem, dass die Unzulänglichkeiten des Stands der Technik vermeidet und auch eine effiziente, zuverlässige und sterile Testumgebung zur Verfügung stellt, in einem einfach hergestellten Format.
  • Die WO 93/06486 stellt eine Assayvorrichtung dar; zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von mindestens einem Analyten in der Testprobe, wobei die Vorrichtung eine Reaktionszone einschließt, die aus separaten Reaktionszonen besteht, zur Bestimmung eines oder mehrerer spezifischer Analyten, die sich innerhalb eines Kontrollfeldes befinden und aus einer Kontrollzone, um ein Muster für die Identifizierung des Testsubjektes zur Verfügung zu stellen. In einer Ausführungsform enthält die Vorrichtung mehrere Reaktionszonen, wobei jede Reaktionszone eine unterschiedliche Schwellenwert-Konzentration für den gleichen Analyten einschließt. Die WO 92/22801 stellt einen automatischen Proben-Analysierapparat dar, der einschließlich eine Bild-erzeugende Vorrichtung zur Verfügung stellt, um Bilder zu detektieren die anzeigen, ob spezifische Reaktionen in Reaktions-"wells" einer Reaktionskartusche stattgefunden haben, einen Mechanismus zum ansaugen und dispensieren von Flüssigkeiten, der einen Mechanismus zur Detektion des Flüssigkeitsniveaus enthält, einen Mikroprozessor und die Logik für die Kontrolle der Arbeitsgänge des Apparats und für die Analyse der Informationen, die von der Bild-erzeugenden Vorrichtung erhalten werden, um eine visuelle Anzeige der Testergebnisse zu generieren.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Im allgemeinen ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Detektion eines Zielliganden in einer Reaktionsprobe ausgerichtet. In der vorliegenden Offenbarung ist der Zielligand Nucleinsäure, aber es ist zu verstehen, dass die Erfindung eine weite Anwendbarkeit bei vielen anderen Zielliganden hat, die spezifisch an eine Einfangstelle gebunden werden können um ein detektierbares Signal zu generieren. So zum Beispiel sind die Konzepte der vorliegenden Erfindung ebenfalls bei Assays für Partner von immunologischen Paaren anwendbar, wie Antikörper und Antigene.
  • Somit umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse der Ergebnisse einer Assayreaktion, wobei die Schritte folgendes umfassen:
  • Bereitstellen eines festen Trägers, der mehrere Replikat-Einfangstellen enthält und Mittel zur Erzeugung, in einem Signalbereich der genannten Replikatstellen, eines detektierbaren Signals, das das Vorhandensein oder die Menge des Analyten anzeigt, worin jede der Replikatstellen spezifisch ist für denselben Analyten und jede Replikatesstelle enthält zusätzlich zum Signal-Bereich einen nicht-Signal-Bereich;
  • Aussetzen des Trägers einer Reaktionsprobe, von der angenommen wird, dass sie den Ziel-Analyten enthält und, dort wo der Analyt vorhanden ist, Erzeugen eines detektierbaren Signals an den genannten Replikatstellen;
  • Erstellen eines Videobildes der Replikat-Einfangstellen;
  • Erstellen einer digitalen Darstellung des Videobildes für jede der Replikatstellen und Speichern der digitalen Darstellungen in einem Computerdatenspeicher; und
  • Analysieren der digitalen Darstellungen, um zu bestimmen ob das detektierbare Signal vorhanden ist, als ein Maß des Vorhandenseins oder der Menge an Analyt.
  • In einer bevorzugten Ausführung wird die digitale Darstellung des Videobildes ausgeführt, indem man Abtastzeilen des Bildes erzeugt, wobei jede Abtastzeile eine Mehrzahl an Pixeln enthält. So wird jedes Pixel einem numerischen Wert zugeordnet (zwischen 0 und 255 im Falle des 8 Bit Systems), der das Graustufen-Äquivalent des Videobildes an dem Pixel darstellt. Diese digitale Darstellung kann dann mit Hilfe des Computers manipuliert werden, um Statistiken zu berechnen, wie die mittlere Standardabweichung und Bereichswerte für jede Abtastzeile. Die statistische Information wird ursprünglich dazu verwendet, den Signalbereich vom Hintergrund zu unterscheiden.
  • Durch die Verwendung von Abtastzeilen, die nur als Hintergrund klassifiziert werden, wird ein Hintergrund-Gradient bestimmt. Dieser Gradient ist verantwortlich für die Varianz in Beleuchtung und Position quer über dem Träger. Er wird dazu verwendet, die Signalwerte gegen die Basislinie oder das Hintergrundsignal zu normalisieren. Vorzugsweise werden Konturenverstärkungs-Techniken verwendet um den Umfang der Signalfelder besser darzustellen.
  • Ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung von multiplen "Replikat"-Stellen oder -Zonen innerhalb einer bestimmten Einfangstelle. Jede solche "Replikatstelle" umfaßt einen Teil des Signalfeldes und einen Teil des Hintergrundfeldes. Es gibt eine Mehrzahl solcher Replikatstellen für jede Analyt-Fangfläche.
  • Durch die Berechnung einer digitalen Darstellung für jede Replikate können die Felder (sowohl das Signal, als auch der Hintergrund) mit jenen von anderen Replikatstellen für das gleiche Analyt verglichen werden. Wenn eines der Replikate signifikant verschiedene Ergebnisse aufweist, können die digitalen Daten dieser Seiten ausgeschlossen werden, um den Vertrauenskoeffizienten der Ergebnisbestimmung zu verbessern.
  • In dem bevorzugten Verfahren schließt der Träger auch einen Strichcode ein oder andere optisch codierte Informationen, welche als Teil des Videobildes gelesen werden. Diese Informationen können verwendet werden, um den Computer bezüglich der Anzahl, der Position und der Art der sich auf dem Träger befindenden Replikatstellen zu instruieren, wie auch zur Bereitstellung von Informationen über die Anzahl der verschiedenen Analyt-Einfangflächen, die Arten der durchzuführenden Tests und sogar codierte Patientenidentifizierung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 veranschaulicht mit Hilfe eines Blockdiagramms die allgemeinen Komponenten des Systems der vorliegenden Erfindung;
  • 2A bis 2H veranschaulicht mehrere Ansichten einer Variation der Reaktions-/Detektionseinheit, vor dem Zusammenbau. 2A, ein partieller Querschnitt entlang der Linie a-a in 2C, zeigt die obere, oder die Detektionskammer. 2B zeigt die untere, oder die Reaktionskammer, die zur Einführung in die Detektionseinheit aligniert ist. 2C ist eine Querschnittsansicht entlang der Linien c-c in 2A. Die 2D und 2E sind Querschnittsansichten entlang der Linien d-d und beziehungsweise e-e, in 2C. Es ist ersichtlich, dass 2D einen vorderen Winkel darstellt, während die 2A und 2E seitliche Winkel darstellen. Die 2F, 2G und 2H zeigen die Reaktions-/Detektionseinheit nach dem versperrbaren Einrasten der Reaktionskammer in die Detektionskammer und ihre Einführung in den Halter des Thermocycler. 2F ist eine seitliche Querschnittsansicht, wie 2A, während
  • 2G eine vordere Querschnittsansicht ist und eine Variation der Tastatureingabe zeigt. 2H ist ein Querschnitt entlang der Linie h-h in 2F.
  • Die 3A bis 3D veranschaulichen mehrere Ausführungsformen und Variationen einer Reaktions-/Detektionseinheit, entsprechend dieser Erfindung. Die 3A und 3B veranschaulichen Schnappeinfassung Ausführungsform der Reaktions-/Detektionseinheit nach dem abschließbaren Einrasten der Reaktionskammer an die Detektionskammer. Die 3C und 3D zeigen eine Variation der Reaktions-/Detektionseinheit im Querschnitt, worin die Einrastvorrichtung und die Konfiguration der Detektion sich von jenen in den 3A und 3B unterscheiden.
  • Die 4A bis 4D veranschaulichen vergrößerte Ansichten der abschließbaren Einrastvorrichtung der zusammengebauten Reaktions-/Detektionseinheit. Die 4A zeigt einen Standard-Friktions- oder Luer-Fit im Querschnitt; die 4B zeigt eine schematische Darstellung eines Klinken- oder Schnapp-Fit -Verschlusses; und die 4D zeigt einen Verschluß vom Typ Schraubengewinde im Querschnitt.
  • Die 5A bis 5D veranschaulichen den Transfer einer Amplifikations-Reaktionsprobe aus der Reaktionskammer in die Detektionskammer der Einheit, entsprechend den Verfahren dieser Erfindung. Vor jeder Seitenansicht der Detektionskammer befindet sich eine Vorderansicht derselben.
  • 6 veranschaulicht die bevorzugte Ausführungsform eines zwei-Etagen-Heizelementes, zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung, wobei jede Etage ringförmig konfiguriert ist.
  • 7 veranschaulicht eine partielle Querschnittansicht einer bevorzugten Thermocycler Vorrichtung der Erfindung.
  • Die 8A bis 8D veranschaulichen alternative Ausführungsformen des bevorzugten Detektionssystems der Erfindung. Die 8A zeigt eine Ausführungsform mit einem motorisierten Ring; die 8B zeigt einen stationären Ring mit einem motorisierten Spiegel und einer Lampe; die 8C stellt eine Anordnung zur Detektion der Reflexion dar; und 8D stellt eine Anordnung zur Detektion der Transmission dar.
  • Die 9A bis 9K sind Flußdiagramme, die, der Erfindung entsprechend, ein Steuerungsprogramm zur Steuerung der Heizelemente eines zweiteiligen Thermocycler veranschaulichen.
  • 10 veranschaulicht ein Zeit- und Temperaturprofil für verschiedene Aspekte des Systems von 1.
  • Die 11A bis 11D sind Flußdiagramme, die, der Erfindung entsprechend, ein Computerprogramm zur Verarbeitung eines Videobildes veranschaulichen.
  • Die 12A und 12B zeigen vergrößerte Teile der Ablesezone 68 des Streifenträgers, der in den 2A und beziehungsweise 3A gezeigt wird.
  • Die 13 und 14 sind digitalisierte fotografische Aufnahmen der Ergebnisse von sechs Proben, so wie sie in den Beispielen 6 und beziehungsweise 12 beschrieben sind. In jeder Figur enthielten die drei Proben links Ziel-DNA und ein Fleck oder eine Bande ist sichtbar; die drei auf der rechten Seite taten dies nicht.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG EINIGER AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • SKIZZE DER AUSFÜHRLICHEN OFFENBARUNG:
    • 1. Systemübersicht
    • 2. Reaktions-/Detektionseinheiten
    • A. Reaktionskammern
    • B. Detektionskammern
    • C. Detektions-Träger
    • D. Verschlußmechanismen
    • 3. Thermocycling – und Transfer-Vorrichtung
    • a. Cycler-Vorrichtungen
    • b. Transferverfahren
    • 4. Detektionssysteme
    • 5. Computer/Schaltkreis – Steuerungen
    • 6. Temperaturkontrolle
    • a. Hardware
    • b. Software
    • 7. Videoverarbeitung
    • B. Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nucleinsäuren
    • 9. Kits der Erfindung
    • 10. Beispiele
    • 11. Sequenz-Listing
  • 1. Systemüberblick
  • 1 ist ein verallgemeinertes schematisches Diagramm eines Amplifikations- und Detektionsapparats, dessen Konfiguration der Erfindung entspricht. Der Apparat 10 enthält eine Vorrichtung für Thermocycling 16, einschließlich der ersten und zweiten Heizelement-Etagen 17 und 18 und deren assoziierten Thermosensoren 122, 123, einen Ventilator-Motor 19 und ein Detektionssystem 22, die alle einzeln weiter unter im Detail beschrieben werden. Der Apparat 10 umfaßt auch eine Computersteuerung 26, die an die Thermocycler Vorrichtung 16 gekoppelt ist. Im allgemeinen ist die Thermocycler Vorrichtung 16, unter der Steuerung von Computer 26 der sowohl an die Heizelement-Etage 1 (17) als auch an die Heizelement-Etage 2 (18) unabhängige Signale sendet, in der Lage unabhängig (eine) vorgeschriebene Temperatur(en) in lokalisierten Segmenten des Reaktionsbehälters, der innerhalb der Thermocycler Vorrichtung 16 untergebracht ist, zu liefern, um Ziel-Nucleinsäure die sich in der Reaktionsprobe befindet zu amplifizieren und/oder zu transferieren. Die Details bezüglich der Computersteuerung von Vorrichtung 16 werden in späteren Abschnitten beschrieben.
  • Der Apparat 10 enthält auch eine Vielfalt von Reaktions-/ Detektionseinheiten 20 (siehe 2–3). Die Einheiten 20 haben eine zweiteilige, verschließbare Konstruktion, die eine Reaktionskammer 30 und eine Detektionskammer 32 einschließt, wie das in den 2A bis 2H und 3A bis 3D gezeigt wird. Die Reaktionskammer 30 enthält die Reaktionsprobe zur Durchführung der erwünschten Amplifikationsreaktionen. Die Detektionskammer 32 ist mit Mitteln zur Generierung einer detektierbaren Anzeige der Ergebnisse der Amplifikationsreaktion ausgestattet. Die spezifischen Aspekte dieser Reaktions-/Detektionseinheiten 20 werden später in dieser Darstellung im Detail beschrieben.
  • Die Verfahren der Amplifikationsreaktion beginnen mit dem Einführen einer Reaktionsprobe 38 in die Reaktionskammer 30, zusammen mit den erwünschten Amplifikations-Reagenzien. Die Detektionskammer 32 wird dann mit der Reaktionskammer 30 gekoppelt um eine geschlossene Einheit 20 zu bilden, die dann in die Heizelement-Etagen 17, 18 der Thermocycling – Vorrichtung 16 plaziert wird, wie dies am besten aus den 2F und 5A–5D hervorgeht. Nachdem die Reaktions- und Detektionskammern 30. 32 gekoppelt wurden bleibt die Einheit 20 verschlossen, womit eine geschlossene Umgebung zur Durchführung sowohl der Amplifikation als auch der Detektion bereitgestellt wird.
  • Der Computer 26 steuert die Temperatureinstellungen und die Zeitsetzung jeglicher Temperaturzyklen, abhängig von der Art der Amplifikationsreaktion die durchgeführt wird. Für Amplifikationsreaktionen wie die PCR und die LCR ist der Computer 26 so programmiert, dass er die Heizelement-Etagen durch einen oder mehrere Zyklen hohe Temperatur zur Denaturierung führt, gefolgt von einer niedrigen/Annealing-Temperatur. Dort wo zwei Heizelement-Etagen zur Verfügung stehen ist der Computer 26 in der Lage die Temperatur der oberen Heizelement-Etage 17 unabhängig von der unteren Heizelement-Etage 18 zu steuern, obwohl sie auch identischen Protokollen folgen können.
  • Am Ende der Amplifikationsreaktion und ohne die geschlossene Reaktions-/Detektionseinheit zu öffnen, wird die Reaktionsprobe aus der Reaktionskammer 30 in die Detektionskammer 32 der geschlossenen Einheit 20 befördert. Die Reaktionsprobe wird vorzugsweise durch das Expandieren eines Treibmittels in die Reaktionskammer 30 transferiert, um die Probe und die Reagenzien in die Detektionskammer zu drücken.
  • Die Detektionskammer 32 enthält eine Möglichkeit zur Detektion um eine detektierbare Anzeige von den Ergebnissen der Amplifikationsreaktion zu generieren. Im allgemeinen enthält das Mittel zur Detektion einen Träger 60, der eine oder mehrere Fangstellen 74 hat, zur Immobilisierung und Anreicherung von amplifizierter Zielnucleinsäure, die in dem Reaktionsprobe 38 vorhanden ist. Die immobilisierte amplifizierte Zielnucleinsäure ist an den Fangstellen 74 mit einem detektierbaren Indikator assoziiert und dieser Indikator wird von dem Detektionssystem 22 und dem Computer 26 detektiert und analysiert.
  • Die verschiedenen Komponenten von Apparat 10 werden nun einzeln mit weiteren Details beschrieben werden, einschließlich multipler Variationen des oben bekanntgemachten allgemeinen Überblicks.
  • 2. Reaktions-/Detektionseinheit
  • a. Reaktionskammern
  • Die Reaktions-/Detektionseinheiten 20 der vorliegenden Erfindung werden in den 2A bis 2E, 3A bis 3D, wie auch in anderen Figuren gezeigt. Jede Einheit 20 umfaßt eine Reaktionskammer 30 und eine Detektionskammer 32. Die Einheit 20 kann auch entsorgbar sein.
  • Die Amplifikationsreaktion der Nucleinsäure findet in der Reaktionskammer 30 statt. Die Reaktionskammer 30 ist aus einem Material wie Glas oder Plastik hergestellt, das den zur Denaturierung der Nucleinsäuren erforderlichen Temperaturen, typischer Weise 80–110°C, standhalten kann. Das untere Ende 34 der länglichen Reaktionskanmmer 30 ist geschlossen und das obere Ende 36 ist offen um die Reaktionsprobe 38 aufzunehmen und, falls erwünscht, die Reagenzien für die Amplifikationsreaktion. Solche Reaktionsreagenzien können von dem Benutzer in die Reaktionskammer hinzugefügt werden, sie werden aber vorzugsweise während der Herstellung eingeführt und durch einen entfernbaren oder abtrennbaren Verschluß (nicht gezeigt) eingeschlossen, in welchem Fall nur die Probe vom Benutzer hinzugefügt wird. Die Probe kann in jeder bekannten Art und Weise in die Reaktionskammer 30 eingeführt werden. So zum Beispiel kann sie in eine Spritze (nicht gezeigt) aufgenommen werden und in die Reaktionskammer 30 durch Entfernen des Verschlusses oder durch dessen Punktion mit einer Hohlbohr-Spritzenspitze eingeführt werden. Somit schließt die Reaktionsprobe 38 in Kammer 30 sowohl die Probe als auch die Amplifikations-Reagenzien ein. Es kann zusätzlich auch ein Treibmittel 40 enthalten und eine oder mehrere Komponenten des Detektionssystems.
  • Die Größe der Kammer 30 sollte so gewählt sein, dass sie gerade die relativ kleinen Mengen an Reaktionsprobe 38 enthält.
  • Vorzugsweise ist die Kammer 30 so dimensioniert, dass sie 10 μl bis etwa 200 μl Reaktionsprobe umfaßt. Noch besser umfaßt die Kammer 30 etwa 50 μl bis etwa 120 μl. Die Reaktionskammer 30 sollte auch eine geeignete Größe haben, so dass die Oberflächenspannung in der Reaktionskammer 30 reduziert wird und das Schäumen der Reaktionsprobe während der Aufheizung vermieden wird. Außerdem sollte die Reaktionskammer 30 eine hohes Oberfläche zu Volumen Verhältnis haben, um die Geschwindigkeit des Wärmetransfers zur Reaktionsprobe hin zu erhöhen. Vorzugsweise hat die Reaktionskammer 30 eine längliche Röhrenform, mit Längsachse. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Reaktionskammer 30 ein Mikrospritzen-Röhrchen oder ein Kapillarröhrchen, das am unteren Ende versiegelt ist.
  • Es wurde festgestellt, dass Reaktionskammern mit glatten Innenwänden im Vergleich zu Kammern die im Inneren unregelmäßige Oberflächen aufweisen, insbesondere am geschlossenen unteren Ende 34, eine schwache Leistung haben. So, zum Beispiel, erbringen Mikrospritzen- oder Kapillarröhrchen, die erhitzt werden um ein Ende zu versiegeln, eine gute Leistung, wobei anscheinend das Erhitzen Unregelmäßigkeiten an der inneren Oberfläche verursacht, während ein Kapillarröhrchen mit geschlossenem Ende (z. B. von Varivest, Grass Valley, CA: siehe Beispiel 4) eine schlechtere Leistung erbrachte, es sei denn es wurde vorher ebenfalls geschmolzen. Es wird angenommen, dass die unregelmäßige Oberfläche ein Kondensationszentrum für die Verdampfung zur Verfügung stellt, die am oder in der Nähe des unteren Teils der Probe beginnt. Die Anmelder beabsichtigen aber nicht von jeglicher einzelnen Theorie oder einem Operationsmechanismus limitiert zu werden oder daran gebunden zu sein.
  • Das mechanische Schleifen oder Schruppen des Inneren des Röhrchens wird die Leistungen ebenfalls verbessern, wie auch Furchen oder Firste im Inneren. Die Leistung kann ebenfalls durch die Zugabe von kleinen Kochschnitzeln oder Stäbchen, oder von Mikropartikel-Kügelchen in den unteren Teil des Reaktionsröhrchens verbessert werden. So, zum Beispiel, können Kügelchen aus Polystyren, Glas, Keramik, Edelstahl oder aus anderen geeigneten inerten Materialien mit einer Größe im Bereich von etwa 1,0 bis 0,1 mm im Durchmesser als Kondensationszentren verwendet werden. Es wird angenommen, dass die Partikelgröße nicht kritisch ist, vorausgesetzt die Partikel passen in die Reaktionskammer. Solche Partikel sollten den Reaktionsreagenzien gegenüber inert sein und sollten eine höhere Dichte als die Reaktionsprobe haben.
  • b. Detektionskammern
  • Die Trennung von amplifizierter Zielnucleinsäure von der Reaktionsprobe findet in der Detektionskammer 32 statt, wie es in den 2 und 3 gezeigt wird. Die Detektionskammer 32 ist aus einem transparenten Material, wie Plastik oder Glas, hergestellt und hat ein offenes Ende 48 und ein geschlossenes Ende 54. Die Reaktionsprobe 38 fließt in die Detektionskammer 32 durch das offene Ende 48, wo sie einen Detektionsträger 60 (weiter unten im Detail beschrieben) antrifft.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform (2) enthält die Detektionskammer ein Reservoir 37, zum Auffangen des Probenfluids, das aus der Reaktionskammer befördert wird. Dieses kann beispielsweise ausgeführt werden, indem man das Probenfluid in das offene Ende 48 dirigiert und durch einen Fließweg, der eine Öffnung 39 oberhalb des Bodens der Detektionskammer 32 hat, so dass das Fluid seitlich in die Kammer einläuft. Alternativ kann ein Standrohr-Einlaß ein Reservoir bilden. Das Reservoir 37 unterhält einen Vorrat an Reaktionsprobenfluid, das für den Detektionsträger 60 verfügbar ist, auch wenn das Probenfluid abkühlt und in die Reaktionskammer 30 zurückweicht (Vergleiche die 5C und 5D, in denen im Reservoir Fluid eher vom Streifen 61 absorbiert wird, als dass es im Reaktionsröhrchen nach unten zurückweicht.) Für längliche Detektionskammern, die mit Reservoirs und seitlicher Eintrittsöffnung 39 ausgestattet sind, kann es auch hilfreich sein winklige Lamellen 43 anzufertigen, um der ganzen Detektionskammer zusätzliche Festigkeit zu verleihen.
  • In einem anderen bevorzugten Merkmal ist die Querschnittsform (2C) der Detektionskammer polygonal oder asymmetrisch, so dass sie in eine passende Furche der Heizelement-Etage in einer einzigen möglichen Orientierung eingesetzt werden kann. Dieses ist am besten in den 2F und 2H gezeigt, die einen trapezförmigen Sitz darstellen. Bei Konfigurationen für die Detektion der Transmission (siehe unten) ist es vorzuziehen, dass die vordere und die hintere Seite der Kammer im wesentlichen parallel bleiben. Ein Trapez ist das einfachste Polygon bei dem diese Vorgabe eingehalten wird, während es dennoch eine fixe Orientierung diktiert. Es können aber auch andere polygonale oder asymmetrische Formen in Betracht gezogen werden. Bei Konfigurationen für die Detektion der Reflexion (siehe unten) müssen die vordere und die hintere Seite nicht parallel sein und es eignen sich auch andere Polygone dafür. Falls eine rundliche Sitzkonfiguration verwendet wird, kann diese eine Nocke oder eine flache Seite besitzen, um eine einzige Orientierung zu diktieren. Der Sitz muß nicht die gleiche Konfiguration wie die optischen Fläche(n) haben.
  • Die Detektionskammer 32 ( und/oder die Reaktionskammer 30) kann die Tabelemente 58 (in 2G und 7 gezeigt) enthalten, welche die Kammer innerhalb der Thermocycling – Vorrichtung 16 tragen und welche eine einfache Handhabung gewährleisten. Das Tabelement 58 kann auch Mittel zum Einrasten einer Keilnute 91 enthalten (in 2G und 7 gezeigt) die in der Heizelement-Etage 17 lokalisiert ist. Diese Alternative zu einer polygonalen Form gewährleistet ebenfalls eine vorgeschriebene Orientierung der Detektionskammer 32 im Bezug zur Heizelement-Etage, und auch im Bezug auf das Detektionssystem 22, vorausgesetzt das Detektionssystem ist hinsichtlich der Heizelement-Etage fixiert.
  • Die 3A–3D zeigen alternative Ausführungsformen zur bevorzugten Ausführungsform aus 2. Die Ausführungsformen haben ähnliche Komponenten und Merkmale, und diesen wurden die gleichen Bezugsziffern zugeordnet wie in der Ausführungsform aus 2. Die Ausführungsformen aus 3 enthalten aber nicht das Merkmal Reservoir.
  • Die Einheit 20 kann auch mit einem Strichcode versehen werden (nicht gezeigt), der vorzugsweise auf der Detektionskammer 32 angebracht ist. Ein Strichcode-Leser (nicht gezeigt), der an der Thermocycler Vorrichtung 16 zum Lesen des Strichcodes bereitgestellt ist, kann dann dem Computer 26 die codierte Information mitteilen. Der Strichcode kann die einzelne Einheit 20 identifizieren und kann andere passende Informationen über die Probe und die durchzuführende Reaktion zur Verfügung stellen. Einige dieser Informationen können die Identität des Patienten enthalten und/oder die Konfiguration der Fangstellen 74, so wie weiter in dieser Darstellung in Zusammenhang mit dem vom Computer 26 implementierten Videoverarbeitungs-Programm beschrieben.
  • c. Detektionsträger
  • Die Detektionskammer 32 beinhaltet auch einen Detektionsträger 60, zur Aufnahme der Reaktionsprobe, Trennung der amplifizierten Ziel-DNA und Generierung einer sichtbaren Anzeige der Ergebnisse der Amplifikationsreaktion. Typischer Weise enthält der Detektionsträger einen festen Träger, auf dem ein auf das Vorhandensein des Ziels deutendes Signal angereichert werden kann, was für heterogene Assays wohlbekannt ist.
  • Solche festen Träger schließen, zum Beispiel, Plastikarten, Glas, natürliche und synthetische Polymere und Derivate davon, einschließlich Cellulose-Ester, mikroporöses Nylon, Polyvinylidindifluorid, Papier, und mikroporöse Membranen ein. Die Träger können, zum Beispiel, in Form von Fasern, Kügelchen, Dias, zylindrischen Stäbchen oder Streifen vorhanden sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Detektionsträger 60 ein mikroporöser Streifen 61, der in den 2, 3 und 5 gezeigt wird und der in der Lage ist Kapillarmigration zu unterstützen. Noch besser ist Nitrocellulose als Träger, wobei solche Nitrocellulose eine Porengröße von etwa 2 μm bis etwa 20 μm hat, üblicherweise 5 oder 10 μm. Vorzugsweise ist der poröse Träger inert oder er wird mit Hilfe von Blockern und/oder Transport-fördernden Agenzien (siehe, z. B., U.S. Patent 5.120.643) inert gemacht, und er reagiert im allgemeinen physikalisch oder chemisch mit keinem der Reagenzien oder Zielnucleinsäuren aus der Reaktionsprobe. Die Verwendung von Transport-fördernden Agenzien ist im Fachgebiet bekannt und wird weiterhin in Beispiel 3 diskutiert. Poröse und mikroporöse Träger weisen einen Dochteffekt auf, durch Kapillarität und chromatographische Eigenschaften; von der Erfindung werden aber auch nicht-chromatographische Träger und nicht-poröse Träger erwogen.
  • Der Detektionsträger 60 kann jede geeignete Form haben, einschließlich eine runde Form oder er kann scheibenförmig oder rechteckig sein. Die Größe oder die Maßen des Detektionsträgers 60 sollten derart gewählt werden, dass sie eine ausreichende Resolution des sichtbaren Indikators gewährleisten, der durch die auf dem Detektionsträger 60 immobilisierten amplifizierten Ziel-Nucleinsäure produziert wird. Das Detektionsmittel 60 ist vorzugsweise klein und/oder schmal, um die Zeit, die zur Detektion der immobilisierten Ziel-Nucleinsäure notwendig ist, zu verkürzen und um den Materialverbrauch zu minimieren. Diejenigen mit Erfahrung im Fachgebiet werden in der Lage sein die Maße des Detektionsmittels 60 zu optimieren, im Verhältnis zum Reaktionsvolumen der Reaktionsprobe 38, zur Menge des amplifizierten Ziels und zur Größe der Reaktionskammer 30 und der Detektionskammer 32. Die Detektionskammer 32 kann so konfiguriert werden, dass sie das Detektionsmittel 60 beherbergt.
  • Typischerweise werden verschiedene Trägermaterialien 60 die Reaktionsprobe 38 mit unterschiedlicher Geschwindigkeit aufnehmen und transportieren, abhängig von, zum Beispiel, der Porengröße und der Dicke des Trägers. Der Träger sollte derart gewählt werden, dass er die Reaktionsprobe 38 nicht weiter als bis zu spezifischen Bindungspaar-Partnern oder Fangmoleküle, die weiter unten beschrieben werden, transportiert, mit einer Geschwindigkeit welche die zur Bindung der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure benötigte Zeit überschreitet.
  • Der bevorzugte Träger 60 ist ein Streifen 61, der folgendes umfaßt, ein erstes Ende 62, bei dem der Transport der Reaktionsprobe beginnt, ein zweites Ende 64, bei dem der Transport der Reaktionsprobe endet und eine oder mehrere Regionen 66, 68, 70, die die Mechanismen umfassen, welche die Isolierung der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure in der Detektionskammer 32 erlauben.
  • Wie in den 2D und 5D gezeigt wird, enthält der Streifen 61 mindestens zwei Regionen, worin eine erste Region 66 am oder in der Nähe des ersten Endes 62 des Streifens dazu dient, die in der Reaktionsprobe vorhandene amplifizierte Ziel-Nucleinsäure zu markieren, und eine zweite Region 68 dazu dient, das markierte amplifizierte Ziel von der Reaktionsprobe zu trennen, durch die Immobilisierung des amplifizierten Ziels auf dem Streifen 61. Die zweite Region 68 kann eine oder mehrere Zonen beinhalten, worin jede Zone mindestens eine Fangstelle 74 zur Immobilisierung der Ziel-Nucleinsäure hat und zur Bereitstellung einer sichtbaren Anzeige, wenn die Ziel-Nucleinsäure auf der Fangstelle immobilisiert worden ist. Die Fangstellen 74 können als kontinuierliche Banden angeordnet sein, wie in 2D und 3C gezeigt; als diskontinuierliche Banden, wie in 2G; oder als individuelle Flecken, wie in 3A und 5A–5D. Die Signifikanz solcher multiplen Fangstellen und Replikatstellen innerhalb einer Fangfläche wird weiter unten diskutiert.
  • Man wird verstehen, dass die Markierungsfunktion nicht auf dem Streifen selber auftreten muß, sondern in jedem Punkt zwischen der Reaktionsprobe und den Fangstellen auftreten kann, einschließlich innerhalb der Reaktionsprobe. So zum Beispiel kann ein Konjugat-Kissen an das untere Ende eines Detektionsträger-Mediums angebracht werden. Solch ein Kissen kann auch an das offene Ende 36 der Reaktionskammer, an das offene Ende 48 der Detektionskammer, oder an die Öffnung 39 oder das Reservoir 37 der in der 2 gezeigten Ausführungsform placiert werden. Falls das Konjugat nicht am Streifen befestigt ist scheint es besser zu sein wenn es zumindest mit dem Streifen Kontakt hat.
  • Der Streifen 61 kann auch eine dritte Region 70 enthalten, die als Kontrollzone oder Vergleichs-Standard für das Detektionssystem 22 dient. Vorzugsweise sind all diese Regionen 66, 68, 70 räumlich getrennte Flächen des Trägers 61. Die Funktionen der Regionen 66, 68, 70 werden weiter unten mit weiteren Details beschrieben, in Zusammenhang mit den Verfahrender Detektion amplifizierter Ziel-Nucleinsäure(n).
  • Der Träger 61 kann, wenn notwendig, an ein inertes Substrat fixiert werden, das vorzugsweise aus einem transparenten Material hergestellt ist, wie Glas, Plastik oder Nylon, das ausreichend rigide ist um eine Strukturstütze bereitzustellen. In der in den 2 und 5 dargestellten Ausführungsform ist die Detektionskammer mit Nägeln oder Stiften 41 ausgestattet, die den Streifen rigide in Position halten. Solche Nägel oder Stifte 41 können während der Herstellung in das Kammergehäuse in Form gepreßt werden. Der Träger und das Substrat befinden sich vorzugsweise an einem fixen Standort oder Winkel innerhalb der Detektionskammer 32, so dass die Detektion der auf dem Träger 61 immobilisierten, amplifizierten Ziel-Nucleinsäure, wie weiter unten in Zusammenhang mit den Verfahren der Erfindung beschrieben wird, an einem vorher bestimmten Standort oder Winkel in Bezug auf das Detektionssystem 22 stattfinden kann.
  • d. Verschlußmechanismen
  • Die Detektionskammer 32 ist derart entworfen, dass sie eng mit der Reaktionskammer 30 zusammenpaßt, um zu verhindern, dass nach der Durchführung der Amplifikationsreaktion jegliche amplifizierte Nucleinsäure verlorengeht. Aus diesem Grund enthält die Reaktions-/Detektions-Einheit 20 eine Einrast-Vorrichtung, zum abdichtenden Einrasten der zwei Kammern 30, 32 ineinander. Das Mittel zum Einrasten kann durch mehrere bekannte Mittel erfolgen. Das Mittel zum Einrasten sollte eine sichere Abdichtung bieten, so dass aus den Kammern 30, 32 keine potentiell kontaminierenden Fluide durchsickern; mit anderen Worten sollten sie unter Bedingungen von erhöhter Temperatur oder erhöhtem Druck, oder bei normaler Handhabung und/oder Entsorgung nicht aufgeschlossen oder getrennt werden.
  • Die 4A bis 4D veranschaulichen mehrere Mechanismen zum verschließbaren Einrasten oder Koppeln der zwei Kammern 30, 32 der Einheit 20. Möglicherweise ist der einfachste Mechanismus dafür die Luer-Spritzen-Passung. Diese wird in einem vergrößerten Detail in 4A dargestellt, so wie in 2 und anderen Figuren. Das offene obere Ende 36 der Reaktionskammer 30 schließt eine winklige Stirnflächenbearbeitung 44 um ihren äußeren Umfang ein und das offene Ende 48 der Detektionskammer 32 schließt eine winklige Stirnflächenbear beitung 50 um ihren inneren Umfang ein. Der Winkel der Schräge an den zwei Flächen 44, 50 ist angepaßt, so dass eine enge Reibungspassung erreicht wird wenn die zwei Kammern zusammengepreßt werden, wie das in den 2E, 2F, 3C, 3D und 4A gezeigt wird. Obwohl nicht gezeigt, schließen die Variationen dieses Schließmechanismus das Luer-Lock-System und ein Bajonettverschluß-System ein.
  • Ein zweiter Verschlußmechanismus wird in 4B detailliert veranschaulicht. Es ist eine Schnapp-Passung oder Klinken-Variation der Standard-Luer-Passung. Das obere Ende 36 schließt die abgeschrägte Vorderseite 44 und einen ringförmigen Vorsprung oder eine Klinke 46 um seinen äußeren Umfang ein. Die Detektionskammer 32 schließt die abgeschrägte Vorderseite 50 und eine ringförmige Klinke oder einen Vorsprung 52 ein. Der Winkel der Schräge ist wieder angepaßt, um einen engen Verschluß zu bilden, und die ringförmigen Vorsprünge 46, 52 rasten ineinander ein um die Trennung der zwei Teile zu verhindern. Eine andere Variation eines Schnapp-Passung-Verschlusses wird in 4C veranschaulicht. Obwohl etwas anders geformt, sind sich die Elemente alle ähnlich und wurden mit identischen Bezugsziffern versehen. Eine Schnapp-Passung wird durch das Einrasten der Enden erreicht, so dass der Vorsprung 52 sich über die Vorderseite 44 bewegt und mit dem Vorsprung 46 einrastet.
  • In einem letzten Verschlußmechanismus, der in 4D veranschaulicht ist, wird das offene Ende 36 der Reaktionskammer 30 mit Außengewindeschrauben 47 eingepaßt. Das Innere des offenen Endes 48 der Detektionskammer 32 wird ähnlich mit passenden Innengewinde-Schrauben 49 eingepaßt. Durch das Einschrauben der Reaktionskammer in die Detektionskammer wird eine geschlossene Reaktions-/Detektions-Einheit erhalten. Innerhalb des Umfangs der Erfindung sind viele andere äquivalente Verschlußvariationen möglich. Idealer Weise sind die Verschlußmechanismen unter normalen Handhabungsbedingungen praktisch unumkehrbar.
  • Der Erfindung entsprechend können die Reaktions-/Detektions-Einheiten 20 mit Thermocycling – Vorrichtungen mit einer oder zwei Etagen verwendet werden, wie weiter unten beschrieben wird.
  • 3. Vorrichtung für das Thermocycling und den Transfer
  • a. Cycler- Vorrichtungen
  • Die 6 und 7 veranschaulichen die Details einer bevorzugten Ausführungsform der Vorrichtung für Thermocycling und Transfer 16, die in 1 schematisch dargestellt ist. Es sollte aber verstanden werden, dass sowohl ein-Etagen als auch multi-Etagen Heiz-/Transfereinheiten zur Verwendung in den Vorrichtungen und mit den Verfahren der Erfindung geeignet sind. Somit beinhaltet der Cycler 16 mindestens eine Heizetage 17 und wahlweise zwei Heizetagen 17 und 18 zur Bereitstellung der erwünschten Temperatur en) für die Reaktionskammer 30 unter der Kontrolle des Computers 26. In einer Ausführungsform bilden die Heizetagen einen ringförmigen oberen Heizring 90, der räumlich von einem ringförmigen unteren Heizring 92 getrennt ist. Der Luftraum zwischen den Heizringen 90, 92 agiert als Isolator, obwohl andere Isoliermaterialien verwendet werden können. Die Heizetagen können eine Vielfalt von anderen Formen haben, wie linear, plan oder keilförmig (nicht gezeigt). Einer oder mehrere Kühlrippen 93 werden auf die Ringe 90, 92 placiert, wobei sie typischer Weise radial nach innen angeordnet werden, um zur Reduzierung der Temperatur der Ringe 90, 92 während der Kühlzeiten beizutragen. Ein Ventilator 94 wird unterhalb der Kühlrippen 93 placiert, um zusätzlich zur Reduzierung der Temperatur der Ringe 90, 92 während der Kühlzeiten beizutragen.
  • Die Heizringe 90, 92 sind aus einem wärmeleitenden Material, wie Aluminium, Kupfer oder Gold, hergestellt. Die Wärme kann den Ringen 90, 92 über konventionelle Widerstandsheizstreifen 95, 96 geliefert werden, vorzugsweise entlang einer Umfangsoberfläche der Ringe 90, 92, wie das in 6 gezeigt wird, oder mit Hilfe von anderen bekannten Mitteln, wie ein Verteiler oder durch Konduktanz. Bei den multi-Etagen-Systemen kann der Computer 26 die Temperatur jedes Heizrings 90, 92 unabhängig voneinander kontrollieren, durch die unabhängige Versorgung der Heizstreifen 95, 96 mit Strom. Er kann auch die zwei Etagen zusammen verfolgen, als wären sie eine.
  • Wie in 7 gezeigt wird, ist die Einheit 20 in einer von mehreren Apertura oder "wells" 97 in den Heizringen 90, 92 placiert, so dass ein erstes longitudinales Segment 33 der Reaktionskammer 30 dem oberen Ring 90 exponiert ist und ein zweites longitudinales Segment 35 der Reaktionskammer 30 dem oberen Ring 92 exponiert ist. Wie in den 6 und 7 gezeigt wird, besteht jedes der "wells" 97 aus einer Apertur 98 im oberen Ring 90 in Registrierung mit einer Apertur 99 im unteren Ring 92. Die oberen Ring-Apertura 98 erstrecken sich vollständig über den oberen Ring 90. Die unteren Ring-Apertura 99 können sich gänzlich über den unteren Ring 92 erstrecken, wie das in den 2G und 7 gezeigt wird, vorausgesetzt es gibt eine Möglichkeit die Reaktions-/Detektions-Einheit 20 im "well" 97 zu stützen, wie der vorhin beschriebene Stützklappenteil 58. Alternativ können sich die Apertura 99 nur teilweise durch den unteren Ring 92 erstrecken, damit sich das geschlossene Ende 34 der Reaktionskammer 30 auf den unteren Ring 92 stützen kann.
  • Der Computer 26 (siehe 1) kontrolliert den oberen Heizring 90, den optionalen und unteren Heizring 92 und den Ventilator 94, um (die) vorgewählte Temperatur en) in Richtung der Reaktionsprobe 38 in der Reaktionskammer 30 zu steuern. Die Aufheiz- und Kühl-Zyklen der Thermocycling – Vorrichtung 16 und ihre Steuerung durch den Computer 26 werden detaillierter weiter unten beschrieben, in der Darstellung bezüglich der Computer/ Schaltkreis-Steuerungen. Wenn die Amplifikationsreaktion beendet ist, weist der Computer 26 das Heizelement an, Wärme an das Treibmittel 40 zu liefern, bei oder oberhalb des Schwellenwerts seiner Ausdehnungstemperatur. Wenn die Schwellenwert-Temperatur erreicht ist, wird das Treibmittel 40 expandieren und dadurch die Reaktionsprobe 38 nach oben in die Detektionskammer 32 zwingen, In einer Ausführungsform wird das Treibmittel dadurch ausgedehnt, dass der untere Ring 92 gegenüber dem oberen Ring 92 übermäßig erhitzt wird.
  • b. Transferverfahren
  • Die 5A–5D veranschaulichen den Transfer der Reaktionsprobe 38 aus der Reaktionskammer 30 in die, Detektionskammer 32 in einem eine-Etage-Apparat. Die Einheit 20 ist innerhalb der Apertur 97 im Heizelement 16 untergebracht. In einem alternativen zwei-Etagen-System ist die Reaktionskammer 30 in den Apertura derart positioniert, dass ein erstes longitudinales Segment 33 (2B und 3A) der Reaktionskammer 30 dem oberen Ring 90 ausgesetzt ist und ein zweites longitudinales Segment 35 (2A und 3A) der Reaktionskammer 30 dem unteren Ring 92 ausgesetzt ist.
  • In der 5A ist die Amplifikationsreaktion vollständig und das Heizelement 16 wurde auf die Schwellenwert-Temperatur des Treibmittels 40 erhöht. Bei zwei-Etagen Systemen kann der obere Ring 90 ursprünglich bei einer Temperatur unterhalb der Schwellenwert-Temperatur gehalten werden, um die mögliche Gefahr zu reduzieren, dass die Reaktionsprobe 38 nach Beendigung der Amplifikationsreaktion verdampft. Es ist vorzuziehen, dass die Schwellenwert-Temperatur des Treibmittels oberhalb der höchsten Temperatur en) der Amplifikationsreaktion liegt (liegen), so dass das Treibmittel 40 nicht während der Amplifikationsreaktion expandiert.
  • So wie es in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich "Treibmittel" auf jede Substanz die als Antwort auf einen Reiz, vorzugsweise ein nicht-mechanischer Stimulus, expandiert. Das Treibmittel 40 kann beispielsweise ein Gas (so wie Luft), eine Flüssigkeit oder eine feste Komponente sein. Im Falle von flüssigen und festen Treibmitteln können diese im allgemeinen verdampfen um eine Expansion zu verursachen. Der Stimulus zur Expansion des Treibmittels 40 kann, zum Beispiel Hitze, Licht oder eine Kombination davon sein, aber in der vorliegenden Erfindung ist es vorzugsweise Hitze. Die Reaktionsprobe 38 kann selbst als Treibmittel 40 dienen. Die mechanischen Arten von Druck, wie Hydraulik oder Septum-Deformation, führen nicht zur Expansion des Treibmittels.
  • In 5B hat das Heizelement 16 das Treibmittel 40 bis an die Schwellenwert-Temperatur erhitzt und das Treibmittel 40 hat sich ausgedehnt um die Reaktionsprobe 38 hinauf, in Richtung Detektionskammer 32 zu drücken. Bei zwei-Etagen-Systemen kann zu diesem Zeitpunkt der obere Heizring 90 auf die Schwellenwert- Temperatur gebracht werden, um zur Ausdehnung des Treibmittels 40 beizutragen, während dieses sich durch das erste longitudinale Segment 33 nach oben bewegt. Wie später in Zusammenhang mit der 10 beschrieben wird, ist der Computer 26 mit einer programmierbaren Zeitverzögerung ausgestattet, um es dem oberen Heizring 90 zu ermöglichen nach dem unteren Heizring 92 auf die Schwellenwert-Temperatur zu überhitzen.
  • Das Heizelement 16 (oder beide, oberer und unterer Heizring 90, 92) fahren fort die Schwellenwert-Temperatur zu liefern, um das Treibmittel 40 auszudehnen, wie das in den 5b und 5C gezeigt wird, bis die Reaktionsprobe 38 vollständig in die Detektionskammer 32 übertragen wird, vorzugsweise in dessen Reservoir 37 über die seitliche Öffnung 39.
  • In 5C fängt die erste Region 66 des Detektionsstreifens 61 an, benetzt zu werden. Diese Region (oder ein vorheriger Teil des Probenwegs, siehe oben) enthält vorzugsweise einen Marker (z. B. Zone 67), der sich mit der diese Region passierende amplifizierten Ziel-Nucleinsäure assoziiert. Ein Verfahren zur Durchführung dieser Assoziation ist die Verwendung eines Haptens, das an die Nucleinsäure gebunden ist und eines kolloidalen Partikels, das mit einem anti-Hapten-Antikörper konjugiert ist. Das kolloidale Gold oder Selenium sind als Marker geeignet, wie auch farbige Latexpartikel. Die Haptene und die Hapten-Bindung sind im Fachgebiet bekannt, insbesondere bi-Hapten-Bindungs-Verfahren in Verbindung mit LCR- und PCR-Amplifikation von Nucleinsäure. Siehe, zum Beispiel, die EP-A 357 011 und EP-A-439 182. Während die an das Hapten gebundene Nucleinsäure die Zone 67 passiert, wird das Marker-Konjugat solubilisiert und durch die Reaktionslösung mobilisiert, und es bindet mit den Haptenen an die Nucleinsäure. Als Alternative könnte man einen detektierbaren Marker direkt an die Sonde/den Primer koppeln, vorausgesetzt das interferiert nicht mit der Hybridisierung oder mit irgendeiner erforderlichen enzymatischen Aktivität, wie die Extension und die Ligation.
  • Während die Lösung den Streifen 61 hinaufwandert, trifft sie die Fangstellen 74 in Region 68 und wahlweise die Kontrollseiten in Region 70 an. Bei den Fangstellen 74 wird ein zweiter Antikörper, gegen ein zweites Hapten, gegen den Transport immobilisiert. Alle Nucleinsäuren, die an dieses Hapten gekoppelt sind, werden an diesen Stellen immobilisiert. Falls die immobilisierte Nucleinsäure amplifiziert war und dadurch auch das erste Hapten enthält, wird sich Konjugat an den Fangstellen anreichern und kann dadurch detektiert werden (5D). Jede Fangstelle 74 kann immobilisierten Antikörper gegen ein unterschiedliches Hapten enthalten und ermöglicht somit die Multiplex – Amplifikation und Detektion durch die Verfahren der Erfindung. Alternativ können multiple Fangstellen 74 Antikörper gegen das gleiche Hapten enthalten, womit sie eine Mittelung des Signals zwischen jeder der Stellen ermöglichen.
  • Es sollte auch verstanden werden, dass die Aspekte dieser Erfindung bezüglich des Transfers mittels thermischer Expansion nicht auf Assays mit Nucleinsäuren oder auf Thermocycler limitiert sind. Der Aspekt des Transfers ist nützlich wann immer man eine Reaktionsprobe von einem Reaktions-Standort an einen Detektions-Standort bewegen möchte. Er ist besonders nützlich in Situationen, in denen es wünschenswert ist (z. B. aus Gründen der Kontamination) einen Transfer innerhalb eines versiegelten oder geschlossenen Behälters zu machen. Er kann aber auch in Assays verwendet werden in denen nicht amplifiziert wird und keine Nucleinsäure verwendet wird, wie die Immunoassays, vorausgesetzt die Reagenzien können die Höhe der Temperaturen vertragen die notwendig sind, um den Transfer durchzuführen.
  • 4. Detektionssysteme
  • Die Ergebnisse der Amplifikationsreaktion werden mit Hilfe des Detektionssystems 22 und der Computersteuerung 26 detektiert und analysiert. Der detektierbare Marker ist vorzugsweise ein sichtbarer Marker, aber auch andere detektierbare Marker, wie UV-, IR- oder fluoreszente Marker, können ebenfalls verwendet werden. Das bevorzugte Detektionssystem 22 generiert ein Videobild des Trägers 60 und umfaßt eine Videokamera 100 und eine Lichtquelle 104 (beide werden in den 7 und 8A bis 8D gezeigt) zur Belichtung des Trägers 60. Eine Aufnahme des Trägers 60 wird durch die Kamera 100 bereitgestellt , entweder direkt oder durch Reflexion, und die Kamera 100 generiert ein Videobild, das in den Computer 26 eingespeist wird. Die sichtbaren Marker werden, der Einfachheit halber, später diskutiert.
  • Für das Detektionssystem 22 ist eine Vielfalt an Konfigurationen geeignet; einige davon sind in den 8A bis 8D dargestellt. Im allgemeinen sollte das Detektionssystem 22 eine Lichtquelle 104 zur Belichtung des Detektionsmittels 60 beinhalten und eine Kamera 100 zum Erstellen von Videobildern des Detektionsmittels 60. Die Kameralinse kann direkt auf das Detektionsmittel 60 gerichtet sein, oder es kann ein Spiegel zur Verfügung stehen, um ein Bild des Detektionsmittels 60 an die Kameralinse zu reflektieren.
  • Wie in 8B gezeigt wird, schließt das Detektionssystem 22 eine Kamera 100, eine Kameralinse 102, eine Lichtquelle 104, einen Spiegel 106 und einen Motor 108 (vorzugsweise einen Schrittmotor), der an den Spiegel 106 gekoppelt ist, ein. Die Lichtquelle 104 ist so positioniert, dass die Kameralinse 102 die kolorimetrischen Signale, die vom Träger 61 reflektiert werden, mißt. Die Kamera 100 und der Spiegel 106 werden bezüglich der Heizringe 90, 92 axial positioniert und der Spiegel 106 ist in solch einem Winkel positioniert, dass er ein Bild des porösen Trägers 61 an die Kameralinse 102 reflektiert. Die Kamera 100 ist stationär und der Spiegel 106 wird vom Motor 108 gedreht, unter Computersteuerung, um der Kameralinse 102 aufeinanderfolgend ein Bild des Streifens 61 von jeder Detektionskammer 32 darzubieten. Die Kamera 100 generiert ein Videobild des Streifens 61 von jeder Detektionskammer 32 und leitet dieses Bild an den Computer 26 zur Analyse weiter. Die Software für die Analyse dieses Bildes ist später im Abschnitt über die Videoverarbeitung beschrieben.
  • Die 8A veranschaulicht eine andere Konfiguration des Detektionssystems 22. Dieses Detektionssystem schließt eine Kamera 100, eine Kameralinse 102, eine Lichtquelle 104, einen Spiegel 106 und einen Motor 109, der an die Heizringe 90, 92 gekoppelt ist, ein. Die Lichtquelle 104 ist so positioniert, dass die Kameralinse 102 die kolorimetrischen Signale, die vom Träger 61 reflektiert werden, mißt. Die Kamera 100 und der Spiegel 106 werden bezüglich der Heizringe 90, 92 axial positioniert und der Spiegel 106 ist in einem Winkel positioniert der so gewählt ist, dass er ein Bild des Trägers 61 an die Kameralinse 102 reflektiert. Die Kamera 100 und der Spiegel 106 sind stationär, und die Heizringe 90, 92 werden vom Motor 109 gedreht, unter Computersteuerung, um aufeinanderfolgend jedes Detektionsmittel ins Bild zu rücken, um ein Bild des Streifens 61 von jeder Detektionskammer 32 dem Spiegel 106 darzubieten, der das Bild an die Kameralinse 102 reflektiert. Die Kamera 100 generiert ein Videobild des Streifens 61 von jeder Detektionskammer 32 und leitet dieses Bild an den Computer 26 zur Analyse weiter.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann die Kameralinse 100 direkt auf den Träger 61 gerichtet werden, wobei die Notwendigkeit des Spiegels 106 ausscheidet. In einer anderen Alternative kann sich die Lichtquelle innerhalb des Rings befinden, während sich die Kamera außerhalb des Ringes befindet, oder umgekehrt. Diese Alternativen verwenden die Detektion der Transmission, die weiter unten in Zusammenhang mit der 8D diskutiert werden.
  • In 8C ist ein Reflexions-Fluoreszenz-Detektionssystem mit einer Kamera 100, einer Kameralinse 102, einer Lichtquelle 104, einem Anregungsfilter 110 und einem Emissionsfilter 112 ausgestattet. Die Lichtquelle 104 und die Kamera 100 sind so positioniert, dass die Kameralinse 102 die fluoreszenten Signale empfängt, die vom Träger 61 in der Detektionskammer 32 emittiert werden. Der Anregungsfilter 110 ist zwischen der Lichtquelle 104 und dem Träger 61 angebracht, und der Emissionsfilter 112 ist zwischen dem Träger 61 und der Kameralinse 102 angebracht.
  • In 8D ist ein anderes Fluoreszenz-Detektionssystem mit einer Kamera 100, einer Kameralinse 102, einer Lichtquelle 104, einem Anregungsfilter 110 und einem Emissionsfilter 112 ausgestattet. Die Lichtquelle 104 und die Kamera 100 sind so positioniert, dass sich der Träger 61 zwischen der Lichtquelle 104 und der Kamera 100 befindet. Somit empfängt die Kameralinse 102 die fluoreszenten Signale, die durch den Träger 61 übertragen werden. Der Anregungsfilter 110 ist zwischen der Lichtquelle 104 und dem Träger 61 angebracht, und der Emissionsfilter 112 ist zwischen dem Träger 61 und der Kameralinse 102 angebracht. Ein Transmissions-Detektionssystem wird mit weiteren Details im ebenfalls in Besitz befindlichen U.S. Patent 5.387.790 beschrieben.
  • Die für die Transmissions-Detektion geeigneten Schaltungsanordnungen sind im allgemeinen bekannt, obwohl eine besondere Schaltung im ebenfalls in Besitz befindlichen U.S. Patent 5.387.790 beschrieben ist.
  • Es wird in Betracht gezogen, dass die Detektionssysteme entweder die Transmissions- oder die Reflexions-Verfahren, die in den 8C und 8D gezeigt werden, verwenden könnten und jede der Verfahren zur Darbietung sukzessiver Detektionsmittel 60 an die Kamera. Konkret könnten die Detektionssysteme den in 8B gezeigten rotierenden Spiegel und den Motor beinhalten, oder die in 8A gezeigten rotierenden Heizringe 90, 92 und den Motor (mit oder ohne Spiegel).
  • 5. Computer/Schaltungssteuerungen
  • Wie in 1 gezeigt wird, kann die Computersteuerung 26 als ein IBM AT-kompatibler Personalcomputer implementiert werden, mit einem Monitor 113, einer Tastatur 114 und Möglichkeiten zur Speicherung der Daten. Der Computer 26 schließt eine Einzelbilder-Extraktionskarte 116, eine 16-bit analog/digital E/A-Karte 118 und eine handelsübliche Leiterplatte (PCB) 120 ein. Die CorecoTM OC-300, von Coreco (Montreal, Canada) erhältlich, ist eine geeignete Einzelbilder-Extraktionskarte 116. Eine geeignete analog/digital E/A-Karte 118 ist von Data Translation Company beziehbar.
  • Das Diagramm in 1 veranschaulicht eine vereinfachte Darstellung der in der Einzelbilder-Extraktionskarte 116, der E/A-Karte 118 und der PCB 120 enthaltenen Schaltungsanordnung. Die erhält von der Kamera 100 Videosignale zur Verarbeitung und Analyse. Die E/A-Karte 118 und die PCB 120 steuern zusammen die Aufheiz- und Kühl-Zyklen, durch die Steuerung der Heizstreifen 95, 96 und des Ventilators 19. Das PCB 120 enthält konventionelle Schaltungsanordnungen, die dazu verwendet werden, den Heizstreifen 95, 96 und dem Ventilator 19 den geeigneten Strom zu liefern und auch die tatsächliche Temperatur der Heizstreifen 95, 96 zu überwachen. Es werden ein Paar Thermistoren 122, 123 an die Heizringe 90, 92 gekoppelt, um die Temperatur der Ringe 90, 92 zu prüfen. Die Thermistoren 122, 123 generieren ein Ausgabe-Signal, das die Temperatur der Ringe 90, 92 darstellt, und dieses Signal wird an die PCB 120 zurückgeschickt.
  • Der Computer 26 schließt ein Software-Programm ein, das die Temperatur der Heizringe 90, 92, durch die Steuerung der Heizstreifen 95, 96 und des Ventilators 19 steuert. Der Computer 26 beinhaltet auch Software Programme zum Auffangen und zur Analyse des Videosignal-Imputs bei der Einzelbilder-Extraktionskarte 116. Die 9A bis 9K veranschaulichen ein Flußdiagramm eines geeigneten Temperatur-Steuerungsprogramms 200. Die 11A bis 11D veranschaulichen ein Flußdiagramm eines geeigneten Videoverarbeitungs-Programms 600. Das Temperatursteuerurngs-Programm 200 und das Videoverarbeitungs-Programm 600 können mit Hilfe einer kommerziell erhältlichen Programmiersprache, wie Basic oder C implementiert werden.
  • 6. Temperaturkontrolle
  • a. Hardware
  • Im allgemeinen liefert das Temperatur-Steuerungsprogramm 200 Instruktionen an PCB 120 über die E/A-Karte 118. So zum Beispiel setzt das Temperatur-Steuerungsprogramm 200, das mit digitalen Signalen kommuniziert, eine erwünschte "festgesetzte"-Temperatur für den oberen und den unteren Heizring 90, 92 fest. Die E/A-Karte 118 konvertiert die digitalen Computersignale bei den D/A-Wandlern 126, 128 in analoge Signale. Für jeden Heizstreifen steht ein D/A-Wandler zur Verfügung und somit kann, wenn zwei Heizblöcke verwendet werden, die Temperatur eines jeden einzelnen separat gesteuert werden. Die analoge Ausgabe vom D/A-Wandler 126 ist mit der oberen Heizetage 17 über einen Komparator 130 und ein integriertes Relais 132 gekoppelt, und die analoge Ausgabe von D/A-Wandler 128 ist mit der unteren Heizetage 18 über einen Komparator 134 und ein integriertes Relais 136 gekoppelt.
  • Die Ausgabe von einem Relais 132 ist an den oberen Heizstreifen 95 gekoppelt, der an den oberen Heizring 90 gekoppelt ist. Die Ausgabe eines anderen Relais 136 ist an den unteren Heizstreifen 96 gekoppelt, der an den unteren Heizring 92 gekoppelt ist. Die Relais 132, 136 führen den Heizstreifen 95, 96 Strom zu, die ihrerseits Wärme an die Heizringe 90, 92 abgeben. Die Thermistoren 122, 123 sind an die Heizringe 90, 92 gekoppelt, um die Temperatur der Heizringe 90, 92 zu prüfen und entsprechend den abgetasteten Temperaturen elektrische Signale zu entwickeln. Die von dem Thermistor 122 gelieferten Signale werden über einen Operationsverstärker 138 mit dem Komparator 130 gekoppelt, und die vom anderen Thermistor 123 gelieferten Signale werden über einen Operationsverstärker 140 mit dem Komparator 134 gekoppelt. Die Ausgaben der Operationsverstärker 138, 140 werden auch in die A/D-Wandler 142, 144 auf der E/A-Karte 118 eingespeist, um den Computer 26 und die Software für die Temperatursteuerung mit digitalen Signalen zu versorgen, die die gegenwärtigen Temperaturen des oberen Heizrings 90 und des unteren Heizrings 92 darstellen.
  • Der Computer 26 generiert ein digitales Signal, das die erwünschte oder die "festgesetzte" Temperatur für jede Etage darstellt. Diese werden von der PCB 120 an den D/A-Wandlern 126, 128 akzeptiert und in analoge Signale umgewandelt, um die Heizstreifen 95, 96 zu steuern, um so diese festgesetzten Temperaturen zu erreichen. Die Komparatoren 130, 136 vergleichen andauernd die Spannungen an ihren zwei Eingabe-Leitungen. Für den Komparator 130 entsprechen die Eingabe-Spannungen der Temperatur des oberen Heizringes 90 (von Thermistor 122) und der von dem D/A-Wandler 126 empfangenen festgesetzten Temperatur. Für den Komparator 134 entsprechen die Eingabe-Spannungen der Temperatur des unteren Heizringes 92 (von Thermistor 123) und der von dem D/A-Wandler 128 empfangenen festgesetzten Temperatur. Wenn die abgetastete Temperatur eines der Heizringe 90, 92 niedriger ist als die festgesetzte Temperatur, fährt der entsprechende Komparator , 130 oder 134, fort die festgesetzte Temperatur an die Heizstreifen 95, 96 über die Relais 132, 136 auszugeben. Wenn die abgetastete Temperatur der Heizringe 90, 92 die festgesetzte Temperatur übersteigt, unterbrechen die Komparatoren 130, 134 die Ausgabe an die Heizstreifen 95, 96. Das Programm kann dann über das integrierte Relais 137 das PCB anweisen, den Ventilator-Motor 19 zu starten und umgekehrt, zu unterbrechen, wenn die Kühlzeit abgelaufen ist, i. e. wenn die niedrige "festgesetzte"-Temperatur erreicht ist.
  • b. Software
  • Das in den 9A bis 9K veranschaulichte Flußdiagramm verwendet konventionelle Block-Symbole um die von dem Temperatur-Steuerungsprogramm durchgeführten Hauptfunktionen darzustellen. Das Temperatur-Steuerungsprogramm 200 hat vier Hauptabschnitte oder Routinen. Der erste Abschnitt ist der "Initialize" (Initialisierungs-) Abschnitt 202, der in 9A gezeigt wird, der die Computer-Hardware auf den Empfang der Daten vorbereitet, durch die Definition von Software. Variablen und fixen Hardware-Parametern in einer konventionellen Art und Weise. Wenn der Computer 26 eingeschaltet wird, dann wird der "Initialize" (Initialisierungs-) Abschnitt 202 einmal ausgeführt. Der zweite Abschnitt ist der "Edit"- Abschnitt 204, der in den 9b bis 9D gezeigt wird, und der es dem Anwender ermöglicht die Wahl der verschiedenen Parameter festzusetzen und/oder zu ändern, die ein konkretes Denaturierungs-Protokoll, falls eines vorhanden ist, und Zyklus/Überhitzungs-Protokoll, falls eines vorhanden ist, definieren. Der dritte Abschnitt ist der "Denature" -(Denaturierungs-) Abschnitt 206, der in den 9E bis 9G gezeigt wird, und der das PCB 120 instruiert, die Heizringe 90, 92 auf die vom Deneturierungs-Protokoll gewählte Temperatur zu bringen. Der vierte Abschnitt ist der "Cycle/Superheat"- (Zyklus/Überhitzungs-) Abschnitt 208, der in den 9H bis 9K gezeigt wird, und der das PCB 120 instruiert, die Heizringe 90, 92 auf die von den Cycling-Protokollen und dem Überhitzungs-, oder Schwellenwert-Protokoll gewählte Temperatur zu bringen. Wie schon vorher in dieser Darstellung beschrieben wurde, expandiert das Überhitzungs-Protokoll den Treibstoff 40 in der Reaktionskammer 30, um dadurch die Reaktionsprobe 38 aus der Reaktionskammer 30 in die Detektionskammer 32 zu überführen. Vorzugsweise wiederholt das Programm 200 das Hoch- und Niedrig-Temperatur Cycling für eine vorbestimmte Anzahl von Zyklen X und geht dann zum Überhitzungs-Protokoll über.
  • Wie in 9A gezeigt wird, startet der Initialisierungs-Abschnitt 202 das Programm 200 beim Block 210 und initialisiert dann die Software-Konstanten und -Variablen am Block 212. Der Block 212 führt solch konventionelle Schritte, wie Zuweisung und Definition von Speicherstellen in der Computer-Hardware und Definition von Programmvariablen, durch. Diese Schritte sind notwendig um es einem Computerprogramm zu ermöglichen mit der Computer Hardware effizient zu kommunizieren. Das Programm 200 ermöglicht dem Anwender, bei den Blocks 214, 216 und 218, entweder eine erwünschte Protokoll-Datei (im Computerspeicher oder auf dem Datenträger gespeichert) anzugeben oder ein Set Vorgabe-Protokollwerte zu akzeptieren. Die Protokoll-Datei enthält Werte für ein Set von Parametern, die die Eigenschaften eines bestimmten Cycling/Überhitzungs-Protokolls definieren. In jedem der Fälle können die Protokoll-Parameter durch den Anwender im unten beschriebenen Editier-Abschnitt 204 geändert werden. Für die dargestellte Ausführungsform des Temperatur-Steuerungsprogramms 200 sind folgende Parameter in der Protokoll-Datei enthalten, und in der äußersten rechten Kolonne werden beispielhafte Werte angegeben. Im dargestellten Programm 200 ist die Shutoff- (Abschalt-) Temperatur (die nur zum Ende des Betriebes verwendet wird, um den Ventilator abzuschalten) kein editierbarer Parameter, sondern sie ist voreingestellt.
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Die Parameter werden mit Bezug auf 10 beschrieben, die eine Temperatur gegen Zeit Darstellung des Heizrings (der Heizringe) (und dementsprechend der Reaktionskammer 30) ist, im Laufe eines Denaturierungsprotokolls, eines Cycling-Protokolls und eines Überhitzungs-Protokolls. In 10 wird vorausgesetzt, dass es zwei Heizetagen gibt, die aber entweder gleichzeitig funktionieren, oder nur. eine davon bis zum Überhitzungs-Zyklus in Verwendung ist. So wie gezeigt, startet (starten) der (die) Heizring(e) bei einer bestimmten Temperatur zur Zeit T0. Diese Temperatur kann jeder Wert gleich oder unter der Wartetemperatur vom Ende der letzten Amplifikationsreaktion sein. Im abgebildeten Beispiel ist (sind) der (die) Heizring(e) in etwa bei Raumtemperatur bei T0. Nach T0 instruiert das Temperatur-Kontrollprogramm 200 das PCB 120 den (die) Heizringe) auf eine erste "festgesetzte"-Temperatur zu bringen, in diesem FAll die "Denaturierungstemperatur", deren Wert gewählt wird, um die Nucleinsäure in der Probe und/oder jede Sonde oder Primer zu denaturieren. Die Denaturierungstemperatur befindet sich typischer Weise im Bereich von etwa 80–100°C; im Beispiel ist der Wert ist 95°C. Weil die "festgesetzte"-Temperatur nicht sofort erreicht werden kann, erhöht sich oder "steigt" die Temperatur schrittweise auf die "festgesetzte"-Temperatur innerhalb der Zeitspanne von "festgesetzte"-Temperatur bis T1. Über die Feedback-Thermistoren tastet das Programm 200 ab wann der (die) Heizring(e) die angewählte "festgesetzte"-Temperatur erreicht hat (haben) und hält diese Temperatur für die vorgewählte Zeitspanne von T1 bis T2 (die "Denaturierungszeit"), um die Proben-DNA und alle reagierenden Sonden oder Primer zu denaturieren.
  • Nach dem Ablauf der Denaturierungszeit (T2) stellt das Programm die "festgesetzte"-Temperatur auf "Low Cycling Temperatur" (niedrige Cycling Temperatur) und der (die) Heizring(e) "steigen" ab bis auf diese neue "festgesetzte"-Temperatur, während der Zeitspanne von T2 bis T3 , die dann während der "Low Cycling Time" (niedrige Cycle-Zeit ) erhalten bleibt. Vorzugsweise werden die Abstiegs-Zeiten (z. B. T2 bis T3 und T6 bis T7) minimiert, mittels Einschalten des Ventilators 19, der dazu beitragen soll den (die) Heizring(e) zu kühlen. Die werte für diese Parameter werden so ausgesucht, dass sie die Temperatur und die Zeit für das erneute Aufschmelzen der Primer oder Sonden an das mögliche Ziel oder die vom Ziel hergestellten Amplikons. Die Schmelztemperaturen sind abhängig von der Sondenlänge und dem Gehalt an Guanosin- oder Cytosin-Resten, wie das im Fachgebiet bekannt ist, und werden typischer Weise einige Grad unter der errechneten Tm für die Sonden oder Primer eingestellt. Für typische Längen der Primer und Sonden können sich die niedrigen Cycling Temperaturen im Bereich von etwa 45–70°C befinden; der Wert im Beispiel wurde auf 60°C festgelegt. Diese Zeitspanne wird in 10 von T3 bis T4 gezeigt.
  • Als nächstes erfolgt durch das Programm eine Rückssetzung der "festgesetzten"-Temperatur , die auf die "Hohe Cycling Temperatur" ansteigt, und die weiter während der "Hohen Cycling Zeit" gehalten wird, wie in 10 von T4 bis T5 und von T5 bis T6 gezeigt. Die Werte für die "Hohe Cycling Temperatur" und die "Hohe Cycling Zeit" werden derart gewählt, dass die Sonden oder Primer von Zielen oder Amplikons erneut denaturiert werden. Im allgemeinen ist die "hohe Cycling Temperatur" leicht niedriger als die Proben-Denaturierungs-Temperatur, aber sie muß höher sein als die Tm der Amplikons. Üblich sind Werte im Bereich von etwa 70–95°C; der im Beispiel angegebene Wert ist 80°C.
  • Nach dem Ablauf der "Hohen Cycling Zeit" erfolgt durch das Programm die Rücksetzung der "festgesetzten"-Temperatur auf die "niedrige Cycling Temperatur", der (die) Heizring(e) "steigen ab" auf T7 und der Prozess wiederholt sich. Jeder Zyklus besteht aus einer hohen und einer niedrigen Temperatur, wie in 10 gezeigt. Die "Gesamtanzahl der Zyklen" ist der Parameter dessen Wert die Anzahl der Zyklen steuert. Die Anzahl der Zyklen wird, abhängig vom durchgeführten Assay, stark variieren. Sowohl für PCR als auch für LCR ist es nicht ungewöhnlich zwischen 10 und 70 Zyklen zu haben, im allgemeinen zwischen 25 und 50.
  • Nachdem die Gesamtanzahl der Zyklen erreicht wurde, wechselt das Programm zum Aspekt der Überhitzung, um die Reaktionsprobe 38 aus der Reaktionskammer 30 in die Detektionskammer 32 zu überführen, wie das weiter oben in Zusammenhang mit den 5A–5E beschrieben ist. Bei Systemen mit zwei Etagen wird dieses im allgemeinen so durchgeführt, dass die untere Etage zuerst überhitzt wird und als zweites die zweite Etage, aus Gründen die weiter oben beschrieben wurden. Als Option wird die untere Etage auch auf eine höhere Temperatur überhitzt als die obere Etage, wie in 10 gezeigt. Die unterer-Block-Überhitzungs-Temperatur – und die oberer-Block-Überhitzungs-Temperatur sind Parameter, die die Werte für diese Überhitzungsphasen enthalten. Wie vorhin erwähnt, sind diese Werte so gewählt, dass ein Treibmittel expandieren kann, wodurch die Reaktionsprobe in die Detektionskammer gedrückt wird. Im allgemeinen ist diese Temperatur genauso hoch oder höher als die Denaturierungstemperatur, was aber nicht sein muß, weil das Treibmittel vor den Denaturierungstemperaturen abgeschirmt werden kann, indem es tief in die Reaktionskammer eingebracht wird (i. e. innerhalb der unteren Etage) und nicht die zwei Etagen überquert. Der Einfachheit halber kann eine wässrige Reaktionsprobe als Treibmittel dienen und die Überhitzungs-Temperaturen werden sich im allgemeinen im Bereich von etwa 90-120°C befinden.
  • Bei Systemen mit zwei Etagen ist die "Vorlaufzeit für die Überhitzung" eine optionale Zeitspanne, innerhalb derer der untere Heizring 92 auf seine Überhitzungstemperatur gebracht wird, bevor der obere Heizring 90 auf seine Überhitzungstemperatur gebracht wird. Die "Vorlaufzeit für die Überhitzung" ist in 10 von Ts bis Tu dargestellt. Weiter oben wird ein beispielhafter Wert von 15 Sekunden angegeben. Abhängig vom Wert für die Vorlaufzeit und der Steigung des Überhitzungs-"Anstiegs" kann die Vorlaufzeit (Ts bis Tu) länger als, gleich oder kürzer als die Anstiegszeit (Ts bis Tp) sein; in anderen Worten können die relativen Positionen von Tu und Tp umgekehrt als die dargestellten sein.
  • Die "gesamte Überhitzungs-Zeit" enthält den Zeit-Wert für die Überhitzungsphase, angefangen mit dem Zeitpunkt wenn die obere Etage (oder die einzige Etage wenn nur eine verwendet wird) ihre "festgesetzte"-Temperatur erreicht (z. B. die oberer-Block-Überhitzungs-Temperatur). Diese Zeit wird in 10 von Te bis Tr gezeigt und braucht nur lang genug zu sein, um ein angemessenes Volumen der Reaktionsprobe in die Detektionskammer zu überführen. Dieses wird selbstverständlich vom Probenvolumen und dem Detektionsmittel abhängen, kann aber durch einfache Experimente mit Leichtigkeit bestimmt werden. Ein beispielhafter Wert ist 30 Sekunden. Es sollte aber bemerkt werden, dass alle beispielhaften Zeitangaben und Zeitspannen ein Thema der hierin verwendeten spezifischen Ausführungsform sind und dass die Verwendung anderer Spannen innerhalb der Fähigkeiten derjenigen mit Erfahrung im Fachbereich liegt.
  • Der "Nachlauf"-(Tracking) Parameter bestimmt, im Falle eines Heizelementes mit zwei Etagen, ob sowohl der obere als auch der untere Heizring 90, 92 an dem Denaturierungs-Protokoll und den Cycling-Protokollen teilnimmt. Falls der "Tracking"-Parameter auf "aus" steht, nimmt nur einer der Heizringe 90, 92 an dem Denaturierungs-Protokoll und den Cycling-Protokollen teil.
  • Die "Abschalttemperatur am Ende der Reaktion" ist eine "festgesetzte"-Temperatur, bei der das Programm 200 den Motor des Ventilators, der die Heizringe 90, 92 kühlt, am Ende des Test-Protokolls abschaltet, und in 10 von Th dargestellt wird.
  • Die "Bild-Vezögerungszeit" zeigt dem Computer nur an, eine angegebene Zeit abzuwarten bevor mit den Detektionsverfahren begonnen wird. Diese Zeit sollte ausreichend sein, um es dem Signal in der Detektionskammer zu ermöglichen sich vollständig zu entwickeln, und kann sich im Bereich von etwa 1–10 Minuten oder mehr befinden, abhängig von der Art des Signals und des verwendeten Detektionsmittels.
  • Es wird angenommen, dass man ein Amplifikations-Protokoll wählen kann, das vor der ersten Niedrige-Cycle-Temperatur eine Hohe-Cycle-Temperatur aufruft. In diesem Fall wird die Dauer von T2 bis T3 einfach erweitert, um bei der Hohen-Cycling-Temperatur für eine von dem gewählten Protokoll bestimmten Zeit ein Plateau einzubauen, bevor das Sinken auf die niedrige Temperatur fortgefahren wird.
  • Die 10 zeigt auch den Programmstatus für die Denaturierungs- und Zyklus/Überhitzungs-Routinen. Diese werden weiter unten in Zusammenhang mit der Software beschrieben.
  • Um erneut auf die 9A zurückzukommen, nachdem die Protokoll-Datei gewählt worden ist (Blocks 214, 216 und 218) stellt das Programm 200 einen Hilfetext und die aktuellen Protokoll-Parameter auf den Bildschirm des Monitors 113 auf, bei Blocks 220 und 222. Der Block 220 stellt Hilfe-Informationen zur Verfügung, um die Anwender in der Entscheidung bezüglich der zu unternehmenden Schritte zum Fortfahren des Programms 200, zu unterstützen. Die Bildschirm-Überschriften bei Block 222 stellen auch Eingabeaufforderungen bezüglich der Tastenanschlag-Eingaben zur Verfügung, um das erwünschte Ergebnis zu erzielen.
  • Das Programm 200 initialisiert eine Thermistoren-Nachschlagtabelle bei Block 224. Obwohl der Widerstand der Thermistoren 122, 123 mit der Temperatur variiert, sind diese Temperaturveränderungen nicht linear. Demnach wird eine Nachschlagtabelle zur Verfügung gestellt, so dass das Programm 200 die Temperatur nicht jedes Mal neu berechnen muß, wenn von einem der Thermistoren 122, 123 ein Ablesewert geliefert wird.
  • Die E/A-Karte 118 wird bei Block 226 initialisiert. Dieser setzt die verschiedenen Werte fest, die auf der E/A-Karte 118 verwendet werden, wie die Verstärkungseinstellungen auf den Vorverstärkungsstufen oder die Verwendung von unipolaren (0 Volt bis 10 Volt) oder bipolaren (–5 Volt bis +5 Volt) Signalbereichen. Bei Block 228 werden die Protokoll-Parameter initialisiert und die E/A-Karte 118 wird darauf vorbereitet, Temperaturen in digitale Anzeigen zu konvertieren. Der Block 230 bewegt das Programm 200 zum Editier-Abschnitt 204.
  • Der Editier-Abschnitt 204 des Programms 200 wird in den 9B, 9C und 9D gezeigt. Im allgemeinen ermöglicht der Editier-Abschnitt 204 dem Anwender einige oder alle Protokoll-Parameter , die in den Blocks 216 und 218 des Initialisierungs-Abschnitts 202 gewählt worden sind, zu ändern. Der Editier-Abschnitt 204 löscht die Tastaur 114 bei Block 236, was der Einstellung Key = 0 gleichwertig ist, und zeigt die aktuellen Protokoll-Parameter bei Block 238. Das Programm 200 stellt eine andauernde Anzeige der aktuellen Temperatur der Heizringe 90, 92 zur Verfügung. Dieses wird bei den Blocks 240 und 242 erfüllt, durch das Ablesen der analogen Eingaben des oberen und des unteren Rings 90, 92, die Konvertierung dieser Eingaben in Temperatur-Werte in der Thermistor-Nachschlagtabelle und die Anzeige der Temperatur am Monitor 113. Im Block 244 zeigt das Programm 200 auch die Befehlsinstruktionen für das Editieren der Parameter am Monitor 113 an, Instruktionen welche dem Anwender Prompts zum Editieren der Protokoll-Parameter zur Verfügung stellt.
  • Der Editier-Abschnitt 204 sucht dann eine Tastatur-Eingabe in Block 246, solange bis eins empfangen wird. Der Anwender kann nun Protokoll-Parameter editieren, durch anschlagen irgendeiner der Tasten die in den Blocks 250, 256, 260, 264, 270, 280, 284, 288, 294 und 298 gezeigt werden. Die Taste "U", die in Block 250 gezeigt wird, führt das Programm 200 zum Block 251, der dem Anwender die Rücksetzung der Hohen Cycling Temperatur und der Dauer der Hohen Cycling Temperatur ermöglicht. Ähnlicher Weise bringt die Taste "L", die in Block 256 gezeigt wird, das Programm 200 zu Block 258, der dem Anwender die Rücksetzung der Niedrigen Cycling Temperatur und der Dauer der Niedrigen Cycling Temperatur ermöglicht. Die "C" Taste, die in Block 260 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 262, der dem Anwender das Festsetzen der maximalen Anzahl der Zyklen ermöglicht. Die "W" Taste, die in Block 264 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 266, der dem Anwender die Abspeicherung der editierten Parameter-Protokolle in eine Datei im Speicher des Computers ermöglicht. Die "F" Taste, die in Block 270 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 272, der dem Anwender das Einschalten des Ventilators 94 ermöglicht, und dadurch, wenn erwünscht, das Abkühlen der Heizringe 90, 92. Die "D" Taste, die in Block 280 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 282, der dem Anwender das Editieren der Denaturierungstemperatur und der Denaturierungs-Zeit im Denaturierungs-Protokoll ermöglicht. Die "H" Taste, die in Block 284 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 286, der dem Anwender das Editieren der Überhitzungs-Parameter ermöglicht. Die Überhitzungs-Parameter schließen die Überhitzungs-Temperatur für den unteren Heizring, die Verzögerungszeit für die Überhitzung des oberen Heizrings, die Überhitzungs-Temperatur für den oberen Heizring, und das gesamte Zeitintervall für die Überhitzung ein. Die "T" Taste, die in Block 288 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 290, der dem Anwender das Editieren der Tracking-Parameter ermöglicht. Nachdem das Programm 200 die T Taste in Block 288 aufruft, werden in Block 292 die Zeitgeber festgesetzt, in Erwartung des Starts des Denaturierungs-Abschnitts 206. Die "E" Taste, die in Block 294 gezeigt wird, führt das Programm 200 zu Block 296, die das Programm 200 beendet. Die "S" Taste, die in Block 298 gezeigt wird, setzt "Status", "Anzahl der Zyklen", "Rzeit" und "Taste" alle auf 0 zurück (Block 300) und führt das Programm 200 zum Denaturierungs-Abschnitt 206 in Block 304. Falls die "S" Taste nicht gedrückt wird kehrt das Programm 200 zum Anfang des Editier-Abschnitts 204 zurück.
  • Der Denaturierungs-Abschnitt 206 (9E, 9F und )G) beginnt bei Block 310 und zeigt die aktuellen Protokoll-Parameter in Block 312 an. Der Block 314 löscht die Tastatur-Eingaben und Block 316 überprüft den Wert, der für dir Denaturierungs-Temperatur (TEMP.DEN) eingegeben wurde. Falls die Denaturierungs-Temperatur auf 0 festgesetzt wurde, überspringt das Programm 200 das Denaturierungs-Protokoll und setzt die "Anzahl-der-Zyklen" -Anzeige auf 1 und die Status-Anzeige auf 0 (Block 318) bevor es mit der Zyklus/Überhitzungs-Routine via Block 320 fortfährt. Durch das Einsteigen in den Zyklus/ Überhitzungs-Abschnitt 208 über Block 420 setzt das Programm die Probe der Hohen Cycling Temperatur aus, durch die Gleichsetzung von SETTEMP mit TEMPHI in Block 422 und durch die Eingabe der Zyklus/Überhitzungs-Routine 208 mit der Statusanzeige auf 0.
  • Wenn man aber den Wert aus dem obigen Beispiel verwendet, wird die Denaturierungs-Temperatur auf einen Wert größer als Null (95°C) festgesetzt, womit das Programm 200 die Denaturierungs -Temperatur und die Denaturierungs -Zeit in Block 322 initialisiert, einschließlich einiger Subroutinen zum Erlangen der Tracking Information, zur Festsetzung der Denaturierungs-Temperatur und zum Ausschalten des Ventilators 94. Die "Festsetzung" einer Temperatur oder einer Zeit beruht auf das Anlegen einer Variablen, wie SETTEMP, SETTEMPO oder SETTEMP1 für die Temperatur und RTIME für die Zeit, und die Zuordnung eines Wertes zur besagten Variablen, wobei der Wert unter einem der oben beschriebenen Parameter ausgewählt wird, nämlich: TEMP.DEN, TEMPLO, TEMPHI, TEMPSUPER und TEMPSUPER2 für die Temperatur-Variablen und TIME, DEN, TIMELO, TIMEHI, TIMELEAD und TIMESUPER für die Zeit-Variable. Somit nimmt die SETTEMP Variable bei Block 322 den im Protokoll für die Denaturierungs-Temperatur gespeicherten Wert an.
  • Die Blocks 311, 324 und 326 zeigen, dass der Denaturierungs-Abschnitt 206 andauernd die Tastatur 114 nach Eingaben bezüglich des Parameter-Editieren von Seiten des Anwenders abfragt. Falls eine Tastatur-Eingabe empfangen wird, bewegt sich das Programm 200 zum Editier-Abschnitt 204, und der Anwender kann dann jeden der aktuellen Protokoll-Parameter editieren. Das Programm 200 aktualisiert die Temperatur-Anzeige bei den Blocks 328 und 330.
  • Bei Block 332 verzweigt sich das Programm 200, um entweder Temperatur oder Zeit abzurufen, in Abhängigkeit vom Wert der Programm-Status-Anzeige, der Tasten-Anzeige und der RZeit. Weil die RZeit (wie auch andere Variablen) in Block 300 auf 0 gesetzt wurde, ruft das Programm in diesem ersten Durchgang durch die Schleife die Temperatur ab und bewegt sich nach Block 336. Hier überprüft das Programm 200 die TRACK Variable um festzustellen ob beide Bocks eines zwei-Etagen-Systems die Zyklen parallel durchlaufen sollen oder nicht. Wenn TRACK = an, dann schickt der Block 338 das Programm zu Block 356, der beide Blocks überprüft. Wenn TRACK = aus, dann veranlaßt d er Block 340 das Programm, nur einen Block zu überprüfen – in diesem Beispiel den oberen Block. Für den Rest dieser Beschreibung wird angenommen, dass TRACK = aus, aber diejenigen mit Erfahrung im Fachbereich werden mit Leichtigkeit die Spiegel-ähnliche Art mancher Abschnitte des Flußdiagramms erkennen. In einem System mit einem einzigen Heizelement ist die TRACK-Variable sicherlich nicht erforderlich und es wird nur ein Bock überprüft. In folgender Beschreibung wird ein zwei-Block-System angenommen, worin nur der obere Block zur Denaturierung und fürs Cycling verwendet wird, wobei zu verstehen ist, dass dieses nur eine einzige Ausführungsform ist.
  • Im Abschnitt 206, Denaturierung, kann die Programm-Status-Anzeige vier Werte, von 0 bis 3, haben. Im allgemeinen, wenn die Programm-Status-Anzeige 0 ist (siehe Block 344), hat das Programm 200 dem PCB 120 signalisiert, die Heizringe auf die Denaturierungs-Temperatur zu führen, und das Programm 200 (bei Block 332) fragt die A/D-Wandler 142, 194 auf der E/A-Karte 118 ab, um festzustellen wann der obere Ring die Denaturierungstemperatur erreicht hat (siehe Block 346). Falls der obere Heizring die Denaturierungstemperatur noch nicht erreicht hat, bewegt sich das Programm durch Blocks 350, 372 und 382 und kehrt zur Denaturierungs-Hauptschleife zurück, in der Nähe des Anfangs bei Block 311. Von dort kehrt das Programm zu Block 346 zurück und fragt ab ob der obere Heizring die Denaturierungstemperatur (95°C) erreicht hat.
  • Das Programm 200 bleibt in dieser Schleife bis der obere Heizring 90 die Deneturierungs-Temperatur erreicht hat. Die Antwort bei Block 346 ist nun ja und das Programm 200 setzt die Tasten-Anzeige in Block 348 auf 1. Wenn die Heizringe 90, 92 die Deneturierungs-Temperatur erreicht haben, wird die Tasten-Anzeige in Block 348 auf 1 gesetzt und die Programm-Status-Anzeige wird bei Block 374 auf 1 inkrementiert. Zusätzlich wird die Variable RZeit festgesetzt um den Wert des TIME.DEN (Denaturierungs- Zeit) Parameters in Block 378 anzunehmen, der Zeitnehmer wird bei Block 380 gestartet und das Programm kehrt zur Denaturierungs-Hauptschleife zurück (Blocks 382 und 311).
  • Weil RZeit nun einen Wert hält (120 Sekunden im Beispiel) springt das Programm bei Block 332 zur "Timecheck" Subroutine in Block 396 und fragt ab ob RZeit die Zeit abgeschaltet hat. RZeit "schaltet die Zeit ab" wenn die Zeitspanne für die bestimmte Aktivität (in diesem Fall 120 Sek. Denaturierungs-Zeit) abgelaufen ist. Falls die Antwort auf diese Abfrage nein ist, bildet das Programm eine Schleife zurück zum Anfang des Denaturierungs-Abschnitts 206 und kehrt, über die Blocks 332 und 334, zur Abfrage der Zeitabschaltung in Block 398 zurück. Falls die Antwort auf die Abfrage der Zeitabschaltung ja ist, inkrementiert das Programm 200 die Programm-Status-Anzeige (nun auf 2) bei Block 400 und setzt Taste und RZeit bei Block 402 auf 0 zurück. Dann setzt das Programm 200 die SETTEMP Variable zurück um den Parameter Wert TEMPLO (Block 406) anzugleichen und schaltet den Ventilator (Block 408) ein um den Heizblock 90 auf die Niedrige Cycling Temperatur abzukühlen.
  • Bei der Rückkehr zur Denaturierungs-Hauptschleife (Block 311) mit der Programm-Status-Anzeige auf 2 und dem RZeit Reset auf 0 springt das Programm 200 über die Blocks 336, 340, 342 und 344 zu Block 350 und ruft den oberen Heizblock 90 bei Block 352 auf festzustellen, ob er die SETTEMP (nun die Niedrige Cycling Temperatur) erreicht hat. Falls der obere Heizblock 90 seine festgesetzte Temperatur (60°C im Beispiel) noch nicht erreicht hat bildet das Programm 220 eine Schleife zurück zu Block 352 über die Blocks 372, 382, 311, 332, 336, 340, 342, 344 und 350. Wenn die Niedrige Cycling SETTEMP erreicht ist, inkrementiert das Programm die Taste auf 1 und die Status-Anzeige auf 3 (Blocks 348 und 374) und schaltet den Ventilator ab (Block 390). Dann setzt es die Taste auf 1 zurück und die Status-Anzeige auf 2 bevor es sich in die Hauptschleife des Cycling/Überhitzungs-Abschnitts 208 (Blocks 392 und 394) bewegt. Es sollte bemerkt werden, dass beim Eintritt in die Cycling/Überhitzugs-Routine 208 nach der Denaturierungs-Routine, die Cycling/Überhitzugs-Routine bei der Niedrigen Cycling Temperatur beginnt, während im Falle in dem die Denaturierung ausgelassen wird, das Programm bei der Hohen Cycling Temperatur in die Cycling/Überhitzugs-Routine eintritt (siehe Blocks 318, 320, 420 und 422, wie oben beschrieben). Im Beispiel beginnt der Cycling/Überhitzugs-Abschnitt 208 (9H bis 9K) bei Block 421, wobei SETTEMP schon initialisiert worden ist. Wie auch im Falle des Denaturierungs-Abschnitts 206, fragt der Cycling/Überhitzugs-Abschnitt 208 andauernd die Tastatur 114 über Parameter-Editier-Eingaben ab und führt das Programm 200 zum Editier-Abschnitt 204 zurück, wann immer es eine geeignete Eingabe von der Tastatur 114 erhält. Die aktuelle Temperatur eines jeden Heizblocks 90, 92 wird auf die E/A-Karte 118 gespeichert und bei den Blocks 428 und 430 angezeigt.
  • Bei Block 432 fragt das Programm 200 ab, ob es Zeit oder Temperatur überprüfen sollte, in Abhängigkeit vom Wert der RZeit. Hier ist die RZeit 0 (weil sie letztens bei Block 402 zurückgesetzt wurde), so dass das Programm zu Block 436 springt, um die Temperatur der Heizblöcke zu überprüfen. Weil Tracking aus ist, führt die Abfrage bei Block 436 zur Status-Abfrage bei Block 438 und dann zur Status-Abfrage bei Block 462. Im Cycling/Überhitzugs-Abschnitt 208 kann die Programm-Status-Anzeige elf Werte haben, von 0 bis 10, sie wurde aber beim Verlassen des Denaturierungsabschnitts (Block 392) auf 2 gesetzt, so dass das Programm bei Block 464 abfragt ob der obere Heizblock die Niedrige Cycling Temperatur von 60°C erreicht hat. Diese Temperatur wurde am Ende des Denaturierungs-Abschnitts 206 erreicht (und auch wenn sie nicht erreicht worden wäre, hat Block 392 Key = 1 zurückgesetzt) und somit ist an diesem Punkt Key = 1. Das Programm 200 fließt dann durch die Blocks 476, 478, 484 und 490 zur Abfrage in Block 496, die in diesem Punkt "ja" ist, was die Bewegung des Programms in eine "Status Verändern" ("Change State") Subroutine bewirkt.
  • Im allgemeinen kann beobachtet werden, dass in diesem Programm 200, wenn der Programm-Status Null oder eine gerade Zahl ist, der (die) Heizblocks) auf eine neue festgesetzte Temperatur aufheizt oder abkühlt, und das Programm verzweigt sich, um den (die) A/D -Wandler 142, 144 auf der E/A-Karte 118 nach den von dem (den) Thermistor(en) 122, 123 zugeführten Temperatur-Informationen abzufragen. Umgekehrt, wenn der Programm- Status eine ungerade Zahl ist, dann ist die festgesetzte Temperatur erreicht worden, so dass das Programm springt um den Zeitnehmer abzufragen und so zu bestimmen ob der (die) Heizblock (Heizblöcke) die festgesetzte Temperatur für die entsprechende Zeitspanne gehalten haben. Dieses kann auch in 10 gesehen werden.
  • In der Status Verändern Subroutine bei Block 510 wird die Programm-Status-Anzeige bei Block 512 inkrementiert (auf 3). Dem Block 514 wird mit nein geantwortet und dem Block 518 wird mit ja geantwortet, was das Programm 200 veranlaßt, RZeit zurückzusetzen um den Wert von TIMELO (die Niedrige Cycling Zeit von 60 Sekunden in unserem Beispiel) bei Block 520 anzunehmen. Das Programm schaltet bei Block 522 auch den Ventilator ab und startet den Zeitnehmer bei Block 536 bevor es zum Anfang des Zyklus/Überhitzung-Abschnitts 208 bei Block 421 zurückkehrt.
  • Das Programm 200 bewegt sich über den Anfang des Zyklus/ Überhitzung-Abschnitts zu Block 432. Weil die RZeit nun einen Wert hält (60 Sek.) springt das Programm von Block 432 zur Checktime Subroutine, die bei Block 550 anfängt. Falls RZeit noch nicht abgelaufen ist, kehrt das Programm zur Hauptschleife zurück, bis die 60 Sekunden in der RZeit abgelaufen sind. Wenn die RZeit abgelaufen ist, dann ist die Antwort auf die Abfrage bei Block 552 ja und somit inkrementiert das Programm 200 die Status-Anzeige auf 4 bei Block 555 und setzt RZeit und Tasten auf 0 bevor es sich über Block 556 zu Block 562 bewegt.
  • Wenn das Programm Status 4 und Block 562 erreicht, wird die Anzahl-der-Zyklen-Anzeige bei Block 564 implementiert (in unserem Beispiel auf 1, weil die Zyklus/Überhitzung Routine 208 über die Blocks 392 und 394 aufgenommen wurde, wo Anzahl-der-Zyklen = 0 festgesetzt worden war). Das Programm fragt dann die "Anzahl-der-Zyklen"-Anzeige ab. Falls die Anzahl-der-Zyklen-Anzeige die maximale Anzahl von Zyklen, die als Protokoll-Parameter CYCLEMAX gespeichert sind, nicht überschritten hat, dann setzt das Programm 200 die Programm-Status-Anzeige auf 0 zurück und setzt die Variable SETTEMP auf den Wert der Parameter der Hohen Cycling Temperatur fest und schaltet das (die) Heizelement(e) ein, um den nächsten Zyklus zu beginnen (Blocks 568 und 586) und kehrt dann zur Hauptschleife bei Block 421 zurück. Für das dargestellte Beispiel ist CYCLEMAX 8 und TEMPHI ist 80°C. Somit kehrt das Programm zu Block 421 zurück mit SETTEMP = 80.
  • Diesmal bewegt sich das Programm durch die Hauptschleife, durch die Blocks 424, 428 und 430 zum RZeit Test bei Block 432. Weil RZeit bei Block 555 auf 0 zurückgesetzt wurde springt das Programm zu Block 436, um die Temperatur des Heizblocks (der Heizblöcke) zu überprüfen. Mit Tracking aus führt die Abfrage bei Block 436 zur Status-Abfrage bei Block 438, wo die Antwort nun ja ist. Dieses schickt das Programm zu Block 440 um festzustellen ob der Heizblock (die Heizblöcke) die neue festgesetzte Temperatur erreicht hat (haben). Falls nicht, bewegt sich das Programm durch die Blocks 444, 460, 462, 476, 478, 484, 490 und 496 um zur Hauptschleife zurückzukehren und seine Abfrage über die Temperatur des Heizblocks fortzufahren. Wenn der Heizblock (die Heizblöcke) die festgesetzte Temperatur erreicht haben, inkrementiert die Antwort bei Block 440 die Tastatur-Anzeige auf 1 bei Block 442. Das Programm fährt durch die Blocks 444, 460, 462, 476, 478, 484 und 490 fort bis zu Block 496 und überspringt die "Veränderungs-Status" Subroutine, weil Tastatur = 1 ist.
  • In der Veränderungs-Status – Subroutine bei Block 510 wird die Programm-Status-Anzeige inkrementiert (auf 1), bei Block 512, und Block 514 wird mit ja beantwortet, was das Programm 200 dazu veranlaßt RZeit zurückzusetzen, um den Wert von TIMEHI (die Hohe Cycling Zeit von 60 Sekunden in unserem Beispiel) bei Block 516 anzunehmen. Das Programm startet auch den Zeitnehmer bei Block 536 bevor es sich zum Beginn des Zyklus/Überhitzung – Abschnitts 208 bei Block 421 zurückbewegt. Das Programm 200 bewegt sich durch den Beginn des Zyklus/Überhitzung – Abschnitts 208 zu Block 432. Weil die RZeit nun einen Wert hält (60 Sek.) springt das Programm von Block 432 zur Checktime Subroutine, die bei Block 550 anfängt. Falls RZeit noch nicht abgelaufen ist, kehrt das Programm zur Hauptschleife zurück (Block 554), bis die 60 Sekunden in der RZeit abgelaufen sind. Wenn die RZeit abgelaufen ist, dann ist die Antwort auf die Abfrage bei Block 552 ja und somit inkrementiert das Programm 200 die Status-Anzeige auf 2 bei Block 555 und setzt RZeit und Tasten auf 0 bevor es sich zu Block 556 weiterbewegt.
  • Bei Block 556 ist die Antwort ja, wodurch das Programm veranlaßt wird die Variable SETTEMP auf den Wert des Niedrigen Zyklus Temperatur Parameters (TEMPLO) bei Block 558 zurückzusetzen und bei Block 260 schaltet es den Ventilator an, um den Heizblock (die Heizblöcke) abzukühlen, bevor es zur Hauptschleife bei Block 421 zurückkehrt.
  • Erneut in der Hauptschleife, hat das Programm Block 432 erreicht und entscheidet die Temperatur abzufragen (Block 464), weil RZeit 0 ist. Dieses setzt sich fort bis die erwünschte (TEMPLO) Temperatur erreicht ist, worauf Taste bei Block 466 auf 1 festgesetzt wird. Dieses führt das Programm zurück zur "Status Verändern" Subroutine (Block 510), wo der Status Anzeige inkrementiert wird (auf 3) und RZeit auf TIMELO festgesetzt wird, um den Heizblock (die Heizblöcke während der erwünschte Zeitspanne auf TEMPLO zu halten. Dieses verursacht bei Block 432 das Springen zur Checktime Subroutine (Block 550) um den Zeitnehmer abzufragen. Wie vorhin auch wird, wenn RZeit unterbricht, die Status-Anzeige bei Block 555 inkrementiert (auf 4) , RZeit und Taste werden auf 0 zurückgesetzt und die Anzahl- der-Zyklen-Anzeige wird erneut ausgewertet. Das Programm 200 fährt fort Zyklen auszuführen, wie oben beschrieben, mit Hilfe der Programm-Status 0, 1, 2 und 3, bis CYCLEMAX erreicht wird (z. B. bis die Anzahl-der-Zyklen-Anzeige bei Block 564 auf 9 inkrementiert wird).
  • Wenn die Anzahl-der-Zyklen-Anzeige die maximale Anzahl von Zyklen überschreitet (Block 566), dann überprüft das Programm 200 den Wert von TEMPSUPER in Block 570. Falls dieser 0 ist, wird der Überhitzungs-Teil übersprungen, indem der Programm-Status Anzeige bei Block 574 auf 8 festgesetzt wird. Im dargestellten Beispiel ist der Wert von TEMPSUPER 110°C, worauf der Überhitzungsprozeß des unteren Ringes gestartet wird, durch Festsetzen der Variablen SETTEMP1 gleich 110°C bei Block 572 bevor zur Hauptschleife bei 421 zurückgekehrt wird. SETTEMP1 Ist eine Variable für das Festsetzten der Temperatur von einzig und allein dem unteren Block, während SETTEMP für den oberen Block oder beide Blöcken eingesetzt wurde, wenn Tracking an war.
  • In der Hauptschleife fragt das Programm bei Block 432 erneut die Temperatur ab, weil RZeit 0 ist, und läßt Anfragen bei 438 und 462 aus, um die Anfrage bei 478 zu erreichen, die mit ja beantwortet wird. Das Programm nimmt hier an, dass wenn Tracking aus war, der untere Block bei einer niedrigeren Temperatur ist als der obere Block und Status 4 wird erhalten bis der untere Block die Temperatur des oberen Blocks erreicht. Wenn die Anfrage bei Block 480 ja ist, wird die Tasten-Anzeige auf 1 festgesetzt, wodurch eine Veränderung des Status über die Blocks 496, 500 und 510 bewirkt wird. Dieses inkrementiert die Status-Anzeige (auf 5) und lädt den TIMELEAD- Wert in die Variable RZeit bei Block 526 und startet den Zeitnehmer erneut bei Block 536, bevor zur Hauptschleife zurückgekehrt wird. Der TIMELERD Wert ist die Zeitspanne in der die Überhitzung des unteren Heizblocks 92 die Überhitzung des oberen Heizblocks 90 anführt. Dieses wird von die beispielhaften 15 Sekunden dargestellt und in 10 von der Zeitspanne zwischen Ts und Tu.
  • Nun zweigt die Hauptschleife bei Block 432 zur Checktime Subroutine ab und stellt fest wann RZeit (= TIMELEAD) unterbricht, worauf das Programm 200 den Status-Anzeige inkrementiert (auf 6). Mit Status -Anzeige = 6 zweigt das Programm bei Block 576 ab, um den Wert von TEMPSUPER2 in die Variable SETTEMPO bei Block 576 aufzuladen und die Überhitzung des oberen Blocks zu ermöglichen. SETTEMPO ist eine Variable die einen Wert für die festgesetzte Temperatur des oberen Blocks alleine hält, zum Unterschied vom unteren Block oder beiden Blöcken (wenn Tracking an ist). Bei der Rückkehr zur Hauptschleife verzweigt das Programm, um die Temperaturen bei Block 432 anzufragen und erreicht die Blocks 484 und 486 um zu überprüfen ob der obere Block die festgesetzte Temperatur (TEMPSUPER2) erreicht hat. Wenn er das hat, dann wird die Tasten-Anzeige bei Block 488 auf 1 geändert um das Programm 200 zur Status -Ändern Subroutine bei Block 510 zu bewegen. Dieses inkrementiert erneut den Programm Status (auf 7), was über Block 528 verursacht, dass die Variable RZeit den Wert von TIMESUPER bei Block 530 annimmt, wie auch den Neustart des Zeitnehmers bei Block 536. Im Beispiel war TIMESUPER 30 Sekunden und stellt die Zeitspanne dar, während der der obere Block auf Überhitzungs-Temperatur gehalten wird. In der Hauptschleife verzweigt sich Block 432 zur Subroutine Checktime und bestimmt wann es RZeit (= TIMESUPER) erlaubt wird, zu unterbrechen. Wenn es das macht, inkrementiert das Programm 200 die Status-Anzeige (auf 8), setzt die Tasten-Anzeige und RZeit zurück und bewegt sich zu Block 580, wo das Programm die Temperatur-Ausgaben zum oberen und dem unteren Heizring bei Block 582 abschaltet. In der Vorbereitung zum Abkühlen schaltet das Programm bei Block 584 den Ventilator an und setzt die SETTEMP Variablen für beide Heizblöcke auf den Wert von SHUTOFF zurück. Dieser Wert, im Beispiel 50°C, wird so gewählt, dass der Ventilator nicht ununterbrochen funktioniert, im Versuch die Heizblöcke unter Raumtemperatur abzukühlen.
  • Bei der Rückkehr zur Hauptschleife, mit dem Programm Status auf 8 und RZeit auf 0 zurückgesetzt, springt das Programm zu Block 432 um Temperaturen abzufragen. Bei Block 490 ist die Antwort ja, so dass bei Block 492 das Programm die Temperatur des oberen Blocks abfragt, um festzustellen ob er auf die festgesetzte Temperatur von 50°C abgekühlt ist. Wenn er das hat, wird die Tasten-Anzeige bei Block 494 auf 1 gesetzt, wodurch eine Statusveränderung über die Blocks 496, 500, 510 und 512 auf Status 9 verursacht wird. Bei Block 532 verzweigt sich das Programm, um den Ventilator abzuschalten (Block 534) und den Wert von TIMEIMAGE in die Variable RZeit (Block 535) aufzuladen, bevor der Zeitnehmer (Block 536) gestartet wird und zur Hauptschleife zurückgekehrt wird. Wie schon erwähnt, wird der TIMEIMAGE Parameter so gewählt, dass er der Einheit ermöglicht die Entwicklung ihrer Signale abzuschließen bevor der Detektions-Prozess gestartet wird. In der Hauptschleife verzweigt sich Block 432 zur Subroutine Check Time und inkrementiert nach der Zeitabschaltung den Status-Anzeige (auf 10), wodurch das Programm über die Blocks 581 und 583 veranlaßt wird, die Detektions-Prozedera, die weiter unten in Zusammenhang mit den 11A und 11D beschrieben werden, zu beginnen.
  • 7. Videoverarbeitung
  • Das Detektions-System 22, in einem früheren Abschnitt schon beschrieben, verwendet ein Videoverarbeitungs-Programm, wie das in den 11A–11D veranschaulichte Detektions-Programm 600. Wenn das Computer-Steuerungsprogramm den Programm-Status 10 erreicht, dann wird die Steuerung an das Detektions-Programm 600 transferiert. Im allgemeinen verwendet das Detektions-Programm digitale Video-Analysierungs-Techniken, um das Videobild des Detektionsmittels 60 (z. B. Streifen 61) zu analysieren, das von der Kamera 100 des Detektions-Systems 22 generiert wurde. Vorzugsweise verwendet das Videoverarbeitungs-Programm die digitalen Daten, die von Replikat-Fangstellen aufgenommen wurden, um die Genauigkeit und Verläßlichkeit der allgemeinen Amplifikationsreaktion zu verbessern, wie das weiter unten beschrieben wird. Als erstes ist es aber wichtig die Termini, die in der Beschreibung verwendet werden, zu definieren. Jedes Detektionsmittel 60 schließt mindestens. eine Lesezone 68 ein, wie das in den 2A, 2G und 5A–5G gezeigt wird. Die Lesezonen 68 der Vorrichtungen aus den 2A und 5 werden in den 12A und 12B vergrößert dargestellt. Das Detektionsmittel 60 beinhaltet vorzugsweise auch einen Vergleichsbalken und/oder eine Kontrollzone 70.
  • Jede Lesezone 68 enthält vorzugsweise, wie oben erwähnt, multiple Fangstellen 74, mit dem Zweck den Assay zu multiplexieren. Der Multiplex-Aspekt bezieht sich auf die Durchführung eines Assays für einen oder mehrere Analyten gleichzeitig, zum Beispiel, das Testen sowohl auf Chlamydien, wie auch auf Gonococcen, oder die Untersuchung von genetischen Mutationen an multiplen Stellen in einem Gen oder auch in mehreren Genen. Der Multiplex-Aspekt kann sich auch auf den simultanen Assay für einen Analyten zusammen mit einem Reagens als positiv- und/oder negativ-Kontrolle beziehen. Diese multiplen Fangstellen 74 sind als fortlaufende Banden oder Linien in den 2A und 12A dargestellt, und als einediagonale Anordnung von "Flecken" in den 5 und 12B. Sie wurden vorhin auch als diskontinuierliche Banden oder Linien beschrieben, wie das in 2G zu sehen ist.
  • Diese multiplen Fangstellen 74 müssen von dem, was weiter unten als Replikat-Stellen 72 oder Replikat-Zonen beschrieben werden wird, unterschieden werden. Vorzugsweise ist die Fläche jeder einzelnen Fangstelle 74 groß genug um mehrere "Lese-Fenster", die hierin als Replikat-Stellen oder Replikat-Zonen bezeichnet werden, zu tragen. Diese werden in 12A als umrahmte Flächen auf der oberen Fangstelle 74 dargestellt, und als multiple Scan-Linien auf dem Fleck 74 in 12B. In 2G bilden die diskontinuierlichen Banden natürliche Replikat-Zonen, während mit kontinuierlichen Banden die Replikat-Zonen willkürlich von der Lese-Software angelegt werden (siehe Boxen 72 in 12A). Es sollte verstanden werden, dass jede Replikat-Stelle oder Zone einer Fangstelle 74 zusätzliche Daten für jeden Analyten enthält, als ob "Replikat"-Assays für diesen Analyten durchgeführt werden würden. Das Vorhandensein von mehreren Replikat-Stellen ermöglicht das Verwerfen von statistischen "Ausreißern" und erhöht die statistische Sicherheit darüber, dass das Bild der Fangstelle korrekt und getreu ausgewertet wird.
  • Wenden wir uns nun den Eigenschaften der Erfindung bezüglich der Videoverarbeitung zu. Der Computer 26 und das Videoverarbeitungs-Programm detektieren das Vorhandensein von amplifizierter Ziel-Nucleinsäure die auf dem Träger 61 immobilisiert ist. Im allgemeinen detektiert die Kamera 100 ein Bild vom Träger 61 , für gewöhnlich in Übereinstimmung mit einer der in 8 dargestellten Konfigurationen. Dann gibt die Kamera 100 ein Videosignal an die Einzelbilder-Extraktionskarte 116 des Computers 26 aus. Die Einzelbilder-Extraktionskarte 116 digitalisiert ein Video-Einzelbild und speichert die digitalen Werte in RAM 124. Somit sind die digitalen Werte dem Computer zugänglich und können mit Hilfe des Videoverarbeitungs-Programms 600 manipuliert werden. Der Computer 26 verwendet eine 8-bit Grauwertskala mit einer Auflösung von 512 × 484 Pixel. Ein numerischer Wert wird jedem Pixel zugeordnet, so dass eine Null (0) ein schwarzes Bild darstellt und zweihundert fünfundfünfzig (255) ein weißes Bild darstellt. Jeder Wert zwischen 0 und 255 stellt einen bestimmten Grauwert dar. Die digitalisierte Darstellung eines Videosignals kann auf einem Computer Monitor 113 gezeigt und von einem Anwender betrachtet werden.
  • Das Videoverarbeitungs-Programm 600 wird vom Flußdiagramm veranschaulicht, dass in den 11A bis 11D gezeigt wird. Das Flußdiagramm verwendet konventionelle Symbole um die vom Videoverarbeitungs-Programm 600 durchgeführten Hauptfunktionen darzustellen. Das Videoverarbeitungs-Programm 600 hat zwei Hauptabschnitte oder Schleifen. Der erste Abschnitt ist der "Lese"-Abschnitt, der in Block 606 beginnt und der zweite Abschnitt ist der "Assay"-Abschnitt, der in Block 634 beginnt und eine Subroutine des Lese-Abschnitts 606 ist. Der Lese-Abschnitt wird ein Mal für jede Reaktions-/Detektions-Einheit 20 ausgeführt und der Assay-Abschnitt wird ein Mal für jede Fangstelle 74 , die vom Detektionsmittel 60 einer jeden Einheit 20 abgebildet ist, ausgeführt.
  • Das Programm 600 startet in Block 602 und initialisiert einen Positionszähler in Block 604. Der Positionszähler verfolgt die Anzahl der Reaktions- und Detektions-Einheiten in einem bestimmten Stapel. Für die dargestellten Ausführungsformen für annulare Doppelringe beinhalten die Heizringe 90, 92 vierzig "wells" 97, die dazu dienen die Reaktions/Detektions-Einheiten 20 zu fassen. Der Block 608 schaltet den Motor 108 oder 109 zur nächstem Proben-Lese-Position vor. In den Detektionssystemen 22, die einen Spiegel 106 zur Reflexion eines Bildes des Detektionsmittels 60 an die Kameralinse 102 verwenden, würde der Motor 108 auch den Spiegel rotieren, um sukzessive Bilder von jedem Detektionsmittel 60 an die Kamera 110 zu liefern.
  • Die Reaktions-/Detektions-Einheiten 20 sind vorzugsweise mit einem Strichcode versehen (nicht gezeigt), der das Reaktionsprobe 38 und die Einheit 20 identifiziert und Informationen über den in dieser Reaktions-/Detektions-Einheit durchzuführenden Assay enthält. Der Strichcode stellt dem Computer 26 vorzugsweise auch Informationen über die Konfiguration des Detektionsmittels 60 zur Verfügung, wie Informationen über das Vorhandensein, den Standort und die Geometrie (z. B. Banden oder Flecken) der Kontrollzonen 70, Fangstellen 74 und Replikat-Zonen
  • 72. Vorzugsweise gibt es eine limitierte Anzahl solcher Konfigurationen und die Information über die Konfigurationen ist im Compuerspeicher gespeichert, um vom Computer beim Erhalten eines Strichcode-Signals, das mit einer bestimmten Konfiguration verbunden ist, wiedergefunden zu werden. Alternativ, falls nur eine Konfiguration verwendet wird, kann ein einziger Bezugsstrich einen Bezugsrahmen für die Bildanalyse zur Verfügung stellen.
  • Der Cycler 16 und/oder der Computer 26 sind mit einem Code-Lesegerät (nicht gezeigt) zum Ablesen des Strichcodes versehen. Das Programm 600 liest die Information aus dem Strichcode in Block 610 und bestimmt in Block 612 ob der Strichcode erfolgreich abgelesen worden ist. Falls das Lesen nicht erfolgreich war, zeigt das Programm 600 in Block 614 an, dass kein Strichcode für diese Einheit gelesen worden ist. In Systemen, bei denen die Information des Strichcodes zum Lokalisieren der Position und der Anzahl der Fangstellen benötigt wird, wird der Computer, falls der Strichcode nicht erfolgreich gelesen worden ist, nicht wissen wie die bestimmte Einheit 20 zu behandeln ist und es kann kein Ergebnis übertragen werden, so dass sich das Programm 600 zu Block 616 bewegt, welcher das Programm 600 zur Proben- Endroutine bei Block 678. schickt. War das Ablesen erfolgreich, bewegt sich das Programm 600 zu Block 618, in dem die Informationen über die Konfiguration der Zonen verarbeitet werden, in Vorbereitung zum Erstellen und zur Untersuchung des digitalisierten Bildes.
  • Ist das Videobild einmal von der Kamera 100 der Einzelbild-Extraktionskarte 116 zugeführt, wird das Bild bei Block 620 digitalisiert und bei Block 622 nach der Kontrollzone 70 durchsucht. Typischer Weise ist die Kontrollzone eine vorgeschriebene Zone, die normalerweise für jede Reaktionsprobe positiv ist. Im allgemeinen hat die Kontrollzone zwei Funktionen. Erstens zeigt sie dem Anwender an, dass die Amplifikationsreaktion und der Transfer der probe in die Detektionskammer richtig verlaufen ist. Zweitens stellt sie einen Referenzpunkt zur Verfügung, für die Bestimmung des Standortes der Fangstellen, so wie das von der im Strichcode enthaltenen Information definiert ist. In Block 624 fragt das Programm ab, ob die Kontrollzone gefunden wurde. Falls die Antwort auf die Frage bei Block 624 nein ist, zeigt das Programm einen Fehlercode für die aktuelle Probe an und schreitet zu Block 616 fort, der das Programm 600 zur Proben- Endroutine bei Block 678 schickt. Ist die Antwort auf die Frage bei Block 624 ja, dann schreitet das Programm 600 zu Block 628 fort, der das Programm 600 zur Assay-Lese- Routine bei Block 630 schickt.
  • Die Assay-Lese-Routine bewegt sich zu Block 632 und selektiert, mit Hilfe der Information über die Konfiguration der Zonen , die vom Strichcode der Einheit oder einer anderen Eingabe zur Verfügung gestellt wird, die erste Analyt-Zone zur Verarbeitung. Jede Analyt-Zone ist in mehrere Scan-Linien unterteilt, von denen jede mehrere Pixel pro Scan-Linie enthält. Jedem Pixel wurde während der Digitalisierungsprozedur in Block 620 ein numerischer Wert einer Grauwertskala zugeordnet. In Block 636 überprüft das Programm 600 die Scan-Linien in der aktuellen Analyt-Zone und berechnet den Pixel-Durchschnittswert, die Standardabweichung (SD) und die Bereichswerte für jede Scan-Linie in der aktuellen Analyt-Zone.
  • Das Programm 600 bewegt sich dann zu Block 638 und fragt ob irgendeine der Scan-Linien in der aktuellen Analyt-Zone sich statistisch von anderen Scan-Linien in der aktuellen Analyt-Zone unterscheiden. Ist die Antwort auf die Frage in Block 638 nein, dann bewegt sich das Programm zu Block 640 und berichtet ein negatives Ergebnis für die aktuelle Analyt-Zone. Das Programm 600 bewegt sich dann von Block 640 zu Block 642, der das Programm 600 zur nächsten Zonen-Routine bei Block 670 schickt. Ist die Antwort auf die Frage in Block 638 ja, dann hat das Programm für die aktuelle Analyt-Zone ein positives Ergebnis erkannt und bewegt sich zu Block 644.
  • Nennenswert ist, dass eine Scan-Linie, um sich von anderen statistisch zu unterscheiden, eine Signal-Fläche enthalten muß, während die anderen Scan-Linien das nicht müssen. Somit ist ersichtlich, dass die Konfiguration der Fangstellen 74 und der Replikat-Stellen 72 einen gewissen Abstand zwischen den Stellen lassen muß. Dieses wird in den 12A und 12B durch die Abstände 75 dargestellt. In der Konfiguration mit Banden sind die Banden ausreichend weit voneinander placiert, dass einige Scan-Linien den Abstand zwischen den Banden untersuchen werden. In der Konfiguration mit Flecken sollten nebeneinander liegende Flecken durch einen senkrechten Abstand 75 getrennt sein, falls waagerechte Scan-Linien verwendet werden. Ist dieser Abstand 75 nicht vorhanden und haben alle Fangstellen 74 positive Signale ergeben, dann würden alle Scan-Linien ein Signal enthalten und keine würde statistisch verschieden sein.
  • Der Block 644 beginnt eine Normalisierungsprozedur für den Hintergrund, worin das Programm jede Scan-Linie der aktuellen Analyt-Zone klassifiziert, je nachdem ob sie Signale enthält oder nur Hintergrund. Durch die Verwendung der Scan-Linien die allein als Hintergrund klassifiziert worden sind, stellt das Programm 600 dann einen Hintergrund-Gradienten für die aktuelle Analyten-Zone in Block 646 her und verwendet diesen Gradienten um die Varianz in Belichtung und Position zu begründen. Hintergrund-Gradienten können in verschiedenen bekannten Weisen erstellt werden, wie durch Ableitungs- und Reihen/Kolonnen-Analyse, wie das im Fachbereich bekannt ist. In Block 648 führt das Programm Hintergrund-Einstellungen oder -Normalisierungen der Signal-Scan-Linien durch, mit Hilfe der Informationen aus dem Hintergrundgradienten. Die Hintergrundnormalisierung wird traditionell dazu verwendet, um eine Signal-Basislinie zu erstellen und die Interpretation der Daten zu verbessern, und kann auch auf verschiedene andere bekannte Wege ausgeführt werden, wie Subtraktion oder horizontale/vertikale Mittelsubtraktion. Das Programm bewegt sich dann von Block 648 zu Block 650, der das Programm 600 zu Block 652 transferiert.
  • Die Bildverarbeitungs-Subroutine beginnt bei Block 652. In Block 654 verwendet das Programm Konturenverstärkung, um den Umfang der Signalfläche 77 in einer erfolgreichen Replikat-Stelle 72 zu identifizieren. Die Konturenverstärkung ist eine bekannte Technik der digitalen Bildverarbeitung zur Merkmalausblendung und wird hier eingesetzt, um die Konturen oder Umrisse der Signalfläche für jede Replikat-Stelle zu bestimmen. In Block 656 berechnet das Programm die mittlere Abweichung, die Standardabweichung und die Wertebereiche für alle Pixel innerhalb des Umfangs einer jeden Signalfläche der Replikat-Stellen. Die Analyse wird nun auf die Signalflächen der Replikat-Stellen fokussiert.
  • In Block 658 identifiziert das Programm jedes anomale Ergebnis, indem es fragt ob die Statistik irgend einer der Signalflächen in einer Replikat-Stelle sich von der Statistik der Signalflächen anderer Replikat-Stellen 72 signifikant unterscheidet. Ist die Antwort auf diese Frage nein, dann werden alle Replikat-Stellen 72 als gleich angesehen und das Programm 600 berechnet dann bei Block 660 den mittleren Pixelwert der Signalflächen innerhalb aller Replikat-Stellen und speichert diesen Wert als Ergebnis für die aktuelle Analyt-Zone. Von Block 660 bewegt sich das Programm zu Block 662, der das Programm zur nächsten Zonen-Routine bei Block 670 bewegt.
  • Ist die Antwort auf diese Frage in Block 568 ja, dann bewegt sich das Programm 600 zu Block 664, der abweichende Ergebnisse entfernt, welche als "Ausreißer" oder "Flieger" bezeichnet werden. Die abweichenden Ergebnisse können statistisch auf verschiedene Weise definiert werden, einschließlich Ergebnisse die zu weit vom Mittelwert ausfallen, wobei "zu weit" im Sinne der Anzahl der Standardabweichungen definiert wird, oder im Sinne von statistischer Signifikanz innerhalb vorgegebener Vertrauensgrenzen. In Block 666 bestimmt das Programm, ob nach dem Verwerfen der abweichenden oder anomalen Ergebnisse genügend akzeptable Stellen übrigbleiben, um ein zuverlässiges Testergebnis zu erhalten. Es kann jedes von verschiedenen Kriterien verwendet werden, um die in Block 666 bekanntgemachte Bestimmung zu machen. Zum Beispiel könnte das Programm fordern, dass ein festgelegter Prozentsatz (z. B. mindestens 50%) der identifizierten Replikat-Stellen annehmbar sind. Überschreitet die Anzahl der annehmbaren Replikat-Stellen das festgesetzte Minimum, dann fährt das Programm bei Block 660 zur Berechnung des durchschnittlichen Pixel-Wertes der Signalflächen innerhalb der annehmbaren Replikat-Stellen fort und speichert diesen Wert als Ergebnis für die aktuelle Analyt-Zone. Überschreitet die Anzahl der annehmbaren Replikat-Stellen das festgesetzte Minimum nicht, dann fährt das Programm zu Block 668 fort, der die Zufallsergebnis-Anzeige für die aktuelle Analyt-Zone setzt. Mit anderen Worten, das Programm konnte im gescannten Bild nicht genügend zuverlässige Daten finden, um bezüglich des Assay eine klare Schlußfolgerung zu ziehen. Das Programm bewegt sich von Block 668 zu Block 662, der das Programm zur nächsten Zonensubroutine bei Block 670 führt.
  • Das Programm bewegt sich dann zu Block 672 und fragt ob die aktuelle Zone auch die letzte Zone ist. Ist die Antwort auf diese Frage in Block 672 nein, dann wählt das Programm in Block 674 die nächste Analyt-Zone an und bewegt sich dann zu Block 676, der das Programm zur Assay-Schleife bei Block 634 zurückführt. Ist die Antwort auf diese Frage in Block 672 ja, dann ist die Detektion für die aktuelle Reaktions 7 Detektions-Einheit 20 vollständig und das Programm bewegt sich zur Proben-End-Subroutine, die bei Block 678 beginnt.
  • Das Programm 600 speichert alle Proben-Ergebnisse in Block 680 und zeigt dann die Ergebnisse an und/oder druckt sie in Block 682 aus. Alternativ kann das Programm so konfiguriert werden, dass es alle Daten speichert und sie am Ende eines Laufs ausdruckt. Dann wird der Positionszähler in Block 684 inkrementiert und das Programm fragt dann in Block 686 ob die letzte Position abgeschlossen wurde. Ist die Antwort auf diese Frage in Block 686 nein, dann bewegt sich das Programm zu Block 690, der das Programm zur Lese-Schleife bei Block 606 zurückführt. Ist die Antwort auf diese Frage in Block 686 nein, dann endet das Programm bei Block 688.
  • Es sollte verstanden werden, dass die Verwendung von Aspekten dieser Erfindung bezüglich der Video-Abbildung nicht auf das bevorzugte zwei-Etagen-Cycling-Element limitiert ist, und eigentlich gar nicht auf die Analyse von Nucleinsäuren limitiert ist. Im Gegenteil, die Aspekte der Video-Abbildung können bei jeder Form von Assay verwendet werden, einschließlich, beispielsweise, Immunoassays, bei denen ein Signal generiert werden kann, so dass es mit Hilfe eines Kameramittels und vorzugsweise einer Form von elektromagnetischer Beleuchtung vom Hintergrund unterschieden werden kann.
  • 8. Verfahren zur Amplifikation und Detektion von Nucleinsäuren
  • Übereinstimmend mit einem anderen Aspekt der Erfindung werden Verfahren zur Durchführung der Amplifikation und Detektion von Nucleinsäuren zur Verfügung gestellt. So wie in Hintergrund der Erfindung beschrieben, sind im Fachgebiet verschiedene Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuren bekannt. Die in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Amplifikationsreaktionen sind, ohne darauf limitiert zu sein, PCR, LCR, 3SR und SDA. In der vorliegenden Erfindung enthält die Reaktionsprobe der Amplifikationsreaktion im allgemeinen Ziel-Nucleinsäure, mindestens ein enzymatisches Agens, das die Amplifikation induziert, und einen Puffer. Die in der Erfindung erwogenen enzymatischen Agens schließen ein, ohne darauf limitiert zu werden, Ligasen und Polymerasen und Kombinationen davon. Die Reaktionsprobe kann auch Primer oder Sonden enthalten, die weiter unten beschrieben werden. Vorzugsweise werden die Primer oder Sonden in molarem Überschuß, der Menge an Ziel-Nucleinsäure aus die Reaktionsprobe gegenüber, hinzugefügt. Denjenigen mit Erfahrung im Fachgebiet werden mit Leichtigkeit erkennen, dass bestimmte zusätzliche Agenzien verwendet werden können, abhängig von der Art der Amplifikationsreaktion. So zum Beispiel wird die Reaktionsprobe für PCR Amplifikationsreaktionen im allgemeinen auch Nucleotidtriphosphate, dATP, dCTP, dGTP und dTTP enthalten. Die LCR Reaktionsproben enthalten üblicherweise NAD. Die Mengen all solcher Reagenzien in der Reaktionsprobe können, von denjenigen mit Erfahrung im Fachbereich, empirisch bestimmt werden. Weitere Beschreibungen von Beispielen für solche Reaktionsproben für konkrete Amplifikationsreaktionen werden in den Beispielen 4, 9 und 11 dieser Darstellung gegeben.
  • Die zu amplifizierende interessierende Nucleinsäure, die als Ziel-Nucleinsäure bezeichnet wird, kann Deoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA) sein und kann natürlich oder ein synthetisches Analogon, Fragmente und/oder Derivate davon sein. Die Ziel-Nucleinsäure ist vorzugsweise eine natürlich vorkommende virale Nucleinsäure oder DNA prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs.
  • Die Begriffe "Primer" und "Sonde", so wie sie in der vorliegenden Anwendung verwendet werden, beziehen sich im allgemeinen auf ein Oligonucleotid, das in der Lage ist ausreichend gut mit der Ziel-Nucleinsäure zu hybridisieren. Der Ausdruck "Primer" wird typischer Weise in Zusammenhang mit PCR verwendet und der Ausdruck "Sonde" wird typischer Weise in Zusammenhang mit LCR verwendet. Der Ausdruck "Primer/Sonde" wird in der vorliegenden Anmeldung dort verwendet werden, wo allgemeine Diskussionen sowohl für "Primer"- als auch für "Sonde"-Sequenzen ihre Gültigkeit haben.
  • In den Verfahren der Erfindung ist der/die Primer/Sonde vorzugsweise so gewählt, dass er/sie zu verschiedenen Teilen der Ziel-Nucleinsäure komplementär ist. Die Länge der Primer/Sonde wird von verschiedenen Faktoren abhängig sein, einschließlich, aber ohne darauf limitiert zu sein, Temperatur der Amplifikationsreaktion, Quelle des/der Primer/Sonde, Komplexität der Ziel-Nucleinsäure und Art der Amplifikationsreaktion. Vorzugsweise ist jede (r) Primer/Sonde ausreichend lang, um die erwünschte Spezifität zu haben und die Hybridisierung mit zufälligen Sequenzen, die in der Reaktionsprobe vorhanden sein könnten, zu vermeiden. Noch besser ist jede (r) Primer/Sonde etwa 15 bis etwa 100 Basen lang und am besten etwa 15 bis etwa 40 Basen lang.
  • Der/die Primer/Sonde kann chemisch synthetisiert sein, mit Hilfe von im Fachbereich bekannten Verfahren. Vorzugsweise wird der/die Primer/Sonde mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Techniken der Nucleotid-Phosphoramidit- Chemie synthetisiert und/oder mit Instrumenten die von Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) oder Milligen (Bedford, MA) kommerziell erhältlich sind.
  • Die Primer/Sonden n direkt an einen detektierbaren Marker gekoppelt sein, der mit der Hybridisierung nicht interferiert. Alternativ wird ein spezifischer Bindungspaar-Partner an mindestens eine(n) in der Amplifikationsreaktion verwendete(n) Primer/Sonde gekoppelt. Vorzugsweise wird ein spezifischer Bindungspaar-Partner an jeden Primer eines Primerpaares gekoppelt, oder mindestens an zwei Sonden eines Sonden-Sets, die in einer Amplifikationsreaktion verwendet werden. Noch besser sind die so an die Primer eines Primerpaares oder an mindestens zwei Sonden eines Sets von Sonden gekoppelten spezifischen Bindungspaar-Partner, zwei verschiedene spezifische Bindungspaar-Partner. Wie auch weiter unten beschrieben wird, kann ein erster an ein Primerpaar oder ein Sondenset gekoppelter spezifischer Bindungspaar-Partner dazu verwendet werden, ein amplifiziertes Ziel mit einem Reportermolekül, das mit einem detektierbaren Marker konjugiert ist, zu koppeln. Der zweite spezifische Bindungspaar-Partner kann dann verwendet werden, um das markierte amplifizierte Ziel an ein Fangmolekül, das am Träger 61 immobilisiert ist, zu binden. Vorzugsweise reagieren die zwei spezifischen Bindungspaar-Partner nicht miteinander kreuz und regieren mit den markierten Reportermolekülen oder den am Träger 61 immobilisierten Fangmolekülen nicht kreuz.
  • Typischer Weise enthält der spezifische Bindungspaar-Partner ein Antigen, ein Hapten, eine chemische Verbindung oder ein Polynucleotid, das in der Lage ist von einem anderen Molekül, wie ein Antikörper oder ein komplementärer Polynucleotidabscnitt, gebunden zu werden. Der spezifische Bindungspaar-Partner kann auch ein magnetisches Partikel sein. Die von der vorliegenden Erfindung erwogenen spezifischen Bindungspaar-Partner schließen ein, ohne darauf limitiert zu sein, Biotin, T3, Oligonucleotide, Polynucleotide und medikamentöse Verbindungen, wie Theophyllin, Digoxin und Salicylat. Solche spezifischer Bindungspaar-Partner sind im Fachgebiet bekannt und sind kommerziell erhältlich.
  • Die Verfahren zur Bindung oder Kopplung von spezifischen Bindungspaar-Partern an den/die Primer/Sonde sind im Fachgebiet ebenfalls bekannt. So, zum Beispiel, kann der spezifische Bindungspaar-Partner an den/die Primer/Sonde mittels einer kovalenten Bindung oder standardmäßigen Techniken der b-Cyanoethylphosphoramidit Chemie gebunden werden. Enzo Biochemical (New York) und Clontech (Palo Alto, CA) haben ebenfalls Primer/Sonden Markierungstechniken beschrieben und vermarktet. Die verwendeten Verfahren werden sich abhängig von, zum Beispiel, der Art des spezifischen Bindungspaar-Partners und der Position des spezifischen Bindungspaar-Partners in der Primer/Sonden-Sequenz unterscheiden. Der spezifische Bindungspaar-Partner sollte aber mit Hilfe von thermostabilen Mitteln gebunden werden, um jedes Thermocycling in der Amplifikationsreaktion zu überstehen.
  • Um die Amplifikationsreaktion durchzuführen, wird die Reaktionsprobe 38 in die Reaktionskammer 30 plaziert. Weil die Menge an Reaktionsprobe typischerweise klein ist, könnte es von Vorteil sein die Probe 38 in die Reaktionskammer 30 mit Hilfe einer Mikrospitzenpipette (nicht gezeigt) einzuführen, oder die Kammer kurz zu zentrifugieren, um die Probe 38 an den Boden der Kammer zu zwingen. Die Reaktionskammer 30 und die Detektionskammer 32 werden dann eingerastet, um die versiegelte Einheit 20 zu bilden und die Einheit 20 wird in eine Vorrichtung für Thermocycling 16 eingeführt, vorzugsweise in eine Thermocycling-Vorrichtung 16 wie sie in den 6–8 gezeigt wird und hierin beschrieben wird. Die Reaktionsprobe 38 wird dann Temperatur-Bedingungen ausgesetzt, die ausreichen um die in der Reaktionsprobe vorhandene Ziel-Nucleinsäure zu amplifizieren. Bei einigen Amplifikationsreaktionen, wie PCR und LCR, wird die Reaktionsprobe dem Thermocycling unterworfen. Andere Amplifikationsreaktionen aber, wie SDA und 3SR, können isothermische Bedingungen verwenden. Unter den Bedingungen des Thermocycling werden die Reaktionsproben typischer Weise für festgesetzte Zeitspannen einem Temperaturen-Bereich ausgesetzt. Für die LCR wird das Temperatur-Cycling bei zwei verschiedenen Temperaturen durchgeführt. Beispielsweise wird, wie in Beispiel 5 beschrieben, die Reaktionsprobe bei 85°C und 55°C dem Thermocycling unterzogen. Diejenigen mit Erfahrung im Fachgebiet können geeignete Temperaturen, Cycling Dauer und die Anzahl der für die Vervollständigung der Amplifikationsreaktion benötigten Zyklen empirisch bestimmen, ohne übermäßiges Experimentieren. Unter geeigneten Temperatur-Bedingungen und beim Vorhandensein der Ziel-Nucleinsäure in der Reaktionsprobe werden die Primer oder Sonden im Laufe der Amplifikationsreaktion mit der Ziel- Nucleinsäure hybridisieren.
  • Wenn die Amplifikationsreaktion abgeschlossen ist, wird die Reaktionsprobe aus der Reaktionskammer 30 in die Detektionskammer 32 transferiert, so dass die Reaktionsprobe 38 mit dem Träger 61 in Kontakt kommt (5A bis 5E). Während des Transfers der Reaktionsprobe 38 in die Detektionskammer 32 bleibt die Einheit 20 verschlossen. Der Transfer der Probe kann durch verschiedene Mittel stattfinden, so wie die Bildung einer Gasphase oder die Expansion von Fluid oder Treibmittel, die von der erhöhten Temperatur verursacht werden.
  • Vorzugsweise findet der Transfer der Reaktionsprobe 38 in die Detektionskammer 32 durch die Expansion eines Treibmittels 40 am unteren Ende der Reaktionskammer 30 statt. In der bevorzugten Ausführungsform wird die Expansion eines Treibmittels 40 von der über den Computer gesteuerte Erhöhung der Temperatur des unteren Heizelementes 18 (oder nur des Heizelementes 17) über die Schwellentemperatur des Treibmittels verursacht. Konkret weist der Computer. 26 das Heizelement 17 oder 18 an, das zweite longitudinale Segment 35 der Reaktionskammer 30 aufzuheizen, so dass das Treibmittel 40 einer Temperatur oberhalb der Schwellentemperatur des Treibmittels ausgesetzt ist. Typischer Weise wird das Element auf eine Temperatur von über 95°C errhitzt, üblicherweise auf oder über 100°C. Die derart an die Reaktionskammer 30 gelieferte Wärme verursacht die Expansion des Treibmittels und somit den Transfer der Reaktionsprobe hinauf, in Richtung Detektionskammer 32. Die für die Expansion des Treibmittels 40 benötigte Temperatur hängt von der Natur und der Zusammensetzung des Treibmittels ab. Vorzugsweise hat das Treibmittel 40 eine Schwellentemperatur, die oberhalb der Temperatur en) der Amplifikationsreaktion liegt, so dass das Treibmittel 40 nicht im Laufe der Amplifikationsreaktion expandiert.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform enthält eine Region 66 des Trägers 61 mehrere konjugierte Moleküle, die in der Lage sind an einen ersten spezifischen Bindungspaar-Partner , der an das amplifizierte Ziel in der Reaktionsprobe gekoppelt ist, zu binden. Die Konjugatmoleküle werden mit Hilfe von im Fachgebiet bekannten Verfahren auf den Träger 61 aufgetragen. Beispielsweise können Konjugatmoleküle durch punktförmiges Auftragen und Trocknen auf den Träger 61 aufgebracht werden. Vorzugsweise werden die Konjugatmoleküle auf dem Träger 61 in Anwesenheit von metalöslichen Proteinen, wie Casein, getrocknet um den Transport und die Resolubilisierung der Konjugatmoleküle zu unterstützen. Die Konjugatmoleküle können auch mit Hilfe der im U.S. Patent No. 5.120.643 beschriebenen Verfahren, die hier als Referenz einverleibt sind, aufgetragen werden. Die Konjugatmoleküle in Region 66 sind nicht am Träger immobilisiert, sondern sind eher in der Lage, in Anwesenheit der Reaktionsprobe und/oder des wässrigen Lösungsmittels zu solubilisieren und sich durch Kapillarbewegung entlang des Trägers zu bewegen. Die Beispiele von Konjugatkomponenten, die in der Lage sind an die oben beschriebenen Bindungspaar-Partner zu binden, schließen, ohne darauf limitiert zu sein, folgendes ein: Antibiotin Antikörper, Antithoephyllin Antikörper, Avidin, Kohlenhydrate, Lektine, komplementäre Oligonucleotid- oder Polynucleotid-Abschnitte, Streptavidin und Protein A.
  • Die so auf den Träger deponierten Konjugatmoleküle werden mit einem Marker konjugiert. Der Ausdruck "Marker", wie er in dieser Anmeldung verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das zum Produzieren eines detektierbaren Signals verwendet werden kann. Das Signal sollte visuell detektierbar sein, optisch oder nach Anregung durch eine externe Lichtquelle. Geeignete Marker sind im Fachgebiet bekannt und schließen Latex, farbige Latexpartikel und kolloidale Metalle, wie Gold oder Selenium, ein. Alternativ kann der Marker ein fluoreszentes Molekül, wie Fluorescein, Rhodamin, Acrdinorange oder Texasrot sein. Zusätzliche Marker, die in der Erfindung verwendet werden können, werden im U.S. Patent No. 4.166.105; U.S. Patent Nr. 4,452,886; U.S.Patent Nr.4,954,452; und U.S.Patent Nr.5,120,643 beschrieben. Solche Marker können an die Reportermoleküle gekoppelt oder gebunden sein, entsprechend der im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren. [Siehe zum Beispiel U.S.Patent-Nr. 5,120,643; U.S.Patent Nr. 4,313,734].
  • Beim Kontakt der Reaktionsprobe mit der ersten Region 66 des Trägers 61, der wie oben beschrieben modifiziert ist, bindet die an einen spezifischen Bindungspaar-Partner gekoppelte amplifizierte Ziel-Nucleinsäure an die markierten Reportermoleküle. Außerdem werden die Reportermoleküle auf dem Träger solubilisiert und werden mit der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure der Reaktionsprobe mobilisiert. Wie schon erwähnt wurde, muß das Konjugat nicht am Streifen vorhanden sein und wird gar nicht gebraucht, falls ein detektierbarer Marker direkt an den/die Primer/Sonde gebunden ist.
  • Die Reaktionsprobe wird, zusammen mit dem markierten amplifizierten Ziel, durch Kapillarbewegung zu einer zweiten Region 68 des Trägers 61 transportiert. Die zweite Region 68 des Trägers 61 enthält vorzugsweise mehrere Fangmoleküle (Fangstellen 74), die in der Lage sind einen zweiten spezifischen Bindungspaar-Partner, der an die amplifizierten Ziel-Nucleinsäure gekoppelt ist, zu binden. Wenn der zweite an das amplifizierte Ziel gebundene spezifische Bindungspaar-Partner ein magnetisches Partikel ist, dann. sollte(n) das (die) Fangmolekül(e) so ausgesucht werden, dass sie in der Lage sind das amplifizierte Ziel durch magnetische Anziehung zu fangen und zu immobilisieren. All diese Fangmoleküle sind auf dem Träger 61 immobilisiert. Die Verfahren zur Immobilisierung der Fangmoleküle am Träger 61 sind im Fachgebiet bekannt und schließen folgendes ein: Adsorption, Absorption und kovalente Bindung, wie auch die im U.S. Patent No. 5.120.643 beschriebenen Verfahren. Die Menge der auf dem Träger 61 immobilisierten Fangmoleküle wird unterschiedlich sein, in Abhängigkeit von, beispielsweise, der Bindungsaffinität für den spezifischen Bindungspaar-Partner. Vorzugsweise ist die Konzentration der auf dem Träger 61 immobilisierten Fangmoleküle dem amplifizierten Ziel gegenüber in molarem Überschuß.
  • Vorzugsweise ist die Mehrzahl der Fangmoleküle am Träger 61 immobilisiert, an von vornherein bestimmten Standorten oder Zonen (Fangstellen 74) am Träger 61. Die Fangmoleküle können in jeder erwünschten geometrischer Form oder Konfiguration immobilisiert werden, wie diagonale, senkrechte oder waagerechte Konfiguration, oder in Form von Kreisen oder Balken. Es ist besser alle Kreise oder Balken räumlich zu trennen, damit die Ergebnisse der Amplifikationsreaktion entsprechend detektiert und aufgelöst werden können.
  • Wenn die Reaktionsprobe und das markierte amplifizierte Ziel mit der zweiten Region 68 des Trägers 61 in Kontakt kommt, dann wird die markierte amplifizierte Ziel-Nucleinsäure der Reaktionsprobe 38 an die immobilisierten Fangmoleküle (Fangstellen 74) am Träger 61 binden und am Standort immobilisiert werden. Probenkomponenten die kein Fanghapten tragen werden von der zweiten Region 68 zu zusätzlichen Zonen und/oder zum zweiten Ende 64 des Trägers 61 durch Kapillarbewegung der Reaktionsprobe 38 weggebracht.
  • Außerdem kann der Träger 61 auch eine dritte Region enthalten, die hierin als "Kontroll"-Zone 70 bezeichnet wird. Die Kontroll-Zone 70 ist so modifiziert, dass sie dem Detektionsverfahren einen Kontroll- oder Referenz-Standard zur Verfügung stellt. Vorzugsweise enthält die Kontroll-Zone 70 ein Reagens, das einen detektierbaren Marker an einem im vorhinein bestimmten Standort am Träger 61 abfangen wird. Der Träger 61 kann selbstverständlich zusätzliche Regionen oder Zonen zur Durchführung von weiteren Analysen enthalten. Alternativ, oder zusätzlich, kann der Träger 61 eine(n) Referenz-Fleck oder Zone beinhalten, der/die einen detektierbaren Farbstoff enthält der, obwohl er nicht mit anderen Reagenzien reagiert, ein detektierbares Signal als Rahmen oder Referenz für die automatische Figur durch die Kamera zur Verfügung stellt.
  • Die am Träger 61 immobilisierte markierte amplifizierte Ziel-Nucleinsäure produziert einen sichtbaren Indikator und dieser sichtbare Indikator wird vom Detektionssystem 22 und dem Computer 26 detektiert und analysiert. Der so produzierte sichtbare Indikator ist eine Angabe über das Vorhandensein und die Menge der amplifizierten Ziel-Nucleinsäure in der Reaktionsprobe 38. Falls in der Reaktionsprobe 38 keine amplifizierte Ziel-Nucleinsäure vorhanden ist, wird kein markiertes amplifiziertes Ziel an die immobilisierten Fangmoleküle binden und es wird kein sichtbarer Indikator gemessen. Die Dichte oder die Intensität des Indikators am Träger 61 kann optisch durch jedes Mittel abgelesen werden. Wie hierin für eine Ausführungsform beschrieben wurde, wird das Signal von einem Reflexionsspiegel 106 auf die Linse 102 einer Videokamera reflektiert. Während der Rotation des Spiegels 106 kann jeder Träger 61 in jeder Detektionskammer 32 abgelesen werden.
  • Zusätzlich zu den weiter oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen, zieht die Erfindung alternative Verfahren zur Markierung und Immobilisierung von Ziel-Nucleinsäure in Betracht. So, zum Beispiel, kann der/die Primer/Sonde während der Herstellung an einen detektierbaren Marker gekoppelt werden. Alternativ kann der/die Primer/Sonde während der Herstellung an einen spezifischen Bindungspaar-Partner gekoppelt werden, der ihm/ihr ermöglicht an einen detektierbaren Marker zu binden, der mit einem komplementären spezifischen Bindungspaar-Partner konjugiert ist. Die Bindung des komplementären spezifischen Bindungspaar-Partners kann entweder während oder nach der Amplifikationsreaktion stattfinden. Somit wird in Betracht gezogen, dass amplifizierte Ziel-Nucleinsäure in der Reaktionsprobe an einen detektierbaren Marker gekoppelt werden kann, bevor sie in die Detektionskammer 32 transferiert wird.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird markierte amplifizierte Ziel-Nucleinsäure in der Detektionskammer 32 mittels Mikropartikel-Agglutination detektiert. In dieser Ausführungsform wird ein Primerpaar oder ein Set Sonden während der Herstellung an den gleichen spezifischen Bindungspaar-Partner gekoppelt. Die mit komplementären spezifischen Bindungspaar-Partnern konjugierten Mikropartikel werden dann als Teil des Detektionsmittels 60 eingebaut. Beim Transfer der Reaktionsprobe 38 in die Detektionskammer 32 tritt sie mit dem Detektionsmittel 60 in Kontakt, und das in der Reaktionsprobe 38 vorhandene amplifizierte Ziel bindet an die beschichteten Mikropartikel. Die Mikropartikel agglutinieren auf Grund der Bivalenz des amplifizierten Ziels. Nicht amplifizierte Sonden oder Primer binden nur ein einziges Mikropartikel und werden nicht in der Lage sein die Agglutination auszulösen. Die Agglutination kann dann durch das Detektionssystem 22, wie oben beschrieben, detektiert und analysiert werden.
  • 9. Kits der Erfindung
  • Die Erfindung stellt auch Kits zur Amplifikation und Detektion von Nucleinsäuren zur Verfügung. Die Kits enthalten mehrere Einmalgebrauchs-Reaktionskammern 30, mehrere Einmalgebrauchs-Detektionskammern 32 und Einrastmittel zur abdichtenden Sicherung einer jeden Reaktionskammer 30 mit einer Detektionskammer 32. Jede dieser Einmalgebrauchs-Reaktionskammern 30 enthält einen Träger 61, der für die Immobilisierung von amplifizierter Ziel-Nucleinsäure modifiziert wurde. Das Kit enthält auch einen oder mehrere Behälter in denen sich für die Durchführung von Amplifikationsreaktionen geeignete Agenzien befinden. Für die PCR schließen solche Reagenzien DNA Polymerase, dATP, dCTP, dTTP, dGTP und mindestens zwei Primer, die für eine vorgegebene Ziel-Nucleinsäure spezifisch sind, ein. Für die LCR schließen solche Reagenzien DNA Ligase, NAD und mindestens vier Sonden, die für eine vorgegebene Nucleinsäure spezifisch sind, ein. Die für Reagenzien geeigneten Behälter schließen Flaschen, Glasfläschchen und Reagenzröhrchen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Einmalgebrauchs-Detektionskammern 32 im Kit mit ausgesuchten Reagenzien vorgepackt und mit einer durchstoßbaren Dichtung verschlossen.
  • 10. Beispiele
  • Beispiel 1: Konstruktion von Thermocyclern
    • A. Ein zwei-Ring Thermocycler wurde aus zwei Aluminiumringen mit folgenden Maßen gebaut: 105 mm äußerer Durchmesser, 95 mm innerer Durchmesser und 13 mm Höhe. Der Abstand zwischen den Ringen war 2 mm groß. Jeder Ring enthielt 40 alignierte "wells", zum Halten von Reaktions/Defektions-Einheiten 20, wobei jedes "well" einen Durchmesser von ungefähr 2,3 mm hatte. Die Ringe wurden auf der Innenfläche mit radialen Kühlrippen ausgestattet, wie in 7 gezeigt. An den Außenumfang der oberen und unteren Ringe wurden selbsthaftende Heizstreifen (Minco Products, Minneapolis, MN) angebracht. Die so angebrachten Heizstreifen waren in der Lage etwa 300 Watt Leistung an jeden Ring zu liefern. Die Temperatur der Ringe wurde elektronisch und von der Software gesteuert, wie oben beschrieben. Entlang der Zentralachse der Ringe wurden über den Kühlventilator eine ladungsgekoppelte (CCD) Kamera und ein beweglicher Spiegel eingebaut.
    • B. ein Thermocycler wurde aus einem einzigen anularen Aluminiumring gebaut, mit den Maßen: 105 mm äußerer Durchmesser, 94 mm innerer Durchmesser und 36 mm Höhe. Jeder Ring enthielt 36 alignierte "wells" für Reaktionsröhrchen, wobei jedes "well" einen Durchmesser von 3,5 mm hatte. Der Ring wurde auf der Innenfläche mit radialen Kühlrippen ausgestattet. An den Außenumfang wurde ein selbsthaftender Heizstreifen (Minco Products, Minneapolis, MN) angebracht. Die Temperatur des Ringes wurde von Steuerungselektronik und von der Software gesteuert, wie oben beschrieben. Außerhalb des rings wurde eine CCD Kamera aufgestellt und im Zentrum wurde eine Lichtquelle eingebaut.
    • C. Ein zwei-Etagen Thermocycler wurde aus zwei rechteckigen Aluminiumblöcken gebaut, wobei er folgenden Maßen hatte: 84 mm × 25 mm × 6 mm. Jeder Block enthielt 12 "wells", zum Halten von Reaktions/Detektions-Einheiten 20, wobei jedes "well" einen Durchmesser von ungefähr 0,31 cm hatte. Die Blöcke waren an einer Oberfläche mit Kühlrippen ausgestattet. An die andere Oberfläche wurden selbsthaftende Heizstreifen (Minco Products, Minneapolis, MN) angebracht. Die Temperatur der Blöcke wurde von der Elektronik und von der Software gesteuert, wie oben beschrieben.
  • Beispiel 2: Herstellung der Antikörper-Reagenzien
    • A. Antiserum: Die Antiseren gegen Biotin, Adamantan, Quinolin, Dibenzofuran, Thiophencarbazol und Acridin wurden in Kaninchen gegen jedes mit BSA konjugierte Hapten produziert. Die Details zur Herstellung von Antikörpern gegen Adamantan, Quinolin, Dibenzofuran, Thiophencarbazol und Acridin können im ebenfalls in Besitz befindlichen EP 702 .689, EP 708 .767 und beziehungsweise WO 9320074 gefunden werden.
  • Die monoklonalen Antikörper gegen Fluorescein wurden in Mäusen mit Hilfe von Standardverfahren produziert. Das Antiserum gegen Dansyl war von Mäusen – monoklonal, bezogen von der Universitiy of Pennsylvania (S-T. Fan und F. Karush, Molecular Immunology, 21, 1023–1029 (1984). Die Antisera wurden mit Hilfe eins Durchgangs über Protein A Sepharose® oder Protein G Sepharose® (Pharmacia, Piscataway, NJ) gereinigt und in 0,1 M TRIS pH 7,8, 0,9% NaCl, 0,1% BSA, 1% Sucrose, 1% Isopropanol und eine Spur Phenolrot verdünnt.
    • B. Konjugate: Das kolloidale Selenium wurde nach dem Verfahren von D. A. Yost et al. (U.S. Patent 4.954.452 (1990)) präpariert. Das Kolloid wurde in Wasser verdünnt, um eine optische Dichte von 16 bei 545 nm zu erhalten. Auf 1 ml dieser Suspension wurde 1 μl Anti-Biotin bei einer Konzentration von 1 mg/ml und 60 μl BSA bei einer Konzentration von 100 mg/ml hinzugefügt. Diese Suspension wurde mit Hilfe eines Vortex-Mischers 1 Minute lang gemischt. Ein 0,5 ml Anteil dieser Mischung wurde mit 0,5 ml 40 mM TRIS pH 7,8 , 4% Casein verdünnt und damit ein 10 × 1,25 cm Kissen auf Glasfiberbasis (Lypore 9254, Lydall Inc., Rochester, NY) vollsaugen gelassen. Das Kissen wurde lyophilisiert und in 6 × 6 mm Teile geschnitten.
  • Das Anti-Biotin wurde auch mit Polystyren- uniform gefärbte – blaue Latexpartikel (Bangs Laboratories, Carmel, IN) konjugiert. Die Latexpartikel (380 nm Durchmesser) wurden 1 : 25 in Wasser verdünnt, um 1 ml bei 0,4% Festkörper zu geben und es wurden 10 μl Anti-Biotin bei einer Konzentration von 1 mg/ml hinzugefügt. Die Suspension wurde mit Hilfe eines Vortex-Mischers 45 Sekunden lang gemischt und 5 μl 5%iges Casein in 0,1 M TRIS (pH 7,8) wurden hinzugefügt. Ein 0,5 ml Anteil dieser Mischung wurde mit 0,5 ml 40 mM TRIS (pH 7,8), 4% Casein verdünnt und damit ein 10 × 1,25 cm Kissen (Lypore 254, Lydall Inc., Rochester, NY) vollsaugen gelassen. Das Kissen wurde lyophilisiert.
    • C. Feste Träger: Der Anti-Dansyl-Antikörper (1 mg/ml) wurde auf Nitrocellulose-Blätter (5μm Porengröße, vorgefertigt auf Mylar®, Schleicher and Schuell, Keen, NH) aufgetragen, mit Hilfe einer Motor-angetriebenen Mikrodosierspritze. Zusätzlich wurden Anti-Adamantan, Anti-Acridin , Anti-Quinolin, Anti-Dibenzofuran, Anti-Thiophencarbazol und Anti-Fluoresceinantikörper bei einer Konzentration von 0,5–1 mg/ml auf verschiedene Nitrocellulose Blätter (5μm Porengröße, Schleicher and Schuell, Keen, NH) aufgetragen, durch Reagens-Strahlwurf, wie im U.S. Patent 4.877.745 (Figott) beschrieben, um einen Multiplex-Fangträger zu bilden.
  • Beispiel 3: Herstellung von Detektionskammern
    • A. Rohrförmig: Aus Plexiglasröhrchen von etwa 3 mm Innendurchmesser wurden rohrförmige Detektionskammern gebaut. Die oberen Enden der Detektionskammern wurden verschlossen und in die unteren Enden wurden Innengewinde geschnitten, um mit den in Beispiel 4A, darunter, beschriebenen Mikroröhren-Reaktionskammern mit Gewinde zusammenzupassen.
  • Das Lydall Antibiotin-Konjugat-Kissen von Beispiel 2B wurde am untersten Teil des Antidansyl-Nitrocellulose-Trägers 61 (Beispiel 2C) mit Klebeband fixiert. Der Nitrocellulose-Lydall-Kissen-Träger wurde dann in 3 × 50 mm Streifen geschnitten, die in aus Plexiglasröhrchen von etwa 3 mm Innendurchmesser hergestellten Detektionskammern eingeführt wurden, mit dem Lydall-Kissen-Teil nach unten.
    • B. Rechteckige Kammer mit Reservoir: Die Streifenhalter, die das in 2A–2E gezeigte Design haben, wurden aus Polycarbonat formgepreßt. In die Basis wurde, in die Öffnung die vom Reaktionsröhrchen zum Reservoir führt, ein 6 × 6 mm Teil des Selenium-Antibiotin-Konjugat-Kissens aus Beispiel 2B eingeführt. Ein Multiplex-Fang-Trägerstreifen mit immobilisiertem Antikörper (Beispiel 2C) wurde in den Streifenhalter placiert. Der Deckel wurde an die Basis des Streifenhalters durch Ultraschall angeschweißt, so dass der Streifen mit den Stiften auf seinen Platz fixiert wurde.
  • Beispiel 4: Herstellung der Reaktionskammer
    • A. Die P. C. R. Mikropipetten-Spitzen wurden von Tri-Continent-Scientific, Inc., Grass Valley, CA bezogen und die offenen Spitzen (unteren Teile) wurden durch Heißversiegelung verschlossen. Diese Reaktionskammern waren aus Polypropylen gemacht, hatten ein Volumen von 100 μl und einen Innendurchmesser von 1,8 mm. Die oberen Teile wurden mit einem Gewinde versehen, wie in 13 gezeigt.
    • B. Es wurden handelsübliche Reaktionskammern von Varivest, Inc. Grass Valley, CA bestellt. Diese Kammern waren aus Kapillarröhrchen aus Polypropylen gebaut, und hatten ein Volumen von 100 μl, 3,5 mm AD, 2 mm ID und eine Länge von 3,5 mm. Seltsamer Weise war die Leistung dieser Röhrchen sehr schlecht in Tests, in denen nur die Reaktionsprobe allein als Treibmittel diente, außer die schon versiegelten unteren Enden wurden zuerst geschmolzen, wobei dadurch mutmaßlich Unregelmäßigkeiten in der Oberfläche bei oder nahe dem unteren, geschlossenen Ende eingeführt wurden.
  • Beispiel 5 Herstellung der Reaktionsprobe, J3.11
  • Die Oligonucleotid-Sonden wurden mit Hilfe der Phosphoramidit-Chemie in einem ABI DNA-Synthesizer synthetisiert und wurden mit entweder Biotin- oder Dansyl- Haptenen versehen, wie angegeben. Die Sequenzen (SEQ ID NOS 1, 2, 3 und 4 weiter unten gezeigt) wurden verwendet, um einen Teil des menschlichen Chromosomen 7 zu amplifizieren , der den Polymorphismus J3.11 codiert, der lose mit der Zystofibrose verknüpft ist. (I. Bartels et al., Am. J. Human Genetics, 38 : 280-7 (1986)). Sie alignieren an das Ziel (50 Basen langes synthetisches Ziel: SEQ ID NO.5), wie darunter gezeigt:
    Figure 00720001
  • Um die "doppel-Zonen" ("double-gap") LCR durchzuführen, wie sie in Backman, et al., European Patent Application 439 182 beschrieben wird, enthielten die Reaktionsproben in einem Gesamtvolumen von 100 μl folgende Reagenskonzentrationen: 50 mM EPPS, mit KOH auf pH 7,8 titriert, 20 mM K+; 30 mM MgCl2, 10μm NAD, 1,7 μM dGTP, 9000 Units DNA Ligase von Thermus Thermophilus, 1 Unit DNA Polymerase von Thermus aquaticus; 1 μg Hering Spermium Carrier DNA, 4 × 1012 Kopien (6,7 nMol) von jeder Oligonucleotidsonde (SEQ ID NOS 1, 2, 3 und 4) und 107 Kopien Ziel-DNA (SEQ ID NO.5).
  • Die Reaktionsproben wurden in die Reaktionskammern von Beispiel 4 pipettiert. Die Reaktionskammern wurden dann kurz zentrifugiert, damit die Reaktionsprobe an das untere Ende der Kammer gedrückt wird. Die Reaktionskammern wurden mit den in Beispiel 3A beschriebenen Detektionskammern verschraubt, um geschlossene Reaktions/Detektions-Einheiten 20 zu bilden.
  • Beispiel 6: Amplifikation der DNA und Transfer der Reaktionsprobe aus der Reaktionskammer in die Detektionskammer
  • Die verschlossenen Reaktions/Detektions-Einheiten von Beispiel 5 wurden in einen Schlitz-Ring-Thermocycler eingeführt. (Siehe Beispiel 1A). Der obere und der untere Ring wurden folgendem Temperaturprotokoll unterworfen, um die LCR-Reaktion durchzuführen: 40 Zyklen 82°C, 5 Sekunden lang und 55°C, 60 Sekunden lang. Jeder Zyklus hatte bis zum Abschluß eine Dauer von etwa 2 Minuten, bei einer LCR-Gesamtzeit von etwa 80 Minuten.
  • Nach dem Abschluß des Temperatur-Cycling wurde der untere Ring auf 110°C geheizt und der obere Ring auf 100°C geheizt. Diese Temperaturen wurden 25 Sekunden lang gehalten. Durch thermische Expansion und Verdampfung der Reaktionsprobe in. der Reaktionskammer wurde die Probe aus der Reaktionskammer in die Detektionskammer transferiert, wo die Reaktionsprobe mit dem ersten Ende des Trägers 61, der das markierte Anti-Biotin-Konjugat enthielt, in Kontakt kam. Das markierte Anti-Biotin wurde solubilisiert und die Reaktionsprobe bewegte sich durch Chromatographie den Nitrocellulose Träger 61 entlang (nach oben). In Reaktionsproben die amplifizierte Ziel-DNA enthielten, wurde das Produkt der Amplifikation an die Anti-Dansyl-Fangstellen am Träger 61 gebunden und es wurde eine sichtbare-Farbentwicklung beobachtet. Die Ergebnisse von sechs Reaktionsproben werden in 13 gezeigt. Die drei Proben links enthielten Ziel-DNA und auf dem Detektionsstreifen sind dunkle Flecken sichtbar (siehe Pfeil). Die drei Proben rechts enthielten keine Ziel-DNA und es sind keine Flecken sichtbar.
  • Beispiel 7: Detektions-Imaging
  • Die Detektionskammern aus Beispiel 6 wurden mit einem Flachbett-Scanner (ScanJet C, Hewelett-Packard, Palo Alto, CA) in eine TIFF-Datei gescannt, unter Verwendung folgender Einstellungen: Helligkeit 140 und Kontrast 150. Die TIFF-Datei wurde nach ImageTM (beziehbar von den National Institutes of Health, Research Services Branch, NIH) importiert und die Aufnahmen der entwickelten Banden wurden bezüglich ihrer Pixel-Dichte analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1, weiter unten, eingetragen, wobei die maximale Dichte und die minimale Dichte sich auf die Graustufe des Bildes in unmittelbarer Nachbarschaft der Banden bezieht.
  • TABELLE 1
    Figure 00740001
  • Beispiel B. Videoverarbeitung
  • Eine fotografische Aufnahme, des in Beispiel 6 beschriebenen Produktes der Farbreaktion, wurde mit Hilfe einer CCD-Kamera erstellt. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit und die Menge der Farbreaktion in den festgelegten Regionen des Trägers 61 wurden durch die Analyse der Graustufen-Datendateien bestimmt, die vom Bild generiert wurden, mit Hilfe von Software, die schon vorher in dieser Darstellung beschrieben wurde.
  • Beispiel 9. Alkohol-Treibmittel
  • Die Reaktionsprobe aus Beispiel 5 wird in einem aus einem Mikrospritzengehäuse hergestellten Reaktionsgefäß präpariert, außer dass 2 μl 1-Propanol in das untere Ende der Reaktionskammer eingeführt werden und die Reaktionsprobe derart in die Kammer eingeführt wird, dass die Probe und das 1-Propanol von etwa 2,5 μl Luft getrennt sind. Die Reaktionskammer wird dann verschließbar in die Detektionskammer 32 eingerastet, um eine geschlossene Reaktions/Detektions-Einheit 20 zu bilden, wie in Beispiel 5. Es werden die DNA-Amplifikation und das post-Überhitzungs-Protokoll von Beispiel 6 ausgeführt, außer dass der obere und der untere Ring beide auf 100°C erhitzt werden. Die Verdampfung des 1-Propanols zwingt die Reaktionsprobe nach oben, so dass es mit dem Träger 61 in der Detektionskammer in Berührung kommt. Das Produkt der Farbreaktion auf den Trägerstreifen 61 kann dann von dem in Beispiel 7 oder 8 beschriebenen Figurs-Detektionssystem analysiert werden.
  • Beispiel 10: Einleitung der Expansion des Treibmittels
  • Es wurde die Reaktionsprobe aus Beispiel 5 präpariert, mit der Ausnahme, dass einige Glas-Mikrokügelchen (durchschnittlicher Durchmesser 0,2 mm) (Homogenizing beads, Virtis Corporation, Gardiner, NY) hinzugefügt wurden. Dann wurden die in den Beispielen 6 und 7 beschriebenen Schritte durchgeführt. Die Glaskügelchen verhalten sich als Keime für die Einleitung und Lokalisation des Kochens am unteren Ende der Reaktionskammer und der so generierte Dampf dient dem Transfer der Reaktionsprobe in die Detektionskammer. Die Produkte der Farbreaktion auf dem Trägerstreifen 61 wurden dann vom Figurs-Detektionssystem analysiert, nach der in Beispiel 7 beschriebenen Prozedur.
  • Beispiel 11 Herstellung der Reaktionsprobe, β-Globin
  • Mit Hilfe der Phosphoramidit-Chemie wurden auf einem ABI DNA Synthesizer Oligonucleotid-Sonden (SEQ.ID Nos. 6, 7, 8 und 9) synthetisiert, die mit dem humanen β-Globin Gen hybridisieren, und sie wurden an Haptene, wie Biotin oder Adamantan, wie gezeigt gekoppelt.
  • Figure 00760001
  • Um das in der Europäischen Patentanmeldung 0 439 182 (1991) von Backman et al. beschriebene, sogenannte "double-gap" Verfahren durchzuführen, enthielten die Reaktionsproben folgende Endkonzentrationen, in einem Gesamtvolumen von 100 μl. 50 mM EPPS pH 7,8, mit KOH titriertes KCl, um einen pH von pH 7,8 zu erreichen und 20 mM K+, 30 m MgCl2, 10 μM NAD , 1,7 μM dGTP, 9000 Einheiten DNA Ligase (von Thermus thermophilus), 1 Einheit DNA Polymerase (von Thermus aquaticus) und 1 × 1012 Kopien (1,7 pMol) von jedem Oligonucleotid ((SEQ.ID Nos. 6, 7, 8 und 9). Die Ziele waren 250 ng humane Plazenta-DNA (etwa 105 Kopien), die entweder SEQ.ID NO. 10 oder Wasser enthalten. Die Reaktionsmischungen wurden, dem Beispiel 4B entsprechend, in 100 μl Reaktionskammern einpipettiert, deren Boden geschmolzen und abgekühlt worden war. Die Reaktionskammern wurden kurz zentrifugiert um die Reaktionsmischung auf den Boden des Röhrchens zu bringen. Die Reaktionsröhrchen wurden mit den Detektionseinheiten von Beispiel 3B verschlossen, um versiegelte Reaktions/Detektions-Einheiten zu bilden.
  • Beispiel 12: Amplifikation von DNA und Transfer der Reaktionsprobe aus der Reaktionskammer in die Detektionskammer
  • Die zusammengesetzten Reaktions/Detektions-Einheiten aus Beispiel 11 wurden in den Thermocycler aus Beispiel 1B eingesetzt und, um die LCR Reaktion durchzuführen, folgender Temperatursequenz unterzogen: 35 Zyklen bei 88°C, 10 Sekunden lang und 53°C, 60 Sekunden lang. Jeder Zyklus dauerte ungefähr 2 Minuten, bei einer Gesamtdauer der LCR von etwa 80 Minuten. Nach dem Beenden der Amplifikationszyklen wurde der Ring auf 104°C erhitzt. Diese Temperatur wurde 25 Sekunden lang gehalten. Aufgrund der thermischen Expansion und der Verdampfung der Reaktionsmischung wurde die flüssige Probe aus jedem Reaktionselement in das daran fixierte Detektionselement geschleudert, worin die amplifizierte Probe in das trockene, Anti-Biotin-Konjugat enthaltende Kissen eindrang. Der markierte Antikörper im Kissen wurde solubilisiert und die Mischung begab sich mittels Chromatographie weiter, den Nitrocellulosestreifen entlang. Befand sich der richtige DNA-Abschnitt in der Probe, wurde das resultierte Amplifikationsprodukt an der Anti-Adamantan-Fangstelle zurückgehalten und es konnte eine sichtbare Farbentwicklung wahrgenommen werden. Es wurde an keinem anderen Antikörper-Standort Farbe gesehen. Die Reaktionseinheiten werden in 14 gezeigt.
  • Beispiel 13: Videoverarbeitung
  • Die Reaktions/Detektions-Einheiten von den Beispielen 11 und 12 werden entsprechend den Beispielen 7 und 8 abgebildet und verarbeitet.
  • Beispiel 14: Multiplex-Träger
  • Die Trägerstreifen 61 wurden wie in Beispiel 3B hergestellt, mit einer Vielfalt an Antikörper-Bindungsstellen, wobei jeder Antikörper für ein anderes Hapten spezifisch war. Die Streifen enthalten auch Biotin-markiertes Ovalbumin an einem spezifischen Standort am Träger. Das Biotin-markierte Protein dient als Kontrolle oder Referenz-Standard.
  • Beispiel 15: Multiplex-Detektion
  • Die Oliginucleotid-Sonden werden, wie in Beispiel 5 oder 11 synthetisiert und:
  • Die vier Sonden aus Beispiel 11 hybridisieren mit dem humanen β-Globin Gen. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin-Komponenten, die Ihnen erlauben an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und eine enthält terminales Adamantan, was ihr ermöglicht an Anti-Adamantan zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen. Dieses dient als Positivkontrolle.
  • Vier andere Sonden hybridisieren mit einer in der Natur unbekannten Sequenz. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin- Komponenten, die Ihnen erlauben an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und zwei davon enthalten terminales Dibenzofuran, was ihnen ermöglicht an Anti-Dibenzofuran zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen. Dieses dient als Negativkontrolle.
  • Vier andere Sonden hybridisieren mit dem Teil vom humanen Chromosom 7, der für die DF508 Mutation bei Zystofibrose codiert. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin-Komponenten, die Ihnen ermöglichen an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und zwei davon enthalten terminales Fluorescein, was ihnen ermöglicht an Anti-Fluorescein zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen.
  • Vier andere Sonden hybridisieren mit dem Teil vom humanen Chromosom 7, der für die G551D Mutation bei Zystofibrose codiert. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin-Komponenten, die Ihnen ermöglichen an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und zwei davon enthalten terminales Thiophencarbazol, was ihnen ermöglicht an Anti-Thiophencarbazoh zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen.
  • Vier andere Sonden hybridisieren mit dem Teil vom humanen Chromosom 7, der für die G542X Mutation bei Zystofibrose codiert. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin-Komponenten, die Ihnen ermöglichen an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und zwei davon enthalten terminales Quinolin, was ihnen ermöglicht an Anti-Quinolin zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen.
  • Vier andere Sonden hybridisieren mit dem Teil vom humanen Chromosom 7, der für die W1282X Mutation bei Zystofibrose codiert. Zwei der Sonden enthalten terminale Biotin-Komponenten, die Ihnen ermöglichen an Anti-Biotin-Latex-Konjugat zu binden und zwei davon enthalten terminales Dansyl, was ihnen ermöglicht an Anti-Dansyl zu binden, in einer spezifischen Bindezone am Trägerstreifen.
  • Die DNA-Sequenzabschnitte, die jede dieser Mutationen umgeben, können in der Literatur gefunden werden. Die LCR- Amplifikation wird dann unter den Bedingungen aus den Beispielen 5–6 und 11–2 durchgeführt, die Streifen werden entwickelt und Flecken werden, wie in den Beispielen 7–8, visualisiert.
  • Beispiel 16: Multiplex Videoverarbeitung
  • Die Trägerstreifen 61 werden wie in Beispiel 11 hergestellt, außer dass jeder Antikörper (oder Biotin-markiertes Protein) an drei oder mehr spezifischen Standorten am Streifen vorkommt. Eine Vielfalt an spezifischen Fangstellen 74 oder Bindungsflächen ermöglicht es dem Videoverarbeitungs-Programm 600 die Signale ähnlicher Flecken zu mitteln, womit die Zuverläßlichkeit der Zuordnung eines konkreten Ergebnisses verbessert wird. Zusätzlich können unerwünschte Signale verworfen werden, falls ähnliche Flecken keine Farbe aufweisen.
  • Die Erfindung, für die Schutz begehrt wird, ist durch die angefügten Ansprüche definiert.
  • SEQUENZLISTE
  • Figure 00800001
  • Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001

Claims (20)

  1. Ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Menge eines Analyten in einer Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, welches folgende Schritte umfaßt: – Bereitstellen eines festen Trägers einschließlich einer Vielzahl von Replikat-Einfangstellen, wobei jede Replikatstelle einen Anteil eines Signalbereiches und einen Anteil eines Hintergrundbereiches einschließt und spezifisch ist für den gleichen Analyten; – Bereitstellen an dem Signalbereich jeder Replikatstelle eines Mittels zur Erzeugung eines detektierbaren Signals, das die Anwesenheit oder die Menge an Analyt anzeigt; – Aussetzen des Trägers an die Probe, von der angenommen wird, daß sie den Analyten enthält, wodurch ein detektierbares Signal an jeder Replikatstelle erzeugt wird, falls ein Analyt vorhanden ist; – Erzeugen eines Videobildes des Signalbereichs und des Hintergrundbereiches von jeder Replikat-Einfangstelle; – Erzeugen von digitalen Darstellungen der Videobilder der Signalbereiche und Hintergrundbereiche von der Vielzahl von Replikatstellen und Abspeichern der digitalen Darstellungen in einem Computerspeicher; – Verarbeiten der digitalen Darstellungen der Signalbereiche und Hintergrundbereiche der Replikatstellen, um insgesamt die Anwesenheit oder die Menge des Analyten in der Probe zu beurteilen, worin die Verarbeitung die Normalisierung des Signals gegen die Hintergrundsignalwerte umfaßt.
  2. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Verarbeitung den Vergleich der digitalen Darstellung von mindestens einer Replikatstelle mit der digitalen Darstellung von mindestens einer anderen Replikatstelle umfaßt, um ein verlässlicheres Ergebnis für den Analyten zu liefern.
  3. Das Verfahren von Anspruch 2, worin die Verarbeitung einen Vergleich der digitalen Darstellung von mindestens einer Replikatstelle mit der digitalen Darstellung von mindestens einer weiteren Replikatstelle für den Analyten umfaßt.
  4. Das Verfahren von Anspruch 2, worin der Vergleich das Berechnen der Durchschnitte der digitalen Darstellungen der Replikatstellen umfaßt.
  5. Das Verfahren von Anspruch 4, worin der Vergleich die Berechnung der Standardabweichungen der digitalen Darstellungen der Replikatstellen umfaßt.
  6. Das Verfahren von Anspruch 3, worin der Vergleich die Berechnung der Standardabweichungen der digitalen Darstellungen der Replikatstellen umfaßt.
  7. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die digitale Darstellung eine Vielzahl von Scanlinien und eine Vielzahl von Pixeln für jede der Scanlinien umfaßt.
  8. Das Verfahren von Anspruch 7, welches weiterhin den Schritt Feststellen, ob sich eine der Scanlinien statistisch von einer der anderen Scanlinien unterscheidet, umfaßt.
  9. Das Verfahren von Anspruch 8, worin die digitale Darstellung jedem Pixel einen numerischen Wert zuordnet, und wobei das Feststellen, ob sich eine der Scanlinien statistisch von einer anderen der Scanlinien unterscheidet, durchgeführt wird durch die Berechnung des Pixelmedians und der Standardabweichung für jede Scanlinie, und durch Vergleich der Berechnungen für jede Scanlinie.
  10. Das Verfahren von Anspruch 7, worin die Verarbeitung den Vergleich der Pixelwerte der Signalbereiche für zwei oder mehr der Replikatstellen umfaßt.
  11. Das Verfahren von Anspruch 10, worin der Vergleich die Berechnung des Pixelmedians und der Standardabweichungen für die Signalbereiche von mindestens zwei der Replikatstellen umfaßt.
  12. Das Verfahren von Anspruch 10, das weiterhin den Schritt Bestimmen, ob sich irgendein Signalbereich statistisch von dem Signalbereich anderer Replikatstellen unterscheidet, umfaßt.
  13. Das Verfahren von Anspruch 12, welches weiterhin die Schritte umfaßt Bestimmen, ob der Signalbereich irgendeiner Replikatstelle statistisch annormal ist, und Verwerfen des Pixelmedians und der Standardabweichungsdaten einer solchen annormalen Replikatstelle vor der Bestimmung eines Ergebnisses.
  14. Das Verfahren von Anspruch 1, welches weiterhin den Schritt Verwenden einer Kantenverstärkung, um die Abgrenzungen der Signalbereiche innerhalb der Replikat-Einfangstellen, welche ein nachweisbares Signal besitzen, zu identifizieren, umfaßt.
  15. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Replikat-Signalbereiche in einer kontinuierlichen oder diskontinuierlichen linearen Anordnung konfiguriert sind.
  16. Das Verfahren von Anspruch 1, worin die Replikat-Signalbereiche im wesentlichen in einer kreisförmigen Geometrie angeorndet sind.
  17. Das Verfahren von Anspruch 1, worin der Träger weiterhin optisch kodierte Informationen umfaßt, die die Konfiguration der Stellen der Replikate auf dem Träger betreffen, und die Information in dem Videobild enthalten ist und vor dem Schritt der Erzeugung einer digitalen Darstellung analysiert wird.
  18. Das Verfahren von Anspruch 1, worin der Träger weiterhin eine Kontrollzone auf dem Träger umfaßt, wobei die Kontrollzone ein nachweisbares Signal umfaßt, unabhängig vom Vorhandensein von Analyten, und worin die Kontrollzone in das Videobild eingeschlossen ist, und als Referenzpunkt dient zur Ausrichtung der Vielzahl von Replikat-Stellen.
  19. Das Verfahren von Anspruch 1, worin der Träger weiterhin mindestens zwei Einfangstellen umfaßt, jeweils für einen unterschiedlichen Analyten und jeweils eine Vielzahl von Replikatstellen umfassend, welche spezifisch sind für nur einen der Analyten.
  20. Ein Verfahren zur Analyse der Ergebnisse einer Assayreaktion zur Bestimmung der Anwesenheit oder der Menge eines Analyten, welches die folgenden Schritte umfaßt: – Bereitstellen eines festen Trägers, der eine Vielzahl von Replikat-Einfangstellen einschließt, worin jede Replikatstelle einen Anteil eines Signalbereiches und einen Anteil eines Hintergrundbereiches einschließt, die spezifisch sind für den gleichen Analyten; – Bereitstellen an den Signalbereich jeder Replikatstelle von Mitteln zur Erzeugung eines nachweisbaren Signales, welches hinweisend ist für das Vorhandensein oder die Menge des Analyten; – das Exponieren des Trägers gegenüber einer Reaktionsprobe, von der vermutet wird, daß sie den Analyten enthält, und falls Analyt vorhanden ist, Erzeugung eines nachweisbaren Signals an jeder Replikatstelle; worin das Verfahren zur Analyse der Ergebnisse folgendes umfaßt; – Erzeugen von Videobildern der Signalbereiche und Hintergrundbereiche jeder Replikat-Einfangstelle nach Exposition des Trägers gegenüber der Reaktionsprobe; – Erzeugen von digitalen Darstellungen der Videobilder von den Signalbereichen und von den Hintergrundbereichen jeder Replikatstelle und Speichern der Videodarstellungen in einem Computerspeicher; – Heraussondern von Replikatstellen für welche statistisch signifikante unterschiedliche digitale Darstellungen erzeugt werden durch den Vergleich der digitalen Darstellungen für die Signalbereiche und Hintergrundbereiche von unterschiedlichen Replikatstellen und das Eliminieren signifikant unterschiedlicher digitaler Darstellungen; – Bestimmen der Anwesenheit oder Menge des Analyten durch Analysieren der zurückbleibenden digitalen Darstellungen der Signalbereiche und Hintergrundbereiche, um festzustellen, ob das nachweisbare Signal vorhanden ist.
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