JPH06507496A - 位置決め及び細胞カウントのための光学像形成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 位置決め及び細胞カウントのための光学像形成発明の背景 本発明は広義には、例えば生物検体のような検体を試験するアッセイを実施する ための自動化装置及び方法に係わる。本発明は特に、ドナー由来の組織または血 液のレシピエンドとの適合性を検出する方法を実施するアッセイのための自動化 装置及び方法に係わる。

未知の検体の光学的または電気化学的作用を判定または測定する現在の試験方法 は、多数の医療試験作業において広範囲に使用されている。このような試験にお いては、試料検体を試薬及び他の物質と反応させる。かかる公知の方法には多種 多様なアッセイステップが含まれるが、典型的には、アッセイ作業の間の試料ま たは標識の光学的変化の検出及び測定に依存する。例えば、多数の公知の方法で 単一または複数の波長の蛍光が使用されている。上記及び他のイムノアッセイ方 法は、蛍光偏光イムノアッセイ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｐｏ１ａｒｉｚａ ｔｉｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＦＰＩＡ）、固相凝集、染色細胞形態学、 酵素イムノアッセイ（Ｅ　Ｉ　Ａ）　、化学ルミネセンス及び分光光度アッセイ として公知である。

他の現在使用されているアッセイ方法は、得られた試料を透過光または反射光に 露光することにより行われる。かかるアッセイ作業には、着色濃度を検出するこ と、複数の着色波長の比を検出すること、試料内での偏光を検出すること、所定 の波長における特定の細胞の大きさ及び量、−殺細胞形態または結果の他の光学 特性を決定することが含まれる。次いで、上記作業から得られたデータは、問題 の成分（一種またはそれ以上）の濃度または比を得るために公知の方法において 処理される。しかしながら、これらの方法は完全には受け入れられておらず、通 常はチェックまたは検証として手作業による分析も行われる。

特に重要な１つのアッセイ方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型判定として公知 の作業である。この作業は、ドナー由来の組織、臓器または血液をレシピエンド に適合させることに使用される。このＨＬＡ型判定作業においては、まずヒト細 胞を含む試料中のリンパ球を単離し、次いで種々の抗血清と反応させる。更に、 細胞−血清混合液を補助試薬と一緒にインキュベートする。そのうちの１種は死 滅細胞を染色する１種以上の色素（ｓｔａｉｎｓ）を混合液に加える。次いで、 死滅細胞（溶解細胞）対生体細胞の比を計算することにより反応を評価する。計 算は、顕微鏡を使用し、比を推算することにより行われる。この比を、公知の評 価尺度を使用することにより１〜８の“評点”に変換する。

上記ＨＬＡ型判定法及び他のアッセイ方法においては、常磁性粒子を抗体で被覆 し、次いでその常磁性粒子を分析すべき試料と混合する。常磁性粒子上の抗体は 試料中の特定の細胞に結合する。かかる特定の細胞成分は、試験中の集団内の他 の細胞から磁気分離法を使用して分離することができる。或いは、ナイロンウー ルカラムを使用することにより細胞を分離することもできる。細胞を抗体と反応 させた後、試料混合液に、粒子暴露、試薬暴露、インキュベーション及び洗浄と いった一連の作業を実施する。試料中の細胞は、ＨＬＡアッセイに関して上述し たような１種以上の化学マーカーを用いて染色することもできる。通常は、試料 は熟練者によって手作業で分析される。この手作業分析には通常、抗体と反応し た細胞のおおよその割合を決定する視認分析が含まれる。

上記及び他の入手可能なアッセイ法の大きな欠点は、方法のほとんどのステップ を手作業で行う必要があることである。例えば、かかる方法のほとんどで試料を 手作業で調製する必要がある。更に、分注、混合、洗浄、インキュベーション、 データ収集、評価、及び記録といったステップも手作業で行われる。即ち、はと んどの入手可能なアッセイ法において作業員には多大な時間が要求される。

当業者には明らかなように、上記ステップを手作業で行うことは、誤差が生じる 機会が多（なることからも望ましくない。これは特に、何回も繰り返される作業 に当てはまる。誤差の可能性は、かかる方法の多くが極めて少量の、即ち通常は １μｍ以下の量をピペット添加する必要があることから更に増大される。また、 顕微鏡と鉛筆を使用して多数の反応を評価することも、分析誤差の可能性を増大 する。

更なる欠点は、試験を実施する個人に容認される主観性である。この主観性は、 アッセイごとのみならず、同じアッセイにおいて何回も繰り返される作業におい ても分析は非−質的となり得る。

幾つかの入手可能なＨＬＡアッセイ装置においては個々のステップが自動化され ているが、かかる装置のほとんどのステップは依然として手作業で行われている 。例えば米国特許第４．３１８．８６６号（Ｋａｗａｈａｌａ　ｅｔａｌ、）は 、位相差顕微鏡と、電気信号ピックアップ装置によって検出される信号を生成す るための光学像を使用するＨＬＡ型判定装置を開示している。像は、２値化され 、反応または非反応リンパ球に対応する所定のテンプレートパターンと比較され る。結果の評価は自動化されているが、試料の調製、インキュベーション及び洗 浄は作業員によって手作業で行われねばならない。

更に上記装置は、ＨＬＡ型判定試験の評価をするための専用エレクトロニックハ ードウェアを使用する。以下に詳述するように、試料中の埃または塵といった異 物、試料容器の掻き傷、または例外的に大きい細胞は、信頼性のないまたは誤っ た結果をもたらし得る。実際、このような起こり得る変化に対して設計変更しな ければ、人ならば読取り可能な多くの試料が該装置によっては読取り不可能であ る。

試料を調製する作業員が使用する方法の変更は、装置の大幅な設計変更なくして は信頼性のない結果となり得る。端的に言えば、特に意図されたちの以外のアッ セイを評価するための装置の拡張は困難である上にコストもかかり、各アッセイ に対してハードウェアの大幅な設計変更が必要となる。

米国特許第４，３１８，８６６号に記載のもののような入手可能な自動化装置の 別の大きな欠点は、それらが特定のアッセイ法（例えばＨＬＡ型判定）に対して 設計されていることである。ハードウェアまたはソフトウェアの大幅な設計変更 な（しては、装置が当初は意図されていなかったアッセイを実施することは不可 能である。このような大幅な設計変更は非実用的であり、従って入手可能な装置 の使用は単一タイプのアッセイに制限される。

試料を反応ウェル内に正確に分注することも高精度のアッセイ結果を得るには重 要である。ＨＬＡ型判定においては、分注は通常は手作業で行われる。所定の手 作業にょる分注作業には、０．５μｍ〜１．０μｍの試料を、２．５μｌの鉱油 で覆われた０、５μｌの試薬中に分注することが含まれる（鉱油は試薬の蒸発を 防ぐために使用される）。或いは、作業員の誤差の影響を低減するためにより多 い量が必要である。この分注ステップを行うために作業員は有意な量の時間を費 やし、この時間は、試薬の種類が増加するほど長くなる。また、試薬の多くはか なり高価であるため、量を増加するとコストが増える。更に、作業員は通常ピペ ットの先端を油の底面下で且つ試薬自体の中に挿入する。１つの反応部位から次 の反応部位への持越しを防ぐため、作業員は通常プローブの先端を手作業で拭き 取り、これにも作業員は時間を要すると共に、誤った結果を与える可能性も増大 する。

自動化アッセイ装置及び方法がＨＬ　Ａアッセイ法に使用されるならば、それら は、液体レベルを極めて正確に監視し且つ液体分注機構（例えばピペット）を正 確に制御し得る必要がある。正確な分注機構は、上述のごとく極めて少量の液体 （１μｍ以下）を通常は別の液体を含む容器内に分注する必要があるが故に、Ｉ −Ｉ　Ｌ　Ａ型判定においては特に重要である。幾つかの自動化液体分注装置が 現在入手可能であるが、それらは、ＨＬＡ型判定のようなアッセイにおいて試料 を分注するのに完全には適していない。使用可能な自動化液体分注装置は一般に 、容器内の液体レベルを検出し、次いで、液体表面に関する分注プローブの位置 を決定することにより動作する。次いでこの情報が、プローブ先端が試料容器内 の液体中に入った時点を決定するために使用される。液体表面が検出され、プロ ーブが流体中にあると判断されると、流体が容器中に分注されたりまたは容器か ら吸引され得る。液体分注装置の精度は一部には液体レベル検出の精度に依存す る。

ＨＬＡ型判定アッセイにおいて入手可能な液体レベル検出及び流体分注装置の使 用可能性の制限は、ピペット添加プローブが試料容器内を液体に向かって動（と きに液体表面を検出するキャパシタンス法を使用することに起因する。

試薬を覆っている油の誘電率は低いので、このようなキャパシタンスまたはコン ダクタンス装置においては１μｌより少ない量の液体を分注することは複雑とな る。油の誘電率は空気の誘電率の２倍にしかすぎず、このことでほとんどのキャ パシタンス検出法は、油表面を検出することにおいては信頼性のないものとなっ ている。更に油の抵抗率は高いために、入手可能なコンダクタンス法は正確には 使用され得ない。

入手可能な容量性タイプの分注装置は、試料小滴が分注プローブ上に形成された 時点または試料小滴がプローブ先端から離脱または解放された時点を決定する手 段を持たない。これらの事象の一方または両方の発生を検出し得ることは、分注 装置の精度及び信頼性を向上するために使用され得る重要な情報である。

従って、極めて少量の液体（１μｍ以下）を検出し得ると共に低誘電率を有する 液体のレベルをも検出し得る、液体レベル検出及び液体分注装置を得ることが望 まれる。

有意な改善が必要である別のアッセイ試験分野は、反応をカウントするために使 用される像処理の分野である。ある種のＨＬＡ読取り装置においては既に光電子 増倍管が使用されているが、それらは欠点がないわけではなく、市場で容易には 受け入れられていない。かかる読取り装置は、各波長において反応部位からの全 光出力を測定するための蛍光デンシトメータとして光電子増倍管を使用する。こ れは理想的な試料には容認し得るが、埃、塵もしくは他の干渉性物質のごとき汚 染物質または掻き傷のごとき他の異常が反応部位にある場合には重要な誤差を生 み出し得る。この方法は、反応部位にある物体の特性、例えば粒子の形状または 大きさを決定し得ないことから誤りを生じる。従って、撮像装置の視野内で特性 を区別する優れた能力を有する装置が必要である。所望の選択性を与えるために より高い倍率及び選択マスク法が光電子増倍管に対して開発され得るが、そのよ うな装置のコスト、信頼性及び処理能力からそれは非実用的となろう。更に、そ のような装置・は作業員が見慣れた像を生成することはなく、従って、装置が生 成した結果を確認するために熟練者が像を評価することができない。

従って、上記事柄を鑑み、本発明の第１の目的は、血清、結晶または細胞成分、 及び他の非生物試料を含む試験検体の定性的、定量的または形態的分析を自動処 理するための装置及び方法を提供することである。

本発明の別の目的は、自動細胞分離、自動試料処理及び自動結果読取りを含む、 ＨＬＡ型判定を実施するための自動化装置を提供することである。

本発明の更に別の目的は、分析すべき検体がその上に置かれ、次いで自動化装置 によって分析される、使い捨てまたは再使用可能なカートリッジにおいてアッセ イを実施するための装置及び方法を提供することである。

本発明の更に別の目的は、極めて少量の液体分注を制御し、比較的低い誘電率を 有する液体でさえその液体レベルを正確に決定し、且つ小滴形成及び離脱を判定 し得る、液体分注及び液体レベル検出系を備えた分析装置を提供することである 。

本発明の更に別の目的は、誘電率が異なる液体間の界面を検出し得る検出系を提 供することである。

本発明の更に別に目的は、データの自動寸法測定及びカウントのための、強力で 、コスト効率がよく、効果的な像処理を有する分析装置を提供することである。

本発明の更に別の目的は、種々のタイプのアッセイを実施するために現場で改良 可能な装置を提供することである。

発明の要約 上記目的及び他の目的を達成するため、本発明は、細胞分離、試料処理、分注及 びアッセイ結果評価を含むアッセイ作業に必要なステップを自動化する装置を提 供する。

該装置は、種々の試薬がその上に配置された複数の反応ウェルを有する反応カー トリッジにおいてアッセイを実施する。反応カートリッジの少なくとも１つのウ ェルは、試料を受容するために備えられている。またカートリッジは、試料に結 合するように処理されており且つそれに結合しなかった細胞から分離し得る粒子 （例えば常磁性粒子）を含むためのウェルを含んでいると共に、試料中の特定の 種類の細胞に結合するように処理されている少なくとも１種の蛍光物質を含むウ ェルも備えられている。カートリッジは、プローブを洗浄するように構成された 洗浄域と、液体及び廃液を保持するための溜めとを含む。

本発明の装置は、各反応ウェルにおいて特定の反応が起こったかを示す像を検出 するための光学または像形成装置を含む。本発明装置は更に、液体レベルを検出 するための機構を含む、液体を分注及び吸引するための機構をも含む。

該装置は更に、像形成装置から受け取った情報を分析し、且つその情報を処理し て実施中のアッセイ及びそれらの結果の視覚表示を生成する論理をも含む。該装 置の動作及び像処理を支援するためにマイクロプロセッサが備えられる。

本発明の装置は、各反応ウェルにおいて特定の反応が生じたことを示す像を検出 するための光学または像形成系を含むだけでなく、光学像形成のために反応ウェ ルを正確に自動位置決め及び自動焦点調整する必要もある。反応ウェルの自動位 置決めは、まずウェルの縁部を、次いでウェルの中心を位置決めすることにより 、機内での反応ウェルの位置を判断することにより行われる。ウェルの中心の位 置決めは、種々の断面またはライン状の画素の値を得、断面タイプを総合的に分 析することにより視野内でのウェルの向きを判定し、向きが決定したところでウ ェルの座標を計算することにより行われる。反応ウェルを自動焦点調整すること においては、反応像の最大鮮鋭度の判定は、像を取得し、像の粗さく５ｈｏｒｔ ｎｅｓｓ）を測定し、次いで光学焦点に対するＺ軸の変位を計算し、トレーを新 たな位置まで移動させ、この処理を、ウェルが視野の中央にくるまで繰り返すこ とにより行われる。自動位置決め及び自動焦点調整によって、像を得ることによ り行われる細胞カウントに適した光学像が与えられる。

本発明の別の態様においては、本発明の装置及び方法に使用し得るカートリッジ のための特に新規の構成が与えられる。カートリッジは、種々の試薬がその中に 配置された複数の反応ウェルを含む。カートリッジは更に、単位量の分離用粒子 と、単位量の分析すべき試料を受容するように構成されたウェルと、試料の分析 に使用し得る単位量の染料（例えば蛍光染料）を格納するためのウェルとを含み 得る。またカートリッジは、プローブ洗浄域として使用し得るウェルを含むのが 好ましい。

本発明の別の態様においては、複数の液体レベルを検出するため及び液体を分注 するために特に他に類のない構成が与えられる。液体レベル検出及び液体分注機 構は、流体がそこを通して分注されるプローブを含む。該装置は、プローブによ って小滴が形成された時点及びその小滴がプローブから離脱した時点を検出し得 る手段を含む。発振器が無線周波数信号をプローブの先端に与える。分注プロー ブ及び反応ウェルの下方には、増幅及び分析回路に接続された伝導性エレメント が設置されている。伝導性エレメントは、プローブから無線周波数信号を受取り 、該信号を、プローブがウェル内の液体表面に到達した時点、小滴が形成された 時点及びプローブから離脱した時点、並びにプローブが液体中に挿入された時点 を決定すべく処理する。

本発明の装置は、移植診断のためにＨＬＡ及びＰＲＡ（Ｐａｎｅｌ　Ｃｒｅａｔ ｉｖｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）型判定を実施するように設計されたランダムアクセ ス自動化装置系である。該装置は、試料ウェル（１つまたはそれ以上）と、試薬 ウェル（１つまたはそれ以上）と、反応ウェル（１つまたはそれ以上）と、プロ ーブ洗浄／廃液ウェル（１つまたはそれ以上）とを単一ユニット内に具備する、 使い捨てまたは再使用可能なカートリッジを使用する。構成ウェルの数はアッセ イに応じて変化するが、使い捨てカートリッジの外寸は長さ５．５インチＸ幅３ ．３インチＸ高さ０．５５インチであるのが好ましい。識別のために、人及び機 械が読取り可能なラベル（機械の場合はバーコード）を使い捨てカートリッジに 貼り付けることができる。

図示したように、該装置を構成する主要なサブシステムは、ピペットロボット、 読取りロボット、フルイディックス系、リーダ、ロードステーション、アンロー ドステーション及びインキュベータステーションである。装置機能は、内蔵ＰＣ ベースコンピュータコントローラによって制御される。人とのインターフェース 機能及びデータ管理機能は、外部のＰＣベースヒユーマンインターフェースワー クステーション（ＰＣｂａｓｅｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｗｏｒｋ ｓｔａｔｉｏｎ）によって行われる。

本発明の他の目的、利点及び新規特徴は、一部は以下の説明に記載し、一部は以 下の説明から当業者には明らかになり、また本発明を実現することによっても判 るであろう。

本発明の目的及び利点は、全ての等偏動を含む、特に添付の請求の範囲に指摘し た組合せによって得ることができる。

図面の簡単な説明 図１は、試薬と分析すべき試料とを保持するための本発明のカートリッジの１つ の実施態様である。

図２は、ウェル内の試薬及び小滴を示す、図１に示したカートリッジにある反応 ウェルの１つの実施態様である。

図３は、本発明の分析装置の主要構成部品の実施態様のブロック図である。

図４は、図３に示した装置及び方法の実施態様の概略ブロック平面図である。

図５は、図３及び図４に示したピペットロボット及びイメージロボットに使用さ れ得る、グリッパを含む３軸ロボツトの１つの実施態様である。

図６は、図５に示した３軸ロボツトに使用され得るグリッパの１つの実施態様で ある。

図７は、本発明の液体レベル感知装置の１つの実施態様のブロック図である。

図８は、本発明の液体レベル感知及び分注機構のブロック図である。

図９は、図７及び図８に示した液体レベル感知及び分注機構に使用される増幅回 路の１つの実施態様である。

図１０は、第１の分注方法における本発明の液体レベル検出系からの出力信号を 示すグラフである。

図１１は、図７及び図８に示した液体レベル感知及び分注構成に使用され得る方 形波発振器の１つの実施態様である。

図１２は、本発明の光学または像形成装置の１つの実施態様の概略図である。

図１３は、本発明の像処理構成の１つの実施態様の概略ブロック図である。

図１４は、第２の分注方法における本発明の液体レベル検出系からの出力信号を 示すグラフである。

図１５は、分析装置の主要構成部品を示す、カバーを取り外した本発明の装置の 前方斜視図である。

図１６は、頂部カバーを取り外した図１５の装置の平面図である。

図１７は、本発明の光学装置の別の実施態様の側方断面図である。

図１８は、図３及び図４に示したピペット及びイメージロボットに使用され得る 、グリッパを含む３軸ロボツトの別の実施態様の斜視図である。

図１９は、ＡＢ、ＢＣＳＣＤＳＢＣＳＣＢ及びＤＡの断面をソフトウェア決定す るために機内のウェルの位置を決定するための図である。

図２０は、図１９の座標を再び使用して図１９の像の断面を示す図である。断面 を個々に分析する場合、それは以下の４つのうちのいずれかで表すことができる ：タイプ１−全てが白の画素； タイプ２−全てが黒の画素； タイプ３−１回の遷移； タイプ４−２回の遷移。

図２１は、断面が順序１−３−２−３を有する場合の種々のウェルの向きを示す 図である。

図２２は、順序４−２−２−２におけるウェルの向きを示す図である。

図２３は、順序１−１−３−３の構成を示す図である。

図２４は、断面の順序が２−２−３−３に対応する像を示す図である。

図２５は、ソフトウェアがＸ軸においてウェルの端部部分を検出した像を示す図 である。

図２６は、カートリッジがソフトウェア制御移動された結果、ウェルの縁部位置 がフレームの中央に合わせられたことを示す図である。

図２７は、ウェルが確実にフレームの中央に置かれるような所定の座標に端部位 置を置（べく移動されたウェルを示す。

図２８は、ウェル及びフレームの像上に重ねられた問題の領域を示す図である。

図２９は、問題領域（ｒｅａｇｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｔｅｒｅｓｔ、ＲＯＩ）にお ける典型的なヒストグラム及びしきい値を示すグラフである。

図３０は、ヒストグラム上に設定される理想的なしきい値を示すグラフである。

図３１は、２つの細胞の典型的なグレイスケール分布と異なるしきい値を有する ２つのセルとを示す図である。

図３２は、細胞カウント処理の間に計算された複数のしきい値を示すグラフであ る。

図３３は、強陰性、弱陰性、弱陽性、陽性及び強拍性の反応からできる像Ａ−Ｅ を示す。

図３４の上段のグラフＡ−Ｅは、Ｘ軸を画素位置情報とし、Ｙ軸をグレイスケー ル強度として反応強度を示すグラフであり、図３４の下段は、情報の分類及び評 価の一方法である強度情報の導関数を示すグラフである。

図面を参照すると、図１には、試験すべき試料の分析に使用される試験カートリ ッジ１０の好ましい実施態様が示されている。図１に示した実施態様においては 、カートリッジ１０はＨＬＡ組織型判定に特に適している。この実施態様及び後 述する他の実施態様はＨＬＡ分析用に製造されているが、本発明の装置及び方法 は他のアッセイ法にも使用され得ることは当業者には明らかであろう。

トレーまたはカートリッジ１０は２つの試料ウェル１１ａ及びｌｌｂを含む。第 ２ウエルは、第１試料が満足の行く結果を与えなかった場合に該カートリッジを 使用して２回目の試験を行うための試料を保持する、予備試料ウェルとして使用 することができる。試料カートリッジ１０は更に、常磁性粒子と蛍光染料または 発蛍光団とを格納するために使用される反応ウェル１２をも含む。蛍光染料は、 例えば青色励起・緑色発光波長のものとすることができる。

ウェル１３は補助試薬及び第２の発蛍光団を含む。第２の発蛍光団は緑色励起・ 赤色発光波長のものであるのが好ましい。カートリッジ１０は更に、複数の個々 に独立した洗浄ベイスン１４（図では１０個）を有するプローブ洗浄域を含む。

洗浄ベイスン１４はプローブ洗浄域１５の中央内に廃液する。プローブ洗浄域の 中央にはプロッタ１９を設置することができる。プロッタ１９は、カートリッジ １０を輸送する際のしぶき及び溢れを防ぐべく過剰な流体を吸収する。ブロック １９が廃液を吸収するが故に廃液の廃棄が容易になる。なぜならば、かかる廃液 は今や固体状態であり、カートリッジ１０自体と一緒に廃棄し得るからである。

ブロック材料は、プローブ洗浄域１５内で２軸移動吸収体容器（ｂｉ−ａｘｉａ ｌ　ｔｒａｎｓｏｒｂ　ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を規定するよう選択されるのが好 ましい。

適当なブロック材料は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｆｉｌｔｒｏｎａ　Ｃｏ、（ Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）から入手可能な結合酢酸セルロースである。

図示したように、カートリッジ１０は複数の反応ウェル１６を含む。図１に示し た実施態様においては、カートリッジ１０は、その中央域の両側にそれぞれ７２ 個の反応ウェルを含む。即ち、１つの実施態様において全部で１４４個またはそ れ以上の反応ウェル１６が与えられる。反応カートリッジ１０は更に、反応及び 洗浄流体を吸収するためのプロッタ材料１７を含むこともできる。プロッタ１７ は、ビン２１及びリブ２３によってカートリッジ１０内に保持されている。

こうしてカートリッジ１０は、単位用量の必要な試薬、染料及び分離用粒子と単 位試料用ウェルとが備えられ得る構成を有利に与える。更にこの構成によってア ッセイステップが自動化され得る。

図２を参照すると、カートリッジ１０の反応ウェル１６の好ましい構成が示され ている。各反応ウェルは好ましくは、底部直径０．０２０インチ、頂部直径０． ０９０インチ及び高さ０．０９０インチを有する。反応ウェルは、鉱油非含有の 高級ポリスチレンでできたカートリッジ上に公知の方法、例えば射出成形によっ て形成することができる。

反応ウェル１６の内側表面は、公知のガスプラズマ（またはガスイオン化）処理 法によって、例えば文献”Ｔ　ｒ　ｅ　ａｔｉｎｇ　Ｐｌａｓｔｉｃ　５ｕｒｆ ａｃｅｓ　ＷｉｔｈＣｏｌｄ　Ｇａｓ　Ｐｌａｓｍａｓ”、Ｐ、Ｒｏｓｅｅｔ　 ａｌ、、Ｐｌａｓｔｉｃｓ　Ｅｎｇｒ、、Ｏｃｔ。

１．１９８０　（この文献は参照により本発明の一部を構成するものとする）に 記載の方法によってプラズマ処理されているのが好ましい。図２に示した実施態 様においては、各ウェル１６は、蒸発を防ぐために２．０μｌの油（例えば鉱油 ）で覆われた０、５μｍの抗血清を含む。当業者には認識されるように、ウェル 内の油の量は変えることができる。例えばウェルは２．０〜２．５μｍの油を含 み得る。

図２には更に、油層２４内に分注されている、０．５μｌの試料を含む小滴２５ も示されている。

次に図３及び図４を参照すると、本発明の装置の１つの実施態様の主要構成部品 がブロック図で示されている。該装置は、ロード域３０とスタットロード域３２ とを含む。

スタットロード域３２は、ロード域３０内のものよりも高い優先順位を有するカ ートリッジ１０を保持するために使用され得る。即ち、スタットロード域３２内 にロードされたカートリッジ１０は最初に処理される。図１に示したカートリッ ジ１０はロード域３０またはスタットロード域３２のいずれかに手作業で挿入さ れる。カートリッジ１０は、カートリッジ１０をロボットのグリッパアーム内で 整列または配向する（詳細は後述する）ために使用されるキー１８を含む。ピペ ットロボット３４（詳細は後述する）は、カートリッジ１０をロードまたはスタ ット域から把持したりカートリッジ１０を像取得域４２に移送するグリッパを含 む。像取得域４２は、トレー識別情報、例えばバーコードまたは光学式文字認識 （ＯＣＲ）タイプの情報の像を得るための手段を含み得る。この情報は、分析す べき特定のカートリッジに所望のアッセイを決定すると共に、任意の試料または 患者の識別情報を記録するために使用し得る。

該情報は、後の管理タスクのためにデータベース内に格納され得る。イメージロ ボットは、バーコードが装置によって読み取られ得るように、カートリッジをロ ード域３０またはスタットロード域３２から像取得域または専用リーグを横切る よう移動させることができる。

該装置は、アッセイ条件が当分野において公知の方法で同定された後に所望のア ッセイを完了するのに必要な作業を計画するマイクロコンピュータ及び電子回路 ４４を含む。

また該装置は、情報をマイクロコンピュータのメモリ内に手作業で入力したり、 かかる情報を直列通信インターフェースを介してダウンロードしたり、またはか かる情報を着脱可能な磁気装置から読み取ったりするために作業員が使用し得る ユーザインターフェース４８を含むのが好ましい。

図４に示したように、該装置は更に緩衝液用容器５２、電源４１、試料ポンプ５ ０を含み、また必要によっては洗浄ポンプ５４を含むことができる。

図３及び図４に示した装置または機器は、図１５及び図１６に作動機器としてよ り明確に示されている。図１５及び図１６は、図３及び図４に表わされた主要構 成部品を有する装置を示す。前方斜視図である図１５及び平面図である図１６は いずれもカバーが取り外された状態で表されており、従って図３及び図４に単純 なブロック図で表わされたものよりも実際の動作関係において構成部品を見るこ とができる。

ピペットロボット３４及びイメージロボット４０は任意の適当な３軸ロボツトと することができる。図５及び図１８は、現在使用されている２種類の実施態様の 図である。

３軸ロボツトは、グリッパアーム５６を所望の位置に移動させるためにそれぞれ の並進スクリューと協働する３つのステップモータ２０１．２０２及び２０４を 備えている。

ここではＸ軸における移動アセンブリを簡単に説明するが、Ｙ軸及びＹ軸におけ る移動も同様に行われることは当業者には認識されよう。

Ｘ軸移動アセンブリは、ロボットの残りのアセンブリを支持しているプラットホ ーム２０３を並進移動させるための並進スクリュー２０８に連結されているステ ップモータ２０４を含む。Ｘ方向での並進移動を安定化するために、案内レール ２１０及び協働直線形軸受け２０６が備えられている。Ｘ方向での位置を決定す ると共に並進移動を制御するために、スイッチ２１２が備えられている。

１つの実施態様においては、Ｘ軸及びＹ軸の正常作動行程は７．７５インチであ り、Ｙ軸の作動行程は９．２５インチである。各軸は、全行程にわたって最低精 度子／−０゜００３インチで位置決めし得ることが好ましい。組立て後の３軸ロ ボツトは、各軸の全行程にわたって最低精度子／−０，００５インチで位置決め し得ることが好ましい。各軸において、ｏ、ｏｏｉインチ／１．８°ステップ送 り（２００ステップ／回転）の最小分解能であるのが好ましい。

各軸は、２００ステップ／回転、４位相、８ワイヤステツプモータによって駆動 される。各軸は、最高速度５．０インチ／秒で並進し得、且つ、各軸で５０．０ インチ／秒／秒の並進加速及び各軸で５０．０インチ／秒／秒の最高並進減速が 可能である。各ステップモータは、螺旋ばねタイプのゼロバックラッシカップリ ングを介してまたは直接連結によって対応並進スクリューに連結されている。Ｘ 軸は各走行端部に位置センサを有し、Ｙ軸及びＺ軸はモータ側走行端部に位置セ ンサを有する。

適当な３軸ロボツトは販売元から入手可能であり、その−例としては、ＤＡＥＤ ＡＬ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ　Ｃ１ｔＶ、ＰＡ）製のＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、１０５０７ ３Ｐ−２０Ｅを挙げることができる。

図示したように、３軸ロボット３４．４０はグリッパアーム５６を含む。図６を 参照すると、グリッパアーム５６はベース部材５８を含んでおり、このベース部 材５８によってそれぞれのロボットに取り付けらいる。ベース部材５８は更に斜 行部材５９に連結されており、部材５９は更にジョーアセンブリに連結されてい る。

グリッパジョーアセンブリは、固定ジョー６０とばね荷重ジョー６２とを含む。

グリッパアーム５６は、ジョー６０及び６２がベースアーム５８の軸と垂直に配 置されるように構成されている。ジョー６０及び６２の各把持端部は、カートリ ッジ１０の把持を容易にするような角度が与えられている。

グリッパジョー６０及び６２上にはそれぞれノツチ６４及び６６が設けられてい る。ノツチ６４及び６６は、カートリッジ１０を把持し且つ整列すべくカートリ ッジｌｏ上のリブ２７を咬合するのが有利である。

把持動作の際、カートリッジはグリッパジョー６０及び６２の間で中央合わせさ れる。アーム５６がＹ軸に沿ってカートリッジ１０に向かって動かされると、リ ブ２７がグリッパジョー６０及び６２の各々の内側表面と関係し、それによって ばね荷重グリッパ６２は僅かに開かれる。グリッパアーム５６はＹ方向でカート リッジ１０に向かって、リブ２７がノツチ６４及び６６と咬合するまで前進され る。

リブ２７がノツチ６４及び６６内に移動すると、ばね荷重グリッパジョー６２は その非偏倚位置に戻る。

ばね荷重グリッパジ１−６２の整列を検出するためにセンサ６８が備えられるの が有利である。センサ６８は、カートリッジ１０が挿入されたときにグリッパジ ａ　６２が非偏倚位置にあるかどうかを判断する。これによって、更なる処理を 行う前にカートリッジ１０がグリッパアーム内に適正に位置決めされたか否かを 検出する構成が与えられる。適当な検出器は、０ＰＴＥＫ　（ＣａｒｌｓｏｎＳ Ｔｅｘａｓ）から市販されているような、Ｍｏｄｅｌ　Ｎｏ。

０ＰＢ９９０Ｐ５１で販売されているスロット式光学スイッチである。

カートリッジ１０をグリッパジョーアセンブリから解放するためには、カートリ ッジ１０は、グリッパジョーアセンブリから下向きに延伸するリップ部分を含む 。リップ部分（図示なし）は、カートリッジ１０の一方の側縁、例えば矢印２０ で示した側から下向きに延伸するリップであり得る。このリップ部分は、グリッ パアーム５６がカートリッジ１０からＹ軸に沿って遠ざかるとき固定突出縁（図 示なし）と関係するように構成されており、突出縁とリップ部分とは、カートリ ッジ１０をグリッパジョーアセンブリから解放すべく協働する。

次いでカートリッジ１０は閉ループピペット域３６に移送され、そこで、予め格 納されているアッセイに関する情報（詳細は後述する）に基づいて吸引、混合、 分注、洗浄及び／または粒子分離作業が実施される。ピペット域は、粒子分離及 び洗浄作業の間反応ウェル１６の側部近傍または下方に配置される磁石を含むの が好ましい。

次いで、イメージロボット４０またはピペットロボット３４がカートリッジをイ ンキュベーショントランスファー域３８内に置く。カートリッジ１０はインキュ ベーション域３８内に、必要な反応が起こるのに十分な所定のインキュベーショ ン時間保持される。インキュベーション域３０は、装置のピペットロボット３４ 側及びイメージロボット４０側の両方からアクセス可能であるのが好ましい。ピ ペットロボット３４がカートリッジ１０をインキュベーション域３８内に移動さ せた後には、ピペットロボット３４は別のカートリッジの処理を開始すべく自由 となる。ロボット３４及び４０は、必要な回数だけ、また各アッセイの予め格納 されている条件によって指示されるままに、カートリッジ１０をインキュベーシ ョン域３８からピペット域３６または他の作業域に戻し得るランダムアクセス能 力を有する。

特定のカートリッジ１０に対して全てのピペット添加及びインキュベーション域 での作業が完了したら、イメージロボット４０はカートリッジをインキュベーシ ョン／トランスファー域３８から把持する。次いでイメージロボット４０はカー トリッジ１０を像取得域４２に移送し、そこで像情報が測定され、マイクロコン ピュータ及び電子回路４４（詳細は後述する）によって更に信号処理するために 電気情報に変換される。特定のカートリッジ１０に対して必要な全ての像が取得 されたならば、イメージロボット４０はカートリッジ１０をアンロード域４６に 移送する。

ピペットロボット３４及びイメージロボット４０は相互に独立に動作し、それに よりカートリッジ１０の並行処理を可能とするのが好ましい。

上述の装置は、移植診断分野において必要とされるＨＬＡ及びＰＲＡアッセイを 実施するよう設計されているが、該装置は、他の試験態様を包含し得る極めて融 通性のある自動化ピペット添加装置及びリーダであることが理解される。該装置 の有益性の幾つかを以下に記述する。

多くの別の使い捨てカートリッジ構成を採用することができる。長さ５．５イン チＸ幅３．３インチ×高さ０．５５インチの外寸を有するカートリッジにおいて 、試料ウェル、反応ウェル、混合ウェル、洗浄ウェル及び試薬ウェルを種々の寸 法及び組合せで使い捨てカートリッジに組み込むことができる。実際には唯一の 制限は、使い捨てカートリッジは底部から読取り可能であると共に、上部または 底部のいずれかから照射される必要があることである。

アッセイの通信規約及び手順は、変更することもできるし、混成することもでき る。即ち、任意の数のピペットステップ、インキュベーションステップ及び読取 りステップを任意の順序で行うことができる。インキュベーションステップの継 続時間を変えることもできる。アッセイ通信規約を混成する上での１つの制約は 、処理能力が通常は悪影響を受けることである。

ピペット添加量の範囲は広い。これまでの試験では１回当たり０．５μｍから５ ０μｍ以上が分注されている。０゜５μｍの分注に必要とされる分注プローブの 直径は小さいために（０，０１０インチ）、１００μｍ以上の分注に過剰な時間 を要する。この制約は、分注プローブを、分注する容量に最適な直径のプローブ と置き換えることにより解消され得る。装置上で混合する手段は、フルイディッ クス吸引／分注によるものかまたは使い捨てカートリッジをロボットによって動 かすことにより混合するものである。

手作業で調製された試料が適当なウェル内に入れられた使い捨てカートリッジは 、装置作業員によってロードステーション内に置かれる。一度に最高１０個まで の使い捨てカートリッジをロードステーション内にロードすることができる。該 ステーションは、ロードステーション内に積み重ねられた使い捨てカートリッジ から、一番下の使い捨てカートリッジを分離すべく作動する。一番下の使い捨て カートリッジを取り出すことにより、使い捨てカートリッジは装置内に置かれた 順番に試験されることが保証される。

ピペットロボットはロードステーションに移動し、使い捨てカートリッジをグリ ッパ内に把持する。使い捨てカートリッジ上のキーが該カートリッジをグリッパ 内で整列させる。グリッパ内に配置されたセンサはコンピュータコントローラに 、使い捨てカートリッジがグリッパ内に適正に配置されたことを示す。そうする とピペットロボットは使い捨てカートリッジをロードステーションから取り出し 、それをバーコードリーダまで移動させる。

バーコードリーダは、固定ＬＥＤリーグである。ピペットロボットは、使い捨て カートリッジの端部に位置するバーコードラベルを走査すべく、使い捨てカート リッジをバーコードリーグを横切って動かす。バーコードラベルがうまく読取れ たならば、コンピュータコントローラは使い捨てカートリッジのタイプを識別し 、その使い捨てカートリッジを処理するのに必要な装置動作を計画する。或いは 、この処理のために像形成系を使用することもできる。

ピペットロボットは、使い捨てカートリッジを装置のピペット添加側全体にわた って移動させ得る３軸リニアロボツトである。ピペットロボットは、ロード、バ ーコードリーダ、フルイディックス及びインキュベータをアクセスし得る。読取 りは通常は読取りロボットを使用して行われるが、必要であればピペットロボッ トはリーダをアクセスすることもできる。ピペットロボットはアンロードをアク セスすることはない。

フルイディックス系は、流体を吸引及び分注し、磁気分離、プローブ洗浄及び液 体レベル感知を実施し得る。作動に際して、分注プローブは固定され、ピペット ロボットは使い捨てカートリッジをプローブまで移動させる。磁気分離のために 磁石を適所に移動させるためにはアクチュエータが使用される。プローブ洗浄は 、使い捨てカートリッジの一部であるプローブ洗浄ウェル内で行われ、全ての廃 液は、使い捨てカートリッジによって装置から排出される。

液体レベル感知は、トランスミッタとして分注プローブを使用すると共に、使い 捨てカートリッジの下方に分注プローブと一列に設置された受信アンテナを有す るＲＦ（無線周波数）系である。場合によっては、液体レベル感知は分注検証に も使用され得る。

インキュベータは加熱され、３４℃＋／−２℃に調整される。最高１０個までの 使い捨てカートリッジを常にインキュベータ内に格納することができる。いずれ かのロボットが使い捨てカートリッジをインキュベータ内に配置したりまたはそ こから回収し得る。

読取りロボットは、グリッパの向きが逆転していることを除いてピペットロボッ トと同一である。読取りロボットは、インキュベータ、リーグ及びアンロードを アクセスし得る。読取りロボットは、ロード、バーコードリーグ及びフルイディ ックスはアクセスしない。

装置上のリーダは実質的に、検出器としてＣＣＤカメラを有する倒立顕微鏡であ る。自動対物レンズターレットによって、読取り中のアッセイに対して４種の倍 率の１つを選択することができる。１倍から１０倍の倍率を試験した。

蛍光フィルタパックと組合せた石英ハロゲンランプによって、蛍光アッセイに使 用される前方照射が得られ、ＬＥＤによって、凝集アッセイのための後方照射が 得られる。自動フィルタターレットによって、蛍光アッセイにおいては６つのフ ィルタパックのうちの１つを選択し、凝集アッセイにおいてはフィルタパックを 使用しないことが可能となる。

各反応ウェルは、像分析の前に自動的に位置決め及び焦点合わせが行われる。Ｈ ＬＡアッセイにおける像分析は、染色された白血球の蛍光像をＣＣＤカメラ上に 形成することを含む。各機において細胞をカウントし且つ寸法測定するために、 像分析アルゴリズムが使用される。凝集アッセイにおいては、反応ウェル底部の 凝集パターンの像をＣＣＤカメラ上に形成する。次いで、像の直径にわたる強度 分布から結果を誘導する。

アッセイが完了し結果が出されたならば、読取りロボットは使い捨てカートリッ ジをアンロードステーションに移す。アンロードステーションは、使い捨てカー トリッジを、積み重ねられた使用済使い捨てカートリッジの一番下に加えるべく 作動化する。常に最高１７個までの使い捨てカートリッジをアンロードステーシ ョン内に積み重ねることができる。ロード及びアンロードステーションの収容能 力は、最高４時間の全く人手のかからない自動化時間を提供する。

該装置が特に優れている箇所は、１つの試料を多数の試薬に対して試験し得るこ とである。クラスＩ　ＨＬＡアッセイにおいては単一試料が最高２００種類の抗 原に対して試験される。装置レイアウトは、この種の試験を最少時間で実施でき るよう最適化される。この最適化は、アレルギー試験、微生物感受性試験、また は１つの試料を多数の試薬に対して試験する必要がある任意の他のタイプの試験 に同様にうま（適合され得る。

像処理及びデータ管理もまた該装置の長所である。ＣＣＤカメラの使用及び像分 析によって、強度、寸法、パターンまたはこれらの任意の組合せに基づいて反応 を評価することができる。フィルタの使用または場合によってはカラーカメラの 使用によって、反応を評価するために色を使用することもできる。人間インター フェースワークステーションとしての標準ＰＣは、データの収集、分析及び管理 の有効手段を提供する。人間インターフェースワークステーションは、他の実験 装置またはＬＩＳ　（Ｌａｂ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ、実験情 報システム）へのインターフェースとしても役立ち得る。

ピペットロボット ピペットロボットは、トレーを、装置のピペット添加セクションにわたって移動 させるために使用される３軸Ｘ−Ｙ−Ｚロボットである。各軸は、ステップモー タ及び並進スクリューによって駆動される。更に各軸は、該軸のホームポジショ ンを検出するためにホームセンサを使用する。

Ｘ軸は該装置の左右方向と定義され、Ｘ軸のホームポジションは左端である。Ｙ 軸は該装置の前後方向と定義され、Ｙ軸のホームポジションは後端である。Ｚ軸 は該装置の上下方向と定義され、Ｚ軸のホームポジションは下端である。

ピペットロボット及び読取りロボットのＺ軸には、トレーをピックアップ及び保 持するために使用される受動グリッパが取り付けられている。該グリッパは、グ リッパ内のトレーの存在及び位置を検出する２つのセンサを有する。トレー不在 センサは、グリッパ内にトレーがないことを検出する。トレー位置不適合センサ は、グリッパ内にトレーはあるが位置が不適正であることを検出する。

ステップロスを検出するために、３つ全ての軸がホームポジションにあるところ から全ての動きが始まり且つそこで終了する。ピペットロボットは、ホームポジ ションから、ロード、ピペッタ、インキュベータ及びリーダまで移動し読取りロ ボットは、トレーを、装置の読取りセクションにわたって移動させるために使用 される３軸ｘ−ｙ−ｚロボットである。各軸は、ステップモータ及び並進スクリ ューによって駆動される。更に各軸は、該軸のホームポジションを検出するため にホームセンサを使用する。Ｘ軸は該装置の左右方向と定義され、Ｙ軸のホーム ポジションは後端である。Ｚ軸は該装置の上下方向と定義され、Ｚ軸のホームポ ジションは下端である。

ステップロスを検出するために、３つ全ての軸がホームポジションにあるところ から全ての動きが始まり且つそこで終了する。読取りロボットは、ホームポジシ ョンから、インキュベータ、リーダ、アンロードまで移動し得る。

リーダ リーダは実質的に、ＣＣＤカメラ上に像形成する倒立顕微鏡である。対物レンズ 交換ホイール、フィルタ交換ホイール及び２つの光源を使用することで、リーダ は、蛍光読取り装置（抗原アッセイ用）または凝集読取り装置（抗体試験用）と して構成することができる。

対物レンズ交換ホイール及びフィルタ交換ホイールは個々に１組のギヤを介して ステップモータによって駆動される。各ホイールの周縁に取り付けられた大きな ＳＳＴギヤとステップモータに取り付けられたより小さなウレタンギヤとを使用 することにより、５．７６＋１の減速が得られる。ホイールとモータとの中心距 離は、ギヤ間に僅かな干渉を与え、それによってゼロバックラッシ駆動を生むよ うに制御される。

前方照射源は、積分グイクロイックレフレクタを有する石英ハロゲンランプであ る。照射光を物体平面に集光するために集光レンズが使用される。未使用のとき は常閉ソレノイド作動シャッタが前方照射光を遮断しており、ランプは継続的に 放置され得る。このランプを冷却するためにファンが使用され、高温の空気は導 管によって装置から直接排出される。ランプは、定電圧駆動装置によって制御さ れる。

強度制御は行われない。

後方照射源はＬＥＤである。ＬＥＤは、ＬＥＤが使用されるときにはオンに、使 用されないときにはオフに切り換えられる定電圧駆動装置によって制御される。

抗原アッセイを読取るためには、対物レンズ交換機構は１０倍対物レンズを選択 するよう動かされ、フィルタ交換機構は第１蛍光フイルタパツク（赤色）を選択 するよう動かされる。ウェルの側部と底部との間で高コントラストを有するウェ ルの像を生成すべく　ＬＥＤが点灯される。そして、自動位置決め及び自動焦点 合わせが行われる（後述）。

ＬＥＤが消灯されると、死滅細胞（赤色）の像をカメラ上に形成すべく前方照射 シャッタが開かれ、最初の読取り像が取得される。次いでフィルタ交換機構が、 第２蛍光フイルタパツク（緑色）を選択するよう動かされ、生体細胞（緑色）の 像がカメラ上に形成され、２番目の読取り像が取得される。前方照射シャッタが 閉じられると１つのウェルの読取りが完了する。このプロセスが全てのウェルに 対して繰り返される。

（ＨＬＡモードにおいて）抗体アッセイを読取るためには、対物レンズ交換機構 及びフィルタ交換機構が、適正な倍率及びフィルタセットを選択すべく動かされ る（倍率はウェルの寸法に応じて１〜４倍で変化する）。凝集パターンの像をカ メラ上に形成するためにバックライトが点灯される。必要であれば、読取り像を 取得する前に自動位置決め及び自動焦点合わせが行われる。そうしてこれが、全 てのウェルに対して繰り返される。

ピペット添加機構（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）ピペット添加機構は、液体レベル感知系 のための伝送アンテナとしても作用する固定ピペットチップを保持している。下 方ユニットは直線形ステップモータによって作動化される。この下方ユニットは 、該下方ユニット内でばね荷重されている受信アンテナと、磁気分離ステップに 使用される磁石アームとからなる。ホームセンサは、下方ユニットのホームまた は下位ポジションを検出する。

動作は、下方ユニットがホーム（下位）ポジションにあるところから開始する。

これにより、トレーをプローブと下方ユニットとの間に置くことができる。次い で下方ユニットを、所望の作業に適正な高さまで移動させるべくモータが作動さ れる。

ポンプ ポンプは、より小さな試料シリンジとより大きな緩衝液シリンジとを有する双シ リンジユニットである。２つのシリンノは、入口と放出口とを有する単一マニホ ールドに連結されている。入口は弁制御される。閉鎖位置においては、弁は緩衝 液シリンジをマニホールドに連結し且つ入口を閉鎖しており、開放位置において は、弁は緩衝液シリンジを緩衝液びんに連結し且つ緩衝液シリンジをマニホール ドから遮断する。放出口は、ピペット添加アセンブリの分注チップに直接連結さ れている。

シリンジは、ベルトを介してステップモータによって駆動されるラックピニオン 駆動装置によって作動される。弁は、ステップモータに直接連結されている。

動作は、シリンジがホーム（上位）位置にあり且つ弁がホーム（閉鎖）位置にあ るところから開始する。分注チップから吸引及び分注するために、弁は閉じたま までチップが流体中に入れられると、シリンジは、要求される分注に適当な距離 だけ上向きに（ホームに向かって）移動される。

緩衝液びんから吸引し、次いで分注チップから分注するために、まず弁が開かれ 、次いで緩衝液シリンジが下向き（ホームから遠ざかる向き）に移動され、そう して緩衝液びんから試料が吸引される。次いで弁が閉じられると、緩衝液シリン ジは、要求される分注に適当な距離だけ上向きに（ホームに向かって）移動され る。

インキュベータ インキュベータは、インキュベートされるトレーのための制御温度保管位置であ る。一度に最高１０個までのトレーをインキュベータ内に置（ことができる。

大きなアルミニウムブロックから伝導性インキュベータが機械加工される。アル ミニウムの高い熱伝導性によって、インキュベータの場所ごとの温度差は最小限 に抑えられる。

大きなインキュベータは大きな熱気塊を与え、経時的な温度変動が最小に抑えら れる。

３種のヒータ構成のうちのいずれかを使用することができる。第１の構成におい ては、２つの３インチ×５インチパッドヒータがインキュベータの右側と左側と に取り付けられ、ＲＴＤ（Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｄｅｖｉｃｅ ）センサが中央に配置される。第２の構成においては、ヒータはインキュベータ の中央に垂直に挿入される棒状ヒータであり、ＲＴＤセンサは側面に表面装着さ れる。第３の構成では、頂部、底部及び左右側面に巻き付けられた幅２インチの ヒータと、中央に配置されたＲＴＤセンサとが使用される。

温度制御は、直列リンクを介して装置のコントローラと通信し得る独立コントロ ーラによって制御される。

ロード ロードステーションは、最高１０個まで積み重ねられたトレーを作業員から受取 り、−回に１つのトレーをＦＩＦＯ順序でピペットロボットに与える役割を果た す。ロードブラットホームアセンブリは直線形ステップモータによって作動され る。ロードブラットホームアセンブリホームセンサは、ロードブラットホームア センブリのホーム即ち上位位置を検出し、ロードブラットホーム伸長センサは、 伸長即ち下位位置を検出する。トレー−イン−ロードセンサは、ロードステーシ ョン内に少なくとも１つのトレーが存在することを検出する。ドアセンサは、ロ ード／アンロードドアが開いているか閉じているかを検出する。

１〜１０個のトレーをロードブラットホームアセンブリ上に積み重ねることがで きる。ロードブラットホームアセンブリが下降されるとき、カム作動化ストップ が一番下のものを除（全てのトレーを保持すべく介入し、更に下降が続くと一番 下のトレーは、ピペットロボットによってピックアップされるよう積重ね体から 分離する。一番下のトレーが取り出されると、ロードブラットホームアセンブリ は、カム作動化ストップが遠ざかるときに残りのトレーを保持するために上向き に移動する。

ロードステーションの下方には２つのスタットトレー用固定スフットスロットが ある。いずれかのスタットスロットに入れられたトレーは、ロードステーション にあるトレーより先に処理される。トレー−イン−スタットセンサ（２）は、ス タットスロット内のトレーの存在を検出するピペットロボットはトレーをスタッ トスロットから直接取り出す。

ロードステーションには固定非接触バーコードリーグが装備されている。トレー をロードステーションまたはスタットスロットから取り出した後、ロボットはト レーを、ト　・レーの端部にあるバーコードラベルをバーコードリーダのそばで トレーＩＤを読取るように動かす。

ロードまたはアンロードステーションの動作の間ロード／アンロードドアをロッ クするためには、ソレノイド作動化ドアロックが使用される。これは、作業員を ロード機構から保護するためである。

アンロード アンロードステーションは読取りロボットから使用済みのトレーを受取り、それ らを、作業員が取り出せるように最高１７個まで積み重ねる。アンロードプラッ トホームアセンブリは直線形ステップモータによって作動される。アンロードプ ラットホームセンサはアンロードプラットホームアセンブリのホーム即ち上位位 置を検出し、アンロードプラットホームアセンブリ伸長センサは、伸長即ち下位 位置を検出する。アンロード７５％フルセンサは、アンロードステーション内に 少なくとも１３個のトレーが存在することを検出する。アンロードフルセンサは 、アンロードステーション内に１７個のトレーが存在することを検出する。

アンロードドアセンサは、アンロードドアが開いているか閉じているかを検出す る。

アンロードステーションは、使用済みトレーが装置からアンロードされる準備が できるまでホームポジションを維持する。読取りロボットが使用済みトレーを持 ってアンロードステーションに向かって移動すると、アンロードプラットホーム アセンブリアクチュエータはアンロードプラットホームアセンブリをホームポジ ションから伸長ポジションまで移動させる。既にアンロードステーションにある トレーは、ばね荷重ストップによってアンロードプラットホームの上方の適所に 保持されている。読取りロボットはトレーをアンロードプラットホーム上に置き 、それを解放するか、またはアンロードアセンブリにある解放特性によってトレ ーから解放される。次いでアンロードプラットホームアセンブリはホームポジシ ョンに戻される。アンロードプラットホームアセンブリが上向きに移動すると、 アンロードプラットホーム上のトレーかばね荷重ストップを開かせ、トレーは既 にある積重ねに加えられる。

ロードまたはアンロードステーションの動作の間ロード／アンロードドアをロッ クするためには、ソレノイド作動化ドアロックが使用される。これは、作業員を アンロード機構から保護するためである。

液体レベル感知及び液体分注 上述したように、カートリッジ１０の反応ウェル１６は、数μｌ　（約２〜３μ Ｉ）の油で覆われたμｌ量の抗血清を含む。試料を反応ウェル１６に分注するた めに使用される液体分注及び液体レベル感知系は、分注プローブが油の上面下に 挿入された時点を検出し得ることが必要である（図２参照）。

試料（または分注される他の流体）の小滴が各反応ウェル１６内に実際に堆積さ れたことを保証するため、装置は、小滴が分注プローブ上に形成された時点、形 成された小滴が分注プローブから離脱した時点、及び分注プローブが油または血 清中に挿入された時点を検出し得ることが望ましい。現在好ましい作業態様にお いては、分注プローブが油または血清中に挿入された後に小滴が形成され、プロ ーブが液体から引き出されるときに試料小滴が分注プローブから“拭い取られる （ｗｉｐｅｄ　ｏｆｆ）”。小滴形成及び離脱に関する情報を使用する閉ループ 系と組み合わされた上記方法では、試料が各反応ウェル内に実際に堆積されたこ とが保証される。

しかしながら、他の態様の小滴形成及び分注も可能であることは当業者には認識 されるであろう。例えば、分注プローブを液体試薬中に挿入する前に、小滴を分 注プローブ上に空気中で形成することもできる。

本発明の液体分注系の実施態様を図７に概略的に示す。

液体分注系は、液体を分注するための分注プローブ７０を含む。上述したように 、分注プローブ７０を反応ウェル１６に関して位置決めするために、３軸ロボツ トはステップモータを使用することによりカートリッジ１０をＸ１ＹまたはＺ方 向のいずれかにおいて移動させ得る。

正弦波または方形波発生器（発振器）７４は無線周波数（ＲＦ）信号を生成し、 この信号は増幅器７６によって増幅されてから分注プローブ７ｏに転送される。

分注プローブ７０からＲＦ倍信号受は取るために、伝導性エレメント７２が備え られている。伝導性エレメント７２は増幅器７８に電気的に接続されている。増 幅器７８は、以下に詳述する更なる処理のために、伝導性エレメント７２から受 け取った信号を増幅する。別の実施態様においては、伝導性エレメント７２は、 後述する粒子分離過程及び作業に使用される磁石であり得る。

カートリッジ１０は、反応ウェル１６が分注プローブ７０の下方でおおよそ中央 合わせされるように位置決めされる。この位置決めは、最初にロボットをトレー ニングすることにより達成される。好ましい実施態様においては、分注プローブ ７０は反応ウェル１６の底部の上方的３ｍｍのところにある。別の実施態様にお いては分注プローブ７０は他の位置に配置することもできる。例えば、小滴がウ ェル１６の壁面上に分注されるよう、分注プローブ７ｏを反応ウェルの縁部また はリムに配置してもよい。

反応ウェル１６が適正に位置決めされると、発振器７４からの信号のモニタリン グが開始される。ＲＦ傷信号反応ウェル１６内の流体中及び容器を通過し、伝導 性エレメント７２によって受け取られる。伝導性エレメント７２に受け取られた 信号は、増幅器及びフィルタ７８によって増幅及び濾波される。次いで信号は、 好ましくは全波整流器８０によって、出力信号が受信ＲＦ信号の振幅に対応する ＤＣ値となるように整流される。次いでＤＣ信号は増幅器８２によって増幅され 、アナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換器８４によってディジタル信号に変換さ れる。

図８を参照すると、液体分注系のための制御系の実施態様が示されている。整流 及び濾波されたＤＣ信号は必要によっては抽出及び保持回路８６に与えることが できる。ステップモータ制御ユニット８８からパルスが生成される都度、抽出及 び保持回路８６の抽出が行われ、従って、ＤＣ信号値と試料カートリッジ１０の 相対位置とが同調される。

ＤＣ信号は、ステップモータ制御ユニット８８からのパルスの立下り区間におい てロックされ、論理信号がディジタイザ９０に送られる。ディジタイザ９ｏは１ ２ビツトＡＤＣであるのが好ましい。そうして、ディジタル化されたＳＣ信号値 がマイクロコンピュータ４４によって記憶及び分析される。

或いは、抽出及び保持回路８６を含まず、同調信号がマイクロコンピュータ４４ から直接与えられる系を構築することもできる。

ステップモータ制御ユニット８８からパルスが来る都度、ＤＣ信号を（ステップ モータ制御またはマイクロプロセッサ信号のいずれかから）ロックし、ディジタ ル化し、且つ分析する上述の処理は、ステップモータの連続する２つのステップ 間に有意な差が生じるまで続行される。この時点で、カートリッジ１０の上向き の移動は、ステップモータ制御ユニット８８に送られた命令によって中止され得 る。

カートリッジ１０の相対位置は、マイクロコンピュータ４４によってステップモ ータ制御ユニット８８から検索される。カートリッジ１０の相対位置が所定範囲 （マイクロコンピュータ４４のメモリ内に格納されている）内であれば、処理は 続行され、そうでなければエラー状態が報告される。

液体レベルが所定範囲にあることが識別されると、カートリッジ１０が同じく上 向きに約０．５ｍｍ更に移動することで処理が続行される。この移動の間、予想 外の状態をチェックするためにＤＣ信号は継続的に抽出、ディジタル化及び分析 される。この移動の終了時には、分注プローブ７０の端部は反応ウェル１６内の 油２４の内部にあることが合理的に保証される。

次に、垂直運動と同調するパルス流を無効にするためにマイクロコンピュータ４ ４から信号”Ｍ”が送られる。この同じ信号“Ｍ”によって、ＤＣ信号値をステ ップモータ駆動及び分注ポンプと同調させるパルス流が有効となる。

所定数のステップにおいて分注ポンプを駆動するステップモータを稼働させるプ ログラム命令が発せられ、ＤＣ信号値はマイクロコンピュータ４４によって再び 抽出、ディジタル化及び分析される。小滴を分注するプロセスは、ＤＣ信号に適 正な増加が認められるまで続行されるか、またはＤＣ信号値に増加がないかもし くは容認不可能な増加があった場合に停止される。

小滴がうまく生成及び分注されたならば、カートリッジ１０を下向きに動かすべ くプログラム命令がステップモータ制御ユニット８８に送られる。この移動の間 、ＤＣ信号値がマイクロコンピュータ４４によって抽出、ディジタル化及び分析 される。分注プローブ７０の先端が上位液層、例えば油の表面に接近すると、小 滴の“拭い取り（ｗｉｐｉｎｇ−ｏｆｆ）”プロセスが行われてＤＣ信号値の急 増が認められ、このことで、小滴が実際にプローブから離れ、反応ウェル１６中 に分注されたことが確証される。

本発明の液体レベル検出回路からの出力信号ＶＤＣを図１０に示す。この例では 、プローブ７０を、油層によって覆われた試薬を含む反応ウェル中に挿入し、小 滴を液体中で形成した。原点から“Ａ”で表された電圧までの曲線部分は、プロ ーブ７０が油層の上面に接近するときに生成された信号に対応している。”Ａ” 及びＢ″で表された電圧間の曲線部分は、プローブ７０が油層中を試薬に向かっ て進行しているときに生成された信号に対応している。“Ｂ”及び“Ｃ”で表さ れた電圧間の曲線部分は、液体中での小滴の形成に対応している。“Ｃ″で表さ れた電圧から斜めに減少している曲線部分は、プローブ７０が引き出されたとき に生成された信号に対応している。曲線の勾配は、小滴がプローブ７０から解放 された時点Ｔｏまで急激に減少し続け、それから曲線の勾配は一気に下降してい る。

図１４に示した信号は、勾配に急激な変化があったときにピークが生成され且つ それが検出され得るよう、必要によっては微分し得ることが判る。微分は、適当 な微分回路またはマイクロコンピュータ４４によって実施することができる。

次に、ＲＦ増幅回路を説明する。図９に示したように、増幅回路１００は２つの 縦続演算増幅器１１８及び１２４で構成されている。演算増幅器１１８の正入力 端子は抵抗器１１１及びコンデンサ１１０を介して伝導性エレメント７２に接続 されている。演算増幅器１１８の正入力端子は更に、出力作用点Ａを電源１０９ の１／２に維持する抵抗器１１２及び１１３で形成されている電圧分割回路に接 続されている。抵抗器１１２．１１３及びコンデンサ１１０は、回路の感受性を 低周波数信号に低下させるための高域フィルタとして作用する。演算増幅器１１ ８の負入力端子は抵抗器１１４及びコンデンサ１１５を介して接地されていると 共に、抵抗器１１６を介して出力端子にも接続されている。

デカップリングコンデンサ１１５によって、単位ＤＣ利得をもってして演算増幅 器１１８の高ＡＣ利得が可能となる。演算増幅器１１８のＡＣ利得は抵抗器１１ ６及び１１４によって規定される。

演算増幅器１１８の出力端子は抵抗器１１７を介して接地されていると共に、コ ンデンサ１１９及び抵抗器１２０を介して演算増幅器１２４の入力にも接続され ている。演算増幅器１２４の正入力端子もまた、抵抗器１２１を介して接地され ている。演算増幅器１２４の負端子は抵抗器１２２を介して接地されていると共 に、抵抗器１２３を介して出力端子にも接続されている。演算増幅器１２４の利 得は抵抗器１２３及び１２２によって規定される。

次に、全波整流及び浦波回路を説明する。整流回路はコンデンサ１２５を介して 演算増幅器１２４の出力端子に接続されている。図９に示した整流及び浦波回路 ４１の実施態様においては、２つの演算増幅器１３７及び１３８が、ＤＣ信号１ ３９を生成すべく種々の抵抗器、ダイオード及びコンデンサに公知の構成におい て接続されている。

増幅回路１００からの負信号に対しては、演算増幅器１３７の出力はダイオード １２８によって０．７ｖにクランプされると共に、演算増幅器１３８の負端子か らはダイオード１３１によって遮断される。このとき演算増幅器１３８は、入力 抵抗器１３０及び帰還抵抗器１３５を有するインバータとして作用し、演算増幅 器１３８の出力端子に正信号が与えられる。

増幅回路１００からの正信号に対しては、演算増幅器１３７は、入力抵抗器１２ ６及び帰還抵抗器１３２を有するインバータとして作用し、演算増幅器１３８は 加算インバータとして動作し、再び正出力１３９が与えられる。抵抗器１２６． １２９．１３０及び１３５が同じ値を有し且つ抵抗器１３２が抵抗器１３０の半 分の値を有する場合、回路１０１は正確な全波整流器として作用する。回路１０ １は、抵抗器１３５及びコンデンサ１３４によって形成される時定数が、平均化 された入力電圧の最大時間よりずっと大きい場合には平均化フィルタ（ａｖｅｒ ａｇｉｎｇ　ｆｉｌｔｅｒ）になる。

次に図１１を参照すると、方形波発振回路の１つの実施態様が示されている。方 形波発振回路は、５つの抵抗器２１５．２１６及び２１８と、コンデンサ２１７ 及び２２０と、演算増幅器２１９とを含む。好ましくは５０％デユーティサイク ルＴＴＬレベルで動作する発振器は、コンデンサ２１７に接続されており、抵抗 器２１５を介して接地されている。適当な発振器は、ＷａｖｅｔｅｋからＭ　ｏ 　ｄ　ｅｌ　Ｎｏ、１４５として入手可能な関数発生器である。演算増幅器２１ ９は、抵抗器２１５及び２１６の値によって決定される利得で信号を増幅する。

増幅器２１９の出力は、コンデンサ２２０を介して伝送アンテナＡＣに接続され ている。

次に、本発明の装置及び方法の別の実施態様を説明する。

この実施態様は、高い誘電率を有する別の流体が検出されたとき流体分注が行わ れることで上述の実施態様とは異なる。以下に記述する方法においては、２つの 流体は同様の粘性を有しており、従って該方法によって２つの流体は混合される 。

ここでも、所定数のステップにおいて移動すべくプログラム命令が発せられると カートリッジ１０が上向きに移動することからプロセスは開始する。上向き移動 は、曲面が検出されるかまたは上向き移動の終了が検出されるまで続行される。

一旦分注ブローブ７０が油に接触すると、油面が検出され、プログラムは、上向 き移動を停止する命令を発する。この時点で、カートリッジ１０の相対位置がチ ェックされる。カートリッジ１０のＺ方向における相対位置が（マイクロコンピ ュータメモリ内に記憶されている）所定範囲内であるならば、カートリッジ１ｏ を上向きに移動させる別のプログラム命令が発せられる。上向きに移動させるス テップの数は所定の値に等しく、上向き移動は、ステップモータの連続する２つ のステップ間のＤＣ信号値に有意な増加があるまで、または上向き移動の終了が 検出されるまで続行される。ＤＣ信号値の急増は、油よりも大きい誘電率を有す る流体が存在することを意味する。そこで上向きの移動は停止され、上述の分注 作業が行われる。図１４は、この実施態様における検出回路からの信号を示して いる。電圧レベル“Ａ”の信号は、油面が検出された時点を表しており、時点Ｔ 、の電圧”Ｂ”及び“Ｃ”間の信号は、プローブがウェルの底部にある流体に接 触したときの分注プロセスを表わしており、時点Ｔ、及びＴ２間の曲線は、プロ ーブの向きの変化を表わしている。時点Ｔ２で油の下面に達したときに小滴は“ 拭い落とされた”。信号は、曲面に到達するまでは急激に減少しない。

光学素子 図１２を参照すると、本発明の分析装置の光学または像形成ユニットの１つの実 施態様が示されている。光学ユニットは、少なくとも２つのフィルタブロック１ ７１を含むターレット１７７を含むのが好ましい。ターレット１７７はモータ１ ７５によって回転される。各フィルタブロック１７１は、励起フィルタ１７０、 出射フィルタ１７２及びダイクロイックミラー１７４を有する。好ましくはタン グステンハロゲンランプである光ランプ１７６は白色光を与える。光は、集光器 １７３によって集光されてから励起フィルタ１７０を通過し、次いでダイクロイ ックミラー１７４によってカートリッジ１０に向かって反射される。そうすると 光は、拡大レンズまたは対物レンズ１７８を介して反応ウェル１６に与えられる 。拡大対物レンズは１０倍拡大対物レンズであるのが好ましい。光は反応ウェル １６内の物体によって反射される。試料ウェル１６から反射した光は、対物レン ズ及びダイクロイックミラー１７４を通過してから、更に出射フィルタ１７２を 通過する。出射フィルタ１７２を透過した光は次いで光検出器１８０のＣＣＤ素 子１８５に達し、そこで光は以下に詳述するように処理される。図１２に示した ように、該構成は、各反応ウェル１６の底部を介して読み取る倒立顕微鏡に類似 である。図示したように光学系は更に、少なくとも２つの対物レンズ１７８を保 持するように構成された対物レンズターレット１７９を含むのが好ましい。更に 光学系はバックライト源（詳細は後述する）を任意に含むことができる。

図１７には光学ユニットの別の実施態様の側方横断面図が示されている。図１７ の光学ユニットは全体的に縮尺して表わされており、図１２には示されていない 追加エレメントが示されている。例えば、ＣＣＤカメラ１９０；フィルタブロッ クターレット２３０；及びフィルタブロックターレットモータ２３２が図１２の エレメントに加えて示されている。

フィルタブロックターレット１７７は、少な（とも６つまでのフィルタ、例えば Ｎ１ｋｏｎ　（日本）販売のフィルタパックを像形成位置に回転し得る半径があ って、３６００の回転範囲を有するのが好ましい。レンズブロックまたは対物レ ンズターレット１７９は、少なくとも４つまでの標準顕微鏡対物レンズを像形成 位置に回転し得る半径があって、やはり３６０°の回転範囲を有するのが好まし い。各ターレットは、全回転範囲において＋／−約０．００３インチの最低精度 で位置決めし得る必要がある。組立て後の各光学モジュールは、各ターレットの 全回転範囲において＋／−約０．００３インチの最低精度で位置決めし得る必要 がある。

図示したように、光学モジュールは、２つの直接／駆動ステップモータ被動回転 プラットホームを含むのが好ましい。各軸は、ＶＥＸＴＡ　（東京２日本）販売 のＭｏｄｅｌＮｏ、ＰＸ２４４０２ＤＡのような、４００ステップ／回転、４位 相、８ワイヤステツプモータによって駆動されるのが好ましい。

フィルタブロック及びレンズターレットの各サブアセンブリは、フィルタパック 及びレンズが、カメラ内で蛍光試験像を作る光のピーク強度によって測定したと きに、最適光経路の＋１または一１ステップ内にあるような“ホーム“回転位置 に位置センサを有するのが好ましい。該センサは、０ＰＴＥＫ　（Ｃａ　ｒ　Ｉ 　ｓ　ｏｎ、テキサス）製のＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、０ＰＢ９９０Ｐ５１のようなス ロット式光学スイッチのごとき非機械的タイプのものであるのが好ましい。

青色励起−緑色発光に対しては適当なフィルタパックが市販されている。適当な フィルタパックは例えばＮｉｋ。

ｎ（日本）販売のＢ−２Ｅ　Ｅｐｉ−蛍光フィルタ装置である。ダイクロイック ミラー１７４は発光体１７６に対して４５°に配置され、約５１０ｎｍの特性波 を有するのが好ましい。励起フィルタの主波長は好ましくは４７０ｎｍであり、 バンド幅は約４０ｎｍである。射出フィルタ１７２は５２０〜５６０ｎｍのスペ クトル透過範囲を有する。

緑色励起／赤色発光に対しても例えばＮ１ｋｏｎ　（日本）販売のＧ−２Ａ　Ｅ ｐｉ−蛍光フィルタ装置のごときフィルタバックが市販されている。ダイクロイ ックミラー１７４もランプ１７６に対して４５°に配置されており、約４８０ｎ ｍの特性波を有する。励起フィルタ１７０は約５３５ｎｍの主波長を有し、バン ド幅は約５０ｎｍである。射出フィルタ１７２のスペクトル透過範囲は５９０以 上である。

拡大対物レンズ１７８もまた市販されており、例えば開口数０．２５及び作動距 離５．２を有するＮ１ｋｏｎ　ＰＩａｎ　１０　ＤＬとすることができる。この 開口数の大きい対物レンズは、蛍光像の光度を増強するために望ましい。

ランプ１７６のランプ色温度は、青色励起に対しては３０００°に以上であるの が好ましい。ランプ光出力は４００ル一メン以上であるのが好ましい。

顕微鏡の対物レンズとリレーレンズとを組合せて使用する場合には、中性濃度フ ィルタ（図示なし）を与えることが有利となり得る。この実施態様においては、 リレーレンズ及び中性濃度フィルタバックと組合せて、４．０倍ペリフォーカル （ｐｅｒｉｆｏｃａｌ）拡大対物レンズを使用することができる。凝集アッセイ を読み取ることに使用するために、ＬＥＤのような透過光源１８１を備えること もできる。

光学系は、像の焦点を合わせるために自動焦点調整手段を含むのが好ましい。現 在考えられる１つの実施態様においては、ＬＥＤ１８１は、ウェルの縁上に焦点 を合わせるように使用される。この方法を用いて焦点調整するための幾つかの自 動焦点アルゴリズムが当分野において使用可能である。例えば１つの適当なアル ゴリズムは、“Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｍａｇｎｉｔｕｄｅ Ｓｃｈｅｍｅ”に基づいている。このアルゴリズムは、論文“Ｉｍｐｌｅｍｅｎ ｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　Ａｌｇｏｒｉｔ ｈｍｓ　ｆ。

ｒ　ａ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｖｉｓｉｏｎ　ＳｙｓｔｅｍＷｉｔｈ　Ｃａｍｅｒ ａ　Ｃｏｎｔｒｏ！”、Ｓｃｈｌａｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｒｎｅｇｉｅ−Ｍｅ ｌｌｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ａｕｇｕｓｔ　１５．１９８３（ＣＭＵ−Ｒ１ −ＴＲ−８３−１４）に記載されており、この論文は参照により本発明の一部を 構成するものとする。

下記の表１に、本発明の装置及び方法と一緒に使用し得る適当な発蛍光団の励起 及び発光波長を列挙する。

５（６）カルボキシフルオレセイン　４９０ｎｍ　５２０ｎ■ジアセテート（約 ９５％ＨＰＬＣとの混合異性体）Ｃ１８１１１＠０．　ＦＷ４６０．４ヨウ化プ ロピジウム　５３５ｎｍ　６０２ｎ厘（約９５〜９８％ＴＬＣ）　（結合）本Ｃ ２，Ｅ１３４Ｎ４Ｉ！　Ｆ？６８８．４本−結合発光周波数において励起 像処理 上述したように、本発明の装置及び方法に使用される像処理ユニットは、各反応 ウェル１６内で緑色及び赤色色素で染色された生体細胞対死滅細胞の比を決定す る。各ウェルにおける反応評価は、全細胞数に対する死滅細胞の割合に基づいて 行われる。人により評価が行われる当分野の現在の慣用法のごとく、評価は１〜 ８の範囲で行われる。評点１は、はとんどの細胞が抗血清と反応せずに生体（緑 色）で存在することを示す。これとは反対に評点８は、はとんどの細胞が抗血清 及び発蛍光団と反応して死滅（赤色）して存在することを示す。

ＨＬＡ型判定において問題の細胞の大きさは直径が６〜１２ミクロンであり、１ ００〜３００細胞／像であるのが好ましい。これは、倍率１０として５１２Ｘ４ ８４分解能を使用すると１細胞当たり９画素面積を占めることになり、鮮明な蛍 光を示す一部の細胞では単一細胞で最高８１画素面積を占めることを意味する。

平均蛍光細胞像対バックグラウンド平均の比は少なくとも３：１であるのが好ま しい。

図１３に示したように、１つの実施態様においては、像処理系は固体電荷結合デ バイス（ＣＣＤ）カメラ１９０を含む。ＣＣＤカメラ１９０はフレームグラバ（ ｆｒａｍｅｇｒａｂｂｅｒ）２２２に結合されている。フレームグラバ２２２は 、内蔵算術及び論理処理ユニットを含むのが好ましい。適当なフレームグラバ２ ２２はＣｏｒｅｃ。

Ｍｏｎｔｒｅａｌ、（Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）からＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、０Ｃ −３００として入手可能である。適当なソフトウェアもＣｏｒｅｃｏからＦＧ３ ソフトウェアパッケージとして入手可能である。像処理システムは、表示モニタ １９４を備えたＰＣコンピュータによって実行される。

適当なＰＣコンピュータは、幾つかの販売元、例えばＣ。

ｍｐａｑから入手可能なＩＢＭ　ＡＴ　ＣｏｍｐａｔｉｂＩｅ　２５ＭＨｚ　３ ８６である。該システムは、得られた像を表示するためのモニタ１９２、例えば 標準Ｒ８１７０イメージモニタを含む。適当なモニタは、Ｈｉ　ｔａｃｈｉＤｅ ｎｓｈｉＳＬｔｄ、（Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ、Ｎ、Ｙ、）からＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、 ＶＭ−１２０１６として入手可能である。ディジタル信号処理（ＤＳＰ）カード ２２４はシステム性能を増大する（詳細は後述する）ことが見込まれ有利である 。ＤＳＰカード２２４は処理能力をフレームグラバ２２２単独での６倍に増大す る。即ち、フレームグラバ２２２のみしか使用しないと像１つ当たりの処理に少 なくとも４秒を要するが、ＤＳＰカード２２４による処理は１／２秒以下となる ことが見込まれる。

フレームグラバ２２２からのデータは標準ＡＴババス介してＤＳＰカード２２４ に転送し得るが、これは、主マイクロコンピュータに重負荷を与える。従って、 ＤＳＰカード２２４は（点線で示されている）ビデオバスを介してフレームグラ バ２２２に接続するのが好ましい。このことにより主プロセツサは他のタスクの ために解放される。

本発明に使用するのに適していると立証されたＣＯＤカメラは、Ｈｉ　ｔａｃｈ ｉ　ＤｅｎｓｈｉＳＬｔｄ、（Ｗ。

ｏｄｂｅｒｒｙ、Ｎ、Ｙ、）から入手可能なＭｏｄｅｌ　Ｎｏ、ＫＰｌｌｏであ る。

以下、本発明の像処理段に使用し得る幾つかのアルゴリズムを説明する。１つの 実施態様においては、フレームグラバの範囲／オフセット作業及びライブ／取得 作業を制御するためにＦＧ３ソフトウェアが使用され得る。範囲及びオフセット は例えば、典型的には、全桁３２／２５６のゼロ値をシフトし、１６／２５６の 範囲を最高密度に拡張する、それぞれ１６セツト及び３２セツトであり得る。先 の値は、最高コントラストの像を最少量のノイズで与えることが判明した。−星 像の焦点が上述のごとく合わせられたならば、像は取得され、次いで保存される 。この時点から、全ての処理はコンピュータＲＡＭにおいて完全に行なわれ、結 果はＥＧＡまたはＶＧＡスクリーン上に表示される。

バックグラウンド光の勾配を補償するためには行正規化法を使用することができ る。各行のデータ（５１２点）を加算し、次いで５１２で除算し、しきい値決定 （ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）の際のその行のベースラインとして評価する。任 意の点における全像正規化（行及び列）は、その点の元値から行平均及び月平均 を減算した値の平均である。負の値を避けるため、これは、（行）平均を手作業 で入力したしきい値に加算することにより行うこともできる。

小さな“霜降り（ｓａｌｔ　ａｎｄ　ｐｅｐｐｅｒ）”ノイズを像から排除する ため、最至近隣接フィルタ回旋法（ｎｅａｒｅｓｔ　ｎｅｉｇｈｂｏｒ　ｆｉｌ ｔｅｒ　ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用することができ る。倍率１０、ＣＣＤ素子サイズ１／２インチ及び６〜１２Ｍ細胞サイズを基準 にして、実質的に円形であり面積にして少なくとも９つの画素からなる細胞にお いて、所与のしきい値より大きい強度を有する隣接画素を持たない画素は重要で ない。

当業者には認識されるように、このタイプのフィルタ処理には多数の異なる核ま たは重みがある。使用し得る１つの方法は、任意の画素が、選択されたしきい値 以上の少なくとも１つの他の画素をその位置の（縦方向または斜め方向で）上方 または下方に有するか、または該画素値がゼロになる必要がある。このことで全 ての単一画素ノイズエレメントは排除され、全ての“生き残り”エレメントが２ 次元になる。

より一般的な方法は、核の対応する値の重みを各画素に乗算する、典型的には像 “Ｉ”の３×３の領域上にマツピングされる３×３核“Ｋ“を使用する。結果は 、加算され、重み合計で除算される。

一旦像を正規化し、しきい値としての正規化値を使用してフィルタ処理したら、 アルゴリズムは、手作業で選択されたしきい値を促すのが好ましい。これは、バ ックグラウンドの色を見、最も明るいバックグラウンド色をカラーバーと比較す ることにより決定される。カラーバーの各色は、原像の１６グレイスケ一ル強度 の値を有する。一般にこの値によって、幾つかのより弱い細胞を収縮させる可能 性はあるが、コントラスト及び焦点に従って全てのバックグラウンドが確実に排 除される。データ損失が最少である最良の選択を与えるためには幾つかの実験が 必要となり得る。

例えば、値４８がこの方法でうまく作用することが判っている。

一旦全てのパラメータを選択したならば、像を走査するために“反転充填（ｒｅ ｖｅｒｓｅ　ｆ　ｉ　１１）”アルゴリズムを使用することができる。この反転 充填アルゴリズムは、左上から右に向かって走査し、最初のゼロでない画素を検 出したときに停止する。好ましくは次いでカウンタが初期化され、そのライン上 で（ゼロ）バックグラウンド画素を検出するまで検索を続行しながら増分される 。検索は、１行下の最初の画素に戻り、左に向かって最初のバックグラウンド画 素が検索される。先のフィルタ処理によって全てのエレメントは２次元であるこ とが保証されているので、この方法は容認可能である。最も左側にあるゼロでな い画素が検出されたとき、カウンタは再び、最も右側の画素に到達するまで増分 される。最後にチェックした行より下に画素がな（なるまで、このプロセスが後 続の各行に対して続行される。

上記方法は、ＨＬＡアッセイにおける細胞のようにエレメントが多少なりとも円 形である限りはうまく作用する。

しかしながらこの態様のアルゴリズムは、細胞クラスタまたは他の非円形エレメ ントが像中にある場合、特に横方向に大小のある“ダンベル”形のエレメントに おいては、中央行は別として左側の大エレメントの大きさは適正に判断されるが 、右側のエレメントは半分に分断されるという欠点を有し得る。上記及び他の同 様のエラーが起こり得るが、細胞寸法測定及びその後のカウントは、人による読 取りに匹敵する評価を与えることが判明した。

各画素をカウントするとき、選択された２値色に８を加えることによりその色は 明るい値に変化する。一旦エレメントの処理が完了すると、その寸法が選択範囲 と比較される。細胞がその範囲内にあるならばプロセスが繰り返され、色は明白 色（色１５）に変えられる。次いで、像全体が検索されるまで次のエレメントの 始まりを検索するラスター走査が続行される。

上記方法は適当ではあるが、極めて長時間を要する上に、充填時間が境界検出時 間に加えられ、従ってよりいっそうのオーバーヘッドを生じる。

上述のアルゴリズムは、ＶＧＡまたはＥＧＡ表示カードを備えたシステムに使用 することができる。ＥＧＡ表示カードを使用する場合、ＥＧＡ表示カードは１６ 色分解能による６４０Ｘ３５０画素を有しているが、得られる像は２５６グレイ スケールによる５１２Ｘ４８４画素であるが故に、何等かの変更が必要となり得 る。アスペクト比の大きな変化が細胞を歪ませ、円形よりはむしろ縦方向に細長 （見せる。このことは、Ｘ軸において各画素を２つずつ重複させて３２０Ｘ３５ ０の視野ウィンドウ即ちほぼ１：１のアスペクト比を与えることにより解決し得 る。グレイスケール強度を４ビツト右にシフトし、即ち１６で除算し、次いで考 え得る１６色にマツピングすることができる。所望であれば、この疑似色マツピ ングは、入手可能な６４０Ｘ４８０分解能がもはやアスペクト比問題を与えず、 全原像を表示し得るビデオグラフィックアダプタ（ＶＧＡ）において使用するこ ともできる。

別の実施態様においては、“輪郭特性抽出（ｃｏｎｔ。

ｕｒ　ｆｅａｔｕｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）”アルゴリズムが使用される。

“反転充填”アルゴリズムと“輪郭特性抽出”方法とでは２つの主な相違がある 。両方とも像を左上から右に向かって最初のゼロでないエレメントを走査するが 、輪郭アルゴリズムは、隣り合う非強調表示画素を、輪郭が完成するまで反時計 回りに検索することにより、エレメントの周縁のベクトルマツプを生成する。次 いでエレメントの寸法がベクトルマツプから計算される。

しかしながらこの方法は、各エレメント内の全ての画素ではな（各エレメントの 周縁のみに注目する。これを、原像データのディスクスワツピングではな（てフ レームグラバ２２２において処理することと組合せると共に、寸法測定／カウン トアルゴリズムを実行中に手作業で選択された全フレームしきい値の２値化を実 施し得ることで、処理能力が大幅に向上する上に、エレメントの形状に起因する エラーが排除される。輪郭特性抽出アルゴリズムは、バックグラウンドの高コン トラスト像にでさえうまく作用する。

しかしながら該アルゴリズムは、しきい値を手作業で選択することが必要であり 、バックグラウンド光の勾配または他のフィルタ処理を考慮していないが、これ らのことは全て自動評価に望まれている。

別の実施態様においては、リアルタイムの像平均化のためにフレームグラバ２２ ２が使用される。この方法は、選択された数のｏｎ　ｔｈｅ　ｆｌｙの像データ フレームを加算し、中間結果を第２フレームバツフア内に維持する。

アッセイ作業において問題の像に対し、２〜４つのフレームを平均化することで 信号対ノイズ（細胞対バックグラウンド）比を十分に向上し、更にフィルタ処理 することなくかかる像を使用することができる。このことにより、処理オーバー ヘッドを主コンピユータに加えることな（、処理能力が著しく増大される。

像ウィンドウ内で局所的な自動しきい値決定及び２値化を実施し得ることは、内 勤評価において望ましい。これは、Ｃｏｒｅｃｏ販売のソフトウェアを使用し、 ユーザ仕様サイズ、例えば３２Ｘ３２画素のウィンドウにおいて統計分析を実施 し、ウィンドウのヒストグラムのピークを見ることによりそのウィンドウ内に任 意の細胞が存在するか判定することにより行うことができる。ただ１つのピーク しか存在しないならば、これはバックグラウンドピークと仮定され、その領域内 に細胞は存在しない。２つのピークが検出されたならば、バックグラウンドピー クとフォアグラウンドピークとの間のユーザ選択パーセント距離によってしきい 値が選択され、この値を使用してウィンドウが２値化される。ここから、反応ウ ィンドウ１６の内勤評価を完了すべく、上述の輪郭寸法測定／カウントアルゴリ ズムが使用され得る。

最も好ましい実施態様においては、高速自動しきい値決定及び２値化を実施する ためにＤＳＰカード２２４が使用される。ＤＳＰカード２２４は、並行高速乗算 器及び加算器を備えたプロセッサと、別個の命令及びデータバスとを含むのが好 ましい。

上記に簡単に記載したように、１つの実施態様においては、フレームグラバ２２ ２は像を取得し、それらをＡＴ主コンピュータバスを介してＤＳＰ人カバカバッ ファブロックで伝送する。ＤＳＰは、データを受取ると、しきい値を自動的に決 定する全ての演算を実施し、像を２値化し、寸法測定及びカウントすべきエレメ ントを圧縮する。各エレメントの処理が完了すると、結果はＤＳＰ出力出力バッ ファ室かれる。ここから、主コンピユータによって最終的な寸法測定及びカウン トが行われる。

より好ましくは、データはフレームグラバ２２２からビデオバスを介して直接伝 送される。このことにより主コンピユータは他のタスクから解放され、マルチプ ロセッサ構成の利点を十分に活かすことができる。

自動位置決めアルゴリズム ２種類のアルゴリズムを検討した。いずれの方法の試験も優れた結果を与えた。

方法＃１ この方法の目的は、まず像中でウェルの縁部を位置決めし、次いで中央を位置決 めすることにより、機内でのウェルの位置を決定することである。

ソフトウェアは、像の各側面からの断面またはライン状の画素値を得る。図１９ において、かかるラインは、ＡＢ。

ＢＣＳＣＤ及びＤＡの断面に対応する。図１９における像の断面を図２０に示す 。ＢＣ断面においては、ウェルの左縁は黒から白への遷移によって示されており 、ウェルの右縁は白から黒への遷移によって表されている。

断面を個々に分析する場合、それは４つの可能性のうちのいずれかで表され得る 。全ての画素が“白色”値を有するならばその断面はタイプ１と定義される。全 ての画素がこのような２つの遷移を含むならばその断面はタイプ２と定義される 。

タイプ１−全てが白色画素； タイプ２−全てが黒色画素； タイプ３−１回の遷移（白から黒または黒から白）−タイプ４−２回の遷移（白 から黒及び黒から白、または黒から白及び白から黒）。

各断面にタイプを割り当てたなら、そのタイプを総合的に分析する。１組の断面 タイプによって視野内の物体の向きが決定される。例えば図２１は、断面が順序 １−３−２−３を有する場合のウェルの種々の向きを示している。図２２は、順 序４−２−２−２に対するウェルの向きを示している。順序１−１−３−３の構 成は図２３に示されている。図２４は、断面の順序２−２−３−３に対応する像 を示している。像及び問題の物体、即ちウェルの底部との物理的及び幾何学的関 係に従って、他の向き、即ち他の順序も考え得る。

ウェルの向きが既知となったならば、機内でのその座標を計算することができる 。ウェルの物理的特性及び視野は既知であるので、各断面における遷移の位置と 、機内でのウェルの向きとによって、ウェルの中央の座標を決定するのに十分な 情報が与えられる。

方法＃２ この方法では、ウェルの像を１次元に規定し、その次元においてウェルの端部を 見つけ、トレーを動かすことによりかかる端部を既知の位置に再配置し、このプ ロセスを繰り返す。ウェルの像はたった２回の反復でフレームの中央に合わせら れる。

ソフトウェアは、Ｘ軸においてウェルの端部位置（図２５の点Ａ）を見つける。

これは、機内の全ての横方向断面の縁部を分析することにより得られる。認めら れた全ての縁部について、ソフトウェアは最小Ｘ座標を有する縁部を選択する。

ソフトウェアはウェルを、縁部の位置がフレームの中央にくるように動かす。Ｘ 軸の最小または最大位置が再度決定される。ウェルとフレームとの幾何学的関係 のために、この新しい位置はＸ軸内の端部位置を表す（図２６の点Ｂ）。ウェル がフレームの中央に置かれることを保証する所定の座標に端部位置を配置すべ（ 、ウェルが移動自動焦点調整機能の目的は、像の最高鮮鋭度を決定することであ る。基本動作は、像を取得し、鮮鋭度を測定し、最適焦点までのＺ軸における変 位を計算し、トレーを新しい位置まで移動させることである。

以下のにステップによって自動焦点調整作業が行われる１、像を取得する。

２、ウェルの縁部に沿って問題の領域（ＲＯＩ　）を生成する。ＲＯＩは、像処 理を行う領域を制限し、計算に要する時間を短縮する。図２８は、像上に重ね合 わされた問題の領域を示している。

３、問題の領域において５ｏｂｅｌエツジフイルタを実施する。このフィルタは 、強度勾配の大きさの推定値を与える通常の像処理機能を有する。縦方向及び横 方向エツジのような他のフィルタを使用することもできる。

４、問題の領域におけるヒストグラムを計算し、該ヒストグラムに対するしきい 値を計算する。これまでのところ、しきい値の値は経験的に決定されている。別 の方法では、各機に対して計算される動的しきい値が導かれる。図２９は、ＲＯ Ｉの典型的なヒストグラム及びしきい値を示している。

５、しきい値と上限値との間の値を有する画素数を加算する。和は、焦点品質の 測定値であり、焦点度が変化すると共に変動する。

６、一旦焦点品質測定値が既知となったならば、ソフトウェアはそれを前の測定 値と比較し、光学焦点からの変位を計算する。トレーをこの位置まで移動させ、 焦点品質が最高となるまでステップが繰り返される。

細胞カウントアルゴリズム 細胞カウントアルゴリズムは機内に存在する細胞の数を決定する。

細胞カウント作業のステップを以下に記述する二１、像を取得する。

２、像のヒストグラムを計算する。

３、しきい値を計算する。理想的にはしきい値は図３０に示したようなヒストグ ラム上の位置に設定される。しきい値を見つけるためには以下のステップが実施 される：Ａ、ヒストグラムを平均し、１次導関数を計算する。

Ｂ、１次導関数を平均し、２次及び３次導関数を計算する。

Ｃ１低から高への強度変化を検索し、２次及び３次導関数の値が０と１の間であ る強度レベルを見つける。このことにより、突然の変化のヒストグラム空隙上の 領域が保証される。

Ｄ、ステップＣで見つけた強度レベルから出発し、高から低への強度変化を検索 し、３次導関数が負値から正値に変化する強度レベルを見つける。この値がしき い値であり、バックグラウンドとフォアグラウンドとの境界を示す。

４、像のしきい値以上の値を有する画素を走査する。画素が認められたならば、 エツジ追跡アルゴリズムを用いて物体の輪郭を描（。物体の面積を計算する。

５、物体の面積を、細胞面積の上限及び下限と比較する。

物体の面積が範囲内にあるならば、それを細胞として分類し、像から取り出す。

６、ステップ４及び５を、機内の全ての画素が走査されるまで繰り返す。

７、上限面積を越えた物体は実際には密接している複数の細胞であり得、従って 考慮する必要がある。かかる物体を見極めるため、脱凝集（ｄｅ−ｃｌｕｍｐｉ ｎｇ）または分解アルゴリズムが開発された。細胞は、周縁から中心へ向かって 正の強度勾配を有し、従って細胞の中央部は縁部よりも明るく見える。図３１は 、しきい値を１５３以下とした場合の２つの細胞の典型的なグレイスケール分布 を示している。しきい値が最も外側の領域よりも低い値に設定されていると、２ つの細胞は単一物体として見える。しきい値を大きくすると、細胞の寸法は減少 し、結果的に２つの別個の物体として見える。図３１は、しきい値を１８０〜２ １０に設定した場合の２つの細胞を示している。

脱凝集効果を得るため、現在のしきい値を所与の量に増加し、ステップ４〜６を 実施する。所定の条件が満足されるまで、例えば物体が認められないかまたは反 復回数が設定値、例えば５回に等しくなるまで、サイクルを繰り返す。

図３２は、このプロセスの間に計算された複数のしきい値を示している。

凝集検出の説明 本発明の１つの実施態様においては、装置の凝集検出は、ＣＣＤカメラを使用し 、標準９６ウエルマイクロタイタープレートに類似の使い捨てカートリッジの各 ウェルの像を得る。この像は、各ウェルごとに少なくとも８×８画素を８レベル ダレイスケ一ル表示によって与えるようにディジタル化され、最低でも２５６グ レイレベルを有する３０×３０画素アレーが推奨されるが、２５６またはそれ以 上の分解能を有する５１２ｘ４８４画素アレーを使用することもできる。かかる 像を図３３のＡ−Ｅに示す。図３３Ａは強陰性、図３３Ｂは弱陰性、図３３Ｃは 弱陽性、図３３Ｄは陽性、図３３Ｅは強陽性の反応である。

ディジタル化表示は、強度データの少なくとも１つの横断面図を得（横断面が１ つだけであるならばそれは中心を通る必要がある）、必要によってはノイズを排 除するために低域フィルタを使用し、リム情報を除去するために単純データ置換 法を使用することにより分析される。このリム補正は単に、前校正位置によって リムデータではないがリムに近いことが判っているデータを取り、この値を、化 学反応の結果によって生じたのではない強度遷移に拡張することからなる。この ように処理された強度を図３４の上段のグラフに示す。ここで、Ｘ軸は画素位置 情報であり、Ｙ軸はグレイスケール強度である。

強度のみに基づいてパターン認識及び微分類を実施することは可能であるが、こ の方法には、高度の位置再現性が要求されることや、細胞濃度及びピペット添加 量の非−貫性、光源の変動、並びに反応時間によって惹起される強度及び幾何学 的変化を含む幾つかの短所がある。

上記理由により、強度の導関数をめ、それを、かかる反応の分類及び評価の一次 手段とする。導関数を図３４の下段のグラフに示す。かかる導関数の強陰性から 強陽性への単調減少値に留意されたい。勾配和（ｓｌｏｐｅ　ｔ。

ｔａｌ）と称される各ウェルの導関数の負及び正のピークの絶対値の和をとるこ とにより、各ウェルの中央の“ボタン状部”、このボタン状部を取り巻く　“ハ ロ部”及びバックグラウンドの相対的な“鮮鋭度”に関係する数値が、絶対強度 値とは無関係に生成される。この方法は、熟練実験技術者の読取り及び評価方法 のエキスパートシステムモデルとして開発された。

最も重要な評価作業は、弱陰性Ｂと弱陽性とを識別することである。中央強度値 は同様であるが、ボタン状部、ノ）口部及びバックグラウンドの遷移は、絶対強 度よりは導関数による勾配情報を使用してより容易に分類可能である。

勾配和及び中央強度の典型的な値を以下に示す。各群における勾配和及び中央強 度の範囲は約＋／−１０単位である。

Ａ強陰性　７０　４０　０ Ｂ弱陰性　５０　４０　１ Ｃ弱陽性　３０　４０　２ Ｄ陽性　２０　５５　３ Ｅ強陽性　１０　７０　４ ＋／−１０範囲を含む上記値から判るように、勾配和情報のみに基づく評価アル ゴリズムは、強陰性、弱陰性及び陽性の間で重複することな（区別可能であり、 強陰性＝勾配和〉６０ 弱陰性＝４０〈勾配和〈６０ 陽性＝勾配和＜４０ となる。

しかしながら、勾配和のみを使用して弱陽性、陽性及び強陽性を区別すると、＋ ／−１０の範囲で不明確な評価となり得る。必要によっては、中央値によって陽 性をより容易に分類することができる： 弱陽性＝勾配和〈４０且つ中央値〈５０陽性＝勾配和く３０且っ５０く中央値＜ ６２強強拍＝勾勾配〉２０且っ中央値〉６２実際のカットオフ値は、予め保存さ れている統計情報もしくは内蔵校正ウェルまたはこれらの両方によって設定する ことができる。勾配和及び中央値を使用して評価するために線形回帰法を使用す ることもできるし、実験ごとの変動及び反応時間を内蔵コントロールを用いて調 整することもできる。主判別ツールとして勾配和を使用することにより、強度の みに基づく方法には見られないしっかりとした信頼性のある検出環境が可能であ るので、上記評価用パラメータを使用してニューラルネット（Ｎｅ　ｕ　ｒ　ａ 　１　ｎ　ｅｔｓ）を構築することもできる。

本発明装置の動作 本発明の装置の動作をＨＬＡ型判定において説明する。

作業員はまず公知の方法（例えばＦｉｃｏｌｌ　Ｈｙｐａｑｕｅ　ｍｅｔｈｏｄ ）によって問題の細胞を単離する。

反応カートリッジ１０には通常試薬が凍結乾燥状態で備えられているので、作業 員はカートリッジ１０を溶かす。カートリッジ１０は、アッセイタイプ及び他の 情報を含む予め印刷されたバーコードを有するのが好ましい。次いで作業員は、 マイクロコンピュータのキーボードを使用して患者情報をタイプ入力することに より患者データをログインする。

作業員は、ピペットによって分注するために常磁性ビーズ及び発蛍光団をカート リッジ１ｏのウェル１２内に入れる。次いで、５０μｌの試料細胞が試料ウェル ｌｌａ、１１ｂまたは両方に作業員によって手作業で入れられる。次いで作業員 はカートリッジ１ｏを自動化装置のロード域３０内にロードする。ピペットロボ ット３４がカートリッジ１０を回収し、更にそれを、予め印刷されているカート リッジバーコード上の情報を読み取るためにバーコードリーダーまで移動させる 。

ピペットロボット３４はカートリッジ１ｏを輸送し、それをピペット下に置（。

そうするとピペットはウェル１２から５０μｌの常磁性ビーズ及び緑色発蛍光団 をとって試料ウェルに加える。適当な緑色発蛍光団は表１に示した５゜６カルボ キシフルオレセインである。次いで混合液は、インキュベーション域３８におい て、インキュベータ周囲温度３４℃＋／−２℃で１０分間インキュベートされる 。ピペットロボット３４はカートリッジ１０を回収し、更にそれをピペットまで 移動させる。

次に、常磁性ビーズに付着した細胞を保持するために、希土類磁石（Ｐｅｒｍａ ｇ、ＩＬ）のような磁石が試料ウェル近傍に置かれる。そうして、未結合の細胞 を洗い流すために試料ウェルｌｌａ及びｌｌｂが洗浄される。試料ウェルｌｌａ 及びｌｌｂの各々から７０μｌが廃棄プロッタ中に吸引され、更に同容量の７０ μｌの緩衝液が試料ウェル１１ａ及びｌｌｂに加えられる。この洗浄ステップが ３〜４回繰り返され、終審量１００μｌが残される。

次いで磁石が取り除かれ、細胞は試料ウェルｌｌａ及び１１ｂ内で再懸濁及び混 合される。０．５μｌの細胞が、カートリッジ１０の反応ウェル１６の１つにピ ペットで添加される。ＣＣＤを使用し４９０ｎｍにおいて読み取ることにより、 この反応ウェルにおける細胞がカウントされる。

細胞数が不適当である場合は作業員に信号が与えられ、カートリッジは拒否され る。細胞数が多すぎる場合は、細胞数を推定し、希釈する必要がある。

細胞数が適当であったかまたは細胞数が希釈されたならば、０．５μｌの細胞が 各反応ウェル１６中に分注される。

次いでカートリッジ１０は、３４℃＋／−２℃のインキュベータ域３８に約３０ 分間移される。４８０μｌの緩衝液を含む再水和補助試薬／赤色発蛍光団混合液 がピペットに与えられる。適当な赤色発蛍光団は表１に示したヨウ化プロピジウ ムである。カートリッジ１０がピペットまで移動されると、ピペットは反応ウェ ル１６ごとに３μｌの補助試薬を分注する。全ての反応ウェル１６が完了すると 、カートリッジ１０はインキュベータ域３８に移され、分析中の試料に応じて３ ０〜４５分間インキュベートされる。必要によっては、ピペットは反応ウェル１ ６ごとに５０μｌの緩衝液を分注することができる。次いでカートリッジ１０は イメージロボット４０によって回収され、各ウェルは４９０ｎｍ１５４０ｎｍに おいて像処理され、結果及び／像が保存される。試料が像処理された後（細胞が カウントされ、評価された後）、カートリッジ１０はアンロード域４６に移され 、そこで作業員によって手作業でアンロード本発明の装置及び方法の使用をより 明確に説明するために以下の実施例を与える。

実施例１　像分析のための補助試薬依存性小リンパ球毒性を使用する２色蛍光に よるＨＬＡ型判定図１を参照すると、ウェルｌｌａ及びｌｌｂは、ＨＬＡ型判定 を実施すべき白血球懸濁液を保持するための容器を指す。リンパ球精製は、公開 方法（Ｖａｒｔｄａｌ　Ｆ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｔｉ５ｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１９８６；　２８　：　３Ｏ− １３１２）に従ってＣＤ２またはＣＤ８モノクローナル抗体に結合させた常磁性 粒子（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ 、ＭＡ）から購入、商標ＢＩＯＭＥＧ）を使用して行なった。クラスＩＩ型判定 に対しては、Ｌ２４３のようなモノクローナル抗体を、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａ ｇｎｅｔｉｃｓＩｎｃ、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入される同様の常 磁性粒子に結合することもできる。最初に精製リンパ球懸濁液を２つの試料ウェ ルｌｌａまたはｌｌｂの一方に手作業でロードした後は、後続の全てのステップ は本発明装置によって制御される。カートリッジ１０には、型判定用血清、常磁 性粒子及び５．６　カルボキシフルオレセインジアセテート（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、 ＭＯ）混合液、クラス■またはＩＩＨＬＡ型判定を実施するのに必要な凍結乾燥 補助試薬（Ｐｅｌ　Ｆｒｅｅｚｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗ■）及びヨウ化プロ ピジウム（Ｓ　ｉ　ｇｍａ、ＭＯ）混合液を含む試薬が含まれていた。容量１０ ０μｌの常磁性粒子及び５．６　カルボキシフルオレセインジアセテート混合液 を１００μＩのリンパ球試料中にピペット添加した。室温で１０分間インキュベ ートした後、ウェルの下側を希土類（Ｐｅｒｍａｇ、ＩＬ）磁石に１５秒間当接 することにより、染色されロゼツト化した細胞を未結合の白血球から分離した。

次いで、ロゼツト化細胞を、前述の磁性装置によって適所に維持しながら、それ ぞれ３００μｌのＩ　ＴＤＸ（登録商標）緩衝液（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ、Ｉ Ｌ）で３回洗浄した。最低０．５μｌのロゼツト化白血球が、２゜５μｌの鉱油 中に沈められた０、５μｍ以上のＨＬＡ型判定血清を含む反応ウェル１６内にピ ペット添加された。３０分間のインキュベーションの終了後、２ｍｇ／ｍｌのヨ ウ化プロピジウムを含む最低３μｍのウサギ血清（補助試薬）が各反応ウェル１ ６に加えられた。室温で３０分間インキュベートする反応が実施された。リンパ 球溶解（ｌｙｍｐｈｏｌｙｓｉｓ）の程度が変化することで陽性反応が示された 。５，６　ＣＤＦ染色細胞は、励起（４５０〜４９０ｎｍ）及び発光（５２０〜 ５６０ｎｍ）フィルタセラ）（Ｎｉｋｏｎ、日本）のちとに視認され、一方、Ｐ Ｉ染色細胞は、励起（５１０〜５６０ｎｍ）及び発光（５９゜ｎｍ）フィルタセ ットを使用して観察することができた。

実施例２　生検材料または組織断片における生化学マーカーのための標識細胞の 免疫細胞化学染色料のアッセイにおいては、イムノペルオキシダーゼ細胞化学法 を用いる正常及び異常乳房組織におけるヒトエストロゲンレセプター発現を使用 した。組織を採取し、Ａｂｂｏｔｔ−ＥＲ−ＩＣＡ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａ ｓ５ａｙ　（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ　ｐａｒｋ。

ＩＬ）に従ってイムノペルオキシダーゼ反応を使用して調製した。有意な量のエ ストロゲンレセプターを含まない細胞の核は淡青色を示すはずであり、これに対 して、エストロゲンレセプター発現が高まっている腫瘍細胞は赤褐色に見えるは ずであった。この方法の適用は、ＤＮＡ／ＲＮＡプローブを使用する現場ハイブ リダイゼーション法、または種々の同位体、化学色素、免疫反応もしくは酵素／ 基質の組合せを含む他の免疫染色法と併用し、他の細胞または亜細胞生化学マー カーに拡張することができる。生化学マーカーとしては、タンパク質、炭水化物 、脂質、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。検体は、血液塗抹 ；生検材料または細胞塗抹；または化学固定、凍結もしくは標準方法に従うパラ フィン切断法によって調製される組織薄片のいずれかであり得る。

実施例３　被分析物質判定の前面イムノアッセイ以下に詳述するように、本発明 の著しく有利な点は、種々のタイプのアッセイを実施するよう装置を改善し得る ことである。例えば本発明の装置及び方法は、蛍光または比色イムノアッセイの 精度及び感受性を増強するために使用することができる。異なるアッセイタイプ の１例においては、反応は９６ウエルマイクロタイターカートリツジ（Ａｂｂｏ ｔｔ　Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋｓ、ＩＬ）において実施される。試薬 混合、インキュベーション及びシグナル生成は反応ウェル内で行われる。試料反 応においては、常磁性粒子を当業者には周知の方法によってマウスＩｇＧで被覆 する。マウスＩｇＧを検出するためには、βガラクトシダーゼで標識されたヤギ 抗マウスが使用される。

反応を開始するため、５０μｌのマウスＩｇＧ被覆常磁性粒子を同容量のヤギ抗 マウス−βガラクトシダーゼ結合体と反応ウェル内で室温で２０分間混合する。

常磁性粒子は磁石を用いて適所に保持しておき、未結合のヤギ抗マウス−βガラ クトシダーゼ結合体を、全部で５００μｌのＴＤＸ（登録商標）緩衝液（Ａｂｂ ｏｔｔ　Ｌａｂｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ）を用いて洗い流した。容量５０μ ｌの発蛍光性物質、例えばジ−β−ガラクトシルフルオロ上イン（Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ、ＭＯ）を粒子に加える。蛍光濃度または吸収変化を、上述の像分析装置によ ってモニタすることができる。

実施例４　凝集によるＢ型肝炎表面抗原の検出試薬と９６反応ウェルＶ底凝集プ レートとを含む、Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈ ｉｃａｇｏ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ　６００６４販売のＡｂｂｏｔｔ　Ａｕ５ｃｅｌ ｌ（登録商標）キットを使用し、与えられた手順に従って凝集アッセイを実施し た。Ａｂｂ。

ｔｔ　Ａｕ５ｃｅｌｌ（登録商標）キットの手順は参照により本明細書の一部を 構成するものとし、これは、Ｂ型肝炎表面抗原検出用逆受身血球凝集のためのも のである。凍結乾燥された抗体−感作硬膜細胞（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄｄｕｒａ ｅｙｔｅ　ｃｅｌｌｓ）を再構成溶液を用いて再構成した。２５μｌの検体希釈 緩衝液を各反応ウェルに加えた。２μｌの試験血清を適当なウェルに加えた。次 いで、２５μｌの抗体−感作硬膜細胞を各反応ウェルに加えた。プレートまたは カートリッジトレーの側部を軽くたたくことにより反応ウェル内の反応物質を混 合し、プレートを振動させずに２時間インキュベートしてから、本発明に使用さ れる装置を使用して読取った。

現場改良 本発明の装置及び方法は従来の装置よりも著しい利点を与える。かかる利点の一 部は上記説明のなかに記述されている。ここに詳述する別の著しい利点は、種々 のアッセイを実施するための装置の拡張性と、装置が種々のアッセイを実施する ように改良するために行われるべき変更が最小限であることとにある。

上述したように、試料調製の多様性及び他の例外事項によって、全てではないが ほとんどの入手可能な系の有用性は制限されている。なぜならば、かかる系には 、その多様性を受容するためには大幅なハードウェアの設計変更が必要であるか らである。更に、入手可能な自動化アッセイ装置は、単一種類のアッセイに専用 である。ここでも、当初意図された以外のアッセイを実施するためには、装置を 改良すべくハードウェアの大幅な設計変更が必要とされる。

本発明の装置は、上記制限を持たない構成を提供する。

本発明の装置及び方法は、アッセイ試験における多様性を受容するためまたは種 々のアッセイを実施するために容易に再構成することができる。変更は単に、光 学フィルタ及び対物レンズを交換する、並びに／または像処理アルゴリズムを変 更することと、他の若干の変更とが必要なだけである。現場改良を行な・う前に 、アルゴリズムを開発し、適当なフィルタ及び対物レンズを選択することができ る。現場で改良を行う人間が多大な努力をせずとも、かかる変更または改良が現 場で実施され得ることが理解されよう。

アッセイステップは自動的に実施されるので、有意な量の作業員の時間が削減さ れる。本発明の装置を使用して行われたＨＬＡアッセイにより作業員は、手作業 でステップを実施するのに要する時間の６３％〜８０％の時間を節約することが できる。

該装置におけるリーグは、蛍光、凝集、吸収及び化学ルミネセンスアッセイを読 取るように構成することができる。

また、細胞形態を決定することもできる。他のアッセイは、より高い分解能並び により優れた感受性及び安定性を要求することもできる。このことは、異なるコ ンピュータハードウェア及び場合によってはより長い処理時間を必要とする別の カメラを用いて解決され得る。

上述の好ましい実施態様の記述は説明を目的としたものである。これらは本発明 を網羅するものでもないし、また本発明をここに開示した形態に制限するもので もない。本発明の範囲は、全ての等個物を含む以下の請求の範囲によってのみ規 定される。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ ＴＤＴ ＦＩＧ、　１Ｂ ＦＩＧ、１Ｂ 強度 強度 強度 ＦＩ６．３３

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．アッセイを実施するためのプログラマブルランダムアクセス自動化装置にお いて光学像を形成するために反応ウェルを自動位置決めする方法であって、 まず像内で前記反応ウェルの縁部を位置決めし、次いで該ウェルの中心を位置決 めすることにより、像内での該ウェルの位置を判定し； 前記像の各側面における断面またはライン状の画素を得前記断面を、４つの可能 性： （ａ）タイプ１−全てが白色画素； （ｂ）タイプ２−全てが黒色画素； （ｃ）タイプ３−白から黒または黒から白への１回の遷移； （ｄ）タイプ４−白から黒及び黒から白、または黒から白及び白から黒への２回 の遷移 に分類し； 前記１組の断面のタイプを総合的に分析することにより視野内での前記ウェルの 向きを決定し；前記ウェルの向きが決定されたところで該ウェルの座標を計算す る ことを含む方法。
2. ２．アッセイを実施するためのプログラマブルランダムアクセス自動化装置にお いて光学像を形成するために反応ウェルを自動焦点調整する方法であって、 前記反応ウェルの像の最大鮮鋭度を決定し；前記像を取得し、且つ該像の鮮鋭度 を測定し；光学焦点に対するＺ軸の変位を計算し；トレーを新たな位置まで移動 させ、前記処理を、該ウェルが視野の中央にくるまで繰り返す ことを含む方法。
3. ３．アッセイを実施するためのプログラマブルランダムアクセス自動化装置にお いて反応ウェルの内容物の光学像を形成するために自動焦点調整する方法であっ て、前記像を取得することにより該像の最大鮮鋭度を判定し前記反応ウェルの縁 部に沿って問題領域を生成し；像処理する際の問題領域の面積を制限し、従って 計算に必要な時間を短縮し； 前記問題領域においてＳｏｂｅｌエッジフィルタを実施し； 前記問題領域においてヒストグラムを計算し；前記ヒストグラムのしきい値を決 定し；前記しきい値と上限値との間の値を有する画素の数をまとめ、この和を焦 点品質の測定値とし；前記焦点品質測定値を前回の測定値と比較し、光学焦点か らの変位を計算し； 前記反応ウェルを前記光学焦点位置まで移動させ、前記自動焦点調整ステップを 、焦点像質が最高となるまで繰り返す ことを含む方法。
4. ４．細胞カウントを必要とするアッセイを実施するためのプログラマブルランダ ムアクセス自動化装置において光学像形成によって反応ウェル内の細胞をカウン トする方法であって、 前記像を取得することにより得られる、前記反応ウェルの像内に存在する細胞の 数を判定し； 前記像のヒストグラムを計算し； 前記ヒストグラムを平均し、１次導関数を計算することにより該ヒストグラムの しきい値を計算し；前記１次導関数を平均し、更に２次及び３次導関数を計算し ； 低から高への強度変化を検索し； 前記２次及び３次導関数の値が０と１の間である強度レベルを判定し、それによ って前記ヒストグラムの急変空隙域を保証し； 前記強度レベルから出発して、高から低への強度変化を検索し、前記３次導関数 が負値から正値に変化する強度レベルを判定し、前記値を、バックグラウンドと フォアグラウンドとの境界を示すしきい値とし； 前記しきい値以上の値を有する画素の像を走査し；１つの画素が認められたとき に周縁追跡アルゴリズムを用いて当該物体の輪郭を決定し、その物体の面積を計 算し前記物体の面積を細胞面積の上限及び下限と比較し、該物体の面積が適正範 囲内にあるならばそれを細胞として分類し； 該物体を像から消去し； 像内の全ての画素が走査されるまで、走査、輪郭決定、及び比較のステップを繰 り返す ことを含む方法。
5. ５．前記面積上限を超えた物体に、 細胞は周縁から中心に向かって正の強度勾配を有し、従って細胞の中心は縁部よ りも明るく見えることに基づく脱クランプアルゴリズムを開発し； ２つの細胞に対して、しきい値を１５３以下とした場合の２つ以上の細胞の典型 的なグレイスケール分布を分析し前記しきい値を大きくし、従って細胞寸法を小 さくし、最終的に２つの別個の細胞の像を与え；物体が認められなくなるかまた は反復回数が設定値に等しくなるまで前記サイクルを繰り返す ことを含む請求項４に記載の方法。