JP6919181B2 - 液滴分注装置、液滴分注方法、及び被着対象物の製造方法 - Google Patents
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Description
粒子を含む液滴を形成し、液滴を被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる液滴形成手段と、
着滴した液滴に含まれる粒子を撮像する撮像手段と、
撮像手段により撮影した画像から液滴に含まれる粒子を計数する粒子計数手段と、を有する。
本発明の液滴分注装置は、被着対象物と、液滴形成手段と、撮像手段と、粒子計数手段とを有し、乾燥手段、移動手段、及び制御手段を有することが好ましく、更に必要に応じてその他の手段を有する。
本発明の液滴分注方法は、液滴形成工程と、撮像工程と、粒子計数工程とを含み、乾燥工程、移動工程、及び制御工程を含むことが好ましく、更に必要に応じてその他の工程を含む。
また、本発明の液滴分注装置及び液滴分注方法は、被着対象物の複数の凹部(ウェル)の所定位置に液滴を着滴させることで、ウェル内において粒子を探すための所作が不要となるため、粒子計数にかかる処理時間を短縮することができる。
以下、本発明の液滴分注装置の説明を通じて、本発明の液滴分注方法の詳細についても明らかにする。
被着対象物は、液滴形成手段で形成された粒子を含む液滴が着滴する複数の凹部が形成された部材である。
被着対象物としては、液滴形成手段から吐出された液滴が付着することができれば、その材質、形状、大きさ、構造などについて特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
被着対象物の材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、半導体、セラミックス、金属、ガラス、石英ガラス、プラスチックスなどで形成されたものが好適に挙げられる。
なお、被着対象物の下方から凹部内に着滴された粒子を撮像する場合には、透明性の高い材質を用いることが好ましく、例えば、樹脂製、ガラス製のプレートが好適に使用される。
被着対象物の形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、板状、プレート状などが好ましい。
被着対象物の構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、単層構造であっても複数層構造であっても構わない。
被着対象物に設ける凹部の数は、複数であり、2つ以上が好ましく、5つ以上がより好ましく、50以上が更に好ましい。
液滴誘導手段は、被着対象物の凹部の中央部に設けられていることが、少なくとも1つの凹部が形成された被着対象物の凹部の中央部に、液滴を高い精度で着滴させることができる点から好ましい。
液滴誘導手段としては、被着対象物の少なくとも1つの凹部の中央部と周辺部とを異なる電荷状態にするため、凹部の中央部及び周辺部の少なくともいずれかに配置された液滴誘導用電極であることが好ましい。これにより、液滴吐出部により吐出された液滴を電気的に凹部の中央部へ引っ張って誘導することができる。また、凹部の中央部及び周辺部の少なくともいずれかを同時に荷電することができ、高スループット化できる。
周辺部に配置された液滴誘導用電極は、吐出された液滴と反発する電荷を有することが好ましい。
中央部に配置された液滴誘導用電極は、吐出された液滴を引き寄せる電荷を有することが好ましい。
凹部の中央部は、凹部の中心から半径2.5mm以下が好ましく、半径1.0mm以下がより好ましく、半径0.25mmが更に好ましい。凹部の周辺部は、凹部の中央部以外である。
液滴誘導用電極を凹部の周辺部に配置する場合には、凹部の周縁に環状(リング状)に設けることが好ましい。
液滴誘導用電極の材質としては、例えば、ニッケル、銅、銀、金、ニッケル−クロム合金、ステンレス鋼、あるいはこれらの合金又は混合物、カーボン、白金、タンタル、ITO(Indium Tin Oxide)、亜鉛、カーボンナノチューブ、チオフェン、グラフェン、ピロール類などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
液滴誘導用電極は、被着対象物の凹部を跨ぐような棒状形状であってもよい。液滴誘導用電極を被着対象物の凹部を跨ぐように設けることにより、液滴誘導用電極同士をつなぐ配線数を減らすことができ、液滴分注装置の構成部品を少なくすることができる。
液滴形成手段は、粒子を含む液滴を形成し、液滴を被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる手段である。
液滴形成工程は、粒子を含む液滴を形成し、液滴を被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる工程であり、液滴形成手段により好適に行うことができる。
液滴吐出部は、粒子を含む液滴を吐出させる部である。
光を受光したときに発光可能な粒子としては、蛍光を受光して飛翔液滴中の粒子数をカウントできる点から、蛍光タンパク質を発現する細胞、蛍光色素により染色された染色細胞、蛍光色素により染色された無機微粒子、蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子が好ましく、蛍光タンパク質を発現する細胞、蛍光色素により染色された染色細胞が特に好ましい。
染色細胞における蛍光色素としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、セルトラッカーオレンジ、セルトラッカーレッド、エオシン、ローダミン6Gなどが挙げられる。
蛍光色素により染色された有機ポリマー粒子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、SPHERO Fluorescent Nile Red particles(ベイバイオサイエンス株式会社製、1%(w/v)、直径10μm〜14μm)などが挙げられる。
真核細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましく、細胞が細胞集合体を形成する場合は、細胞と細胞とが互いに接着し、物理化学的な処理を行わなければ単離しない程度の細胞接着性を有する接着性細胞がより好ましい。
分化した細胞としては、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞;星細胞;クッパー細胞;血管内皮細胞;類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞;繊維芽細胞;骨芽細胞;砕骨細胞;歯根膜由来細胞;表皮角化細胞等の表皮細胞;気管上皮細胞;消化管上皮細胞;子宮頸部上皮細胞;角膜上皮細胞等の上皮細胞;乳腺細胞;ペリサイト;平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞;腎細胞;膵ランゲルハンス島細胞;末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞;軟骨細胞;骨細胞などが挙げられる。接着性細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、又はそれらを何代か継代させたものでもよい。
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞;単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞;iPS細胞などが挙げられる。
原核細胞としては、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。
液体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン交換水、蒸留水、純水、生理食塩水などが挙げられる。
また、液滴の直径をRとし、粒子の直径をrとすると、R>3rであることが好ましい。R>3rであると、粒子の直径と液滴の直径との関係が適正であり、液滴の縁の影響を受けることがないため、粒子の計数精度が向上する。
液滴の液量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1,000pL以下が好ましく、100pL以下がより好ましい。
液滴の液量は、例えば、液滴の画像から液滴の大きさを求め、液量を算出する方法などにより測定することができる。
液滴吐出部としては、オープンヘッド、及びクローズヘッドのいずれであっても構わない。
液体保持部は、光を照射されたときに発光可能な粒子を含む液体を保持する部である。
液滴吐出部がオープンヘッドの場合には、大気開放部を上部側に有している。なお、大気開放部の位置は上部に限定されない。液体中に混入した気泡は大気開放部から排出可能に構成されている。
液体保持部の材質としては、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム等や、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどが挙げられる。
これらの中でも、粒子として細胞やタンパク質を用いる際には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることが好ましい。
細胞の付着性は一般的に材質の水との接触角に依存性があると言われており、材質の親水性が高い又は疎水性が高いときには細胞の付着性が低い。親水性の高い材料としては各種金属材料やセラミックス(金属酸化物)を用いることが可能であり、疎水性が高い材料としてはフッ素樹脂等を用いることが可能である。
これら以外にも、材料表面をコーティングすることで細胞接着性を低下させることも考えられる。例えば、材料表面を前述の金属又は金属酸化物材料でコーティングすることや、細胞膜を模した合成リン脂質ポリマー(例えば、日油株式会社製、Lipidure)によってコーティングすることが可能である。
膜状部材は、吐出口(ノズル)が形成され、液体保持部に保持された液体をその振幅運動による振動により吐出口から液滴として吐出する部材である。
膜状部材は、液滴吐出部がオープンヘッドの場合には、液体保持部の下端部に固定されている。
膜状部材は、液滴吐出部がクローズヘッドの場合には、液体保持部の上端部に固定されている。
液体保持部に保持された液体は、膜状部材の振動により貫通孔である吐出口から液滴として吐出される。
膜状部材の平面形状としては、例えば、円形、楕円形、長方形、正方形、菱形などが挙げられる。
膜状部材の材質としては、柔らかすぎると膜状部材が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さを有する材質を用いることが好ましく、例えば、金属、セラミックス、高分子材料などが挙げられ、具体的には、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム、二酸化ケイ素、アルミナ、ジルコニアなどが挙げられる。これらの中でも、液体保持部と同様に、粒子として細胞やタンパク質を用いる場合には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることが好ましい。
吐出口としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、1つであってもよいが、複数の吐出口であることが、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができ、生産性を向上できる点から好ましい。
複数の吐出口としては、その配列数、配列態様、間隔(ピッチ)、開口形状、開口の大きさなどについては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
吐出口の配列数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、液滴吐出部の吐出面の長さ方向に沿って1列以上配設されていることが好ましく、1列以上4列以下がより好ましい。吐出口を1列以上設けることにより、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができると共に、粒子の種類(例えば、細胞の種類など)応じて列を変えて一度に吐出することができる。
1列当たりの吐出口の数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択されるが、2個以上100個以下が好ましく、2個以上50個以下がより好ましく、2個以上12個以下が更に好ましい。1列当たりの吐出口の数が2個以上100個以下であると、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させることができる高い生産性を有する液滴分注装置を提供することができる。
複数の吐出口の配列態様としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、規則配列(例えば、千鳥格子配列など)であっても、不規則配列であってもよい。
複数の吐出口が、複数列である場合には、隣接する吐出口から吐出される液滴同士の干渉を防止でき、粒子の検出感度を向上させるため、各列の間に仕切り部材を設けることが好ましい。仕切り部材としては、例えば、仕切り板などが挙げられる。
複数の吐出口は、等間隔に並んで配列されていることが好ましく、隣接する吐出口の中心間の最短距離である間隔(ピッチ)Pとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、50μm以上1,000μm以下が好ましい。
複数の吐出口の開口形状としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円形、四角形などが挙げられる。
複数の吐出口の平均径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、粒子が吐出口に詰まることを避けるため、粒子の大きさの2倍以上とすることが好ましい。
粒子が、例えば、動物細胞、特にヒトの細胞である場合、ヒトの細胞の大きさは、一般的に、5μm以上50μm以下であるため、複数の吐出口の平均径は、使用する細胞に合わせて、10μm以上100μm以下が好ましい。
一方で、液滴が大きくなり過ぎると、微小液滴を形成するという目的の達成が困難となるため、複数の吐出口の平均径は、200μm以下であることが好ましい。したがって、複数の吐出口の平均径は、10μm以上200μm以下がより好ましい。
振動部材は、膜状部材を振動させて吐出口(ノズル)から液滴を吐出させる部材である。
振動部材は、液滴吐出部がオープンヘッドである場合には、膜状部材の下面側に形成されている。
振動部材は、液滴吐出部がクローズヘッドである場合には、膜状部材の上面側に形成されている。
振動部材の形状、大きさ、材質、及び構造については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
振動部材の形状としては、特に制限はなく、膜状部材の形状に合わせて適宜設計することができるが、例えば、膜状部材の平面形状が円形である場合には、クローズヘッドの場合には、円形の振動部材を設けることが好ましい。また、オープンヘッドの場合には、複数の吐出口の周囲に平面形状が円環状(リング状)の振動部材を形成することが好ましい。
圧電材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ジルコン酸チタン酸鉛(PZT)、ビスマス鉄酸化物、ニオブ酸金属物、チタン酸バリウム、又はこれらの材料に金属や異なる酸化物を加えたものなどが挙げられる。これらの中でも、ジルコン酸チタン酸鉛(PZT)が好ましい。
第2の光照射部は、液滴吐出部から吐出された液滴に光を照射する部である。
固体レーザーとしては、例えば、YAGレーザー、ルビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。
YAGレーザーの市販品としては、例えば、Explorer ONE−532−200−KE(スペクトラ・フィジックス株式会社製)などが挙げられる。
レーザーのスポット径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、100μm以上2,000μm以下が好ましい。スポット径が100μm以上2,000μm以下であると、飛翔液滴の吐出ばらつきが発生した場合においても液滴にレーザーが照射される確率が高くなるため、液滴内の粒子のカウント精度低下を抑制可能であるという利点がある。
パルス光のパルス幅としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、10μs以下が好ましく、1μs以下がより好ましい。
単位パルスあたりのエネルギーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、集光の有無等の光学系に大きく依存するが、0.1μJ以上が好ましく、1μJ以上がより好ましい。
第2の光照射部としては、液滴の吐出に同期して光を照射できることが好ましい。これにより、異なる位置から吐出された液滴に、光をより確実に照射することができる。
ここで、同期するとは、液滴が吐出されて所定位置に達したときに第2の光照射部が光を照射することを意味する。つまり、第2の光照射部は、液滴の吐出に対して、所定時間だけ遅延して光を照射する。
第2の光照射部から照射される光は、飛翔中の液滴1つに照射されることが好ましい。
受光部は、光を照射された粒子からの発光を受光する部である。
二次元素子としては、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)撮像素子、ゲートCCDなどが挙げられる。
受光部としては、CMOS撮像素子を有するカメラが好ましい。
CMOS撮像素子を有するカメラの市販品としては、例えば、高感度カメラ(pco.edge、sCMOS、株式会社東京インスツルメンツ製)などが挙げられる。
受光部が1つであると、飛翔する液滴に複数個の光が照射されたときに発光可能な粒子が含まれる場合に、光が照射されたときに発光可能な粒子同士が重なることに起因して、粒子計数手段が液滴に含有された光が照射されたときに発光可能な粒子の個数を誤検知する(カウントエラーが発生する)おそれがあるが、受光部を2以上設けることで光が照射されたときに発光可能な粒子が重なる影響を低減することが可能である。
後述する粒子計数部としては、光が照射されたときに発光可能な粒子の輝度値あるいは面積値と、予め設定された閾値とを比較することで実行可能である。受光部を2以上設置する場合、それぞれの受光部から得られる輝度値あるいは面積値のうち、最大値を示すデータを採択することで、カウントエラーの発生を抑制することが可能である(粒子の重なりが生じた場合、輝度値及び面積値のいずれも低減する結果となるため)。また、二次元受光素子を複数設置する場合、得られる複数の形状データを基に、粒子数を推定するアルゴリズムにより粒子数を決定づけてもよい。
なお、コントラストを向上するため、第2の光照射部から出射される光が直接入射しない位置に受光部を配置することが好ましい。
なお、ここで、「同期する」とは、例えば、複数の液滴が吐出されて所定位置に達したときに液滴に光が照射され、光が照射されたときに発光可能な粒子が発光するタイミングで、受光部が発光を受光することを意味する。つまり、受光部は、異なる位置からの複数の液滴の吐出、及び光照射部による光の照射に対して、それぞれ所定時間だけ遅延して発光を検出する。
フィルタとしては、例えば、光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタなどが挙げられる。
粒子計数部は、受光部により受光した発光に基づき、液滴に含まれる粒子を計数する部である。
粒子計数部としては、例えば、CPU(Central Processing Unit)、ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、粒子計数部の各種機能は、ROM等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてCPUにより実行されることによって実現できる。但し、粒子計数部の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、粒子計数部は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
粒子計数部は、例えば、受光部が受光した光量と予め設定された閾値とを比較して、粒子の個数を検知することができる。この場合には、受光部として一次元素子を用いても二次元素子を用いても構わない。
受光部として二次元素子を用いる場合は、粒子計数部は、受光部から得られた二次元画像に基づいて、粒子の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、粒子計数部は、画像処理により粒子の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、粒子の個数を検知することができる。また、二次元素子を用いる場合には、発光を受光する直前のタイミングにて液滴の画像を撮影することで、不吐出検知も可能となる。
なお、粒子の個数が0個である液滴を被着対象物に付着させないようにすることもできる。これにより、被着対象物の汚損を防止することができる。
更に、異なる位置から所定の回数の液滴を吐出した後に、後述する記録部に記録した発光の輝度値及び発光の受光面における形状の情報を読み出し、吐出させた各々の液滴に含まれる粒子の個数を計数するようにしてもよい。
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、駆動部、光学系、記録部を有することが好ましい。
撮像手段は、被着対象物に着滴した液滴に含まれる粒子を撮像する手段である。
撮像工程は、被着対象物に着滴した液滴に含まれる粒子を撮像する工程であり、撮像手段により好適に行うことができる。
走査部による対物レンズの走査により、深さ方向の焦点深度を50μm以下の間隔において、撮像素子による複数枚の撮影を行うことが好ましい。
これにより、複数枚の画像の中から、コントラストの高い画像を選択取得できるため、ウェル内の粒子数のカウント精度を向上させることができる。
凹部に着弾した液滴内の粒子は液滴周縁部の影に隠れてしまい、粒子数のカウントが困難になってしまう。そのため、液滴が着弾した後、乾燥するまでのタイムディレイを設けた後に撮像することが好ましい。
この際、被着対象物の凹部に着滴している液滴を乾燥させるための乾燥手段を有していると、液滴が乾燥するための時間を短縮化できるので好ましい。
乾燥手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、温風ヒータ、赤外線ヒータ、赤外線乾燥装置、マイクロ波乾燥装置などが挙げられる。
粒子は焦点位置がずれると画像のコントラストが悪化するため、取得した画像から粒子数を正確にカウントすることが困難となってしまう。そのため、凹部内に液滴が着弾した後、走査装置により複数枚の画像を取得することにより、コントラストの高い画像を選択・取得することが可能となる。
細胞のスケールは、約10μm程度であり、10μmの粒子を用いた場合には焦点位置が50μmより大きくずれた場合には細胞の輪郭を抽出することが困難になり、良好な個数カウントができなくなってしまう。そのため、走査する焦点位置の間隔は50μm以下に設定することが好ましい。走査する間隔を小さくするほどカウントエラーの発生頻度を抑制可能であるが、同時に走査回数(撮影枚数)が増えるため、処理時間の増大に繋がる。したがって、測定する粒子の大きさに合わせてスキャンする間隔を最適値に設定することがより好ましい。
なお、焦点位置のずれは、ウェルプレートのウェルの形状(例えば、平底、丸底、U底、V底など)やウェルプレートの公差等によって発生するため、それら全てを考慮した上で想定される焦点位置のずれを予め見積もった上で、スキャン回数(取得する画像の数)を設定することが好ましい。
第1の光照射部により粒子に光を照射し、粒子からの発光を撮像素子が受光することが好ましい。
これにより、粒子(細胞)が発光するため、液滴の溶媒の蒸発が完了していない場合、あるいは被着対象物の凹部を形成していない側から撮像する場合の検出感度を向上させることができる。したがって、乾燥手段は不要である。
固体レーザーとしては、例えば、YAGレーザー、ルビーレーザー、ガラスレーザーなどが挙げられる。
YAGレーザーの市販品としては、例えば、Explorer ONE−532−200−KE(スペクトラ・フィジックス株式会社製)などが挙げられる。
レーザーのスポット径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、100μm以上2,000μm以下が好ましい。
粒子計数手段は、撮像手段により撮影した画像から液滴に含まれる粒子を計数する手段である。
粒子計数工程は、撮像工程で撮影した画像から液滴に含まれる粒子を計数する工程であり、粒子計数手段により好適に行うことができる。
粒子計数手段は、本発明の液滴分注装置の各動作を制御するCPU(Central Processing Unit)、ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)、メインメモリなどを有し、液滴分注装置全体の動作を制御するための制御プログラムに基づいて各種処理を実行する。
粒子計数手段は、撮像素子として二次元素子を用いる場合には、画像処理により蛍光粒子の面積値を算出し、予め設定された閾値と比較することにより、個数を検知することができる。画像の形状をもとにした個数判定アルゴリズムを加えると更に好ましい。
撮像素子として1次元素子を用いる場合には、得られた蛍光量をもとに、予め設定された閾値と比較することにより、粒子の個数のカウントが可能である。
移動手段は、被着対象物を平面内で移動させる手段である。
移動工程は、被着対象物を平面内で移動させる工程であり、移動手段により好適に行うことができる。
被着対象物の凹部が形成されていない側に移動ステージを有しているので、撮像手段による粒子の撮像は、被着対象物の凹部が形成されている側から行われる。
これにより、被着対象物として透明性の高い材料を用いる必要がなく、不透明な材料として、例えば、金属材料、セラミックス材料等も適用可能である。
制御手段は、液滴形成手段と複数の凹部との相対的な位置関係を制御する手段である。
制御工程は、液滴形成手段と複数の凹部との相対的な位置関係を制御する工程であり、制御手段により好適に行うことができる。
その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、記録手段、培養手段、加熱手段、攪拌手段、洗浄手段などを有することが好ましい。
なお、各図面において、同一構成部分には同一符号を付し、重複した説明を省略する場合がある。また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状等にすることができる。
図1は、本発明の第1実施形態の液滴分注装置の一例を示す説明図である。この図1Aの液滴分注装置1Aは、液滴形成手段100と、被着対象物200と、撮像手段300と、粒子計数手段400とを有する。
液滴吐出部10は、本実施形態ではクローズヘッドであり、液体保持部11と、吐出口14が形成され、液体保持部11に保持された光を照射されたときに発光可能な粒子3を含む液体2を振動部材13の振動により吐出口14から、図1中D3で示す吐出方向に液滴4を吐出する膜状部材12とを有する。
液体保持部11の下面側には貫通孔である吐出口14が設けられている。
膜状部材12の平面形状は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、円形、楕円形、四角形などが挙げられる。
振動部材13の形状は、膜状部材12の形状に合わせて設計することができる。例えば、膜状部材12の平面形状が円形である場合には、円形の振動部材13を設けることが好ましい。
振動部材13としては圧電素子を用いており、圧電素子としては、ジルコン酸チタン酸鉛(PZT)を用いている。
蛍光色素としては、例えば、セルトラッカーオレンジ、セルトラッカーレッドなどが挙げられる。
蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP;green fluorescent protein)、赤色蛍光タンパク質(RFP;Red Fluorescent Protein)、黄色蛍光タンパク質(YFP;Yellow Fluorescent Protein)などが挙げられる。
マルチウェルプレートとしては、例えば、24ウェル、48ウェル、98ウェル、又は384ウェルプレートがある。また、プレート形状ではなく、8連チューブ等の連結タイプのウェルチューブであってもよい。
被着対象物200の材質としては、本実施形態のようにウェルプレートの下方から撮像手段300により凹部内の粒子を観察する場合には透明性の高い基材を用いる必要があり、例えば、樹脂製のプレート、ガラス製のプレートなどが好適に使用される。
対物レンズ32は、被着対象物200の凹部201内に着弾した液滴に含まれる粒子3が観察可能な位置に設置されている。
粒子3から発せられた光Lfが対物レンズ32を通過し、撮像素子35に入射することで画像情報が取得される。
対物レンズ32としては、高倍率のレンズを用いると検出感度は高くなるが、視野が狭くなるため、視野外に液滴が着弾しやすくなり、カウントエラー頻度が高くなってしまう。一方、低倍率のレンズを用いると視野が広がるためカウントエラー頻度を下げることができるが、低倍率であるため10μm以下の細胞を捉えることが困難となる。したがって、液滴形成手段100の着弾精度から、0.5mm角程度の視野の対物レンズを用いることが好ましい。このような対物レンズとしては、例えば、ミツトヨ株式会社製、無限補正対物レンズ、M−PLAN APO 5Xなどが挙げられる。
本実施形態では、図2Aに示したように、着弾した液滴内の粒子3は液滴周縁部の影に隠れてしまい、粒子数のカウントが困難になってしまう。そのため、液滴が着弾した後、乾燥するまでのタイムディレイを設けた後に撮像することが好ましい(図2B参照)。
この際、被着対象物の凹部に着滴している液滴を乾燥させるための乾燥手段(図示せず)を有していると、液滴が乾燥するための時間を短縮化できるので好ましい。
撮像素子35において、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。
粒子は焦点位置がずれると画像のコントラストが悪化するため、取得した画像から粒子数を正確にカウントすることが困難となってしまう。そのため、凹部内に液滴が着弾した後、走査装置により複数枚の画像を取得することにより、コントラストの高い画像を選択・取得することが可能となる。即ち、細胞のスケールは約10μm程度であり、10μmの粒子を用いた場合には走査する焦点位置の間隔Zが50μmより大きくずれた場合には細胞の輪郭を抽出することが困難になり、良好な個数カウントができなくなってしまう(図3Aから図3D参照)。そのため、走査する焦点位置の間隔は50μm以下に設定することが好ましい。走査する焦点位置の間隔を小さくするほどカウントエラーの発生頻度を抑制可能であるが、同時に走査回数(撮影枚数)が増えるため、処理時間の増大に繋がる。したがって、測定する粒子の大きさに合わせて走査する焦点距離の間隔を最適値に設定することがより好ましい。
なお、焦点位置のずれは、被着対象物の凹部の形状(例えば、平底、丸底、U底、V底など)や被着対象物の公差等によって発生するため、それら全てを考慮した上で想定される焦点位置のずれを予め見積もった上で、スキャン回数(取得する画像の数)を設定することが好ましい。
撮像素子35として1次元素子を用いる場合には、得られた発光量をもとに、予め設定された閾値と比較することにより、粒子の個数のカウントが可能である。
第1の実施形態に係る液滴分注装置によれば、被着対象物の複数の凹部(ウェル)の所定位置に液滴を着滴させることができ、ウェル内において粒子を探すための所作が不要となるため、粒子数の計数にかかる処理時間を短縮することができる。
図4は、第1の実施形態の変形例1の液滴分注装置の一例を示す概略図である。なお、第1の実施形態の変形例1において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
対物レンズ32は、ウェル201内に着弾した液滴に含まれる粒子3が観察可能な位置に設置されている。
第1の光照射部30から発せられた励起光がダイクロイックミラー34を介して対物レンズ32を通り、ウェル201内の粒子3に照射される。粒子3から発せられた蛍光Lfが対物レンズ32を通過し、撮像素子35に入射することで画像情報が取得される。
また、第1の光照射部30を用いる場合、液滴内の粒子3が蛍光を発し、粒子の確認が容易になるため、液滴が乾燥する前に撮像することが可能となり、被着対象物の凹部に着滴した液滴を乾燥させる乾燥手段を設ける必要がない。
なお、第1の光照射部30が発する励起光と比較して粒子の発する蛍光が弱いため、撮像素子35の前段(受光面側)に励起光の波長域を減衰させるフィルタを設置してもよい。これにより、撮像素子35において、非常にコントラストの高い蛍光粒子の画像を得ることができる。フィルタとしては、例えば、励起光の波長を含む特定波長域を減衰させるノッチフィルタ等を用いることができる。
図5は、第1の実施形態の変形例2の液滴分注装置の一例を示す概略図である。なお、第1の実施形態の変形例2において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
ここで、同期するとは、液滴吐出部10による液滴の吐出と同時に(駆動部20が液滴吐出部10に駆動信号を供給するのと同時に)発光することではなく、液滴が飛翔して所定位置に達したときに液滴に光が照射されるタイミングで、第2の光照射部31が発光することを意味する。つまり、第2の光照射部31は、液滴吐出部10による液滴4の吐出(駆動部20から液滴吐出部10に供給される駆動信号)に対して、所定時間だけ遅延して発光する。第2の光照射部31より照射される光Lは、飛翔中の液滴1つに照射されることが好ましい。
受光部41としては、例えば、フォトダイオード、フォトセンサ等の一次元素子が挙げられるが、高感度な測定が必要な場合には、光電子増倍管やアバランシェフォトダイオードを用いることが好ましい。受光部として、例えば、CCD(Charge Coupled Device)、CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor)、ゲートCCD等の二次元素子を用いてもよい。
粒子計数部50としては、例えば、CPU(Central Processing Unit)、ROM(Read Only Memory)、RAM(Random Access Memory)、メインメモリ等を含む構成とすることができる。この場合、粒子計数部50の各種機能は、ROM等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてCPUにより実行されることによって実現できる。但し、粒子計数部50の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。また、粒子計数部50は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
受光部41として二次元素子を用いる場合は、粒子計数部50は、受光部41から得られた二次元画像に基づいて、粒子3の輝度値或いは面積を算出するための画像処理を行う手法を用いてもよい。この場合、粒子計数部50は、画像処理により粒子3の輝度値或いは面積値を算出し、算出された輝度値或いは面積値と、予め設定された閾値とを比較することにより、粒子3の個数を検知することができる。また、二次元素子を用いる場合には、発光を受光する直前のタイミングにて液滴の画像を撮影することで、不吐出検知も可能となる.
図6は、第1の実施形態の変形例3の液滴分注装置の一例を示す概略図である。なお、第1の実施形態の変形例3において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
第1の実施形態の変形例3の液滴分注装置によれば、単位時間当りの吐出する液滴数を増加させても液滴内の粒子数が検知可能な高い生産性を有している。
なお、液体保持部11は、隔壁によって、4つの吐出口14毎に4つの液室に分けて構成することもできる。
液体保持部11は、粒子3を含む液体2を保持する部であり、例えば、ステンレス鋼、ニッケル、アルミニウム等の金属、シリコン、セラミックスなどから形成されている。
液体保持部11の下面側には貫通孔である吐出口14が4つ設けられているが、吐出口の数は、4つに限定されるものではない。
図7は、液滴吐出部10の吐出面11aの吐出口14の配置状態の一例を示す概略平面図であり、吐出口14が吐出面11aの長さ方向に沿って1列に6個配設されている。
図8は、液滴吐出部10の吐出面11aの吐出口14の配置状態の一例を示す概略平面図であり、吐出口14が吐出面11aの長さ方向に沿って1列に12個配設されている。
図9は、液滴吐出部10の吐出面11aの吐出口14の配置状態の一例を示す概略平面図であり、吐出口14が吐出面11aの長さ方向に沿って3列に合計36個配設されている。
図10は、液滴吐出部10の吐出面11aの吐出口14の配置状態の一例を示す概略平面図であり、吐出口14が吐出面11aの長さ方向に沿って3列に合計20個配設されている(いわゆる千鳥格子配列)。
図11は、液滴吐出部10の吐出面11aの吐出口14の配置状態の一例を示す概略平面図であり、吐出口14が吐出面11aの長さ方向に沿って3列に合計36個配設されており、各列の間に仕切り部材25が設けられている。
図12は、第1の実施形態の変形例4の液滴分注装置の一例を示す概略図である。なお、第1の実施形態の変形例4において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
液体保持部11は、粒子3を含む液体2を保持する部であり、本実施形態ではオープンヘッドであるため、上部に大気開放部15を有している。これにより、液体2中に混入した気泡を大気開放部から排出可能である。
振動部材13に駆動部20から駆動信号を供給することにより、膜状部材12を振動させることができる。それによって、吐出口14から液滴4を吐出することができる。
膜状部材12の材質としては、柔らか過ぎると膜状部材12が簡単に振動し、吐出しないときに直ちに振動を抑えることが困難であるため、ある程度の硬さがある材質を用いることが好ましい。膜状部材12の材質としては、例えば、金属材料やセラミックス材料、ある程度硬さのある高分子材料などを用いることができる。
液体保持部11及び膜状部材12の材質としては、粒子として細胞を用いる場合には、細胞やタンパク質に対する付着性の低い材料を用いることができる。
つまり、駆動部20は、吐出波形を振動部材13に加え、膜状部材12の振動状態を制御することにより、液体保持部11に保持された粒子3を含む液体2を吐出口14から液滴として吐出させることができる。また、駆動部20は、撹拌波形を振動部材13に加え、膜状部材12の振動状態を制御することにより、液体保持部11に保持された粒子3を含む液体2を撹拌することができる。なお、撹拌時には、吐出口14から液滴は吐出されない。
なお、液滴を形成しないタイミングで、液滴を形成しない範囲で膜状部材12を振動させ、積極的に気泡を液体保持部11の上方に移動させてもよい。
図13Aは、第2の実施形態の液滴分注装置の液滴形成手段の一例を示す概略図である。図13Bは、第2の実施形態の液滴分注装置の撮像手段の一例を示す概略図である。なお、第2の実施形態において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
被着対象物200の凹部201が形成されている側から撮像手段300による撮像が行われるため、被着対象物200として透明性の高い材料を用いる必要がなく、不透明な材料、例えば、金属材料、セラミックス材料等も適用可能である。
なお、液滴分注装置の液滴形成手段1F−1と撮像手段1F−2とは別体となっているが、一体に構成することもできる。
図14Aは、第2の実施形態の変形例1の液滴分注装置の液滴形成手段の一例を示す概略図である。図14Bは、第2の実施形態の変形例1の液滴分注装置の撮像手段の一例を示す概略図である。なお、第2の実施形態の変形例1において、既に説明した実施の形態と同一の構成については、同じ参照符号を付してその説明を省略する。
液滴誘導手段203としては、被着対象物の少なくとも1つの凹部の中央部と周辺部とを異なる電荷状態にするため、凹部の中央部及び周辺部の少なくともいずれかに配置された液滴誘導用電極であることが好ましい。これにより、液滴吐出部10により吐出された液滴を電気的に凹部の中央部へ引っ張って誘導することができる。また、凹部の中央部及び周辺部の少なくともいずれかを同時に荷電することができ、高スループット化できる。
周辺部に配置された液滴誘導用電極は、吐出された液滴と反発する電荷を有することが好ましい。
中央部に配置された液滴誘導用電極は、吐出された液滴を引き寄せる電荷を有することが好ましい。
凹部の中央部は、凹部の中心から半径2.5mm以下が好ましく、半径1.0mm以下がより好ましく、半径0.25mmが更に好ましい。凹部の周辺部は、凹部の中央部以外である。
液滴誘導用電極を凹部の周辺部に配置する場合には、凹部の周縁に環状(リング状)に設けることが好ましい。
液滴誘導用電極の材質としては、例えば、ニッケル、銅、銀、金、ニッケル−クロム合金、ステンレス鋼、あるいはこれらの合金又は混合物、カーボン、白金、タンタル、ITO(Indium Tin Oxide)、亜鉛、カーボンナノチューブ、チオフェン、グラフェン、ピロール類などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
なお、液滴誘導用電極の材質が透明なものであれば、撮像手段による粒子の撮像を、被着対象物の凹部が形成されていない側から行うことができる。
<1> 粒子を含む液滴が着滴する複数の凹部が形成された被着対象物と、
前記粒子を含む液滴を形成し、前記液滴を前記被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる液滴形成手段と、
着滴した前記液滴に含まれる前記粒子を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により撮影した画像から前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、
を有することを特徴とする液滴分注装置である。
<2> 前記液滴が着滴した凹部内の所定の位置を含む撮影した画像を優先して、前記粒子計数手段により前記粒子を計数する前記<1>に記載の液滴分注装置である。
<3> 前記撮像手段が、対物レンズと、撮像素子と、前記対物レンズの焦点位置を走査する走査部とを有する前記<1>から<2>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<4> 前記走査部による前記対物レンズの走査により、深さ方向の焦点深度を50μm以下の間隔において、前記撮像素子による複数枚の撮影を行う前記<3>に記載の液滴分注装置である。
<5> 前記被着対象物の凹部に着滴した液滴を乾燥させる乾燥手段を有する前記<3>から<4>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<6> 前記粒子が、光を受光したときに発光可能な粒子である前記<1>から<5>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<7> 前記光を受光したときに発光可能な粒子が、蛍光粒子、蛍光色素によって染色された細胞、及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかである前記<6>に記載の液滴分注装置である。
<8> 前記撮像手段が、第1の光照射部と、ダイクロイックミラーとを更に有する前記<6>から<7>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<9> 前記第1の光照射部により前記粒子に光を照射し、前記粒子からの発光を前記撮像素子が受光する前記<8>に記載の液滴分注装置である。
<10> 前記液滴形成手段が、
前記粒子を含む液滴を吐出する液滴吐出部と、
吐出された前記液滴に光を照射する第2の光照射部と、
前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する受光部と、
前記受光部により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数部と、
を有する前記<1>から<9>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<11> 前記被着対象物を平面内で移動させる移動手段を有し、
前記撮像手段による前記粒子の撮像が、前記被着対象物の凹部が形成されている側から行われる前記<1>から<10>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<12> 前記液滴吐出部と前記被着対象物における複数の凹部との相対的な位置関係を制御する制御手段を有する前記<10>から<11>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<13> 前記粒子計数部が、前記液滴に含まれる粒子の数が0個であると判定したとき、
前記液滴吐出部が、同じ前記凹部に対して前記液滴を再度吐出する前記<10>から<12>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<14> 前記被着対象物が、少なくとも1つの凹部の中央部に前記液滴を誘導する液滴誘導手段を有する前記<1>から<13>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<15> 組織体の形成に用いられる前記<1>から<14>のいずれかに記載の液滴分注装置である。
<16> 粒子を含む液滴を形成し、被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる液滴形成工程と、
着滴した前記液滴に含まれる前記粒子を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程により撮影した画像から前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、
を含むことを特徴とする液滴分注方法である。
<17> 前記粒子計数工程において、前記液滴が着滴した凹部内の所定の位置を含む撮影した画像を優先して前記粒子を計数する前記<16>に記載の液滴分注方法である。
<18> 前記撮像工程が、対物レンズと、撮像素子と、前記対物レンズの焦点位置を走査させる走査部とを有する撮像手段を用いて行われ、
前記走査部により深さ方向の焦点深度を50μm以下の間隔で複数枚の撮影を行う前記<16>から<17>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<19> 前記被着対象物の凹部に着滴している液滴を乾燥させる乾燥工程を含む前記<16>から<18>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<20> 前記粒子が、光を受光したときに発光可能な粒子である前記<16>から<19>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<21> 前記光を受光したときに発光可能な粒子が、蛍光粒子、蛍光色素によって染色された細胞、及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかである前記<20>に記載の液滴分注方法である。
<22> 前記撮像工程が、第1の光照射部と、ダイクロイックミラーとを更に有する撮像手段を用いて行われ、前記第1の光照射部が前記粒子に光を照射し、前記粒子の発光を前記撮像手段が受光する前記<20>から<21>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<23> 前記被着対象物を平面内で移動させる移動工程を含み、
前記撮像工程における前記粒子の撮像が、前記被着対象物の凹部が形成されている側から行われる前記<16>から<22>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<24> 前記液滴吐出部と前記被着対象物における複数の凹部との相対的な位置関係を制御する制御工程を含む前記<16>から<23>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<25> 組織体の形成に用いられる前記<16>から<24>のいずれかに記載の液滴分注方法である。
<26> 前記<1>から<15>のいずれかに記載の液滴分注装置を用いて、凹部内の粒子数が計数されており、凹部内の粒子数が既知であることを特徴とする被着対象物である。
3 粒子
4 液滴
10 液滴吐出部
11 液体保持部
12 膜状部材
13 振動部材
14 吐出口
20 駆動部
30 第1の光照射部
32 対物レンズ
33 走査部
34 ダイクロイックミラー
35 撮像素子
100 液滴形成手段
200 被着対象物
201 凹部
202 ステージ
300 撮像手段
400 粒子計数手段
Claims (18)
- 粒子を含む液滴が着滴する複数の凹部が形成された被着対象物と、
前記粒子を含む液滴を形成し、前記液滴を前記被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる液滴形成手段と、
着滴した前記液滴に含まれる前記粒子を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段により撮影した画像から前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数手段と、
を有し、
前記液滴形成手段が、同じ前記凹部の前記所定の位置内に対して、異なる位置に前記液滴を再度吐出することを特徴とする液滴分注装置。 - 前記液滴が着滴した凹部内の所定の位置を含む撮影した画像を優先して、前記粒子計数手段により前記粒子を計数する請求項1に記載の液滴分注装置。
- 前記撮像手段が、対物レンズと、撮像素子と、前記対物レンズの焦点位置を走査する走査部とを有する請求項1から2のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 前記走査部による前記対物レンズの走査により、深さ方向の焦点深度を50μm以下の間隔において、前記撮像素子による複数枚の撮影を行う請求項3に記載の液滴分注装置。
- 前記被着対象物の凹部に着滴した液滴を乾燥させる乾燥手段を有する請求項3から4のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 前記粒子が、光を受光したときに発光可能な粒子である請求項1から5のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 前記光を受光したときに発光可能な粒子が、蛍光粒子、蛍光色素によって染色された細胞、及び蛍光タンパク質を発現可能な細胞の少なくともいずれかである請求項6に記載の液滴分注装置。
- 前記撮像手段が、第1の光照射部と、ダイクロイックミラーとを更に有する請求項6から7のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 前記撮像手段が、撮像素子を有し、
前記第1の光照射部により前記粒子に光を照射し、前記粒子からの発光を前記撮像素子が受光する請求項8に記載の液滴分注装置。 - 前記液滴形成手段が、
前記粒子を含む液滴を吐出する液滴吐出部と、
吐出された前記液滴に光を照射する第2の光照射部と、
前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する受光部と、
前記受光部により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数部と、
を有する請求項1から9のいずれかに記載の液滴分注装置。 - 前記被着対象物を平面内で移動させる移動手段を有し、
前記撮像手段による前記粒子の撮像が、前記被着対象物の凹部が形成されている側から行われる請求項1から10のいずれかに記載の液滴分注装置。 - 前記液滴形成手段が、前記粒子を含む液滴を吐出する液滴吐出部を有し、
前記液滴吐出部と前記被着対象物における複数の凹部との相対的な位置関係を制御する制御手段を有する請求項10から11のいずれかに記載の液滴分注装置。 - 前記液滴形成手段が、
前記粒子を含む液滴を吐出する液滴吐出部と、
吐出された前記液滴に光を照射する第2の光照射部と、
前記光を照射された前記粒子からの発光を受光する受光部と、
前記受光部により受光した前記発光に基づき、前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数部と、を有し、
前記粒子計数部が、前記液滴に含まれる粒子の数が0個であると判定したとき、
前記液滴吐出部が、同じ前記凹部に対して前記液滴を再度吐出する請求項10から12のいずれかに記載の液滴分注装置。 - 前記被着対象物が、少なくとも1つの凹部の中央部に前記液滴を誘導する液滴誘導手段を有する請求項1から13のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 組織体の形成に用いられる請求項1から14のいずれかに記載の液滴分注装置。
- 粒子を含む液滴を形成し、被着対象物の所定の凹部内の所定の位置に着滴させる液滴形成工程と、
着滴した前記液滴に含まれる前記粒子を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程により撮影した画像から前記液滴に含まれる前記粒子を計数する粒子計数工程と、
を含み、
前記液滴形成工程が、同じ前記凹部の前記所定の位置内に対して、異なる位置に前記液滴を再度吐出することを特徴とする液滴分注方法。 - 前記粒子計数工程において、前記液滴が着滴した凹部内の所定の位置を含む撮影した画像を優先して前記粒子を計数する請求項16に記載の液滴分注方法。
- 請求項1から15のいずれかに記載の液滴分注装置を用いて、凹部内の粒子数が計数されており、前記凹部内の粒子数が既知である被着対象物を製造することを特徴とする被着対象物の製造方法。
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