DE69734587T2 - Gerät und verfahren zur fluoreszenzmessung der dna-amplifikation - Google Patents

Gerät und verfahren zur fluoreszenzmessung der dna-amplifikation Download PDF

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Description

  • Die Erfindung betrifft allgemeinen ein Verfahren zur Echtzeitüberwachung (Echtzeit-Monitoring) der Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz (Target-Nukleinsäuresequenz) in einer biologischen Probe durch Polymerasekettenreaktion.
  • In vielen Bereichen von Industrie, Technologie und Forschung besteht ein Bedarf, kleine Proben verlässlich und reproduzierbar einem Thermocycling zu unterziehen. Der Bedarf danach, eine Probe wiederholten Temperaturzyklen auszusetzen, trifft insbesondere für biotechnologische Anwendungen zu. In der Biotechnologie ist es oft wünschenswert, kleine Materialproben in kurzer Zeit wiederholt zu erhitzen und abzukühlen. Einer dieser regelmäßig durchgeführten biologischen Prozesse ist die zyklische Amplifikation von DNA.
  • Die zyklische Amplifikation von DNA mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase ermöglicht automatisierte Amplifikation primerspezifischer DNA, allgemein als „Polymerasekettenreaktion" bekannt. Die Automatisierung dieses Prozesses erfordert ein kontrolliertes und präzises Thermocycling der Reaktionsmischungen, die üblicherweise in mehreren Behältern enthalten sind. In der Vergangenheit wurde ein übliches Mikrofugenröhrchen aus Plastik als bevorzugter Behälter eingesetzt.
  • Kommerziell erhältliche, programmierbare Metallheizblöcke wurden in der Vergangenheit dazu verwendet, das Thermocycling der Proben in den Mikrofugenröhrchen über das gewünschte Temperatur-Zeit-Profil hinweg durchzuführen. Das Unvermögen, die Temperatur der Heizblöcke in kurzer Zeit schnell und genau über große Temperaturbereiche einzustellen, hat die Verwendung von Vorrichtungen mit Heizblöcken als Wärmesteuerungssystem zur Durchführung der Polymerasekettenreaktion unerwünscht gemacht.
  • Zudem weisen die üblicherweise eingesetzten Mikrofugenröhrchen Nachteile auf. Das Material der Mikrofugenröhrchen, ihre Wandstärke und ihre Geometrie stellen ein Hindernis für ein schnelles Aufheizen und Abkühlen der darin enthaltenen Probe dar. Das Plastikmaterial und die Wandstärke der Mikrofugenröhrchen fungieren als Isolator zwischen der darin enthaltenen Probe und dem umgebenden Medium, wodurch die Übertragung von Wärmeenergie behindert wird. Die Geometrie des Mikrofugenröhrchens stellt dem für die Übertragung von Wärmeenergie ausgewählten Medium zudem eine kleine Oberfläche zur Verfügung. Der fortgesetzte Einsatz der Mikrofugenröhrchen mit ihrer suboptimalen Geometrie im Stand der Technik zeigt, dass die Vorzüge einer verbesserten Wärmeübertragung (die sich durch Vergrößerung der Oberfläche eines Probenbehälters für eine Probe mit konstantem Volumen ergibt) nicht erkannt wurden.
  • Als Thermocycler für die Polymerasekettenreaktion wurden daneben auch Vorrichtungen mit Fluidaustausch (oder mechanischer Übertragung) eingesetzt. Obwohl Wasserbäder für das Thermocycling der Mischung einer Polymerasekettenreaktion über ein gewünschtes Temperatur-Zeit-Profil, das für den Ablauf einer Reaktion notwendig ist, eingesetzt wurden, stellt die große Wärmemasse des Wassers (und die geringe thermische Leitfähigkeit der Plastikmikrofugenröhrchen) einen signifikanten limitierenden Faktor für die Leistungsfähigkeit der Vorrichtung und die Reaktionsausbeuten dar.
  • Vorrichtungen mit Wasserbädern sind in ihrer Leistungsfähigkeit limitiert. Der Grund liegt darin, dass die Wärmemasse des Wassers den hiermit erreichbaren, maximalen Temperatur-Zeit-Gradienten deutlich begrenzt. Zudem hat sich gezeigt, dass die Wasserbadvorrichtung aufgrund der Größe und Anzahl an wasserführenden Schläuchen und externen Temperatursteuervorrichtungen für das Wasser sehr schwerfällig ist. Darüber hinaus ist die erforderliche strenge periodische Wartung und Inspektion der Wasseranschlüsse, durch welche Lecks im Wasserbad aufgespürt werden sollen, mühsam und zeitaufwendig. Bei einer Wasserbadvorrichtung ist es nicht zuletzt schwierig, die Temperatur in den Probenröhrchen mit der gewünschten Genauigkeit zu steuern.
  • Das US-Patent 3,616,264 von Ray zeigt eine thermische Druckluftvorrichtung, um biologische Proben mittels Umluft auf eine konstante Temperatur zu erwärmen oder abzukühlen. Obwohl die Vorrichtung von Ray bei der Aufrechterhaltung einer konstanten Temperatur innerhalb einer Luftkammer einigermaßen effektiv ist, erfüllt es nicht das Erfordernis, die Temperatur in zyklischen Phasen schnell anzupassen, wie es für ein Temperatur-Zeit-Profil biologischer Prozesse, beispielsweise bei der Polymeraseketten-reaktion, notwendig ist.
  • Das US-Patent 4,420,679 von Howe und das US-Patent 4,286,456 von Sisti et al. offenbaren Gaschromatographieöfen. Die offenbarten Vorrichtungen aus den Patenten von Howe und Sisti et al. sind zur Durchführung von Gaschromatographieverfahren, aber nicht zur Durchführung von Thermocycling geeignet, da dieses wesentlich schneller durchgeführt werden muss, als es mit einer der oben beschriebenen Vorrichtungen möglich wäre. Schnelles Thermocycling ist bei der Durchführung vieler Prozesse nützlich. Vorrichtungen, wie die in den Patenten von Howe und Sisti et al. beschriebenen, sind nicht dafür geeignet, solche Reaktionen effizient und schnell durchzuführen.
  • Die internationale Patentanmeldung WO 95 32306 offenbart ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, wobei das Verfahren die Schritte (i) der Amplifikation der Zielnukleinsäure zum Erhalt eines Amplifikationsprodukts mit Hilfe einer Polymerase, eines ersten Primers mit oder ohne ein Segment, das nicht benachbart zu einer ersten Startsequenz liegt, und eines zweiten Primers mit oder ohne ein Segment, das nicht benachbart zu einer zweiten Startsequenz liegt, in Gegenwart eines Oligonukleotids, das nicht in der Lage ist, als Primer für die Polymerase zu fungieren, wobei das Oligonukleotid wenigstens 5 aufeinander folgende Nukleotide, die zu wenigstens 5 aufeinander folgenden Nukleotiden des ersten Primers komplementär sind, besitzt; und (ii) des Nachweises der Zielnukleinsäure durch Überwachung der Amplifikation umfasst.
  • Die europäische Patentanmeldung EP 0 229 943 offenbart Fluoreszenzsonden mit Stokes-Verschiebung für Polynukleotidhybridisierungsassays, die dazu konzipiert sind, für ein festgelegtes Spacing von Nukleotidbaseneinheiten zwischen den Donor- und Akzeptorfluorophoren zu sorgen. Wenn die Sonden an das Zielpolynukleotid hybridisiert werden, sind die für einen strahlungsfreien Energietransfer gepaarten Fluorophore durch 2 bis 7 Nukleotidbaseneinheiten voneinander getrennt. Die Fluorophore werden über 4 bis 30 Angström lange Linker-Arme an die DNA- oder RNA-Sonden gebunden. Vorzugsweise setzt man Fluorescein als Donor mit Texas-Red als Akzeptor ein.
  • Die europäische Patentanmeldung EP 0 566 751 offenbart ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäuresequenz im Format eines homogenen Assays mit Hilfe eines Energietransfersystems. Bei diesem Verfahren wird ein 5'-markierter Primer, der eine in sich selbst komplementäre Sequenz besitzt, in einem Amplifikationsprozess zusammen mit einem anschließenden Nachweis mit einer 3'-markierten Sonde für die amplifizierte Region. Bei Hybridisierung der Sonde nahe dem kurzen doppelsträngigen DNA-Stück, das aus der Rückfaltung der in sich selbst komplementäre Primerregion resultiert, die in das amplifizierte Produkt eingebaut wurde, liegen die Marker nahe beieinander. Dieses Dokument offenbart auch den neuen, für dieses Verfahren eingesetzten Primer.
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist insbesondere für die Molekularbiologie von grundlegender Bedeutung und ist die erste praktische molekulare Methode für klinische Labors dar. Trotz ihrer Nützlichkeit und Beliebtheit macht man mit dem derzeitigen Verständnis der PCR keine großen Fortschritte. Amplifikationen müssen durch Ausprobieren optimiert werden und Protokolle werden oft blind befolgt. Das begrenzte Verständnis der PCR, das sich im Stand der Technik findet, ist ein gutes Beispiel dafür, wie Fachleute sich damit zufrieden geben, eine leistungsstarke Methode zu verwenden, ohne über diese nachzudenken und diese zu verstehen.
  • Die PCR erfordert ein Thermocycling der Probe. Wie oben ausgeführt, wird im Stand der Technik ein Thermocycling nicht nur langsam ausgeführt, sondern es werden im Stand der Technik zudem die zugrunde liegenden Prinzipien ignoriert, die den Ablauf einer PCR ermöglichen und dazu eingesetzt werden könnten, die PCR noch nutzbringender zu gestalten. Es wäre daher ein großer technischer Fortschritt, Verfahren und Vorrichtungen bereitzustellen, die insbesondere zur schnellen Durchführung von PCR und zur raschen Analyse der stattfindenden Reaktion ausgelegt werden können, vor allem dann, wenn die Reaktion während ihres Ablaufs, also in Echtzeit, analysiert werden kann.
  • In Anbetracht des oben ausgeführten Standes der Technik versucht die vorliegende Erfindung die folgenden Aufgaben und Vorteile zu erfüllen.
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur schnellen Durchführung einer PCR und zur gleichzeitigen Überwachung der Reaktion bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur schnellen Durchführung von PCR bereitzustellen, wobei die Reaktion kontinuierlich überwacht wird und die Reaktionsparameter während des Reaktionsablaufs eingestellt werden.
  • Diese und weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüche ersichtlich oder lassen sich bei der Ausführung der Erfindung erkennen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Echtzeitüberwachung einer Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe durch Polymerasekettenreaktion bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Amplifikation der Zielsequenz durch Polymerasekettenreaktion in Gegenwart zweier Nukleinsäuresonden, die an nebeneinander liegende Bereiche der Zielsequenz hybridisieren, wobei eine der beiden Sonden mit einem Akzeptorfluorophor und die andere Sonde mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert ist, so dass die Donor- und Akzeptorfluorophore bei Hybridisierung der beiden Sonden mit der Zielsequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden vorliegen, wobei die Polymerasekettenreaktion die Schritte umfasst:
    Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz zur biologischen Probe und Thermocycling der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur;
  • Anregung der biologischen Probe mit Licht einer vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und Nachweis der Emission von der biologischen Probe.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Analyse einer Ziel-DNA- Sequenz einer biologischen Probe auf DNA-Sequenzpolymorphismen, Heterozygotie oder Mutationen bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Zugabe einer wirksamen Menge von zwei Nukleinsäureprimern und einer Nukleinsäuresonde zur biologischen Probe, wobei einer der Primer und die Sonde mit einem Teil eines ein Akzeptorfluorophor und ein Donorfluorophor umfassenden Fluoreszenzenergietransferpaares markiert sind, und wobei die markierte Sonde an eine amplifizierte Kopie der Zielnukleinsäuresequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden des markierten Primers hybridisiert;
    • (b) Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz durch Polymerasekettenreaktion, wobei die Polymerasekettenreaktion die Schritte der Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz und des Thermocyclings der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur umfasst;
    • (c) Beleuchtung der biologischen Probe mit Licht einer ausgewählten, vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und Nachweis der Fluoreszenzemission der Probe.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur kontinuierlichen Überwachung der Fluoreszenz während einer DNA-Amplifikation bereit. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ermöglicht der Einsatz optischer Komponenten in Verbindung mit Bauelementen, die ein schnelles Thermocycling bewirken, die kontinuierliche Überwachung der DNA-Amplifikation mit zahlreichen verschiedenen Fluoreszenzmethoden. Der Einsatz von Glaskapillarprobenröhrchen und Plastik/Glas-Verbundprobenröhrchen ermöglicht eine schnelle Wärmeübertragung aus Luft (30 Zyklen in weniger als 15 min) und eine gleichzeitige optische Überwachung der Reaktion. Die Fluoreszenz einer einzelnen Probe oder alternativ dazu von mehreren Proben in einem Rotationskarussell, wo alle Proben gleichzeitig dem schnellen Thermocycling unterzogen werden, wird kontinuierlich erfasst.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Fluoreszenz während der DNA-Amplifikation durch 1) den doppelstrangspezifischen Farbstoff SYBRTM Green I, 2) ein Absenken des Fluoresceinquenchings durch Rhodamin nach Spaltung einer doppelt markierten Hybridisierungssonde mit Exonuclease und 3) Resonanzenergietransfer von Fluorescein auf Cy5TM durch benachbarte Hybridisierungssonden überwacht. Wenn Fluoreszenzspezifität und Amplifikationseffizienz bekannt sind, ermöglichen Fluoreszenzdaten, die einmal pro Zyklus erfasst werden, eine Quantifizierung der Kopienzahl des anfänglichen Templats.
  • Im Gegensatz zur „once per cycle"-Messung der Fluoreszenz werden zudem Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung offenbart, die Temperatur, Zeit und Fluoreszenz kontinuierlich über die Dauer eines Zyklus überwachen und auf diese Weise eine 3-dimensionale Spirale erzeugen. Diese 3-dimensionale Spirale kann auf Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur reduziert werden. Plots von Fluoreszenz gegen Temperatur von Hybridisierungssonden unterscheiden zwischen dem kumulativen, irreversiblen Signal der Exonucleasespaltung und der temperaturabhängigen, reversiblen Hybridisierung benachbarter Sonden. Mit Doppelstrangfarbstoffen lassen sich in jedem Zyklus Produktdenaturierung, Reannealing und Extension verfolgen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Fluoreszenzüberwachung (Fluoreszenz-Monitoring) einer PCR als leistungsstarkes Werkzeug zur Quantifizierung von DNA bereit. „Cycle-by-cycle"-Überwachung mit dsDNA- Farbstoffen benötigt keine einzigartigen Sonden und ermöglicht Quantifizierung über einen großen dynamischen Bereich. Sequenzspezifische Fluoreszenzsonden zeigen erhöhte Spezifität und können zur Quantifizierung sehr kleiner Templatkopienzahlen verwendet werden. Es gibt wenigstens zwei Arten sequenzspezifischer, fluoreszierender Oligonukleotidsonden, die bei einer PCR einsetzbar sind. Über den Mechanismus der Signalerzeugung werden diese normalerweise in Hydrolyse- und Hybridisierungssonden unterteilt. Bei „once-per-cycle"-Überwachung der Fluoreszenz kann jedes Sondensystem zur Quantifizierung verwendet werden. Eine kontinuierliche Überwachung der Fluoreszenz ermöglicht die Erfassung von Schmelz- und Annealingkurven des Produkts während des Thermocyclings.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können optische Komponenten zum Fluoreszenz-Monitoring zusammen mit einem schnellen Thermocycler dazu eingesetzt werden, Schmelzkurven der DNA während einer PCR durch Fluoreszenz von für Doppelstrang-DNA spezifischen Farbstoffen zu erfassen. Das Auftragen der Fluoreszenz als Funktion der Temperatur, wenn der Thermocycler durch die Dissoziationstemperatur des Produkts aufheizt, ergibt die Schmelzkurve der DNA. Form und Lage dieser DNA-Schmelzkurve sind eine Funktion des GC/AT-Verhältnisses, der Länge und der Sequenz und können zur Unterscheidung von Amplifikationsprodukten, deren Schmelztemperaturen sich um weniger als 2 °C unterscheiden, verwendet werden. Gewünschte Produkte lassen sich von unerwünschten Produkten, einschließlich Primerdimeren, unterscheiden. Eine Schmelzkurvenanalyse kann den dynamischen Bereich einer quantitativen PCR erweitern. Die vorliegende Erfindung stellt Vorrichtungen und Verfahren für eine Rapid-Cycle-PCR und kombinierter Amplifikation und vollständiger quantitativer Analyse in weniger als fünfzehn Minuten und vorzugsweise in weniger als zehn Minuten bereit.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Echtzeitüberwachung einer Amplifikation einer Ziel-DNA-Sequenz durch Polymerasekettenreaktion sowie auch ein Verfahren zur Analyse einer Ziel-DNA-Sequenz aus einer biologischen Probe auf DNA-Sequenzpolymorphismen, Heterozygotie oder Mutationen bereit. Das Verfahren umfasst die Schritte der Amplifikation der Zielsequenz durch Polymerasekettenreaktion in Gegenwart zweier Nukleinsäuresonden, die an benachbarte Regionen der Zielsequenz hybridisieren, der Anregung der Probe mit Licht einer vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und des Nachweises der Fluoreszenzemission aus der Probe. Eine der Sonden ist mit einem Akzeptorfluorophor und die andere Sonde ist mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert, so dass die Donor- und Akzeptorfluorophore bei Hybridisierung der zwei Sonden mit der Zielsequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden voneinander vorliegen. Die Polymerasekettenreaktion selbst umfasst die Schritte der Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe und das Thermocycling der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur. In einer alternativen Ausführungsform wird die Fluoreszenz der Probe als Funktion der Probentemperatur überwacht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Donorfluorophor Fluorescein. Ein insbesondere für die Verwendung von Fluorescein geeignetes Akzeptorfluorophor ist Cy5.
  • Als weitere Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Echtzeitüberwachung einer Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe durch Polymerasekettenreaktion zur Verfügung gestellt. Diese Ausführungsform des Verfahrens ist ebenfalls zur Analyse einer Ziel-DNA-Sequenz aus einer biologischen Probe auf DNA-Sequenzpolymorphismen, Heterozygotie oder Mutationen nützlich. Das Verfahren umfasst die Schritte:
    • (a) Zugabe einer wirksamen Menge zweier Nukleinsäureprimer und einer Nukleinsäuresonde zu einer biologischen Probe, wobei einer der Primer und die Sonde jeweils mit einem Teil eines ein Akzeptorfluorophor und ein Donorfluorophor umfassenden Fluoreszenzenergietransferpaares markiert sind, und wobei die markierte Sonde an eine amplifizierte Kopie der Zielnukleinsäuresequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden des markierten Primers hybridisiert;
    • (b) Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz durch Polymerasekettenreaktion, wobei die Polymerasekettenreaktion die Schritte der Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz und das Thermocycling der biologischen Probe zwischen wenigstens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur umfasst;
    • (c) Beleuchten der biologischen Probe mit Licht einer ausgewählten, vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und Nachweis der Fluoreszenzemission der Probe.
  • Das Verfahren kann ferner vorteilhaft sein, wenn man einen zusätzlichen Schritt zur Überwachung der temperaturabhängigen Fluoreszenz der Probe einführt.
  • Daten zur temperaturabhängigen Fluoreszenz der biologischen Probe können als Grundlage für die Einstellung der Thermocyclingbedingungen zur Optimierung der Reaktionsausbeute oder -spezifität verwendet werden. Somit wird auch ein verbessertes Verfahren zur Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz einer biologischen Probe zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) Zugabe einer wirksamen Menge zweier Nukleinsäuresonden, die an benachbarte Bereiche der Zielsequenz hybridisieren, zu der biologischen Probe, wobei eine der beiden Sonden mit einem Akzeptorfluorophor und die andere Sonde mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzresonanzenergietransferpaares markiert ist, so dass die Donor- und Akzeptorfluorophore bei Hybridisierung der zwei Sonden mit der Zielsequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden voneinander vorliegen;
    • (b) Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz durch Polymerasekettenreaktion, was ein Thermocycling der biologischen Probe mit vorher festgelegten Temperatur- und Zeitparametern umfasst;
    • (c) Beleuchten der biologischen Probe mit Licht einer ausgewählten, vom Akzeptorfluorophor absorbierten Wellenlänge während der Polymerasekettenreaktion;
    • (d) Überwachung der Fluoreszenzemissionen dieser Probe; und
    • (e) Einstellen der Temperatur- und Zeitparameter gemäß den in Schritt (d) erhaltenen Daten zur Optimierung der Produktausbeute oder -spezifität.
  • Bei jedem der erfindungsgemäßen Verfahren, bei denen ein Fluoreszenzenergietransferpaar als Quelle eines Fluoreszenzsignals den Status der Polymerasekettenreaktion anzeigt, werden gute Ergebnisse erhalten, wenn das Resonanzenergietransferpaar Fluorescein als Donor und Cy5 als Akzeptor umfasst. Die Verfahren werden bevorzugt in einer Vorrichtung durchgeführt, die für ein Thermocycling der biologischen Proben in optisch durchlässigen Kapillarröhrchen mit raschen rampenförmigen Temperaturverläufen, mit minimalen Haltezeiten auf der Höchsttemperatur und mit Messung oder Nachweis der Probenfluoreszenz durch das Ende des Kapillarröhrchens konzipiert ist.
  • Es wird ein Verfahren zur Verbesserung des Nachweises und der Effizienz der Erfassung der Fluoreszenz in einer ein Fluorophor enthaltenden Probe zur Verfügung gestellt. Zur Optimierung von Erfassung und Überwachung der Fluoreszenzemissionen nutzt dieses Verfahren die gesamte Innenreflexion. Das Verfahren umfasst die Schritte des Einbringens der Probe in ein aus optisch durchlässigem Material bestehendes Kapillarröhrchen und des Nachweisens der Fluoreszenz in einer Probe durch ein Ende des Kapillarröhrchens. Das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen des Kapillarröhrchens ist vorzugsweise größer oder gleich 4 mm–1. Falls durch Beleuchtung angeregte Fluorophore Fluoreszenz erzeugen, umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt des Beleuchtens der Probe durch ein Ende des Kapillarröhrchens und vorzugsweise entlang des optischen Wegs der nachgewiesenen Fluoreszenz.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Fluoreszenz der biologischen Probe temperaturabhängig und das Verfahren umfasst somit zusätzlich den Schritt des Aufheizens oder Abkühlens der biologischen Probe während des Nachweisens von Fluoreszenz, wodurch die temperaturabhängige Fluoreszenz in der Probe überwacht werden kann. Die Probe kann ein Fluoreszenzenergietransferpaar umfassen, und die Fluoreszenz wenigstens eines Fluorophors des Fluoreszenzenergietransferpaares wird nachgewiesen. In einer Ausführungsform umfasst die Probe Nukleinsäuren, einschließlich Nukleinsäuresonden. Eine dieser Sonden ist mit einem Akzeptorfluorophor und die andere Sonde mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzenergietransferpaares markiert. Die nachgewiesene Fluoreszenz stammt entweder vom Donorfluorophor oder vom Akzeptorfluorophor oder von beiden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • Um besser verstehen zu können, wie die oben zitierten und weitere Vorteile und Aufgaben der Erfindung erreicht werden, wird die oben nur kurz beschriebene Erfindung nun unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen, die in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind, beschrieben. Die 30–33 und 47 wurden gestrichen.
  • Die Erfindung wird mit Hilfe der beigefügten Zeichnungen genauer und ausführlicher beschrieben, in welchen
  • 1 eine perspektivische Abbildung eines Thermocyclers zeigt, der für ein Thermocycling biologischer Proben und insbesondere für die Durchführung zyklischer DNA-Amplifikationen ausgelegt ist,
  • 2 einen seitlichen Aufriss der Fluidkammerkomponente der Vorrichtung von 1 zeigt,
  • 3 einen Innengrundriss der Fluidkammerkomponente der Vorrichtung von 1 zeigt,
  • 4 einen Innengrundriss der Fluidkammer einer anderen Ausführungsform zeigt,
  • 5 ein optimiertes Temperatur-Zeit-Profil für eine Polymerasekettenreaktion mit dem Thermocycler zeigt,
  • 6 graphisch den Einfluss der Annealingzeit auf die Spezifität und die Ausbeute der Polymerasekettenreaktion zeigt, wenn der Thermocycler eingesetzt wird,
  • 7 graphisch den Einfluss der Denaturierungszeit auf die Ausbeute der Polymerasekettenreaktion zeigt, wenn der Thermocycler eingesetzt wird,
  • 8A–B eine perspektivische Abbildung und eine Querschnittzeichnung bzw. einen Aufriss einer weiteren Ausführungsform zeigen,
  • 8C eine schematische Darstellung der Relation zwischen dem wärmeerzeugenden Element und den Kapillarröhrchen, welche die Proben enthalten, in der Ausführungsform der 8A–B ist,
  • 9A die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur-Zeit-Profile (A–D) und ihre resultierenden Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (A–D) zeigt,
  • 9B einen Zyklus eines weiteren bevorzugten, in der vorliegenden Erfindung verwendeten Temperatur-Zeit-Profils zeigt,
  • 9C–G beispielhaft Zyklen weiterer bevorzugter, in der vorliegenden Erfindung verwendeter Temperatur-Zeit-Profile zeigen,
  • 10 ein Blockdiagramm eines Steuerkreises für ein Temperaturgefälle zeigt,
  • 11 eine schematische Abbildung eines bevorzugten schnellen Thermocyclers mit Fluoreszenznachweis ist,
  • 11A ein Diagramm von Temperatur gegen Zeit ist, das eine bevorzugte Betriebsweise der Vorrichtung von 11 zeigt,
  • 12 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur zeigt, die zusätzlich als 3D-Abbildung wiedergegeben sind,
  • 13 eine Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur eines 536 Basenpaar langen Fragments des humanen β-Globin-Gens ist,
  • 14 ein Plot von Zyklenzahl gegen Fluoreszenz ist,
  • 15 ein Plot von Zyklenzahl gegen Fluoreszenzverhältnis ist,
  • 16 ein Plot von Fluoreszenzverhältnis gegen Temperatur ist,
  • 16A ein Plot von Fluoreszenzverhältnis gegen Zykluszahl ist,
  • 17 ein Plot von Fluoreszenzverhältnis gegen Temperatur ist,
  • 18 ein Plot von Fluoreszenz gegen Zykluszahl für verschiedene Anzahlen anfänglicher Templatkopien ist,
  • 19A–D zwei verschiedene Anordnungen zum sequenzspezifischen Nachweis von PCR-Produkten darstellen,
  • 20 ein Plot des Fluoreszenzverhältnisses (Fluorescein/Rhodamin) gegen Zykluszahl einer DNA-Amplifikation ist, die mit einer doppelt markierten Hydrolysesonde überwacht wurde,
  • 21A–C einen Vergleich von drei Fluoreszenzüberwachungsmethoden für PCR zeigen, einschließlich dsDNA-Farbstoff SYBR® Green I (A), einer doppelt markierten Fluorescein/Rhodamin-Hydrolysesonde (B) und einer mit Fluorescein markierten Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (C),
  • 21D den Variationskoeffizienten der drei in den 21A–C dargestellten Überwachungsmethoden zeigt,
  • 22 Plots zeigt, welche die Anwendung von Interpolationsverfahren zur Quantifizierung von PCR-Fluoreszenzkurven zeigen,
  • 23A einen Plot darstellt, der eine lineare Änderung des Fluoreszenzverhältnisses mit der Temperatur und eine parallele Zunahme der Fluoreszenz mit zunehmender Hydrolyse der Sonde zeigt,
  • 23B einen Plot darstellt, mit dem gezeigt wird, dass sich das Fluoreszenzverhältnis von Hybridisierungssonden mit der Temperatur drastisch ändert,
  • 24 einen Plot darstellt, welcher die Temperaturabhängigkeit des Strangzustands des Produkts während der PCR zeigt,
  • 24A ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenz einer PCR mit SYBR® Green I ist,
  • 25 einen Plot darstellt, welcher die nativen und kompetitiven Komponenten einer Produktschmelzkurve zeigt,
  • 26 einen Plot der Geschwindigkeit des Reannealings des Produkts für verschiedene Konzentrationen von PCR-Produkt zeigt,
  • 27 einen Plot darstellt, welcher die anfängliche Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten zeigt,
  • 28 eine Kurve ist, die ein Musterbeispiel einer Gleichgewichts-PCR und ein Musterbeispiel einer kinetischen PCR zeigt,
  • 29 zeigt, dass die Überwachung eines 10-fach dynamischen Bereichs im log-linearen Teil einer Routine-Amplifikation erfolgte,
  • 34 die mit einer Polarisationssonde erhaltenen Ergebnisse zeigt,
  • 35 die Ergebnisse der Fluoreszenz einer Sonde während einer PCR zeigt, wobei zwischen den Markern Fluorescein und Rhodamin fünf Basen lagen,
  • 36 den Einfluss der Sondenkonzentration auf die Empfindlichkeit zeigt,
  • 37 einen Plot von Zykluszahl gegen Fluoreszenzverhältnis bei einer PCR zeigt, die mit Resonanzenergietransfer und Hydrolysesonden überwacht wurde,
  • 38 ein Plot von Emissionswellenlänge gegen Fluoreszenz für einen Resonanzenergietransfer einer doppelt markierten Fluorescein/Cy5-Sonde ist,
  • 39 ein Plot ist, der Zykluszahl gegen Fluoreszenzverhältnis über Background bei einer PCR zeigt, die durch Resonanzenergietransfer mit Hybridisierungssonden überwacht wurde,
  • 40 ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenzverhältnis bei einer PCR ist, die mit benachbarten Hybridisierungssonden überwacht wurde,
  • 41 ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenzverhältnis bei einer PCR ist, die mittels Hydrolysesonde überwacht wurde,
  • 42A ein Plot von Zeit gegen Fluoreszenz ist, in dem die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz gezeigt ist,
  • 42B ein Plot von Zeit gegen Temperatur zeigt, in dem die inverse Beziehung zwischen Temperatur und Fluoreszenz gezeigt ist,
  • 43A ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenz für die Schmelzkurven von drei verschiedenen gereinigten PCR-Produkten ist,
  • 43 ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenz ist, in dem die Abhängigkeit der apparenten Tm der PCR-Produkte von der Aufheizgeschwindigkeit gezeigt ist,
  • 44 ein Plot von Temperatur gegen relative Fluoreszenz ist, mit welchem gezeigt wird, dass die Tm der PCR-Produkte von der Konzentration des dsDNA-Farbstoffs abhängt,
  • 45 ein Plot von Temperatur gegen Fluoreszenz ist, der die Schmelzkurve zeigt, die erhalten wird, wenn zwei gereinigte PCR-Produkte gemischt werden, die sich in ihrer Tm nur um etwa 2 °C unterscheiden,
  • 46 ein Plot ist, in dem dargestellt ist, wie man die relative Menge jedes PCR-Produkts quantifizieren kann,
  • 48 nützliche Temperatur-Zeit-Segemnte zur Fluoreszenzüberwachung von Hybridisierung veranschaulicht,
  • 49 als Schmelzpeaks dargestellte Schmelzkurveninformation zeigt,
  • 50 die Fluoreszenz dsDNA-spezifischer Farbstoffe als Funktion der Temperatur während der PCR darstellt, womit eine Überwachung des Strangzustands während der einzelnen Zyklen der Reaktion möglich wird,
  • 51 einen Zyklus der Schmelzkurvenerfassung darstellt,
  • 52A die absolute Lage von Schmelzkurven von PCR-Produkten darstellt,
  • 52B zeigt, wie schnelle Temperaturübergänge durch die Denaturierungstemperatur hindurch, die Schmelzkurven zu höherer apparenter Tm verschieben,
  • 53 Schmelzkurven drei verschiedener gereinigter PCR-Produkte zeigt,
  • 54 die sich überlagernden Schmelzkurven zeigt, die beim Mischen gereinigter PCR-Produkte resultieren,
  • 55 die in Schmelzpeaks umgerechneten Ergebnisse aufträgt und dadurch zeigt, dass es möglich ist, Mischungen von Reaktionsprodukten, die sich in ihrem Tm um weniger als 2 °C unterscheiden, in getrennte Peaks aufzulösen,
  • 56 die Analyse einer Schmelzkurve zeigt, die verwendet wird, um gewünschtes Produkt von unspezifischen Produkten, wie beispielsweise Primerdimeren, zu unterscheiden,
  • 57 die einmal pro Zyklus nach Extension des Produkts mit Polymerase erfasste relative Fluoreszenz bei einer Reihe von Reaktionen zeigt, die sich in ihrer anfänglichen Templatkonzentration unterscheiden,
  • 58 die für mehrere Proben erfassten Schmelzpeaks zeigt,
  • 59 die Datenpunkte von 57 multipliziert mit dem entsprechenden Verhältnis aufträgt, was zu einem korrigierten Plot führt,
  • 60 zeigt, dass die Ergebnisse von 58 gut mit den Elektrophoreseergebnissen korrelieren,
  • 61 zeigt, dass die in 56 dargestellten Schmelzkurven in einzelne Produktpeaks aufgelöst werden können, wodurch die relative Menge an verschiedenen vorhandenen Produkten abgeschätzt werden kann.
  • Im Folgenden wird auf die Zeichnungen Bezug genommen, in welchen gleiche Elemente mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet sind.
  • Obwohl dies kein Teil der vorliegenden Erfindung ist, zeigt 1 eine Thermocyclingvorrichtung 10, die eine allgemein mit 11 bezeichnete Kammer mit geschlossenem Fluidkreislauf (besonders bevorzugt mit Luft) umfasst, welche dazu ausgelegt ist, Proben, die ein Thermocycling durchlaufen sollen, durch eine Lüftungsklappe 14 aufzunehmen. Die Kammer mit dem geschlossenen Fluidkreislauf 11 weist mehrere Unterteilungen auf, die jeweils kurz beschrieben werden. Die Vorrichtung 10 umfasst auch eine Steuervorrichtung 12, die über Eingabetasten 25 und ein Display 26 programmiert werden kann, um in der Kammer 11 ein Thermocycling über mehrere Temperaturen in einem vorher festgelegten Zeitraum ablaufen zu lassen. Das Thermocycling in der Kammer 11 kann zur Durchführung verschiedener Prozesse eingesetzt werden und ist, wie weiter unten beschrieben, insbesondere zur Amplifikationen primerspezifischer DNA aus Proben geeignet, die Reaktionsmischungen enthalten.
  • Die Kammer mit geschlossenem Fluidkreislauf 11 ist im Allgemeinen in einem schachtelförmigen Gehäuse 13 untergebracht. Gebläsebefestigungsplatten 16 können, falls gewünscht, so angeordnet werden, dass sie einen kleineren, rechteckigen Bereich der Kammer 11 abtrennen und dazu dienen, ein im Allgemeinen zylinderförmiges Gehäuse 15 zu tragen und daran zu befestigen. Alternativ kann der Ventilator des Gebläses 28 in das Kammergehäuse 13 integriert sein.
  • Das Innere des Gebläsegehäuses 15 umfasst Flügel und Antriebswelle des Gebläses. Der Gebläsemotor (nicht dargestellt) ist außerhalb des Gebläsegehäuses 15 angeordnet und befindet sich daher auch außerhalb der umschlossenen Kammer 11.
  • In dieser Konfiguration stellen Flügel und Antriebswelle die einzigen Gebläseteile dar, die dem zirkulierenden heißen Fluid in der Kammer 11 ausgesetzt sind. Es wäre unvorteilhaft, den Motor innerhalb der Kammer zu befestigen, da er somit Temperaturänderungen ausgesetzt wäre und zudem die Wärmemasse des Motors derjenigen hinzugefügt werden würde, die aufgeheizt und abgekühlt werden soll. Die Verringerung der Wärmemasse, die dem Fluid in der Kammer 11 ausgesetzt wird, ist für das gesamte Betriebsverhalten der Vorrichtung 10 in ihrer Funktion, die darin platzierten Proben vorher festgelegten Temperatur-Zeit-Profilen auszusetzen, wichtig, wie weiter unten beschrieben ist.
  • Das Gebläse 28 ist ein gut bekannter Gebläsetyp, der gewöhnlich als „in line" Gebläsetyp ausgelegt ist, der aufgrund seiner im Allgemeinen geringen Wärmemasse vorzugsweise einen propellerartigen Ventilator oder, falls gewünscht, einen käferläufigartigen Ventilator besitzt, wobei der Ventilator vorzugsweise eine minimale Leistung von 75 ft3 pro Minute aufweist.
  • An der Vorrichtung für die Magnetspule 17 ist eine Magnetspule 18 befestigt. Der Magnetspulenanker 19 ist mit dem oberen Ende 21 einer Stange 20 befestigt, die wiederum fest mit der Lüftungsklappe 14 und drehbar an Stellen oberhalb und unterhalb der Lüftungsklappe 14 an dem Gehäuse 13 befestigt ist. Die Stange 20 ermöglicht daher der Lüftungsklappe 14, relativ zum Gehäuse 13, frei über die Längsachse der Stange zu drehen.
  • Eine Feder 22 ist an einem ihrer Enden über einen Tragpfosten 23 an dem Gehäuse 13 befestigt. Die andere Seite der Feder 22 ist an dem oberen Ende 21 der Stange, direkt neben der Aufhängung des Magnetspulenankers 19, befestigt. Die Feder 22 ist zwischen diesen beiden Befestigungsstellen gespannt. Deshalb neigt die Feder 22 dazu, das obere Ende 21 in Richtung des Tragpfostens 23 zu ziehen, wodurch die Lüftungsklappe 14 dazu neigt, sich in ihre geschlossene Position zu drehen. Wenn die Magnetspule 18 betätigt wird, neigt der Anker 19 dazu, das obere Ende 21 der Sange 20 in Richtung der Magnetspule 18 zu ziehen, was der Zugrichtung der Feder 22 entgegenwirkt und daher dazu neigt, die Lüftungsklappe 14 zu öffnen.
  • Die Steuervorrichtung, im Allgemeinen mit 12 bezeichnet, ist elektrisch über ein Übertragungskabel 24 mit der Kammer 11 verbunden. Das Kabel 24 versorgt auch den Gebläsemotor (nicht gezeigt) und die Heizwendel 31 mit Strom. Zudem ist die Steuervorrichtung 12 auch mit einem Thermoelementsensor 35, um den Temperaturdaten entsprechende Signale zu empfangen, und mit der Magnetspule 18, um den Magnetspulenanker auszulösen, verbunden.
  • Die Steuervorrichtung 12 kann ein gut bekannter Typ einer Temperatursteuereinheit sein, die darauf programmiert werden kann, die Heizwendel 31, die Lüftungsklappe 14 und das Gebläse so anzusteuern, dass innerhalb der Kammer 11 vorher festgelegte Temperaturen als Funktion der Zeit erreicht werden, und die ebenso darauf programmiert werden kann, einen Relaisausgang zum Ansteuern einer Magnetspule für vorher festgelegte Zeiträume und Temperaturniveaus in der Kammer zu betätigen. Eine bevorzugte Temperatursteuer-vorrichtung 12, die für die Ausführungsform der 1-3 verwendet werden kann, ist eine Partlow MIC-6000 Proportional Temperatursteuervorrichtung, die von Omega Engineering Inc., Stanford, Connecticut, unter der Modellnummer CN8600 process controller, erhältlich ist.
  • Obwohl es kein Teil der beanspruchten Erfindung ist, ist das Innere der Kammer 11, wie in den 2 und 3 gezeigt, in vier Hauptabschnitte unterteilt. Der Gebläseabschnitt 28 wird von dem Gebläsegehäuse 15 und den Gebläsebefestigungsplatten 16 gebildet. Der ganze Gebläseabschnitt 28 ist mit dem Ventilator und den oben beschriebenen Teilen der Gebläseantriebswelle ausgefüllt. Das Gebläse kann, wie oben beschrieben ist, einer der vielen, gut bekannten Bauarten entsprechen, und ist deshalb aus Gründen der Übersichtlichkeit in 3 weggelassen worden. Für die vorliegende Erfindung reicht es aus zu verstehen, dass der im Gebläseabschnitt 28 angeordnete Ventilator Fluid durch die Einlassöffnung 36 in den Gebläseabschnitt 28 einträgt und dieses durch die Auslassöffnung 37 wieder herausträgt.
  • Es wird bevorzugt, dass das Fluid vom Gebläse mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 75 ft3 pro Minute vorangetrieben wird. Hinsichtlich der vorliegenden Erfindung ist es jedoch trotzdem wichtig zu realisieren, dass das in der Kammer 11 vorhandene Fluid nur mit dem Ventilator und einem Teil der Gebläseantriebswelle in Berührung kommt und der Gebläsemotor selbst außerhalb des Gebläsegehäuses 15 angeordnet ist, wodurch jegliche Berührung mit dem Fluid in der Kammer 11 vermieden wird. Dies ist wichtig, da es für die Arbeitsgeschwindigkeit der Erfindung entscheidend ist, die Menge an Material zu minimieren, die mit dem Fluid in der Kammer 11 in Berührung kommt, um somit die Wärmemasse des Materials, das während des Thermocyclings von diesem aufgeheizt und/oder abgekühlt werden muss, zu minimieren. Durch Minimierung der vom Fluid zu erwärmenden oder abzukühlenden Wärmemasse wird die Reaktionszeit, die dazu notwendig ist, die Teile der Kammer 11 auf eine einheitliche Temperatur zu bringen, stark verringert.
  • Das den Gebläseabschnitt 28 durch die Auslassöffnung 37 verlassende Fluid tritt in den Heizabschnitt 29 ein. Das den Heizabschnitt 29 durchströmende Fluid muss die Heizwendeln 31 passieren. Wenn die Heizwendeln 31 heißer werden als das in den Heizabschnitt 29 gelangende Fluid, wird das Fluid, während es durch den Heizabschnitt 29 getrieben wird, erwärmt. Die Heizwendel ist vorzugsweise eine 1000 Watt- (125 VAC) Wendel aus Nichromdraht, die um einen Mikroträger gewickelt ist. Es kann jedoch jede beliebige andere Heizeinheit, die zur Erwärmung des in der Kammer vorhandenen Fluidtyps geeignet ist, verwendet werden. Die speziell in der Ausführungsform der 1–3 verwendete Heizwendel wurde von Johnstone Supply, Portland, Oregon, hergestellt.
  • Die Heizwendel 31 wird durch ein in der Steuervorrichtung 12 enthaltenes Ausgangsrelais aktiviert. Das bevorzugte Relais ist ein 25 A, 125 VAC Festkörperrelais, das von Omega Engineering Inc., Stanford, Connecticut, mit der Modellnummer Omega SSR 240 D25, hergestellt wurde.
  • Das den Heizabschnitt 29 passierende Fluid prallt auf die Staubleche 32 und 33, bevor es in den Reaktionsabschnitt 30 gelangt. Die Staubleche 32 und 33 neigen dazu, eine laminare Strömung zu unterbrechen und eine Turbulenz zu erzeugen, durch welche das Fluid effektiv vermischt wird, um mit homogener Temperatur in den Reaktionsabschnitt 30 zu gelangen.
  • Der Thermoelementsensor 35 erzeugt für die Steuervorrichtung 12 ein elektrisches Eingangssignal, das der Fluidtemperatur in dem Reaktionsabschnitt 30 entspricht. Die Temperaturüberwachung während des Betriebs der Thermocyclingvorrichtung 10 wird vorzugsweise mit einem Eisen-Konstantan-Thermoelement vom Typ J, Klasse 30 realisiert. Die Steuervorrichtung verwendet diese Informationen zur Steuerung der Heizwendel 31 nach den vorher festgelegten, einprogrammierten Temperatur-Zeit-Profilen und zur Aktivierung der Magnetspule 18, wie in Kürze erklärt werden wird.
  • Das von dem Reaktionsabschnitt 30 in den Luft-Rückleitungsabschnitt 34 strömende Fluid muss durch den Probenabschnitt 27 (dargestellt durch gestrichelte Linien) strömen. Der Probenabschnitt 27 wird ebenfalls in Kürze erläutert werden.
  • Das sich in dem Rückleitungsabschnitt 34 befindende Fluid wurde aufgrund der Wärmeübertragung auf die im Probenabschnitt angeordneten Proben leicht abgekühlt. Das sich im Rückleitungsabschnitt 30 befindende Fluid wird durch die Einlassöffnung 36 in den Gebläseabschnitt 28 getrieben, aus welchem es wiederum durch die Ventilatorwirkung durch die Auslassöffnung 37 in den Heizabschnitt 39 befördert wird. Deshalb ist die Fluidkammer 11, wenn sie mit geschlossener Lüftungsklappe 14 betrieben wird, eine Fluidkammer mit geschlossenem Fluidkreislauf in der das Fluid kontinuierlich in einer geschlossenen Schleife durch jeden Abschnitte zirkuliert, um die darin angeordneten Teile auf eine konstante Temperatur zu bringen. Die kontinuierliche Zirkulation der Luft in der Luftkammer 11 ermöglicht es, die Proben in dem Probenabschnitt 27 so schnell wie möglich auf eine vorher festgelegte Temperatur zu bringen und diese anschließend, wenn gewünscht, auf dieser Temperatur zu halten.
  • Wenn die Vorrichtung 10 nicht nur dafür verwendet werden soll, das in dem Reaktionsabschnitt 27 enthaltene Material zu erwärmen, sondern dieses anschließend auch so schnell wie möglich auf eine Temperatur, die der Temperatur des umgebenden Fluids (Luft) entspricht oder oberhalb von ihr liegt, abzukühlen, kann die Steuervorrichtung 12 darauf programmiert werden, die Magnetspule 18 zu betätigen, um die Lüftungsklappe 14 zu öffnen und unverzüglich große Mengen des umgebenden Fluids in die Kammer 11 strömen zu lassen, während gleichzeitig das darin erwärmte Fluid entweicht.
  • Deaktivierung der Heizwendel 31 bei kontinuierlicher Aktivierung des Gebläses bei geöffneter Lüftungsklappe 14 treibt das umgebende Fluid in den Rückleitungsabschnitt 34 und von dort aus in den Gebläseabschnitt 28. Das Gebläse treibt anschließend das umgebende Fluid durch den Heizabschnitt 29, von wo aus es direkt, ohne von der Wendel 31 erwärmt zu werden, in den Reaktionsabschnitt 30 gelangt. Das umgebende Fluid passiert somit den Probenabschnitt 27 und entweicht aus der Kammer 11 durch die Lüftungsklappe 14. Bedingt durch die minimale Wärmemasse des in der Kammer 11 enthaltenen Materials und der Wirkung des Gebläseventilators werden große Mengen des umgebenden Fluids an dem Probenabschnitt vorbei und von dort aus der Kammer 11 herausgetrieben. Dadurch wird eine schnelle Abkühlung der Proben oder des in dem Reaktionsabschnitt 27 enthaltenen Materials erreicht.
  • Der Probenabschnitt 27 ist so dimensioniert, dass mehrere Proben, wie beispielsweise die Proben enthaltenden, hohlen länglichen Glasröhrchen, leicht in voneinander räumlich getrennter Ausrichtung angeordnet werden können, so dass sich das Fluid gleichmäßig um jede Probe verteilen kann. Falls gewünscht, kann der Probenabschnitt 27 derart dimensioniert und aufgebaut sein, dass ein Gestell, ein Korb oder etwas Ähnliches, das für die Aufnahme mehrerer räumlich getrennt angeordneter Proben geeignet ist, eingebracht werden kann, so dass eine einfache Beladung des Probenabschnitts 27 mit den Proben möglich wird.
  • Zugang zu dem Probenabschnitt 27 wird durch Drehung der Lüftungsklappe 14 in ihre geöffnete Position erreicht. Wenn die Lüftungsklappe 14 um etwa 90 Grad aus ihrer geschlossenen Position gedreht wurde, wird der Probenabschnitt 27 darüber leicht zugänglich. Wie zu sehen ist, bewirkt eine etwa 90 Grad-Drehung der Lüftungsklappe 14 aus ihrer geschlossenen Position heraus die wesentliche Abtrennung des Rückleitungsabschnitts 34 von dem Reaktionsabschnitt 30. Wenn die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 in einer Betriebsart „Abkühlung" ist, wird umgebendes Fluid somit direkt in den Rückleitungsabschnitt 34 geleitet und im Wesentlichen auf dem gleichen Weg des geschlossenen Fluidkreislaufs, der oben beschriebenen ist, durch den Gebläseabschnitt 28, den Heizabschnitt 29, den Reaktionsabschnitt 30 und den Probenabschnitt 27 getrieben. Das Fluid wird anschließend aus der Luftkammer 11 herausgetrieben und, indem man die Lüftungklappe 14 zwischen den Probenabschnitt 27 und den Rückleitungsabschnitt 34 bringt, wird es daran gehindert, wieder in den Luft-Rückleitungsabschnitt 34 einzutreten.
  • Demnach ermöglicht die Lüftungsklappe 14 nicht nur den Eintritt des umgebendem Fluids in die Kammer 11, sondern sie kann auch das Fluid daran hindern, in einer Schleife durch die Kammer 11 zu zirkulieren. Stattdessen wird das Fluid durch den Probenabschnitt 27 und anschließend aus der Kammer 11 heraus getrieben, um zu einer schnellen Abkühlung der Probeninhalte und der Kammer 11 beizutragen.
  • Wenn die Vorrichtung 10 für zyklische DNA-Amplifikation verwendet wird, ist ein wiederholtes Thermocycling über ein Temperatur-Zeit-Profil erforderlich. Proben, die eine Reaktionsmischung für die Polymerasekettenreaktion enthalten, müssen ungefähr 30-mal ein Temperatur-Zeit-Profil durchlaufen, das den Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsphasen eines Amplifikationsprozesses entspricht.
  • Die Vorrichtung 10 ist aufgrund ihrer geringen Wärmemasse dazu fähig, Proben durch im Vergleich zum Stand der Technik wesentlich verkürzte Temperatur-Zeit-Profile zu fahren. Die DNA-Amplifikation in der Ausführungsform der 1-3 kann in 30–60 Sekunden einen Zyklus des Temperatur-Zeit-Profils durchlaufen (siehe 5). Vorrichtungen des Standes der Technik bräuchten für den gleichen Zyklus etwa 5–10-mal länger. Gegenüber dem Stand der Technik vergrößern diese geringen Zykluszeiten nachweislich Ausbeute und Spezifität der Polymerasenkettenreaktion.
  • Beispiel 1
  • Die Polymerasekettenreaktion wurde in einem 10 μl-Volumen mit 50 ng Templat-DNA, 0,5 mM jedes Desoxynukleotids, 500 nM jedes Oligonukleotidprimers in einem Reaktionspuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH 8,5 bei 25°C), 3,0 mM Magnesiumchlorid, 20 mM KCl und 500 μg/ml Rinderserumalbumin (5) durchgeführt. Polymerase von Thermus aquaticus (0/4 Einheiten Taq-Polymerase – StratageneTM) wurde dazugegeben, die Proben in 8 cm lange, dünnwandige Kapillarröhrchen (hergestellt von Kimble, Kimax 46485-1) gegeben, und die Enden so mit einem Laborgasbrenner zugeschmolzen, dass auf beiden Seiten des Röhrchens eine Luftblase vorlag.
  • Die Kapillarröhrchen wurden anschließend senkrecht in eine Halterung aus 1 mm dicker "vorgestanzter Lochplatte" ("prepunched perfboard", hergestellt von Radio Shack) gestellt. Die Mischung durchlief für die im Temperatur-Zeit-Profil der 5 angegebenen Zeiten 30 Zyklen bestehend aus Denaturierung (90–92 °C), Annealing (50–55 °C), und Elongation (72–75 °C). Temperaturüberwachung der Kapillarröhrchen wurde mit einem Miniaturthermoelement (IT-23, Sensortek, Clifton, NJ) durchgeführt, das in 10 μl destilliertem Wasser positioniert und mit einem Thermoelementmonitor (BAT-12, Sensortek) verbunden war. Die Amplifikationsprodukte wurden durch Elektrophorese auf einem 1,5%-igen Agarosegel aufgetrennt. Es wurden gute Ergebnisse erhalten.
  • Aus der Tatsache, dass die Vorrichtung 10 als wärmeübertragendes Medium Luft anstelle von Wasser verwendet, ergibt sich der Vorteil, dass die Wärmeübertragung über ein Medium (Luft) mit geringer Wärmekapazität erfolgt, welches sehr schnell erwärmt werden kann.
  • Die Ansprechzeit für die Abkühlung der Proben ist sehr kurz, da anstelle der bei aus dem Stand der Technik bekannten Prozessen verwendeten Mikrofugenröhrchen dünnwandige, die Probe enthaltende Glaskapillarröhrchen verwendet werden und die Wärmemasse des Materials in der Kammer 11 minimiert wurde (siehe 5). Solche Ansprechzeiten können die Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsschritte der Polymerasenkettenreaktion hinsichtlich Zeit und Temperatur optimieren.
  • Darüber hinaus werden kürzere "Rampen"-Zeiten erzielt, d. h. es wird die Zeit verkürzt, die erforderlich ist, um die Temperatur in der Probe von einem Wert auf den nächsten Wert der Phasen des Amplifikationsprozesses zu bringen. Dies verkürzt die für eine vollständige Amplifikation erforderliche Zeit und ermöglicht zudem eine spezifische Beobachtung der Annealing-, Denaturierungs- und Enzymkinetik im Ablaufprotokoll einer Polymerasekettenreaktion.
  • Die Staubleche 32 und 33 (wie in 3 gezeigt) können, wenn gewünscht, dazu verwendet werden, eine entsprechende Temperaturhomogenität in dem Probenabschnitt 27 zu erreichen. Wie in dieser Ausführungsform gezeigt, verringern die Staubleche 32 und 33 die Temperaturunterschiede im Reaktionsabschnitt 30 von etwa 10 °C auf etwa 2 °C. Falls gewünscht, können weitere (oder komplexere) Staubleche eingesetzt werden, die den Temperaturunterschied im Reaktionsabschnitt 30 weiter verringern sollen. Alternativ dazu kann der Ventilator, wie in 4 gezeigt, stromabwärts von der Heizwendel 31, aber vor dem Probenabschnitt 27 angeordnet sein, um ein gleichmäßigeres Vermischen zu erreichen.
  • Die durch Verwendung der Vorrichtung 10 erhaltenen Amplifikationsprodukte ähneln qualitativ und quantitativ denjenigen, die mit dem manuellen Thermocyclingverfahren im Wasserbad erhalten wurden. Mit der schnellen Wärmesteuerung der Reaktionsmischung sind jedoch Vorteile für Spezifität und Ausbeute möglich. 6 zeigt den Einfluss unterschiedlicher Denaturierungszeiten des in der Thermocyclervorrichtung 10 verwendeten Temperatur-Zeit-Profils der 5 auf die Ausbeute der DNA-Amplifikation. Die breiteren, senkrechten Linien entsprechen bei einer Denaturierungstemperatur jeweils einer bestimmten Zeit. Wie zu sehen ist, ist die Ausbeute bei der kürzesten möglichen Denaturierungszeit am größten. Eine derart schnelle Reaktion ist mit den Systemen aus dem Stand der Technik nicht möglich.
  • 7 zeigt den Einfluss des in der Thermocyclervorrichtung 10 verwendeten Temperatur-Zeit-Profils der 5 auf die Spezifität (d.h. eine spezifische Produktausbeute anstelle mehrerer ähnlicher Produkte oder anstelle so genannter „Schatten"-Produkte). Wie durch Verringerung der Wärmekapazität (Wärmemasse) der Vorrichtung 10 gezeigt wurde, kann mit der vorliegenden Vorrichtung die für die Polymerasekettenreaktion erforderliche Gesamtzeit deutlich verringert werden. Daneben reduziert die Verwendung kleiner Proben die Menge notwendiger, kostenintensiver Reagenzien um bis zu 90 %, wodurch sich mit Hilfe der vorliegenden Erfindung auch die Verfahrenskosten senken lassen. Beispielsweise können, wenn gewünscht, Kapillarröhrchen 108 mit Innendurchmessern von etwa 0,25 mm bis etwa 1,0 mm verwendet werden. Bei einigen Anwendungen können, wenn gewünscht, auch Kapillarröhrchen 108 mit Innendurchmessern von etwa 0,02 mm bis etwa 0,1 mm verwendet werden.
  • Die Vorrichtung 10 ist zur Amplifikation von DNA beliebiger Herkunft einsetzbar. Auch wenn ein bestimmter Aufbau und bestimmte Anordnungen der vorliegenden Erfindung bezüglich bestimmter Ausführungsformen der Thermocyclingvorrichtung 10 diskutiert wurden, können andere Anordnungen und Aufbauten verwendet werden. Anstelle von Luft können beispielsweise andere Fluide mit im Allgemeinen geringer Wärmemasse als Alternativen in der Vorrichtung 10 eingesetzt werden.
  • 8A zeigt eine perspektivische Abbildung und 8B eine Querschnittzeichnung bzw. einen Aufriss der zusätzlichen Ausführungsform. Es versteht sich von selbst, dass viele der oben aufgeführten Bestandteile und Lehren auch bei der in den 8A–C ausgeführten Ausführungsform Anwendung finden. Aus diesem Grund werden im Folgenden nur entsprechende zusätzliche Informationen über diese Ausführungsform aufgeführt. Ein wesentlicher Punkt der Ausführungsform der 8A–C ist, dass das wärmeerzeugende Element in der Nähe der Behälter liegt, welche die biologischen Proben enthalten, wodurch, wie unten erläutert ist, ein schnelleres Erwärmen und Abkühlen der biologischen Proben möglich wird.
  • Wie in Kürze zu sehen sein wird, stellt die in den 8A–C gezeigte Vorrichtung bezüglich der Geschwindigkeit, mit welcher das Thermocycling durchgeführt wird, eine noch größere Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, z. B. können 15 oder 30 DNA-Amplifikationszyklen in 30, 15, 10 bis 5 oder sogar noch weniger Minuten durchgeführt werden. Darüber hinaus stellt die Vorrichtung 100 eine bessere Wärmehomogenität in den Proben bereit, als es bislang möglich war.
  • In 8A ist der allgemeine Aufbau des Gehäuses 102 der Ausführungsform gezeigt. Das Gehäuse 102 steht auf Füssen 104 (am besten in 8B zu sehen) und dient dazu, die anderen aufgeführten Strukturelemente an ihrem Platz zu halten und die heiß werdenden Strukturelemente von ihrer umgebenden Umgebung zu isolieren. In der in 8A gezeigten Ausführungsform 100 sind Eingabetasten 25 und ein Display 26 enthalten, wie oben für die Vorrichtung 10 beschrieben wurde. Die oben beschriebenen Steuerelemente können ohne weiteres modifiziert werden oder als Muster für eine in der der Ausführungsform der 8A–C einsetzbaren Steuervorrichtung verwendet werden.
  • Wie am besten in der Querschnittzeichnung von 8B dargestellt ist, wird die Probenkammer mit der Klammer 106 bezeichnet. Ein Deckel 138, der durch ein Scharnier 131 mit dem Gehäuse 102 verbunden ist, kann geöffnet werden, um den Zugang zu der Probenkammer 106 zu ermöglichen. Die Probenkammer 106 weist vorzugsweise eine zylindrische Form auf, kann aber jede andere für die bestimmte Anwendung erforderliche Form oder Größe besitzen.
  • Die Probenkammer 106 ist mit einem schwarzen Schaummaterial 110 ausgekleidet, dessen Oberfläche lichtabsorbierende Eigenschaften besitzt, wobei die Masse der Dicke des Schaums Isoliereigenschaften aufweist. Das schwarze Schaummaterial kann eines sein, das bereits im Stand der Technik verfügbar ist und eines, das aus einem Plastikmaterial hergestellt wurde. Der Schaum 110 ist vorzugsweise ein Material, das bereits durch die darüber streichende Luft abgekühlt wurde, d. h. das Material weist eine geringe Wärmeleitfähigkeit und eine poröse Oberfläche auf.
  • Die dunkle oder schwarze poröse Oberfläche des Materials wandelt die kürzere Wellenlänge der auf die Oberfläche treffenden Strahlung in Strahlung längerer Wellenlänge um, d. h. Wärme, die in die Probenkammer abgestrahlt wird.
  • Der Schaum 110 dient dazu, die Probenkammer thermisch von dem umgebenden Luftraum im Gehäuse zu isolieren und er dient ebenso dazu, das von der Lampe 112 ausgestrahlte Licht in Wärmeenergie umzuwandeln. Der Schaum 110 kann durch andere strukturierte Elemente ersetzt werden. Beispielsweise kann ein Material mit einer schwarzen, dunklen oder sonstigen nichtreflektierenden Oberfläche, wie beispielsweise eine dünne Folie aus Polycarbonat mit einer schwarz gestrichenen Oberfläche, auf ein isolierendes Material, wie beispielsweise Fiberglas oder ein Schaumstoffmaterial, aufgebracht sein. Die schwarze oder dunkle Oberfläche, die auf eine Reihe verschiedener Substrate gestrichen werden kann, wandelt kurzwelligere Strahlung in Wärmestrahlung um, während das isolierende Material die Probenkammer thermisch von der Umgebung isoliert. Somit kann der Fachmann mit Hilfe der hier angegebenen Ausführungen viele verschiedene Materialien und strukturierte Elemente zum Auskleiden der Probenkammer einsetzen.
  • Die Lampe 112 ist vorzugsweise eine 500 W-Halogenlampe. Falls geeignete Steuervorrichtungen verwendet werden, können auch Lampen mit höherer Leistung oder mehrere Lampen, beispielsweise vier 500 W-Halogenlampen eingesetzt werden. Eine Lampenfassung 112A ist über eine Trägervorrichtung 112B am Gehäuse 102 angebracht. Die Lampe 112 kann die Probenkammer 106 sehr schnell und gleichmäßig auf die gewünschte Temperatur erwärmen. Andere Wärmequellen, d.h. Infrarotstrahlung, wie beispielsweise das oben beschriebene Nichromdrahtelement, können im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden.
  • In 8B sind zwei dünnwandige Kapillarröhrchen 108, wie sie oben beschrieben wurden, dargestellt. Auch wenn nur zwei dünnwandige Kapillarröhrchen 108 gezeigt sind, kann die Probenkammer 106 viele solcher Röhrchen aufnehmen. Die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 weisen gegenüber den früher eingesetzten Vorrichtungen, die oben beschrieben sind, einige wichtige Vorteile auf und stellen, zusammen mit der Probenkammer 106, eine derzeit bevorzugte Ausführungsform einer Vorrichtung zum Aufnehmen von biologischen Proben dar.
  • Es ist klar, dass ebenso viele andere Strukturelemente mit gleichen oder ähnlichen Funktionen eingesetzt werden können. Um einen leichten Zugang zu den dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 zu ermöglichen, werden diese vorzugsweise so gesteckt, dass sie teilweise durch Öffnungen 140 aus der Probenkammer herausragen, sie können aber auch vollständig in der Probenkammer 106 untergebracht sein, wie es bei zahlreichen Fluid enthaltenden Strukturelementen, die für bestimmte Anwendungen geeignet sind, der Fall ist. Die vorteilhaften dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 haben ein Fassungsvermögen von etwa 10 μl. Es ist selbstverständlich, dass das Volumen der Probe klein gehalten werden sollte und die Oberfläche der die Probe enthaltenden Strukturelemente relativ groß sein sollte, damit sie zusammen eine relativ kleine Wärmemasse darstellen. Es wird auch bevorzugt, dass Proben enthaltende Strukturelemente Volumina im Bereich von etwa 1 μl bis etwa 10.000 μl aufweisen. Dem Fachmann ist aber auch klar, dass im Umfang der vorliegenden Erfindung andere Probenvolumina verwendet werden können, sofern die unterschiedliche Wärmemasse der Strukturelemente berücksichtigt wird.
  • Die Lampe 112 und der Isolierschaum 110 stellen zusammen eine schnelle und gleichmäßige Erwärmung der in den dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 enthaltenen Probe und der in der Probenkammer 106 enthaltenen Luft bereit. Zur Messung der Temperatur in der Kammer wurde ein Thermoelement 134 in der Probenkammer 106 angebracht, und dieses wird dazu verwendet, die gewünschte Temperatur in der Probenkammer, wie oben beschrieben.
  • Das Thermoelement 134 ist vorzugsweise ein im Stand der Technik erhältliches Element, dessen thermisches Ansprechverhalten im Wesentlichen mit dem thermischen Ansprechverhalten der biologischen Probe und des Behälters, der diese enthält, übereinstimmt. Solche Thermoelemente können kommerziell von Lieferanten, wie beispielsweise Idaho Labs, bezogen werden, die eine Baureihe an Thermoelementen herstellen, die als metallummantelte Thermoelemente des Typs J bezeichnet werden. Die Anpassung des thermischen Ansprechverhaltens des Thermoelements an das thermische Ansprechverhalten der biologischen Probe und des Behälters kann vorzugsweise dadurch vorgenommen werden, dass ein Mikrothermoelement, wie beispielsweise das im Stand der Technik bekannte, von PhysiTemp erhältliche Thermoelement Modell IT-23, in eine typische biologische Probe, die in dem gewählten Behälter enthalten ist, eingebracht wird, und die Probe und das Thermoelement in einem Test den gleichen Temperaturänderungen unterzogen werden. Das getestete Thermoelement, oder einige externe Kriterien, können so lange geändert werden, bis das thermische Ansprechverhalten des Thermoelements an das thermische Ansprechverhalten der Probe und ihres Behälters in geeigneter Weise angepasst wurde.
  • Die in 8B dargestellte Anordnung ermöglicht eine gleichmäßigere Erwärmung und Abkühlung der Probe als die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen. In den früher erhältlichen Vorrichtungen erfolgte die Wärmeübertragung über die gesamte Probe durch Konvektion in der Probe. Die durch Konvektion induzierte Bewegung in der Probe, die in einem beliebigen Strukturelement enthalten ist, ist eine Folge von Temperaturgradienten oder -unterschieden in den üblicherweise kleinen biologischen Proben (z. B. 10–100 μl).
  • Der Einfluss der Temperaturgradienten in der Probe macht sich stärker bemerkbar und ist schwieriger zu steuern, wenn sich die Zykluszeit für eine Probe verringert. Das Vorhandensein ungleicher Temperaturen innerhalb einer Probe, und insbesondere das Verlassen auf ein „Mischen durch Konvektion" in der Probe, wie es bei Vorrichtungen aus dem Stand der Technik der Fall war, erhöht gewöhnlich die Zykluszeit einer Probe und hat aller Wahrscheinlichkeit nach schädliche Effekte auf die biologische Probe. Die Vorrichtung 100 ist dazu fähig, für eine Erwärmung und Abkühlung zu sorgen, bei der die Temperaturunterschiede in einer 10 μl Probe während der gesamten Zeit der 30 Zyklen in einem Bereich von weniger als ± 1 °C gehalten werden können.
  • Um für gleichmäßige Erwärmung und Abkühlung zu sorgen, ist es von Vorteil, dass die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 wenigstens einigermaßen gleichweit von der Wärmequelle, beispielsweise der Lampe 112 in der Vorrichtung 100, entfernt sind. 8C zeigt eine schematische Oben-Aufsicht auf die Lampe 112 und mehrere dünnwandige Kapillarröhrchen 108, wie sie in der in den 8A–B dargestellten Vorrichtung 100 angeordnet sind.
  • In der in 8C dargestellten Anordnung sind die dünnwandigen Kapillarröhrchen 108, die am weitesten von der Lampe 112 entfernt sind (angezeigt durch die Linie F), vorzugsweise nicht mehr als im Wesentlichen 40 %, und ganz besonders bevorzugt nicht mehr als im Wesentlichen 25 % weiter von der Lampe 112 entfernt, als der Abstand zwischen der Lampe 112 und jenen dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 ist, die der Lampe 112 (angezeigt durch die Linie N) am nächsten sind. Beispielsweise kann der durch die Linie N angezeigte Abstand etwa 7,3 cm betragen, während der durch die Linie F angezeigte Abstand etwa 8,5 cm beträgt.
  • Es sollte klar sein, dass die Anordnung der dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 anders sein kann, als er in den Figuren dargestellt ist, beispielsweise kreis- oder halbkreisförmig. Außerdem ist klar, dass sich der Punkt, von dem aus der Abstand zwischen dem wärmeerzeugenden Element und den Probenbehältern gemessen wird, mit der Art und Größe des wärmeerzeugenden Elements ändern kann. Beispielsweise kann das wärmeerzeugende Element mehrere Lampen oder elektrische Widerstandselemente umfassen, die sich in Form und Größe unterscheiden. Bei einigen Ausführungsformen kann es auch wichtig werden, den Abstand von der Kammerwand, an der die Probenbehälter angeordnet sind, zu berücksichtigen. In der dargestellten Ausführungsform dienen die Öffnungen 140 (siehe 8A) als Halterungsvorrichtungen für die Probenbehälter, gemäß der vorliegenden Erfindung können jedoch auch andere Strukturelemente mit gleichwertigen Funktionen eingesetzt werden.
  • Mit der Vorrichtung 100 werden zudem die in den Kapillarröhrchen 108 enthaltenen Proben sehr schnell und gleichmäßig abgekühlt. Um die Probenkammer 106 zu kühlen, wird Luft von außerhalb des Gehäuses 102 mit Hilfe eines Ventilators 116, der mit einer von einem Motor 118 angetriebenen Motorwelle 122 verbunden ist, durch ein unteres Gehäuseportal 114 in das Innere des Gehäuses getrieben. Da eine schnelle Abkühlung der Probenkammer erwünscht ist, ist es von Vorteil, dass die Kombination aus Motor 118 und Ventilator 116 ein ausreichend großes Luftvolumen in die Probenkammer 106 einbringt und anschließend diese Luft in der Probenkammer 106 verteilt, wie in Kürze erläutert werden wird. Andere Aufbauten als die in 8B dargestellte Anordnung mit Motor 118 und Ventilator 116 können ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
  • Die Verwendung von Luft als wärmeübertragendem Medium hat, im Gegensatz zu anderen Gasen oder Flüssigkeiten, die Vorteile, günstig zu sein, leicht erhältlich zu sein, einfach mischbar zu sein und keine Katastrophen zu verursachen. Im Fall der beschriebenen Ausführungsformen sorgt das große Verhältnis von Oberfläche zu Volumen der die Probe enthaltenden Kapillarröhrchen mit Luft als wärmeübertragendem Medium für eine schnelle Wärmeübertragung.
  • Während der Abkühlungsabschnitte des Thermocyclings treibt die Ventilatoraktivität 116 Luft mit Raumtemperatur in das Gehäuse 102. Es ist eine über ein Scharnier 129 befestigte Lüftungsklappe 128 vorgesehen. Die Lüftungsklappe 128 wird automatisch über eine Magnetspule 132 geöffnet, so dass das Innere des Gehäuses 102 von dem oberen Gehäuseportal 130 abgetrennt wird. In einigen Ausführungsformen wird die Magnetspule 132 vorzugsweise gegen einen Schrittmotor, wie er im Stand der Technik bekannt ist, ausgetauscht. Der Einsatz eines Schrittmotors ermöglicht es, die Lüftungsklappe 128 genau und schrittweise, gemäß den Anforderungen an Erwärmung und Abkühlung der Proben, zu öffnen und zu schließen. Der Fachmann wird mit Hilfe der hier angegeben Informationen dazu in der Lage sein, einen geeigneten Steuermechanismus zur Verwendung eines Schrittmotors, beispielsweise eine im Stand der Technik bekannte SC-149-Steuervorrichtung für einen Schrittmotor (erhältlich bei Alpha Products), zu entwickeln.
  • Aufgrund der Anordnung des unteren Probenkammerportals 120 und des größeren Querschnittsbereichs und der Lage des oberen Probenkammerportals 126, wird Luft mit Raumtemperatur in die Probenkammer 106 geführt, darin verteilt und innerhalb der Probenkammer 106 von einem mit der Motorwelle 122 verbundenen Schaufelrad 124 vermischt. Das Schaufelrad 124 sollte sich mit relativ hoher Geschwindigkeit drehen, die beispielsweise schnell genug ist, um in der Probenkammer 106 Luftgeschwindigkeiten von vorzugsweise etwa 250 m/min, besonders bevorzugt 500 m/min, und ganz besonders bevorzugt 1000 m/min zu erzeugen. Mit dem sich sehr schnell drehenden Schaufelrad 124 mit einer einzigen oder mehreren Schaufeln wird die Luft in die Probenkammer 106 gebracht, oder getrieben, und entlang des durch die gestrichelte Linie 136 gezeigten Wegs aus der Probenkammer 106 herausgetrieben. Die Drehung des Schaufelrads 124 verstärkt zudem die Vermischung der in die Probenkammer 106 gelangenden Luft und gewährleistet die effizienteste Übertragung von Wärmeenergie von den Oberflächen der dünnwandigen Kapillarröhrchen 108 auf die durch die Probenkammer 106 geleitete Luft. Es ist klar, dass auch andere als die hier dargestellten Strukturelemente gleichwertige Funktionen ausüben können.
  • Da die Magnetspule 132 betätigt werden muss, um die Lüftungsklappe 128 zu öffnen, wird die gesamte in die Probenkammer 106 geleitete Luft mit Raumtemperatur durch ein oberes Probenkammerportal 126 und anschließend durch ein obere Gehäuseportal 130 ausgestoßen, wobei die Wärme von der Probenkammer 106 in die umgebende Atmosphäre übertragen wird. Die schnelle Vermischung der Luft, die durch die Probenkammer 106 strömt und sich in ihr verteilt, führt zu einer schnellen und gleichmäßigen Abkühlung der Proben.
  • Beispiel 2
  • 9A zeigt die Ergebnisse vier verschiedener Temperatur-Zeit-Profile (A–D) und die daraus resultierenden Amplifikationsprodukte nach 30 Zyklen (A–D). Die Profile A und B in 9A wurden mit Hilfe eines Heizblocks aus dem Stand der Technik und Mikrofugenröhrchen aus dem Stand der Technik erhalten. Wie in 9A zu sehen ist, sind die Übergänge zwischen den Temperaturen langsam und viele unspezifische Banden in den Profilen A und B vorhanden. Profil B zeigt (im Gegensatz zu Profil A) eine Verbesserung, da einige unspezifische Banden durch Begrenzung der Zeit, die jede Probe bei jeder Temperatur bleibt, eliminiert werden, wodurch sich zeigt, dass mit kürzeren Zeiten wünschenswertere Ergebnisse erzeugt werden.
  • Die Profile C und D wurden mit der Vorrichtung der 8A–B erhalten. Wie in 9A zu sehen ist, erfolgt die Amplifikation spezifisch und, wie gewünscht, ist die Ausbeute, obwohl sie in C (60 Sekunden Elongation) maximal ist, bei D noch vollkommen ausreichend (10 Sekunden Elongation).
  • Die optimalen Zeiten und Temperaturen für die Amplifikation eines 536 bp-großen β-Globin-Fragments aus humaner genomischer DNA wurden ebenso bestimmt. Amplifikationsausbeute und Produktspezifität waren optimal, wenn Denaturierung (93 °C) und Annealing (55 °C) weniger als 1 Sekunde lang dauerten. Längere Denaturierungs- oder Annealingzeiten brachten keine Vorteile. Die Ausbeute stieg mit längeren Elongationszeiten (bei 77 °C) an, es zeigten sich aber kaum Änderungen bei Elongationszeiten, die länger als 10–20 Sekunden dauerten. Diese unerwarteten Ergebnisse zeigen, dass bei den früher verfügbaren, zur Amplifikation von DNA eingesetzten Vorrichtungen die zur Optimierung der physikalischen und enzymatischen Erfordernisse der Reaktion notwendigen Bedingungen nicht optimal eingestellt waren.
  • Weitere Informationen können erhalten werden aus: Wittwer, Carl T., Marshall, Bruce C., Reed, Gudrun B. und Cherry, Joshua L., "Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis ΔF50B Locus", 39 Clinical Chemistry 804 (1993), und Wittwer, Carl T., Reed, Gudrun H., und Rire, Kirk M., "Rapid DNS Amplification", The Polymerase Chain Reaktion 174 (1994).
  • Aus den in 9A bereitgestellten Informationen ist zu erkennen, dass die erfindungsgemäßen Ausführungsformen die darin angeordneten Proben einem schnellen Thermocycling unterwerfen, wobei die Temperatur der Probe mit einer Geschwindigkeit, die vorzugsweise wenigstens 0,5 °C/s beträgt, erhöht oder erniedrigt wird. Im Fall der erfindungsgemäßen Durchführung der Polymerasekettenreaktion wird die Temperaturänderung vorzugsweise über einen ungefähren Bereich von 30 °C bis 50 °C ausgeführt. Es ist von Vorteil, das Thermocycling schnell genug auszuführen, um wenigstens 30 Thermozyklen in 40 Minuten und besonders bevorzugt 30 Thermozyklen in 20 Minuten und ganz besonders bevorzugt 30 Thermozyklen in 10 Minuten zu vollenden.
  • Die Vorrichtung 100 erhöht und erniedrigt besonders bevorzugt die Probentemperatur mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 1,0 °C/s, besonders bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 4,0 °C/s und ganz besonders bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 10,0 °C/s. Es ist von entscheidender Bedeutung, dass die biologische Probe, und nicht nur das umgebende Medium und/oder der Probenbehälter, die spezifische Temperaturänderung durchlaufen. Die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen, die zudem den Nachteil haben, Temperaturwechsel nicht so schnell wie die vorliegende Vorrichtung auszuführen, erkannten zudem nicht das Problem, auch die Temperatur der Probe, und nicht nur die Temperatur des umgebenden Mediums und des Behälters, schnell und gleichmäßig zu ändern.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren kann, unter Bezug auf die Abbildung der 9B, in wünschenswerter Weise ein Thermocycling mit einer Geschwindigkeit von vorzugsweise wenigstens 10 °C/s und besonders bevorzugt mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 20 °C/s über einen Temperaturbereich von wenigstens etwa 20 °C, besonders bevorzugt über einen Temperaturbereich von etwa 30 °C und ganz besonders bevorzugt über einen Temperaturbereich von etwa 40 °C erreichen. 9B zeigt die Temperatur der biologischen Probe in °C, und nicht nur die der umgebenden Luft oder des Behälters, während die biologische Probe das Thermocycling durchläuft. 9B zeigt eine PCR-Probe, die bei etwa 74 °C startet und für 2 Sekunden auf eine Denaturierungstemperatur, angezeigt durch D, von etwa 92 °C aufgeheizt wird. Die Probe wird anschließend zwei Sekunden lang auf eine Annealingtemperatur, angezeigt durch A, von etwa 55 °C abgekühlt. Der Übergang zwischen der Denaturierungstemperatur und der Annealingtemperatur deckt einen Bereich von 37 °C in unter 4 Sekunden ab, wodurch sich eine Geschwindigkeit von wenigstens 10 °C/s ergibt. Die Probe wird anschließend 5 Sekunden lang auf eine Extensionstemperatur von 74 °C aufgeheizt, in 9B mit E angezeigt. Das Cycling der Proben über die Denaturierungstemperatur, die Annealingtemperatur und die Extensionstemperatur wird dreißig Mal oder so oft wie gewünscht wiederholt.
  • Die 9C–G zeigen beispielhafte Zyklen anderer bevorzugter Temperatur-Zeit- Profile, die mit der vorliegenden Erfindung erreicht werden können. Es ist selbstverständlich, dass Fachleute die dargestellten Temperatur-Zeit-Profile verändern können, um spezielle Prozesse gemäß der vorliegenden Erfindung auszuführen. Der Fachmann versteht auch, dass die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren, wie beispielsweise Vorrichtungen, die über einen Festkörper oder eine Flüssigkeit Wärme zu der Probe hin oder von ihr weg leiten, die hier beschriebenen Temperatur-Zeit-Profile liefern und diese nicht nahelegen oder lehren. Ferner ist offensichtlich, dass die früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren, welche Luft als übertragendes Medium nutzten, wie beispielsweise früher verfügbare Chromatographieöfen, die hier beschriebenen Temperatur-Zeit-Profile nicht liefern können und diese weder nahelegen noch lehren.
  • Um die kürzeste Thermocyclingzeit zu liefern, ist es vorteilhaft, die Lampe (in den 8A und 8B mit 112 bezeichnet) mit einer Leistung von 2000 Watt oder mehrere Lampen mit ähnlicher Ausgangsleistung vorzusehen. Es ist außerdem von Vorteil, einen Steuerschaltkreis für das Temperaturgefälle einzubauen, der in 10 in Verbindung mit einem A-Bus-Steuer-/Erfassungssystem dargestellt ist, wobei ein 8052-Mikrocontrollerboard mit einer Uhr und einem Programmübersetzer für höhere Sprachen, erhältlich von Alpha Products (Modellnummer SP-127), Darian, Connecticut, verwendet wird. Ein Beispiel eines Programmiercodes, der in Verbindung mit dem beschriebenen Mikrocontroller verwendet wird, ist als Anhang „Programmiercode" beigefügt und es wird hier vollinhaltlich Bezug darauf genommen. Der im Anhang angegebene Programmiercode ist eine BASIC52-Datei, die seriell auf den Mikrocontroller geladen werden kann und beispielhaft für eine Steuerung eines Temperaturgefälles während des Thermocyclings sorgt. Die Verwendung einer wärmeproduzierenden 2000 Watt-Vorrichtung und die beschriebenen Strukturelemente zur Steuerung ermöglichen in vorteilhafter Weise Geschwindigkeiten von 20 °C/s.
  • Die bevorzugte Anordnung für den in der 10 dargestellten Steuerschaltkreis des Temperaturgefälles wird nun erläutert werden, wobei klar ist, dass die nicht explizit in 10 dargestellten zusätzlich nötigen Komponenten ohne Weiteres vom Fachmann bereitgestellt werden können.
  • Der Steuerschaltkreis für das Temperaturgefälle in 10 umfasst ein Thermoelement 200, das wie oben beschrieben an das Temperaturverhalten der Probe angepasst wurde. Das Thermoelement 200 ist mit einem integrierten Schaltkreis 206 verbunden, der vorzugsweise einer der aus dem Stand der Technik bekannten, beispielsweise ein AD595, ist, dessen Ausgang zu einem Tiefpassfilter vierter Ordnung 208 mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz und zu einem 12 bit Analog/Digital-Wandler 210 führt, dessen Ausgang zur digitalen Darstellung der Temperatur verwendet wird.
  • Der Ausgang des Schaltkreises 206 wird außerdem zu einem Messschaltkreis des Gefälles 212 geleitet. Der Messschaltkreis des Gefälles 212 umfasst vorzugsweise einen 353-Operationsverstärker 218, ein 100 kΩ-Potentiometer 214, ein 1 MΩ-Potentiometer 230 und einen 22 μF-Kondensator. Der Messschaltkreis des Gefälles 212 gibt ein Signal an den invertierenden Eingang eines 353-Operationsverstärkers 246 aus.
  • Ein Stellkreis des Gefälles 222 umfasst einen Digital/Analog-Wandler 226 zum Einstellen eines positiven Gefälles und einen Digital/Analog-Wandler 224 zum Einstellen eines negativen Gefälles. Die Digital/Analog-Wandler 224 und 226 sind vorzugsweise 8 bit-Digital/Analog-Wandler, die im Stand der Technik mit DA147 bezeichnet werden. Der Stellkreis des Gefälles kann vorzugsweise Anweisungen von anderen digitalen Vorrichtungen (nicht in 19 dargestellt), wie beispielsweise einem PC, empfangen. Die Ausgabe des Stellkreises des Gefälles 228 kommuniziert mit einem Schaltkreis mit Signalsummierung 240.
  • Der Schaltkreis mit Signalsummierung 240 umfasst vorzugsweise 100 kΩ-Widerstände 236, 238 und 244 und einen 353-Operationsverstärker 242. Die Ausgabe des Schaltkreises mit Signalsummierung 240 wird in den nicht-invertierenden Eingang des Operationsverstärkers 246 geführt und stellt das gewünschte Gefälle der Temperaturänderung dar. Die Ausgabe des Operationsverstärkers 246 wird an einem Transistor 248 bereitgestellt, der in einem Stromschaltkreis 262 enthalten ist.
  • Der Stromschaltkreis 262 umfasst eine 5-VDC-Versorgung 250, die den Transistor 248 mit Strom versorgt. Der Emitter des Transistors 248 ist über einen Widerstand 252, vorzugsweise einen 300 Ω-Widerstand, mit einem 3010-Schaltkreis 254 verbunden. Der 3010-Schaltkreis 254 umfasst einen Ausgang, der mit einem Widerstand 256, vorzugsweise einem 180 Ω-Widerstand, in Reihe geschaltet ist. Ein Doppeltransistor 258 wird vorzugsweise zur Steuerung des Stroms, der von einer Gleichstromquelle 260 an eine Lampe 262, oder eine andere wärmeerzeugende Vorrichtung, geliefert wird, verwendet.
  • Der in 10 dargestellte Steuerschaltkreis des Temperaturgefälles sorgt zusammen mit den anderen beschriebenen Systemkomponenten für das Thermocycling biologischer Proben mit wenigstens 20 °C/s über einen Temperaturbereich von 30 °C und ganz besonders bevorzugt über einen Bereich von 40 °C, wobei die Homogenität in der gesamten biologischen Probe erhalten bleibt.
  • Es ist offensichtlich, dass die hier beschriebene Vorrichtung leicht für viele verschiedene Anwendungen eingesetzt werden kann, einschließlich: Prozessen von Polymerasekettenreaktionen; Zyklusequenzierung; und anderer Amplifikationsprotokolle wie beispielsweise Ligasekettenreaktion.
  • Eine Vorrichtung kann auch die Temperatur der in der Probenkammer angeordneten Proben genau steuern und schnell und genau die Temperatur der in einer Kammer angeordneten Proben gemäß einem vorher festgelegten Temperatur-Zeit-Profil variieren.
  • Kontinuierliches Fluoreszenz-Monitoring einer DNA-Amplifikation
  • Die Polymerasekettenreaktion kann schnell durchgeführt werden. Bei Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und der hier beschriebenen Vorrichtung kann die erforderliche Anzahl an Temperaturzyklen routinemäßig in viel weniger Zeit als es bisher im Stand der Technik möglich war, beispielsweise in weniger als 15 Minuten vollendet werden. Durch Minimierung der Denaturierungs- und Annealingzeiten werden auch Spezifität und Ausbeute der schnellen Amplifikationszyklen in einem bislang nicht möglichen Maße verbessert. Neben einer leichteren Wärmeübertragung ermöglicht die Verwendung optisch durchlässiger Kapillarröhrchen gemäß der vorliegenden Erfindung ein kontinuierliches Monitoring der Fluoreszenz während einer DNA-Amplifikation.
  • Fluoreszenzsonden können zum Nachweis und zur Überwachung einer DNA-Amplifikation verwendet werden. Nützliche Sonden umfassen für Doppelstrang-DNA spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden. Mit dem Interkalator Ethidiumbromid steigt die durch UV angeregte rote Fluoreszenz in den Kapillarröhrchen oder Mikrofugenröhrchen nach der Amplifikation an. Der Nachweis sequenzspezifischer Fluoreszenz ist mit Oligonukleotid-Hybridisierungssonden möglich. Beispielsweise können doppelt markierte Fluorescein/Rhodamin-Sonden während der Extension der Polymerase durch 5'-Exonukleaseaktivität gespalten werden, wodurch die Fluorophore getrennt werden und das Fluoreszenzverhältnis von Fluorescein/Rhodamin ansteigt.
  • Fluoreszenz kann nach Abschluss des Thermocyclings, einmal pro Zyklus zur Überwachung der Produktakkumulation, oder kontinuierlich in jedem Zyklus gemessen werden. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung waren die früher zur Verfügung stehenden sequenzspezifischen Verfahren auf Endpunktanalysen beschränkt.
  • Die vorliegende Erfindung erlaubt eine "Cycle-by-cycle"-Überwachung zur Quantifizierung der anfänglichen Anzahl an Templatkopien. Um eine solche "Cycle-by-cycle"-Überwachung auszuführen, wird die Fluoreszenz während der Extensionsphase oder während der kombinierten Extensions-/Annnealingphase in jedem Zyklus erfasst und in Beziehung zur Produktkonzentration gesetzt. Ein quantitativer Test für Hepatitis C-RNA mit dem Interkalator YO-PRO-1TM ist im Stand der Technik bekannt. Siehe Ishiguro, T., J. Saitch, H. Yawata, H. Yamagishi, S. Iwasaki und Y. Mitoma, 1995, "Homogeneous quantitative assay of hepatitis C virus RNA by polymerase chain reaction in the presence of a fluorescent intercalater", Anal. Biochem. 229:207–213. Vor der vorliegenden Erfindung wurde keine effiziente und genaue kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung in jedem Zyklus durchgeführt.
  • Hier wird ein schneller Thermocycler mit integrierter 2-Farben-Fluoreszenzoptik offenbart, der für eine kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung sorgt. Wie im Folgenden ausführlicher diskutiert werden wird, werden hier drei verschiedene bevorzugte Fluoreszenzmethoden zur Verfolgung der DNA-Amplifikation als spezielle Beispiele der vorliegenden Erfindung gegeben. Fachleute sind mit der Verwendung von Ethidiumbromid in Fluoreszenzmethoden, die erfindungsgemäß verwendet werden können, vertraut. In einer derzeit bevorzugten, weiter unten beschriebenen Ausführungsform wird vorzugsweise SYBR® Green I, das im Stand der Technik bekannt und von Molecular Probes, Eugene, Oregon erhältlich ist, als doppelstrangspezifischer Farbstoff eingesetzt. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und Fluoreszenz alle 200 ms erfasst. Diese Daten offenbaren während des schnellen Thermocyclings genaue Details über Produktdenaturierung, -reannealing und -extension, die mit den früher zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und Verfahren nicht verfügbar waren. Zudem werden, wie weiter unten ausführlicher diskutiert ist, die mit einer im Stand der Technik gut bekannten 5'-Exonuclease-Quenchsonde erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen verglichen, die durch doppelstrangspezifische Fluoreszenz erhalten wurden. Daneben wird, wie weiter unten ausführlicher erläutert ist, die Verwendung eines neuartigen Fluoreszenzschemas auf der Grundlage benachbarter Hybridisierungssonden über Resonanzenergietransfer von Fluorescein zu einem bekannten Cyaninfarbstoff Cy5TM, offenbart. Mujumdar, R.B., L.A. Ernst, S.R. Mujumdar und A.S. Waggoner, 1989, „Cyanine dye labelling reagents containing isothiocyanate groups", Cytometry 10:11–19.
  • Wie der Fachmann erkennt, stellt die „Once-per-cycle"-Überwachung mehrerer eine DNA-Amplifikation durchlaufender Proben ein leistungsfähiges quantitatives Werkzeug dar. Mit dieser Offenbarung kann durch kontinuierliche Überwachung während eines Zyklus selbstverständlich die Art der Sondenfluoreszenz bestimmt werden und ein Einblick in die Mechanismen der DNA-Amplifikation vermittelt werden, der im Stand der Technik früher nicht zur Verfügung stand.
  • Obwohl sie kein Teil der vorliegenden Erfindung ist, zeigt 11 eine schematische Abbildung eines bevorzugten schnellen Thermocyclers mit Fluoreszenznachweis, allgemein mit 300 bezeichnet. Eine Heißluftgebläsequelle 302 ist vorzugsweise eine kommerziell erhältliche Vorrichtung mit einer 1600 W-Heizwendel und einem Ventilator. Eine Kaltluftgebläsequelle 304 ist vorzugsweise ein Spaltpolgebläse mit 2200 Umdrehungen/min, das im Stand der Technik von Dayton, Niles, Illinois, Modellnummer 4C006B, erhältlich ist. Es ist vorteilhaft, dass die Kaltluftgebläsequelle 304 Luft mit Raumtemperatur bereitstellt, es liegt aber auch im Umfang der vorliegenden Erfindung, Vorrichtungen einzusetzen, die Fluide mit Temperaturen zur Verfügung stellen, die kleiner als die Temperatur der umgebenden Luft sind. Im Ausführungsbeispiel der 11 werden geriffelte schwarze Nylonröhrchen 306 und 308 mit einem Durchmesser von 2,5 cm dazu verwendet, die Heißluftgebläsequelle 302 bzw. die Kaltluftgebläsequelle 304 mit der Probenkammer 310 zu verbinden. Ein Lüftung 312 und ein Abluftgebläse 314 treiben Luft aus der Probenkammer 310 heraus. Das Innere der Probenkammer 310 wird vor Außenlicht geschützt.
  • Die Temperatur der Proben in der Probenkammer 310 wird mit einem röhrenförmigen, metallummantelten Thermoelement 316, das von Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho, Modellnummer 1844, erhältlich ist, überwacht, das an das thermische Ansprechverhalten der in den Kapillarröhrchen angeordneten Proben angepasst wurde. Die Temperaturhomogenität in der Probenkammer 310 wird mit einem zentral angeordneten Probenkammerventilator 318 erreicht. Der Probenkammerventilator umfasst vorzugsweise einen 1,7 × 11 cm großen Ventilatorflügel, der von Idaho Technology, Modellnummer 1862, erhältlich ist, und einen Motor, der ebenso bei Idaho Technology, Modellnummer 1861, erhältlich ist, mit welchen in der Probenkammer 310 Luftgeschwindigkeiten von wenigstens 800 bis 1000 m/min erzeugt werden.
  • In der Probenkammer 310 sind mehrere Proben, die in Kapillarröhrchen angeordnet sind und von denen einige unter 320 dargestellt sind, senkrecht in einem Rotationskarussell 322 angeordnet. Das Karussell 322 hat vorzugsweise einen Durchmesser von 14 cm und rotiert mit 400 Schritt pro Umdrehung, angetrieben von einem Schrittmotor 324, der mit einem Mikroschrittantriebsmodul 326 gesteuert wird. Der Schrittmotor 324 ist vorzugsweise einer, der von New England Affiliated Technologies, Lawrence, Massachusetts, unter der Modellnummer 2198364 erhältlich ist, und das Mikroschrittantriebsmodul 326 ist vorzugsweise eines, das ebenfalls von New England Affiliated Technologies, Lawrence, Massachusetts, unter der Modellnummer MDM7 „microstepping drive module" erhältlich ist und das 12.800 Schritte pro Karussellumdrehung vorsieht.
  • Weiterhin auf die 11 bezogen wird eine Quelle zur Anregung der Fluoreszenz 328 bereitgestellt. Der Weg der Anregung wird nun im Folgenden beschrieben. Die Quelle zur Anregung der Fluoreszenz 328 ist vorzugsweise eine 75 W-Xenon-Lichtbogenquelle, die mit einem elliptischen Reflektor fokussiert wird, wobei die Xenon-Lichtbogenquelle vorzugsweise von Photon Technology International, South Brunswick, New Jersey, unter der Modellnummer A 1010 mit einem elliptischen Reflektor mit f/2,5 erhältlich ist. Alternativ dazu kann eine lichtemittierende Diode verwendet werden. Das Licht, das von der Quelle zur Anregung der Fluoreszenz 328 ausgesendet wird, wird auf etwa 2 mm fokussiert, wobei eine justierbare Iris 334, beispielsweise eine, die im Stand der Technik von Rolyn (Covina, Kalifornien) mit der Modellnummer 75.0125 erhältlich ist, verwendet wird. Das von der Quelle zur Anregung der Fluoreszenz 328 ausgesandte Licht fällt auf einen kalten Spiegel 330, der vorzugsweise bei Rolyn unter der Modellnummer 60.4400 erhältlich ist, und führt dann durch wärmeabsorbierendes Glas 332, das vorzugsweise auch eines ist, das bei Rolyn unter der Modellnummer 65.3130 erhältlich ist. Danach erfolgt Kollimation durch eine plankonvexe Linse 336, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modellnummer 10.0260 erhältlich ist, einen 450–490 nm Bandpass-Interferenzfilter 338, der vorzugsweise bei Omega Optical, Brattleboro, Vermont unter der Modellnummer. 470RDF40 erhältlich ist, eine fokussierende plankonvexe Linse 340, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modellnummer. 10.0260 erhältlich ist, und ein 1 mm Siliziumdioxidfenster 342, das vorzugsweise von Omega erhältlich ist, um Kondensation auf den soeben beschriebenen optischen Komponenten während des Thermocyclings zu verhindern. Mit Hilfe des beschriebenen Wegs der Anregung wird ein 5–7 mm großer Bereich eines Kapillarprobenröhrchen 320A beleuchtet.
  • Unter weiterer Bezugnahme auf die 11 wird als nächstes der Sammelweg zur Sammlung der aus der Probe 320A emittierten Fluoreszenz beschrieben. Die Optik des Sammelwegs umfasst ein 1 mm dickes Siliziumdioxidfenster 344, das auch dazu eingebaut wurde, Kondensation auf anderen optischen Komponenten zu verhindern. Zwei einander gegenüberliegende asphärische Linsen 346A und B, die vorzugsweise bei Rolyn unter der Modellnummer 17.1175 erhältlich sind, dienen dazu, die emittierte Fluoreszenz auf einen 2 × 10 mm großen Spalt 348, der durch Schneiden eines ausgestellten Röntgenstrahlfilms, der als räumlicher Filter wirkt, hergestellt werden kann, zu fokussieren. Nach dem räumlichen Filter 348 wird die emittierte Fluoreszenz auf eine elektronische 35 mm Blende 350 gelenkt, die über eine elektronische Blendensteuervorrichtung 352 betätigt wird. Die elektronische 35 mm Blende ist vorzugsweise eine Uniblitz-Blende mit der Modellnummer VS35, und die elektronische Blendensteuervorrichtung 352 ist vorzugsweise ein Treiber mit der Modellnummer D122, die beide von Vincent Associates, Rochester, New York, erhältlich sind. Daneben wird auch eine asphärische Sammellinse 354, die vorzugsweise von Rolyn unter der Modellnummer 17.1175 erhältlich ist, zur Verfügung gestellt.
  • Ein Filter 356 ist auch dann umfasst, wenn der Nachweis von SYBR® Green I-Emissionen erwünscht ist. Der Filter 356 ist ein 520–580 nm Bandpassfilter, der bei Omega unter der Modellnummer 550RDF60 erhältlich ist und vorzugsweise für Einfarbmessungen eingesetzt wird. Zum Nachweis anderer Emissionen kann beispielsweise eine Kombination aus Zweifarbenfilter 358 und Wellenlängenfiltern 358A und 358B in einem Filterblock verwendet werden. Zur Auftrennung der Fluorescein- und Rhodamin-Emissionen wird ein Zweifarbenfilter 358 verwendet, der für den Nachweis von Fluorescein vorzugsweise aus einem 560 nm Langpass-Zweifarbenfilter, der vorzugsweise von Omega unter der Modellnummer 560 DRLP erhältlich ist, und einem 520–550 nm Bandpassfilter (358A), der vorzugsweise von Omega unter der Modellnummer 535DF30 erhältlich ist, für den Nachweis von Rhodamin aus einem 580–620 nm Bandpassfilter (538B), der vorzugsweise von Omega unter der Modellnummer 600DF40 erhältlich ist, besteht. Für die Auftrennung von Fluorescein- und Cy5TM-Emissionen ist der Zweifarbenfilter 358 vorzugsweise ein 590 nm Zweifarbenfilter, der von Omega unter der Modellnummer 590 DRLP erhältlich ist, und die Filter 358A und B bestehen für den Nachweis von Fluorescein vorzugsweise aus einem 520–550 nm Bandpassfilter (358A), der von Omega unter der Modellnummer 535DF30 erhältlich ist, und für den Nachweis von Cy5 aus einem 660–680 nm Bandpassfilter (358B), der von Omega unter der Modellnummer 670DF20 erhältlich ist.
  • Unter weiterer Bezugnahme auf die 11 wird die Fluoreszenz, nachdem sie den Filter 358 passiert hat, durch zwei plankonvexe Linsen 360A und 360B, die vorzugsweise bei Edmund, Barrington, New Jersey, unter der Modellnummer 32970 erhältlich sind, auf zwei Photomultiplierröhren 362A und 362B fokussiert. Die Photomultiplierröhren (PMT) 362A und 362B werden vorzugsweise von Hamamatsu, Middlesex, New Jersey, unter der Modellnummer R928 erhalten und sind jeweils in einem Gehäuse untergebracht, das vorzugsweise bei Photon Technology International unter der Modellnummer 714 mit Analogerfassung erhältlich ist. Ein Steuermodul der PMT- und Datenerfassung 364 ist vorzugsweise ebenso vorgesehen. Manuelle PMT-Blenden 366A und 366B, die im Stand der Technik bekannt sind, sind ebenfalls vorgesehen.
  • Die oben beschriebenen optischen Komponenten haben vorzugsweise einen Durchmesser von 5 cm und sind an einer 5 cm großen, universellen Linsenbefestigung angebracht, wobei diese beispielsweise eine ist, die bei Rolyn unter der Modellnummer 90.0190 erhältlich ist. Wie der Fachmann weiß, wurden viele der erforderlichen Strukturkomponenten aus schwarzem DelrinTM hergestellt.
  • Bei Verwendung der in 11 dargestellten Vorrichtung wurde die DNA-Amplifikation in 50 mM Tris, pH 8,3 (25 °C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 μM von jedem Primer, 0,5 mM von jedem Desoxynukleotidtriphosphat und 0,2 U Taq-Polymerase pro 5 μl Probe durchgeführt, soweit es nicht anders in den folgenden Beispielen angegeben ist. Humane genomische DNA (durch 1 minütiges Kochen denaturiert) oder ein gereinigtes Amplifikationsprodukt wurde als DNA-Templat verwendet. Das gereinigte Amplifikationsprodukt wurde über Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung, siehe Wallace, D.M., 1987, „Large- and small-scale phenol extraction and precipitation of nucleic acids", Seite 33–48 bei S. L. Berger und A. R. Kimmel (Hrsg.), Guide to Molecular Cloning Techniques (Methods in Enzymology, Vol. 152), Academic Press, Orlando, erhalten, worauf die Primer durch wiederholtes Waschen durch einen Centricon 30-Mikrokonzentrator (erhältlich bei Amicon, Danvers, Massachusetts) entfernt wurden. Die Templatkonzentrationen wurden durch Absorption bei 260 nm bestimmt. Die Verhältnisse von A260/A290 der Template waren größer als 1,7.
  • Primer wurden mit der im Stand der Technik bekannten Standardphosphoramiditchemie, nämlich mit Hilfe des Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey), synthetisiert. Das 180-Basenpaar-Fragment des Hepatitis B-Oberflächenantigengens wurde mit den Primern
    5'-CGTGGTGGACTTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO: 1) und
    5'-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO: 2)
    (Genbanksequenz HVHEPB) amplifiziert. Der SYBR® Green I-Farbstoff wurde von Molecular Probes (Eugene, Oregon) erhalten. Die β-Actin-Primer und die doppelt markierte Fluorescein/Rhodamin-Sonde wurden von Perkin Elmer (Foster City, Kalifornien) (Nr. N808-0230) erhalten. Die humanen β-Globin-Primer RS42/KM29 (536 Basenpaare) und PC03/PC04 (110 Basenpaare) sind bei Wittwer, C.T., G. C. Fillmore und D. R. Hillyard, "Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air", Nucl. Acids. Res. 17: 4353–4357 beschrieben. Die einfach markierten Sonden
    5'-CAAACAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTGAGGA-Fluorescein-3'
    (SEQ ID NO: 3) und
    5'-Cy5-AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-Phosphat-3'
    (SEQ ID NO: 4)
    wurden mit einem Fluorescein-Phosphoramidit (erhältlich von Glen Research, Sterling, Virginia, Nr. 10-1963), einem Cy5TM-Phosphoramidit (erhältlich von Pharmacia Nr. 27-1801-02) und einem chemischen Phosphorylierungsreagenz (erhältlich von Glen Research, Nr. 10-1900) synthetisiert. Diese benachbarten Sonden hybridisieren intern an das PC03/PC04 β-Globin-Primerpaar auf dem gleichen DNA-Strang und sind durch ein Basenpaar voneinander getrennt. Sonden wurden mit C-18 Reversed-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigt und ihre Homogenität wurde durch Polyacrylamidelektrophorese und Extinktion (A260 und Extinktionsmaximum des Fluorophors) geprüft. Die Hybridisierungssonden (β-Actin und β-Globin) wurden jeweils mit 0,2 mM eingesetzt.
  • In den entsprechenden hier beschriebenen Beispielen wurden Kapillarprobenröhrchen 230 mit Amplifikationsproben von 5 μl beladen. Die Kapillarprobenröhrchen sind vorzugsweise solche, die von Idaho Technology unter der Modellnummer 1705 erhältlich sind und Abmessungen von 1,02 mm Außendurchmesser und 0,56 mm Innendurchmesser aufweisen. Nachdem die Kapillarprobenröhrchen beladen wurden, werden sie mit einer Butanflamme verschweißt. Die Oberfläche des Kapillarprobenröhrchens wurde mit optisch reinem Methanol gereinigt, bevor sie in das Karussell 322 des schnellen Thermocyclers mit Fluoreszenznachweis 300 gestellt wurden.
  • Die Steuerung der in 11 dargestellten Komponenten wurde mit Hilfe einer graphischen Programmiersprache, die als LabView bekannt ist (erhältlich von National Instruments, Austin, Texas) und einer 12 bit Multifunktions-Eingangs/Ausgangskarte (erhältlich von National Instruments unter der Bezeichnung AT-MIO-E2) in einem PC-kompatiblen Computer 366 mit einem Intel® 80486 Mikroprozessor mit einer Taktfrequenz von 120 MHz erreicht. Analogausgangskanäle der Eingangs-/Ausgangskarte wurden zur Steuerung der Empfindlichkeit, d.h. der PMT-Spannung, jeder Photomultiplierröhre 362A und B verwendet. Die Analogeingangskanäle auf der Eingangs-/Ausgangskarte empfangen die Signale von der jeweiligen Photomultiplierröhre 362A und B. Der PC-kompatible Computer steuert Position, Geschwindigkeit und Bewegungsrichtung des Karussells über die Eingangs-/Ausgangskarte. Wenn verschiedene Kapillarprobenröhrchen eingeladen werden, ist es von Vorteil, dass das Karussell 322 jedes Kapillarprobenröhrchen 320 schnell nacheinander an die Position der 100 ms dauernden Aufnahme bringt. Für kontinuierliches Überwachen eines einzelnen Kapillarröhrchens 320A werden die Daten gemittelt und alle 200 ms erfasst. Zeit, Temperatur und 2 Fluoreszenzkanäle werden kontinuierlich als Abbildungen von Fluoreszenz gegen Zykluszahl und Fluoreszenz gegen Temperatur dargestellt. Das Karussell 322 sollte dort angeordnet werden, wo maximale Fluoreszenz und Signale aufgenommen werden. Wenn ein einzelnes Kapillarprobenröhrchen 320A analysiert wurde, wurden die Signale alle 200 ms mit einer integrierenden Zeitkonstante aufgenommen, die an den Photomultiplierröhrchen 364 auf 50 ms gesetzt wurde. Wenn mehrere Photomultiplierröhrchen 366A und B verwendet wurden, wurde die Zeitkonstante auf 0,5 ms gesetzt und das Karussell drehte sich einmal, um die genaue Position zu bestimmen, an welcher jedes Kapillarprobenröhrchen 320 in jedem Kanal maximale Fluoreszenz zeigte. Nach Positionierung des Kapillarprobenröhrchens 320A an einer Position, an der maximale Fluoreszenz erhalten wurde, wurde die Empfindlichkeit jedes PMT 362A und B angepasst und das Karussell drehte sich erneut, um alle Kapillarprobenröhrchen 320 zu zählen und ihre Position zu bestimmen. Signale wurden einmal pro Amplifikationszyklus während der Extension erhalten, wobei die Kapillarprobenröhrchen 320 nacheinander für 100 ms in die Überwachungsposition auf dem Karussell 322 gebracht wurden. Für die Steuerung der Temperatur wurde die Programmierung eines kommerziell erhältlichen, schnellen Thermocyclers, der von Idaho Technology unter der Bezeichnung RapidcyclerTM erhältlich ist und bei dem ein Fremdcompilierer, der von Systronics, Salt Lake City, Utah unter der Bezeichnung BCI51 erhältlich ist, und ein Dallas-Entwicklungssystem (ebenfalls bei Systronics unter der Bezeichnung DPB2 erhältlich) eingesetzt werden, modifiziert.
  • In der Praxis ermöglicht das thermische Ansprechverhalten des schnellen Thermocyclers mit Fluoreszenznachweis (300) Zyklen in 20–30 Sekunden (30 Zyklen in 10–15 min), wie in der Abbildung von Temperatur über Zeit in 11A dargestellt ist. Wenn ein doppelstrangspezifischer Fluoreszenzfarbstoff während der Amplifikation vorhanden ist, nimmt die Fluoreszenz im Allgemeinen zu, je mehr doppelsträngiges Produkt hergestellt wird, siehe Higuchi, R., G. Dollinger, P. S. Walsh und R. Griffith, 1992, "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences", Bio/Technology 10: 413–417.
  • Fluoreszenz hängt auch von der Temperatur ab, ein während des Thermocyclings auftretender ungünstiger Effekt, der sich gewöhnlich dadurch umgehen lässt, dass man Fluoreszenz einmal pro Zyklus bei einer konstanten Extensionstemperatur betrachtet. Wenn Temperatur, Zeit und Fluoreszenz alle 200 ms während einer schnellen zyklischen Amplifikation erfasst werden, lässt sich im Raum eine dreidimensionale Spirale verfolgen, wie sie in 12 dargestellt ist. Die in 12 dargestellte 3D-Kurve wird in 12 auch in Form von Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur projiziert. Die Temperatur-Zeit-Projektion in 12 wiederholt jeden Zyklus und liefert im Wesentlichen die gleichen Informationen wie 11A. Da sich die Fluoreszenz invers zur Temperatur ändert, ist die in 12B gezeigte Fluoreszenz-Zeit-Projektion in frühen Zyklen ein skaliertes Spiegelbild des Plots von Temperatur gegen Zeit. Wenn Produkt akkumuliert, nimmt die Fluoreszenz bei allen Temperaturen mit der Menge an doppelsträngigem Produkt zu. Bei Denaturierungstemperaturen fällt die Fluoreszenz jedoch auf die Grundlinie ab, da nur einzelsträngige DNA vorhanden ist.
  • Bei der in 12 gezeigten Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur von Doppelstrang-Farbstoffen wurde die Zeitachse entfernt und es wird die Temperaturabhängigkeit des Strangzustands bei der DNA-Amplifikation wiedergegeben. Die in 12 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur stammt von einem 180 Basenpaare langen Fragment aus Hepatitis B-Virus-DNA.
  • Die in 13 gezeigte Projektion von Fluoreszenz gegen Temperatur ist für ein 536 Basenpaare langes Fragment von humaner β-Globin-DNA. Die in 13 dargestellten frühen Zyklen scheinen identisch zu sein, wobei ein nichtlinearer Anstieg der Fluoreszenz bei niedrigeren Temperaturen zu sehen ist. Wenn die Amplifikation weiter fortschreitet, erscheinen spätere Zyklen als ansteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperaturen, wobei diese eine deutliche Hysterese zeigen. Das zeigt, dass die beobachtete Fluoreszenz beim Aufheizen größer ist als beim Abkühlen. Wenn die Probe aufgeheizt wird, ist die Fluoreszenz so lange hoch, bis Denaturierung eintritt (als scharfer Abfall der Fluoreszenz zu sehen). Wenn die Probe von der Denaturierungs- auf die Annealingtemperatur abgekühlt wird, nimmt das vom Doppelstrang-Signal schnell zu. Die Fluoreszenz nimmt während der Extension kontinuierlich zu, während die Temperatur konstant gehalten wird.
  • Wenn mehrere Proben einmal pro Zyklus mit SYBR® Green I überwacht werden, kann ein Konzentrationsbereich von 107-108 anfänglichen Templaten unterschieden werden, wie in 14 gezeigt ist. Wenn die Daten auf die Prozentzahl maximaler Fluoreszenz jedes Kapillarprobenröhrchens 320 normiert werden, sind einhundert anfängliche Kopien deutlich von zehn Kopien zu unterscheiden. Der Unterschied zwischen einer und zehn Kopien ist jedoch nur marginal und zwischen null und einer durchschnittlichen Kopie pro Kapillarprobenröhrchen 320 lässt sich kein Unterschied beobachten.
  • Im Gegensatz dazu zeigen sequenzspezifische Sonden einen ähnlich dynamischen Bereich, scheinen aber, wie der Plot in 15 zeigt, sogar eine einzelne anfängliche Templatkopie von negativen Kontrollen zu unterscheiden. Signalerzeugung mit 5'-Exonucleasesonden hängt nicht nur von der DNA-Synthese ab, sondern erfordert auch eine Hybridisierung und Hydrolyse zwischen den Fluorophoren der doppelt markierten Sonde. Diese Hydrolyse vermindert das Quenchen und das Fluoreszenzverhältnis von Fluorescein zu Rhodamin nimmt zu. Während sich die Fluoreszenz von Doppelstrang-Farbstoffen bei weiterem Cycling einpendelt, nimmt das Signal der Exonucleasesonden mit jedem Zyklus weiter zu. Auch wenn letztlich kein Produkt synthetisiert wird, erfolgt weiter Hybridisierung und Hydrolyse der Sonden. Wenn die Anzahl an Templatkopien unter 103 absinkt, nimmt die Signalintensität ab, niedrige Kopienzahlen können jedoch immer noch quantifiziert werden, da das Signal der negativen Kontrolle stabil bleibt.
  • Fluoreszenz-Temperatur-Plots von 5'-Exonucleasesonden bestätigen, dass die Sondenhydrolyse der Mechanismus zur Signalerzeugung ist. In 16 ist ein Fluoreszenz-Temperatur-Plot eines 2-Temperaturen-Cyclings mit der β-Actin-Exonucleasesonde gezeigt. Bei jedem Zyklus variiert das Fluoreszenzverhältnis linear mit der Temperatur und es tritt, wenn überhaupt, nur geringe Hysterese auf. Das Signal nimmt in jedem Zyklus während der Annealing-/Extensionsphase zu, wo angenommen wird, dass die Sonde hydrolysiert wird. Auch wenn die Fluoreszenz sowohl von Fluorescein als auch von Rhodamin bei ansteigender Temperatur abnimmt (Daten nicht gezeigt), ist die Geschwindigkeit der Änderung bei Rhodamin größer, was bei ansteigender Temperatur zu einem ansteigenden Verhältnis führt. Bei der 5'-Exonucleasesonde lassen sich keine temperaturabhängigen Hybridisierungseffekte erkennen. 16A zeigt einen Plot von Fluoreszenzverhältnis gegen Zykluszahl für verschiedene anfängliche Templatkopienzahlen entsprechend der Legende von 18.
  • Wenn das Fluoreszenzsignal nur von der Hybridisierung abhängt, zeigen Plots von Fluoreszenzverhältnis gegen Temperatur im Gegensatz dazu bei einem 2-Temperaturen-Cycling ein unterschiedliches Verhalten mit apparenter Hysterese, wie in 17 dargestellt ist. Zwei benachbarte Hybridisierungssonden sind vorhanden, eine Sonde stromaufwärts, die mit Fluorescein 3'-markiert ist und eine Sonde stromabwärts, die mit Cy5TM 5'-markiert ist. Die Sonden sind durch eine Lücke von 1 Basenpaar getrennt. Bei der Annealing-/Extensionsphase hybridisieren die Sonden an akkumulierendes Produkt und das Fluoreszenzverhältnis von Cy5TM zu Fluorescein nimmt zu. Beim Aufheizen auf Produktdenaturierungstemperaturen scheinen die Sonden zwischen 65 °C und 75 °C zu dissoziieren, wodurch das Fluoreszenzverhältnis auf das Niveau des Backgrounds zurückfällt. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses während der Hybridisierung ist größtenteils auf eine Zunahme der Cy5TM-Fluoreszenz durch Resonanzenergietransfer zurückzuführen.
  • Aus der obigen Diskussion ergibt sich, dass Fluoreszenzüberwachung während einer DNA-Amplifikation eine außergewöhnlich leistungsstarke analytische Methode darstellt. Mit der produktiven und kosteneffizienten Vorrichtung zur Echtzeitüberwachung lassen sich sequenzspezifischer Nachweis und Quantifizierung in fünf bis zwanzig Minuten erreichen, abhängig von der Zahl anfänglicher Templatkopien. Doppelstrangspezifische Farbstoffe wie Ethidiumbromid oder SYBR® Green I können als generische Indikatoren für eine Amplifikation verwendet werden. Der Farbstoff SYBR® Green I wird bei vielen Anwendungen Ethidiumbromid vorgezogen, da das Maximum seiner Anregung nahe dem von Fluorescein liegt und er oft ein stärkeres Signal mit DNA liefert als es bei der Anregung von Ethidiumbromid sichtbar ist. Doppelstrangspezifische Farbstoffe sind von der den Amplifikationsprimern inhärenten Spezifität abhängig. Wie der Fachmann weiß, kann eine unspezifische Amplifikation bei hohen Zykluszahlen die Nachweisempfindlichkeit auf etwa einhundert anfängliche Templatkopien limitieren (siehe 14), wogegen die vorliegende Erfindung zu weiteren Verbesserungen bei der Amplifikationsspezifität führen kann, was dieses Leistungsvermögen weiter verbessern könnte.
  • Wenn Nachweis und Quantifizierung einer geringen Kopienzahl erforderlich sind, lässt sich durch Fluoreszenzsonden für zusätzliche Spezifität sorgen, die zur Signalerzeugung hybridisieren müssen. Spaltung einer doppelt markierten Exonucleasesonde ist eine Methode (siehe Lee, L.G., C.R. Connell und W. Bloch, 1993, „Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes", Nucl. Acids Res. 21:3761–3766 und Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti und K. Deetz, 1995, „Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization", PCR Meth. Appl. 4:357–362), die in der Lage zu sein scheint, eine einzige Templatkopie von einer negativen Kontrolle zu unterscheiden (siehe 15). Obwohl das finale Fluoreszenzsignal abnimmt, wenn niedrige Kopienzahlen amplifiziert werden (vermutlich aufgrund der verminderten Amplifikationseffizienz), scheint eine Quantifizierung zwischen null und hundert Kopien möglich. Das von Exonucleasesonden erzeugte Signal ist kumulativ und steht nur in indirekter Beziehung zur Produktkonzentration. Daher nimmt das Fluoreszenzsignal sogar dann weiter zu, wenn die Produktmenge ein Plateau erreicht hat. Für eine absolute Quantifizierung wären geeignete Standards zur Kontrolle der Amplifikations- und Spaltungseffizienz erforderlich.
  • Die Konstruktion, Synthese und Reinigung der 5'-Exonucleasesonden erfordert Sorgfalt. Hybridisierung ist eine notwendige, aber nicht hinreichende Bedingung für durch Exonuclease erzeugte Signale; nicht alle Sonden werden effizient gespalten. Siehe Lee, L.G., C.R. Connell und W. Bloch, 1993, „Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes", Nucl. Acids Res. 21:3761–3766 und Livak, K.J., S.J.A. Flood, J. Marmaro, W. Giusti und K. Deetz, 1995, „Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization", PCR Meth. Appl. 4:357–362, auf die hier beide vollinhaltlich Bezug genommen wird. Synthese doppelt markierter Sonden umfasst manuelle Zugabe des Rhodaminmarkers, üblicherweise mit anschließender Reversed-Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatographie.
  • Anstatt von der Hydrolyse einer doppelt markierten Sonde abhängig zu sein, kann Hybridisierung direkt durch Resonanzenergietransfer nachgewiesen werden, wie bei Morrison ausgeführt wird. Siehe Monison, L.E., 1992, „Detection of energy transfer and fluorescence quenching", S. 311–352, in L.J. Kricka (Hrsg.), "Nonisotopic DNA probe techniques", Academic Press, San Diego. Wenn 2 benachbarte Sonden, die separat voneinander mit Fluorescein und Cy5TM markiert sind, verwendet werden, nimmt der Energietransfer auf Cy5TM mit der Akkumulierung des Produkts bei jedem Amplifikationszyklus zu (17). Im Gegensatz zu Exonucleasesonden ist die Sondensynthese relativ einfach, da sowohl für Fluorescein als auch für Cy5TM Amidite zum direkten Einbau bei der automatischen Synthese verfügbar sind. Im Stand der Technik ist kein Resonanzenergietransferpaar mit Fluorescein und Cy5TM bekannt. Obwohl die spektrale Überlappung gering ist, sind der molare Absorptionskoeffizient und die Absorptionswellenlängen von Cy5TM im Vergleich mit Rhodamin hoch. Alle drei Faktoren (Überlappung, Absorptionsvermögen und Wellenlänge) tragen zum Überlappungsintegral bei, das die Energietransferrare bestimmt. Cy5TM zeigt ein auch eine geringe Extinktion bei den Anregungswellenlängen für Fluorescein, wodurch eine direkte Anregung des Akzeptors verminder wird.
  • Eine herkömmliche Endpunktanalyse von DNA-Amplifikationen durch Gelelektrophorese identifiziert die Produktgröße und schätzt die Reinheit ab. Da eine Amplifikation jedoch zunächst stochastisch, dann exponentiell und zuletzt stagnierend verläuft, ist der Einsatz einer Endpunktanalyse zur Quantifizierung eingeschränkt. Das mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung stehende „Cycle-by-cycle"-Monitoring ermöglicht relativ leichte Quantifizierung, und ein Fluoreszenz-Monitoring bei geschlossenem Reaktionsgefäß hat, wie der Fachmann erkennt, weitere Vorteile.
  • Im Gegensatz zur Endpunkt- und „Cycle-by-cycle"-Analyse kann die vorliegende Erfindung auch die Fluoreszenz bei jedem Temperaturzyklus verfolgen. Wie oben diskutiert, kann kontinuierliche Fluoreszenzüberwachung mit doppelstrangspezifischen Farbstoffen zur Steuerung von Thermocyclingparametern verwendet werden. Die Amplifikation kann gestoppt werden, wenn eine bestimmte Menge an Produkt synthetisiert wurde, wodurch man eine unerwünschte Überamplifikation alternativer Template verhindert. Die Extensionsphase eines jeden Zyklus muss nur solange andauern, wie die Fluoreszenz zunimmt. Produktdenaturierung kann in Echtzeit gewährleistet werden, wobei die Temperatur solange erhöht wird, bis die Fluoreszenz auf die Grundlinie abfällt. Eine Beschränkung der Zeit, in der das Produkt Denaturierungstemperaturen ausgesetzt wird, ist besonders bei der Amplifikation langer Produkte nützlich.
  • Weitere Anwendungsmöglichkeiten des kontinuierlichen Monitorings mit Fluoreszenzfarbstoffen liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise könnte die Produktreinheit durch genaue Temperatursteuerung und doppelstrangspezifische Farbstoffe über Schmelzkurven berechnet werden. Mit schneller Temperatursteuerung könnte die absolute Produktkonzentration mittels Reannealingkinetik berechnet werden. Die einzigen Anforderungen dafür sind Fluoreszenzvermögen, die Fähigkeit zu schnellen Temperaturwechseln und strenge Temperaturhomogenität innerhalb der Proben. Das hohe Oberfläche-Volumen-Verhältnis der Kapillarprobenröhrchen, zusammen mit der Einfachheit, Luft zu mischen, ermöglicht eine exakte Steuerung der Probentemperatur mit einer Geschwindigkeit, die mit anderen Anordnungen nicht möglich ist. Beispielsweise zeigen Plots von Probentemperatur gegen Zeit in Kapillarröhrchen scharf verlaufende Spitzen bei Denaturierungs- und Annealingtemperatur, während in den im Stand der Technik verwendeten konischen Plastikröhrchen für die gesamte Probe mehrere Sekunden erforderlich sind, um einen Gleichgewichtszustand zu erreichen. Obwohl auf geätzten Silikon- oder Glasplättchen hohe Oberfläche-Volumen-Verhältnisse möglich sind, müssen die beschriebenen Zykluszeiten noch diejenigen erreichen, die bei der vorliegenden Erfindung mit Kapillarprobenröhrchen erreicht werden, und es ist schwierig, über die große der Probe ausgesetzten Plättchenoberfläche Temperaturhomogenität zu erreichen.
  • Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich viele Aspekte der DNA-Amplifikation erkennen, die vorher wenig verstanden wurden. Beispielsweise läuft die Produktdenaturierung in weniger als einer Sekunde ab, wogegen der Stand der Technik noch zehn Sekunden bis eine Minute zur Denaturierung fordert. Beobachtung des Aufschmelzens von Produkt durch Echtzeit-Fluoreszenz-Monitoring mit doppelstrangspezifischen Farbstoffen gemäß der vorliegenden Erfindung (siehe 12 und 13) zeigt, dass kürzere Denaturierungszeiten effektiv sind. Ein weiteres Beispiel ist, dass viele Ursachen für den bekannten „Plateau-Effekt" vorgeschlagen wurden, aber wenig Daten verfügbar waren, um zwischen alternativen Möglichkeiten unterscheiden zu können. Wie in 13 gezeigt, verläuft das Produktreannealing sehr schnell. Tatsächlich durchläuft während späterer Amplifikationszyklen der Hauptanteil der Produkte in jedem Zyklus während des Abkühlens ein Reannealing, bevor die Annealingtemperatur der Primer erreicht wird. Dies erfolgt bei den Abkühlungsgeschwindigkeiten von 5–10 °C/s der vorliegenden Erfindung. Bei einem Produktreannealing mit langsameren Thermocyclern aus dem Stand der Technik ist dieser unerwünschte Effekt größer. Produktreannealing scheint die hauptsächliche und vielleicht einzige Ursache des „Plateau-Effekts" zu sein.
  • Fluoreszenz-Monitoring von Rapid-Cycle-PCR zur Quantifizierung durch „Cycle-by-cycle"-Monitoring
  • Im Stand der Technik werden die PCR-Produkte gewöhnlich nach Vollendung der Amplifikation analysiert. Für genaue Ergebnisse erfordern solche Endpunktverfahren bei quantitativer PCR eine gute Abschätzung der anfänglichen Templatkonzentration. Fluoreszenzüberwachung einer PCR-Probe zur quantitativen PCR wurde mit Ethidiumbromid gezeigt. Die vorliegende Erfindung bietet den Vorteil der Fluoreszenzüberwachung einer PCR-Probe in wenigstens jedem Zyklus. Fluoreszenz wird gewöhnlich einmal pro Zyklus während einer kombinierten Annealing-/Extensionsphase erfasst. Die Fluoeszenz von Ethidiumbromid nimmt zu, wenn es in dsDNA interkaliert, und sie stellt ein Maß für die Produktkonzentration dar. „Once-per-cycle"-Monitoring der Produktmenge mit dsDNA-Farbstoffen stellt einen wichtigen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar, der eine Analyse eines breiten dynamischen Bereichs anfänglicher Templatkonzentrationen ermöglicht.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden bevorzugt für Doppelstrang-DNA spezifische Farbstoffe eingesetzt. SYBR® Green I ist beispielsweise ein bevorzugter empfindlicher Farbstoff um die Akkumulierung von PCR-Produkten zu verfolgen. In 18 ist die Quantifizierung der anfänglichen Templatkopienzahl über einen hundertachtfachen Bereich möglich. In 18 sind die Fluoreszenzkurven entsprechend den anfänglichen Templatkonzentrationen horizontal verschoben. Wie aus dem Plot der 18 zu sehen ist, ist die Empfindlichkeit bei niedrigen anfänglichen Templatkonzentrationen begrenzt, da die Spezifität der Amplifikation nicht perfekt ist. Wenn kein Templat vorhanden ist, werden möglicherweise unerwünschte Produkte wie Primerdimere amplifiziert. Daher gibt es nur einen geringen Unterschied zwischen 0, 1 und 10 durchschnittlichen anfänglichen Templatkopien.
  • Obwohl eine Quantifizierung sehr niedriger Kopienzahlen mit dsDNA-Farbstoffen bislang nicht erreicht wurde, können solche Farbstoffe in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, weil sich u.a. aufgrund der einfachen Anwendbarkeit dieser Farbstoffe Vorteile ergeben. Die dsDNA-Farbstoffe können bei beliebigen Amplifikationen eingesetzt werden und wenn diese Farbstoffe verwendet werden, sind keine maßgeschneidert fluoreszenzmarkierten Oligonukleotide erforderlich. Quantifizierung sehr niedriger Kopienzahlen mit dsDNA-Farbstoffen erfordert eine sehr gute Spezifität der Amplifikation oder, wie durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, Mittel zur Unterscheidung des erwünschten Produkts von unspezifischen Amplifikationen.
  • Betreffend 18 wird ein Plot von Fluoreszenz gegen Zykluszahl einer DNA-Amplifikation gezeigt, welche mit dem dsDNA-Farbstoff SYBR® Green I überwacht wurde. Die Abbildung der 18 wurde von einem 536 Basenpaare langen Fragment des humanen β-Globingens erhalten, das in Gegenwart einer 1:10.000-Verdünnung von SYBR® Green I von 0 auf 109 durchschnittliche Templatkopien amplifiziert wurde. Gereinigte Templat-DNA wurde über PCR-Amplifikation, Extraktion mit Phenol/Chloroform, Ethanolfällung und Ultrafiltration (Centricon 30, erhältlich von Amicon, Danvers, Massachusetts) erhalten und durch Absorption bei 260 nm quantifiziert. Jeder Temperaturzyklus dauerte 28 Sekunden (95 °C Maximum, 61 °C Minimum, 15 Sekunden bei 72 °C, durchschnittliche Geschwindigkeit zwischen den Temperaturen 5,2 °C/s). Alle Proben wurden gleichzeitig amplifiziert und 100 Millisekunden zwischen den Sekunden 5 und 10 der Extensionsphase verfolgt. Die Anzeige wurde in jedem Zyklus für alle Proben aktualisiert und es wurden fünfundvierzig Zyklen in 21 Minuten durchgeführt. Die Daten jedes Kapillarprobenröhrchens wurden auf einen Prozentanteil der Differenz zwischen den minimalen und maximalen Werten für jedes Röhrchen normiert (in 18 durch die y-Achse dargestellt).
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird auch ein sequenzspezifisches Fluoreszenz-Monitoring bereitgestellt. Sequenzspezifischer Nachweis von PCR-Produkten wird mit der vorliegenden Erfindung erreicht, indem man zwei verschiedene Fluorophore mit Oligonukleotidsonden kombiniert. Derzeit werden im Umfang der vorliegenden Erfindung zwei verschiedene Anordnungen bevorzugt, die in den 19A–D wiedergegeben sind. Beide Anordnungen benötigen einen Donor mit einem Emissionsspektrum, welches mit dem Absorptionsspektrum eines Akzeptors überlappt.
  • 19A–D stellen zwei verschiedene bevorzugte Anordnungen für sequenzspezifische Fluoreszenzüberwachung während einer PCR dar. 19A zeigt einen Donor (D), der anfänglich von einem Akzeptor (A) gequencht wird, weil beide zusammen auf einer einzigen Oligonukleotidsonde vorliegen. Nach Hydrolyse durch Aktivität von Polymerase-5'-Exonuclease werden der Donor und der Akzeptor voneinander getrennt und die Fluoreszenz des Donors nimmt zu (19B). In der in 19C gezeigten Anordnung liegt der Donor auf einer Sonde und der Akzeptor auf einem der beiden Primer. Die Farbstoffe auf der Sonde und dem Primer werden einander durch Hybridisierung angenähert. Dies resultiert in einem Resonanzenergietransfer auf den Akzeptor, wodurch die Fluoreszenz des Akzeptors zunimmt (19D).
  • Wenn der Donor und der Akzeptor auf dem gleichen Oligonukleotid synthetisiert werden, quencht der Akzeptorfarbstoff aufgrund der Nähe zum Donor dessen Fluoreszenz (19A). Während des Thermocyclings hybridisiert ein Teil der Sonde an einzelsträngige PCR-Produkte und kann mit Hilfe der Aktivität einer Polymerase-5'-Exonuclease hydrolysiert werden. Da der Donor und der Akzeptor nicht mehr länger miteinander verbunden sind, wird der Donor nicht mehr durch den Akzeptor gequencht und somit nimmt die Fluoreszenz des Donors zu. Da das Fluoreszenzsignal statt von der Hybridisierung von der Hydrolyse der Sonde abhängt, wird diese Gruppe von Sonden hier als „Hydrolyse"-Sonden bezeichnet.
  • Gemäß der in den 19C&D gezeigten Anordnung ist ein unterschiedliches Fluoreszenzschema möglich, wenn der Donor und der Akzeptor auf verschiedenen Oligonukleotiden angeordnet sind. In den 19C&D ist der Donor am 3'-Ende einer Sonde angeordnet und einer der Primer ist mit dem Akzeptor markiert. Es tritt eine minimale Wechselwirkung zwischen den Farbstoffen auf, da sie auf verschiedenen Oligonukleotiden vorliegen. Während des Thermocyclings hybridisiert die Sonde in der Nähe des markierten Primers und es kommt zu Resonanzenergietransfer. Da das Fluoreszenzsignal von der Hybridisierung der Sonde abhängt, wird diese Gruppe von Sonden hier als „Hybridisierungs"-Sonden bezeichnet.
  • Ob die Fluoreszenz des Donors lediglich gequencht wird oder sogar die Fluoreszenz des Akzeptors erhöht, hängt von den spezifischen Fluorophoren und Lösemittelbedingungen ab. Mit Hydrolysesonden wird während einer PCR üblicherweise ein Anstieg der Fluoreszenz des Donors beobachtet, wobei ein Anstieg der Fluoreszenz des Akzeptors gewöhnlich mit Hybridisierungssonden zu sehen ist.
  • Weitere Informationen und Daten zu Hydrolysesonden werden im Folgenden gegeben. Im Gegensatz zu dsDNA-Farbstoffen können sequenzspezifische Sonden sehr geringe anfängliche Templatmengen quantifizieren, wie in 20 dargestellt ist. Wie sich anhand der hier angegebenen Informationen erkennen lässt, kann eine einzelne Templatkopie von Templatabsenz unterschieden werden. Die Effizienz einer Amplifikation nimmt ab, wenn die anfängliche Kopienzahl unter 1.500 fällt. Bezeichnenderweise nimmt das Fluoreszenzsignal sogar nach vielen Zyklen kontinuierlich zu, da Hydrolyse kumulativ ist und keinen strengen Bezug zur Produktkonzentration zeigt.
  • Unter weiterer Bezugnahme auf 20 wird ein Plot von Fluoreszenzverhältnis (Fluorescein/Rhodamin) gegen Zykluszahl einer DNA-Amplifikationen dargestellt, welche mit einer doppelt markierten Hydrolysesonde verfolgt wurde. Die dünnen Linien zeigen den log-linearen Teil jeder Kurve an. Ein 280 Basenpaare langes Fragment des humanen β-Actingens wurde mit 0,15 bis 15.000 (durchschnittlichen) Kopien humaner genomischer DNA in jedem Röhrchen amplifiziert. Die eingesetzte Hydrolysesonde (mit 0,2 μM) ist von Perkin Elmer, Foster City, Kalifornien, erhältlich. Jeder Temperaturzyklus dauerte 26 Sekunden (94 °C Maximum, 60 °C für 15 Sekunden, durchschnittliche Geschwindigkeit zwischen den Temperaturen 6,2 °C/s). Alle Proben wurden gleichzeitig amplifiziert und 100 Millisekunden zwischen den Sekunden 5 und 10 der Annealing-/Extensionsphase verfolgt. Das Display wurde bei allen Röhrchen in jedem Zyklus aktualisiert und es wurden 45 Zyklen in unter 20 min durchgeführt.
  • Im Folgenden werden weitere Informationen und Daten zu Hybridisierungssonden gegeben. Im Gegensatz zu Hydrolysesonden ist das Fluoreszenzsignal der Hybridisierungssonden nicht kumulativ und entwickelt sich bei jeder Annealingphase von Neuem. Die Fluoreszenz ist ein direktes Maß für die Produktkonzentration, da die Hybridisierung eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ist (siehe Young, B. und Anderson, M., (1985), „Quantitative analysis of solution hybridization", in Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B., Higgins, S. (Hrsg.), S. 47–71, Washington D.C. IRL Press). Da die Sondenkonzentration viel größer ist als die des Produkts, hängt der Anteil des Produkts, der an die Sonde hybridisiert, nicht von der Produktkonzentration ab.
  • Die Fluoreszenzsignale von SYBR® Green I, Hydrolysesonden und Hybridisierungssonden werden in 21A–D direkt miteinander verglichen. Alle Sonden weisen nahezu gleiche Empfindlichkeit auf, wobei um den Zyklus 20 herum nachweisbare Fluoreszenz auftritt. Bei verlängerter Amplifikation steigt das Signal bei Hydrolysesonden kontinuierlich an, bleibt bei SYBR® Green I gleich und fällt bei Hybridisierungssonden leicht ab. Das abfallende Signal nach 35 Zyklen mit Hybridisierungssonden kann durch Hydrolyse der Sonde durch Polymerase-Exonuclease-Aktivität hervorgerufen werden. Obwohl die Änderung im Fluoreszenzverhältnis bei der Hydrolysesonde größer ist als bei der der Hybridisierungssonde (21B und 21C), ist der der Variationskoeffizient der Fluoreszenz bei Hydrolysesonden größer (21D). D.h., dass die Fluoreszenz, die von der Hybridisierungssonde hervorgerufen wird, genauer ist als die von einer Hydrolysesonde, obwohl die absoluten Signalhöhen niedriger sind.
  • 21A–D stellen einen Vergleich von drei Fluoreszenzüberwachungsmethoden für PCR bereit. Die Fluoreszenzsonden sind der dsDNA-Farbstoff SYBR® Green I (21A), eine doppelt mit Fluorescein/Rhodamin markierte Hydrolysesonde (21B) und eine mit Fluorescein markierte Hybridisierungssonde mit einem Cy5-markierten Primer (21C). Alle Amplifikationen wurden in 10 Wiederholungsversuchen mit 15.000 Templatkopien (50 ng humane genomische DNA/10 μl) durchgeführt. Die Temperaturzyklen dauerten 31 Sekunden (94 °C Maximum, 60 °C für 20 s, durchschnittliche Geschwindigkeit zwischen den Temperaturen 6,2 °C/s). Fluoreszenz wurde für jede Probe zwischen den Sekunden 15 und 20 der Annealing-/Extensionsphase erfasst. Der Mittelwert +/– Standardabweichung wurde für jeden Punkt dargestellt. SYBR® Green I wurde in einer 1:10.000-Verdünnung bei der Amplifikation eines 205 Basenpaare langen humanen β-Globin-Fragments mit den Primern KM29 und PC04 eingesetzt. Die Hydrolysesonde und die Bedingungen entsprechen den in 20 gezeigten. Die Hybridisierungssonde, TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG-Fluorescein (SEQ ID NO:5) (aus Fluorescein-CPG, erhältlich von Glen Research, Sterling, Virginia), wurde mit KM29 und dem Cy5-markierten Primer CAACTTCATCCACGTNCACC (SEQ ID NO:6), bei welchem N ein mit Cy5 markierter Amin-Modifikator C6dT (Glen Research) (Mono Reactive, von Amersham, Arlington Heights, Illinois) ist, eingesetzt. Die Genauigkeit der drei Fluoreszenzüberwachungsmethoden wird in 21D verglichen. Die Daten sind als Variationskoeffizient (Standardabweichung/Mittelwert) des Fluoreszenzverhältnisses über der Grundlinie (als Mittelwert der Zyklen 11–15) dargestellt.
  • Im Folgenden werden Algorithmen zur Quantifizierung durch „Cycle-by-cycle"-Monitoring diskutiert. Obwohl in Fluoreszenzkurvenscharen, wie beispielsweise den in den 18 und 20 dargestellten, quantitative Informationen über anfängliche Templatkonzentrationen enthalten sind, ist es für Fachleute nicht leicht zu verstehen, wie diese Informationen am besten zu erhalten sind. Unter Bezugnahme auf 22 sind Kurven für die Amplifikation von 104 und 105 Kopien gereinigter Template (18 entnommen) gezeigt, die mit der Amplifikation von 50 ng genomischer DNA verglichen werden. Unter Bezugnahme auf die hier zur Verfügung gestellten Daten erhält ein Fachmann die Informationen darüber, dass die genomische DNA etwas mehr als 104 Kopien des Targets erhält, aber nicht darüber, wie viele Kopien es mehr sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Zahl an Kopien bestimmt werden.
  • Was 22 betrifft, so werden Plots gezeigt, die Interpolationsverfahren zur Quantifizierung von PCR-Fluoreszenzkurven vergleichen. In 22 ist eine Endpunktinterpolation dargestellt, welche die Fluoreszenz von Unbekannten und Standards bei einer gegebenen Zykluszahl vergleicht. In 22 ist auch eine Grenzwertinterpolation dargestellt, welche die Zykluszahl bestimmt, bei der jede Kurven einen gegebenen Fluoreszenzwert überschreitet.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden hier zwei bevorzugte Verfahren zur Interpolation von Daten offenbart. Ein bevorzugtes Verfahren stellt die Interpolation ganzer Kurven dar, wobei versucht wird, alle relevanten Datenpunkte einzubinden. Dieses Verfahren der Kurvenanpassung stellt die genauesten Ergebnisse bereit. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren ist die Interpolation der Unbekannten entlang einzelner vertikaler oder horizontaler Linien. Singuläre vertikale Interpolation ähnelt einer konventionellen Endpunktanalyse. Bei einer bestimmten Zykluszahl wird die unbekannte Fluoreszenz zwischen bekannten Werten interpoliert. In Tabelle 1 unten ist eine Liste angegeben, die aus vertikaler Interpolation der Zyklen 20–24 stammt. Interpolation entlang horizontaler Linien erfordert die Bestimmung eines Fluoreszenzgrenzwerts. Interpolation der Grenzwerte 10, 20, 30 und 40 % sind ebenfalls in Tabelle 1 angegeben.
  • Figure 00370001
  • Wie zu erkennen ist, verwenden Endpunkt- oder Grenzwertinterpolationen nicht viele der verfügbaren Daten und können stark von einzelnen abweichenden Datenpunkten beeinflusst werden, z. B. Endpunktinterpolation bei Zyklus 20. Die vorliegende Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Verfügung, welches Interkalationskurven umfasst, die sich den Daten gut anpassen. Beispielsweise sollte eine exponentielle Anpassung für Daten im log-linearen Bereich einer jeden Kurve der Gleichung F = AN(1 + E)" folgen, wobei F das Fluoreszenzsignal, A ein Skalierungsfaktor für die Fluoreszenz, N die anfängliche Kopienzahl, E die Amplifikationseffizienz und n die Zykluszahl ist. A und E könnten zuerst für Werte von N bestimmt werden, die die Unbekannte umklammern. Anschließend könnte der beste Wert von N für die Unbekannte bestimmt werden. Mit diesem Ansatz beträgt die Anzahl an Genkopien in 50 ng genomischer DNA 1,7 × 104, was in der Nähe der in Tabelle 1 angegebenen Mitte der Werte und nahe dem erfassten Wert von 1,5 × 104 liegt. Andere Kurvenanpassungen können besser als das oben angegebene exponentielle Beispiel sein. Die exponentielle Anpassung beruht notwendigerweise nur auf den log-linearen Zyklen (7 von 45), und diese fallen in einen Bereich, in dem die Genauigkeit der Fluoreszenz recht dürftig ist (21D).
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird zudem eine sigmoide Kurve verwendet, die Parameter umfasst, welche die lag-Phase, die log lineare Phase und die Plateau-Phase beschreiben, so dass alle verfügbaren Daten einbezogen werden. Die Anpassung ist gewichtet, um die erwartete Genauigkeit der Datenpunkte wiederzuspiegeln. Für verschiedene Fluoreszenzsonden sind aufgrund variierender Kurvenformen verschiedene Parameter notwendig (21A–D).
  • Das erfindungsgemäße Merkmal der kontinuierlichen Überwachung, d.h. der mehrmaligen Überwachung innerhalb eines PCR-Zyklus, wird im Folgenden diskutiert. Wenngleich das Fluoreszenz-Monitoring bei einer PCR einmal pro Zyklus bei einer konstanten Temperatur durchgeführt werden kann, bietet. die vorliegende Erfindung den wichtigen Vorteil einer möglichen kontinuierlichen Überwachung während des PCR-Zyklus. Temperatur ist ein wichtiger Faktor, da sich die Fluoreszenz als Funktion der Temperatur ändert. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Überwachung von Fluoreszenz während Temperaturänderungen jedoch sehr informativ. Beispielsweise zeigen Hydrolysesonden, wenn die Fluoreszenz kontinuierlich während des Thermocyclings erfasst wird, eine lineare Änderung im Fluoreszenzverhältnis mit der Temperatur und eine parallele Fluoreszenzzunahme, je mehr Sonde hydrolysiert wird (siehe 23A). Im Gegensatz dazu variiert das Fluoreszenzverhältnis von Hybridisierungssonden mit der Temperatur drastisch (siehe 23B). Bei der Hybridisierung von Sonden bei niedrigen Temperaturen steigt das Verhältnis an und fällt anschließend auf die Grundlinie ab, wenn die Hybridisierungssonde vom Templat abschmilzt.
  • Die Temperaturabhängigkeit des Strangzustands des Produkts während einer PCR zeigt sich in Plots von Fluoreszenz gegen Temperatur, wobei SYBR® verwendet wurde, wie in 24 gezeigt. Wenn die Amplifikation fortschreitet, erscheinen die Temperaturzyklen als ansteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperaturen. Wenn die Probe aufgeheizt wird, ist die Fluoreszenz so lange hoch, bis Denaturierung eintritt. Wenn die Probe abgekühlt wird, nimmt die Fluoreszenz zu und gibt so das Reannealing des Produkts wieder. Wenn die Temperatur während der Extension konstant bleibt, korreliert die zunehmende Fluoreszenz mit zusätzlicher DNA-Synthese. 24 zeigt einen Fluoreszenz-Temperatur-Plot einer DNA-Amplifikation mit dem dsDNA-Farbstoff SYBR® Green I. Ein 536 Basenpaare langes Fragment des humanen β-Globingens wurde ausgehend von 106 Kopien des gereinigten Templats und einer 1:30.000-Verdünnung von SYBR® Green I amplifiziert. Andere Bedingungen entsprechen im Wesentlichen denen, die in Verbindung mit 18 beschrieben sind. Die Zyklen 15–25 sind dargestellt. Die Fluoreszenz-Temperatur-Daten wurden transformiert, um den Effekt der Temperatur auf die Fluoreszenz zu eliminieren.
  • Die Möglichkeit der vorliegenden Erfindung, Produktdenaturierung und Produktreannealing zu überwachen, führt zu weiteren zusätzlichen Verfahren zur Quantifizierung von DNA. Diese zusätzlichen Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Quantifizierung von DNA erfordern Fluoreszenzüberwachung in einzelnen Temperaturzyklen, und sie können nicht eingesetzt werden, wenn die Fluoreszenz nur einmal pro Zyklus erfasst wird. Beispielsweise zeigen PCR-Produkte charakteristische Schmelzkurven, die vom GC/AT-Verhältnis und der Länge des Produkts abhängen (siehe 25). Wenn empirische Algorithmen zur Vorhersage von Schmelztemperaturen verwendet werden, sollten PCR-Produkte insbesondere innerhalb eines Bereichs von 50 °C schmelzen. Da unspezifische Produkte anders als die gewünschten PCR-Produkte schmelzen, kann die dsDNA-Fluoreszenz in spezifische und unspezifische Komponenten aufgeteilt werden. Die Verwendung erfindungsgemäßer Verfahren erlaubt bei Einsatz generischer dsDNA-Farbstoffe wie SYBR® Green I oder Ethidiumbromid eine Quantifizierung sehr niedriger Kopienzahlen. 25 zeigt die Schmelzkurven von drei gereinigten PCR-Produkten. Die PCR-Produkte wurden gereinigt und quantifiziert, wie es in Verbindung mit 18 erläutert wurde. Eine 1:10.000-Verdünnung von SYBR® Green I wurde zu 50 ng DNA in 10 μl 50 mM Tris, pH 8,3 und 3 mM MgCl2 gegeben. Die Temperatur wurde pro Sekunde um 0,2 °C erhöht, die Fluoreszenz erfasst und gegen die Temperatur aufgetragen.
  • Das erfindungsgemäße Merkmal der Verwendung von Schmelzkurven zur kompetitiven Quantifizierung wird im Folgenden erklärt. Gemäß der vorliegenden Erfindung stellt die kompetitive quantitative PCR eine weitere Einsatzmöglichkeit für Schmelzkurven dar. Diese erfindungsgemäßen Verfahren erfordern ein zum nativen Templat kompetitives Templat zur Coamplifikation. Es werden Kontrolltemplate konstruiert, die sich in ihrer Schmelztemperatur von dem natürlichen Amplikon unterscheiden. Eine Verschiebung der Schmelztemperatur von 3 °C kann erhalten werden, indem man den GC-Prozentanteil des Produkts um 7–8 % ändert (siehe Wetmur, J., (1995), „Nucleic acid hybrids, formation and structures", in: Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, Meyers R., Hrsg., S. 605–608, New York, VCH).
  • Eine Verschiebung der Schmelztemperatur von 3 °C reicht aus, um die nativen und kompetitiven Komponenten der Produktschmelzkurve aufzutrennen (siehe 25). Diese Schmelzkurven, die bei der Amplifikation erhalten werden, werden in Schmelzpeaks differenziert (siehe Hillen, W., Goodman, T., Benight, A., Wartell, R. und Wells, R., (1981), „High resolution experimental and theoretical thermal denaturation studies on small overlapping restriction fragments containing the Escherichia coli lactose genetic control region", J. Bio. Chem. 256, 2761–2766, worauf hier vollinhaltlich Bezug genommen wird) und dazu verwendet, die relativen Mengen von Kompetitor und Templat zu bestimmen. Mit diesem Verfahrens sollte eine Analyse der Probe nach dem Thermocycling überflüssig werden.
  • Im Folgenden wird die Hybridisierungskinetik zur absoluten Quantifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung diskutiert. Die vorliegende Erfindung erlaubt auch die Überwachung von Produkt-Produkt-Reannealing nach der Denaturierung und stellt ein Verfahren zur direkten, absoluten Quantifizierung von DNA bereit. Wenn die Probentemperatur schnell von der Denaturierungstemperatur abgesenkt wird und auf einer niedrigeren Temperatur gehalten wird, wird die Geschwindigkeit des Produktreannealings einer Kinetik zweiter Ordnung folgen (siehe Young, B. und Anderson, M., 1985, „Quantitative analysis of solution hybridization", in Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B., Higgins, S., Hrsg., S. 41–47, Washington D.C.: IRL Press.
  • Wenn verschiedene DNA-Konzentrationen untersucht werden, ist die Form der Reannealingkurve für die DNA-Konzentration charakteristisch (siehe 26). 26 zeigt Reannealingkurven für verschiedene Konzentrationen des PCR-Produkts. Verschiedene Mengen eines gereinigten, 536 Basenpaare langen DNA-Fragments (siehe 18) wurden mit einer 1:30.000-Verdünnung von SYBR® Green I in 5 μl 50 mM Tris, pH 8,3 und 3 mM MgCl2, gemischt. Die Proben wurden bei 94 °C denaturiert und anschließend schnell auf 85 °C abgekühlt. Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede gegebene Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann eine unbekannte DNA-Konzentration aus experimentellen Reannealing-Daten bestimmt werden. Die Anfangsbestimmung einer Geschwindigkeitskonstanten ist in 27 gezeigt. Das Abkühlen erfolgt nicht unverzüglich, so dass ein gewisses Maß an Reannealing erfolgt, bevor eine konstante Temperatur erreicht wird. Schnelles Abkühlen, das mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausgeführt werden kann, maximiert die Datenmenge, die zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten oder der DNA-Konzentration zur Verfügung steht. 27 zeigt die Bestimmung einer Reannealing-Geschwindigkeitskonstanten zweiter Ordnung. Die Kurve wurde durch nichtlineare Regression kleinster Quadrate mit Fmax, Fmin, t0 und k als freien Parametern angepasst. Durch die Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten (k) können anschließend DNA-Konzentrationen unbekannter Proben bestimmt werden.
  • Dieses erfindungsgemäße Verfahren erfordert reine PCR-Produkte, aber dies kann mit Hilfe der Schmelzkurven, die ebenfalls während des Thermocycling erhalten werden, sichergestellt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Quantifizierng mittels Reannealingkinetik ist vorteilhaft von möglichen Signalabweichungen unter den Kapillarprobenröhrchen unabhängig.
  • Kontinuierliches Monitoring von Rapid-Cycle-PCR
  • Aus der vorhergehenden Diskussion wird ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung zahlreiche Vorteile ermöglicht, die im Stand der Technik bislang nicht erreichbar waren. Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung Ein-Farben-Fluoreszenzverfahren zur Überwachung von Produktreinheit, Templatquantifizierung und Mutationsnachweis während einer PCR zur Verfügung. Das Vorliegen doppelsträngiger DNA (dsDNA) kann während einer PCR mit Fluoreszenzfarbstoffen überwacht werden. In jedem Zyklus fällt die Fluoreszenz ab, wenn dsDNA denaturiert wird, und sie nimmt mit Produktreannealing und Primerextension zu. Obwohl diese Farbstoffe nicht sequenzspezifisch sind, kann die Produktreinheit durch eine Analyse der Form der DNA-Schmelzkurven gewährleistet werden. Reine PCR-Produkte zeigen scharfe Schmelzübergänge, während Verunreinigungen über einen breiten Temperaturbereich schmelzen.
  • Kompetitive quantitative PCR erfordert die Differenzierung zwischen einem natürlichen Amplikon und einem Kompetitor. Schmelzkurven können zur Unterscheidung von Produkten mit verschiedenen Schmelztemperaturen eingesetzt werden. Die anfängliche Anzahl an Templatkopien wird durch kompetitive Amplifikation mit einem künstlichen Kontrolltemplat quantifiziert, welches sich in seiner Schmelztemperatur vom natürlichen Amplikon unterscheidet.
  • Schmelzkurven können auch zum Nachweis von Mutationen während einer PCR eingesetzt werden. Die beider Amplifikation heterozygoter DNA gebildeten Heteroduplizes schmelzen bei niedrigeren Temperaturen als vollständig komplementäre Produkte. Die Fähigkeit, Deletionen und einzelne Basenmutationen zu bestimmen, wird anhand einer Schmelzkurvenanalyse gezeigt.
  • Die kontinuierliche Überwachung der Bildung von dsDNA wird zur direkten absoluten Quantifizierung von DNA verwendet. Wenn denaturierte DNA schnell abgekühlt wird und auf einer konstanten Reannealingtemperatur gehalten wird, wird die absolute DNA-Konzentration über die Reannealinggeschwindigkeit bestimmt.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zweifarben-Fluoreszenzverfahren bereit, die zum sequenzspezifischen Nachweis bei PCR von der Hybridisierung der Sonde (nicht Hydrolyse) abhängen. Die Annealingkinetik und das Schmelzen der Hybridisierungssonden liefern Informationen, die mit Sonden, die auf einer Exonucleasehydrolyse zwischen Fluorophoren beruhen, nicht verfügbar sind. Die Anzahl der anfänglichen Templatkopien wird durch kompetitive Amplifikation quantifiziert, wobei die Schmelztemperatur der Sonden zur Unterscheidung zwischen den Templaten verwendet wird. Einzelne Basenmutationen werden durch Verschiebungen in der Sondenschmelztemperatur nachgewiesen. Die Bestimmung absoluter Produktkonzentrationen wird durch Analyse der Sondenannealingkinetik gezeigt.
  • Fluoreszenzrückkopplung kann zur Echtzeit-Kontrolle und Optimierung von Amplifikationen eingesetzt werden. Die Fluoreszenz wird zur Steuerung des Thermocyclings verwendet. Unter kontinuierlichem Monitoring von dsDNA-spezifischen Farbstoffen wird die Extension in jedem Zyklus beendet, wenn die Fluoreszenz nicht mehr zunimmt. Die Denaturierungsbedingungen werden automatisch gesteuert, indem man die Temperatur nur solange erhöht, bis das Produkt vollständig geschmolzen ist. Primerannealing wird durch Resonanzenergietransfer auf Cy5-markierte Oligonukleotide überwacht. Das Thermocycling wird automatisch beendet, nachdem eine bestimmte Menge an Produkt hergestellt wurde.
  • Die Vorteile eines schnellen Thermocycling werden inzwischen von der Forschungsgemeinschaft anerkannt. Schnelles Thermocycling mit minimalen Annealing- und Denaturierungszeiten verbessert quantitative PCR und erhöht die Unterscheidung bei allesspezifischen Amplifikationen. Schnelles Thermocycling zur Zyklussequenzierung vermindert Unklarheiten bei der Sequenz und minimiert „Schattenbandierung" bei Amplifikationen von Dinukleotid-Repeats. Bei langer PCR von bis zu 35 kb wird die Ausbeute verbessert, wenn die Probe so wenig wie möglich hohen Denaturierungstemperaturen ausgesetzt wird.
  • Ein kinetisches Paradigma für die PCR ist zweckdienlich. Anstatt PCR als drei Reaktionen (Denaturierung, Annealing, Extension) anzusehen, die bei drei verschiedenen Temperaturen ablaufen, könnte ein kinetisches Paradigma für PCR zweckdienlicher sein (28). Bei einem kinetischen Paradigma besteht die Temperatur-Zeit-Kurve aus kontinuierlichen Übergängen sich überlappenden Reaktionen. Eine vollständige Analyse würde die Kenntnis aller relevanten Geschwindigkeitskonstanten über alle Temperaturen hinweg erfordern. Wären die Geschwindigkeitskonstanten aller Reaktionen bekannt, könnte eine „physikochemische Beschreibung einer PCR" entwickelt werden. Eine Bestimmung dieser Geschwindigkeiten würde eine genaue Steuerung der Probentemperatur erfordern und dabei würde die Überwachung der Reaktionen während des Thermocycling helfen.
  • Die vorliegende Erfindung hat auch die Vorteile, die sich aus der kontinuierlichen Überwachung einer Probe ergeben. Eine Fluoreszenzüberwachung bei jedem Zyklus zur quantitativen PCR bietet Vorteile und funktioniert gut mit Ethidiumbromid. Bei einem „Once-per-cycle"-Monitoring wird die Fluoreszenz während einer kombinierten Annealing-/Extensionsphase erfasst und gibt einen relatives Maß für die Produktkonzentration.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Zeit, Temperatur und dsDNA-Fluoreszenz alle 200 ms erfasst und bei einem schnellen Thermocycling sind feine Einzelheiten der Produktdenaturierung und des Produktreannealings zu beobachten. Diese Einzelheiten ermöglichen eine Produktbestimmung durch Schmelzkurven und stellen Mittel zur relativen und absoluten Produktquantifizierung, zum Mutationsnachweis und zur unmittelbaren Rückkopplung zur Temperatursteuerung bereit. Neben kontinuierlicher Überwachung kann das Aufschmelzen sequenzspezifischer Sonden durch Resonanzenergietransfer bestimmt werden. Die Sonden schmelzen bei einer charakteristischen Temperatur und dies kann auch zur Produktquantifizierung und zum Nachweis einzelner Basenmutationen benutzt werden.
  • Die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf quantitative PCR wird im Folgenden diskutiert. Die Verfahren zur quantitativen PCR im stand der Technik sind arbeits- und kostenintensiv. Die meisten Verfahren des Standes der Technik setzen Endpunktanalysen ein und erfordern für genaue Ergebnisse gute Anfangsschätzungen. Die einmalige Überwachung der Fluoreszenz von dsDNA pro Zyklus mit Farbstoffen stellt einen wichtigen Fortschritt dar, der die Analyse eines breiten dynamischen Bereichs anfänglicher Templatkonzentrationen zulässt. Die erfindungsgemäße kontinuierliche Überwachung innerhalb der Temperaturzyklen erlaubt jedoch die Überprüfung von Produktreinheit, die gleichzeitige relative Quantifizierung mit einem Kompetitor und die Bestimmung der absoluten Produktkonzentration. Alle diese Informationen lassen sich mit einem Kapillarprobenröhrchen mit einem generischen dsDNA-Indikator innerhalb von zehn bis zwanzig Minuten Thermocycling erhalten. Eine Quantifizierung auf Basis interner Sequenzspezifität ist ebenfalls möglich, wenn man Zweifarbenanalyse und Resonanzenergietransfer einsetzt.
  • Die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung zum Nachweis von Mutationen wird im Folgenden diskutiert. Das Screenen nach Mutationen in Genen ist eine schwierige Aufgabe. Verfahren im Stand der Technik (denaturierende Gradientengelelektrophorese, Temperaturgradientengelelektrophorese, Einzelstrangkonformationspolymorphismen und Sequenzbestimmung) erfordern eine PCR-Amplifikation, auf die eine Elektrophorese und der anschließende Nachweis folgen. Schmelzkurven mit dsDNA-Farbstoffen können heterozygote Mutationen identifizieren, die bei der PCR Heteroduplizes bilden. Die Analyse erfolgt bei der Amplifikation ohne dass zusätzliches Handling der Probe oder weiter Geräte notwendig wären. Der Nachweis von Heterozygoten ist beispielsweise für die Bestätigung der genetischen Prädisposition für Brustkrebs wichtig. Siehe Shattuck-Eidens, D., M. McClure, J. Simard, F. Labrie, S. Narod, F. Couch, D. Hoskins, B. Wever, L. Castilla, M. Erdos, L.Brody, L. Friedman, E. Ostermeyer, C. Szabo, M.C. King, S. Jhanwar, K. Offit, L. Norton, T. Gelewski, M. Lubin, M. Osborne, D. Black, M. Boyd, S. Steel; S. Ingles, R. Haile, A. Lindblom, H. Olsson, A. Borg, D.T. Bishop, E. Solomon, P. Radice, G. Spatti, S. Gayther, B. Ponder, W. Warren, M. Stratton, Q. Liu, F. Fujimura, C. Lewis, M.H. Skolnick, D.E. Goldgar, „A collaborative survey of 80 mutations in the BRCA1 breast and ovarian cancer susceptibility gene", „Implications for presymptomatic testing and screening", J. Amer. Med. Assoc., 273:535–541, 1995. Mutationsnachweis durch Sequenzierung der BRCA1- und BRCA2-Gene (> 10.000 Basen) ist im Rahmen einer klinischen Untersuchung nicht machbar. Kosten für die Untersuchung könnten mit Screening-Verfahren für Heteroduplizes gemäß der vorliegenden Erfindung beträchtlich gesenkt werden. Spezifische Mutationen können auch mit sequenzspezifischen Sonden durch Resonanzenergietransfer während der PCR nachgewiesen werden.
  • Im Folgenden werden die Sonden, die erfindungsgemäß vorteilhaft eingesetzt werden können, weiter diskutiert. Die besten Sonden zur kontinuierlichen Überwachung einer PCR sollten spezifisch und nicht teuer sein. Doppelstrang-DNA (dsDNA)-Farbstoffe können bei jeder Amplifikation eingesetzt werden und sind kostengünstig. SYBR® Green I kostet beispielsweise 0,01 Cent pro 10 μl-Reaktion. Daneben kann Produktspezifität durch Schmelzkurvenanalyse erhalten werden. Wenn Sequenzspezifität erforderlich ist, müssen jedoch für jede zu untersuchende Sequenz fluoreszierende Oligonukleotidsonden synthetisiert werden. Die „TagMan"-Sonden, die von Perkin Elmer vertrieben werden, umfassen 2 Fluorophore in jeder Sonde. Wenn die Sonde durch Aktivität einer Polymerase-Exonuclease hydrolysiert wird, wird Fluoreszenz erzeugt. Diese Sonden sind schwer herzustellen und teuer beim Kauf; ihre derzeitigen Kosten vom Herstellers belaufen sich auf $1.200 für 0,1 μmol bestellte Sonde. Zur kompetitiven Quantifizierung eines Targets sind zwei Sonden notwendig. Im Gegensatz dazu lassen sich fluoreszierende, von einer Hydrolyse unabhängige Hybridisierungssonden konstruieren. Diese Hybridisierungssonden erfordern nur ein einziges Fluorophor pro Sonde und sie sind viel leichter zu synthetisieren. Weil ihre Fluoreszenz auf Hybridisierung beruht und nicht auf Hydrolyse, kann die Temperaturabhängigkeit der Sondenfluoreszenz zum Nachweis von Mutationen und zur Quantifizierung eingesetzt werden.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können Polarisationsfluoreszenzsonden verwendet werden. Polarisationssonden wurden als 30-mere synthetisiert, die über Aminolinker verschiedener Länge mit einem 5'-Fluorescein verknüpft waren. Während einer PCR sollte die 5'-Exonuclease-Aktiviät der Polymerase die Sonde erwartungsgemäß spalten und deren Polarisation während der Amplifikation vermindern. Die intakten Sonden hatten eine Polarisation von etwa 90 Millipolarisationseinheiten (mP), die, wenn sie mit Phosphodiesterase I weitgehend hydrolysiert wurden, auf 35 mP abnahm. 34 zeigt die mit einer Sonde erhaltenen Ergebnisse, die mit 0,2 μM in der Amplifikation einer einzelnen Kopie eines Gens mit genomischer DNA als Templat enthalten war. Polarisation nahm im Verlauf von 20 bis 30 Zyklen ab und nahm im Verlauf von wenigstens bis zu 50 Zyklen weiter kontinuierlich ab. Die Abnahme, die als Verhältnis von paralleler zu senkrechter Fluoreszenz ausgedrückt wurde, betrug etwa 11 %. Die Länge des Linkers, die Art des Aminolinkers und das Vorhandensein/Fehlen eines 5'-nichtkomplementären Schwanzes veränderten die beobachteten Änderungen während der PCR nicht wesentlich. Die Zugabe von Sucrose zur Erhöhung der Viskosität der Lösung steigerte die Polarisation sowohl der intakten und als auch der hydrolysierten Sonde, änderte aber nichts am Unterschied im Signal nach der Amplifikation.
  • Anstatt die Polarisation durch Hydrolyse mit Exonuclease zu vermindern, erhöht eine Hybridisierung ohne Hydrolyse die Polarisation. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde eine mit Fluorescein markierte 15-mer-Peptid-Nukleinsäure verwendet. Wegen ihres Amidgerüsts kann sie nicht durch Exonucleaseaktivität hydrolysiert werden. Wenn sie im 10-fachem Überschuss mit gereinigtem, komplementärem einzelsträngigen PCR-Produkt hybridisiert wurde, nahm ihre Polarisierung nur von 85 mP auf 97 mP zu.
  • Zusammenfassend ist zu sagen, dass mit Fluorescein markierte Sonden Änderungen in der Polarisation zeigen, wenn sie hybridisiert oder hydrolysiert werden. Die Änderungen können zur Überwachung einer PCR verwendet werden, aber es sind nur kleine Änderungen. Die vorliegende Erfindung kann in einem Verfahren zur Steigerung des geringen Polarisationssignals der Hybridisierung bei einer Amplifikation mit Strangverdrängung eingesetzt werden. Eine genetisch veränderte Form der Endonuclease EcoRI, der die Spaltaktivität fehlt, die aber die Bindungsspezifität behält, wurde zur Steigerung der Polarisation des Komplexes eingesetzt.
  • Resonanzenergietransfersonden können gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Resonanzenergietransfersonden sind für eine Überwachung von Fluoreszenz besser als Polarisationssonden, da sie eine größere Signalintensität aufweisen. Im Stand der Technik wird Energietransfer bei einer PCR nur bei Endpunktanalysen eingesetzt. Doppelt mit Fluorescein/Rhodamin markierte Sonden werden während der Polymerase-Extension durch 5'-Exonuclease-Aktivität gespalten, wodurch die Fluorophore getrennt werden und das Emissionsverhälrnis von Fluorescein/Rhodamin ansteigt. 35 zeigt Fluoreszenzmesswerte aus einer PCR mit einer Sonde, bei der zwischen den Fluorescein- und Rhodaminmarkern fünf Basen liegen. Die Amplifikation über fünfundvierzig Zyklen wurde in 20 Minuten abgeschlossen, wobei der schnelle Thermocycler mit Fluoreszenznachweis 300 aus der 11 verwendet wurde. Durch „Once-per-cycle"-Überwachung des Fluoreszenzverhältnisses konnte ein 109-facher Bereich anfänglicher Templatkonzentration unterschieden werden. Die Amplifikationskurven sind für jede 10-fache Änderung in der anfänglichen Templatkonzentration um etwa 3–4 Zyklen verschoben. Obwohl die Effizienz abnimmt, wenn die anfängliche Templatkonzentration niedrig ist, lässt sich eine einzelne Kopie von keinem Templat unterscheiden.
  • Das bei der Überwachung durch Hydrolyse erzeugte Signal ist kumulativ und hängt mit der Produktkonzentration nur indirekt zusammen. Wie in 35 gezeigt, nimmt daher das Fluoreszenzverhältnis auch dann kontinuierlich zu, wenn die Menge an Produkt einen konstanten Wert (Plateau) erreicht. Nichtsdestotrotz korreliert das Fluoreszenzsignal, zumindest bis zur Plateau-Phase, gut mit der Menge an PCR-Produkt, wie durch Einbau von 32P-ATP gemessen wurde.
  • Die Sondenkonzentration übt einen nur sehr kleinen Einfluss auf die Empfindlichkeit aus, wie in 36 gezeigt ist. Eine Änderung der Sondenkonzentration um den Faktor 40 verschiebt die Kurve nur um etwa 2 Zyklen. Geringere Sondenkonzentrationen sind etwas empfindlicher, sind aber aufgrund der schwächeren Signalstärke auch variabler. Die Daten der 36 sind bei jeder Sondenkonzentration auf das maximale Signal normiert. Obwohl das Verringern der Sondenkonzentration bei gleicher Menge hydrolysierter Sonde ein stärkeres Signal erzeugen würde, wird dieser Vorteil durch geringere Hybridisierungsgeschwindigkeiten aufgehoben. Die Geschwindigkeit der Sondenhybridisierung an das Target hängt direkt von der Sondenkonzentration ab.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht den Einsatz vieler verschiedener Hydrolysesonden, einschließlich solcher mit Fluorescein und entweder Rhodamin, Eosin oder BODIPY-Farbstoffen (erhältlich von Molecular Probes) markiert sind. Wenn der Abstand zwischen den Fluorophoren abnimmt, nimmt das Quenching und/oder der Energietransfer im Allgemeinen zu, die Hydrolyse bei der PCR nimmt aber ab. Resonanzenergietransfersonden, die eine Hydrolyse erfordern, weisen einige bemerkenswerte Eigenschaften auf. Eine Eigenschaft ist die Resistenz einiger Sonden gegen Hydrolyse. Eine weitere Eigenschaft ist, dass ihre Synthese schwierig ist und manuelle Zugabe wenigstens eines Markers und Hochdruckflüssigkeitschromatographie zur Reinigung erfordert.
  • Cy5 ist ein roter Farbstoff, der seit kurzem als Amidit zum direkten Einbau in Oligonukleotide erhältlich ist. Ein Arbeiten im roten/infraroten Bereich des Spektrums ist für die Auswahl der optischen Komponenten von Vorteil. Laserdioden können zur Beleuchtung eingesetzt werden, Photodiodendetektoren besitzen ausgezeichnete Empfindlichkeit und die meisten Materialien zeigen im entsprechenden Spektralbereich minimale Autofluoreszenz. In Verbindung mit der vorliegenden Erfindung wurde eine Cy5/Cy7-Sonde entwickelt. Mit dieser Sonde konnte Amplifikation nachgewiesen werden, obwohl das Signal schwach war. Wenn die Sonde mit Phosphodiesterase vollständig hydrolysiert wurde, wurde ein nur 2-facher Anstieg des Signals beobachtet. Zwischen den PCR-Zyklen 20 und 40 trat ein 1,3-facher Anstieg des Signal auf, wie in 37 dargestellt ist. Synthese der Cy5/Cy7-Sonde erforderte manuelle Zugabe von Cy7.
  • Doppelt mit Fluorescein und Cy5 markierte Sonden können leicht mit automatischen Oligonukleotidsynthetisierern hergestellt werden. Diese Fluorescein/Cy5-Sonden zeigen hervorragende Änderungen im Fluoreszenzverhältnis, wenn sie mit Phosphodiesterase vollständig hydrolysiert werden. Die Emissionswellenlängen von Fluorescein und Cy5 sind gut voneinander getrennt und zwischen den Fluorophoren tritt, wie in 38 gezeigt ist, ein effizienter Resonanzenergietransfer auf. Obwohl die spektrale Überlappung gering ist, sind der molare Absorptionskoeffizient und die Absorptionswellenlängen von Cy5 groß. Spektrale Überlappung, Absorptionsvermögen des Akzeptors und Wellenlänge des Akzeptors tragen alle zum Überlappungsintegral bei, welches die Energietransferrate bestimmt. Weil Cy5 eine geringe Extinktion bei den Anregungswellenlängen für Fluorescein besitzt, ist auch die direkte Anregung von Cy5 minimal.
  • Die Fluorescein/Cy5-Sonden wurden während der PCR nicht effizient hydrolysiert. Obwohl bei vollständiger Hydrolyse eine 200-fache Änderung des Fluoreszenzverhältnisses möglich ist, ergaben die bevorzugten Fluorescein/Cy5-Sonden einen nur 1,45-fachen Anstieg zwischen den PCR-Zyklen 20 und 40 (siehe 37). Es wurden mehrere Fluorescein/Cy5-Sonden mit unterschiedlich großen Abständen zwischen den Fluorophoren und mit entweder Fluorescein oder Cy5 am 5'-Ende synthetisiert. Bei der PCR ergaben alle geringe Signale. Einige unserer Ergebnisse mit Hydrolysesonden sind unten zusammengefasst: Erzeugeung von Fluoreszenzsignal mit Exonucleasehydrolysesonden
    Figure 00450001
  • Die Resistenz doppelt mit Fluorescein/Cy5 markierter Oligonukleotide gegen Hydrolyse wurde durch Entwicklung von Resonanzenergietransferschemata, die anstelle von Sondenhydrolyse von Sondenhybridisierung abhängen, in einen Vorteil umgewandelt. Anstelle der Hydrolyse einer doppelt markierten Sonde kann Hybridisierung bei der PCR direkt über Resonanzenergietransfer nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu doppelt markierten Exonucleasesonden ist die Synthese einfach markierter Sonden relativ einfach.
  • Die Möglichkeit der vorliegenden Erfindung, bei einer PCR zwei verschiedene Resonanzenergietransferverfahren zum Nachweis von Hybridisierung einzusetzen, ist in 39 gezeigt. Im ersten Verfahren werden zwei benachbarte Hybridisierungssonden verwendet, wobei eine 3' mit Fluorescein und die andere S' mit Cy5 markiert ist. Wenn bei der PCR Produkt akkumuliert, hybridisieren die Sonden während der Annealing-Phase in jedem Zyklus nebeneinander. Im zweiten Verfahren werden ein Primer, der mit Cy5 markiert ist, und eine einzige Hybridisierungssonde eingesetzt. Der markierte Primer wird bei der Amplifikation in das PCR-Produkt eingebaut und es ist nur eine einzige Hybridisierung notwendig. Bei beiden Verfahren nimmt der Fluoreszenzenergietransfer auf Cy5 mit der Hybridisierung zu und wird als Verhältnis der Fluoreszenz von Cy5 zu Fluorescein aufgetragen. Die Fluoreszenz wird einmal pro Zyklus nahe dem Ende einer 2-Temperaturen-Annealing-Extensionsphase erfasst. Die Empfindlichkeit dieser Hybridisierungssonden scheint derjenigen von Hydrolysesonden zu ähneln (vergleiche 29 und 39).
  • Die Temperaturabhängigkeit der Fluoreszenz aus Hybridisierungssonden wird am besten mit den in 40 dargestellten Plots von Fluoreszenz gegen Temperatur wiedergegeben. Diese Plots werden durch Monitoring einer einzelnen Probe alle 200 ms Thermocycling generiert. Während der Annealing-/Extensionsphase hybridisieren die Sonden an das einzelsträngige Produkt und das Fluoreszenzverhältnis (Cy5/Fluorescein) nimmt zu. Während der Erwärmung auf Produktdenaturierungstemperaturen dissoziieren die Sonden bei etwa 70–75 °C, wodurch das Fluoreszenzverhältnis auf das Niveau des Backgrounds abfällt. Im Gegensatz dazu zeigen Hydrolysesonden diese Temperaturabhängigkeit nicht (siehe 41). Plots von Fluoreszenz gegen Temperatur zeigen bei Hydrolysesonden erwartungsgemäß nur eine lineare Abhängigkeit der Fluoreszenz von der Temperatur. Die Möglichkeit, eine Hybridisierung während eines Thermocyclings mit Fluoreszenz zu erfassen, ist ein leistungsstarkes Werkzeug. Die Schmelztemperatur sequenzspezifischer Sonden kann Produkte während einer PCR identifizieren und unterscheiden.
  • Doppelstrangspezifische Farbstoffe können gemäß verschiedenen Aspekten der vorliegenden Erfindung ebenfalls eingesetzt werden. Der Strangzustand von PCR-Produkten kann mit Farbstoffen verfolgt werden, die in Gegenwart von dsDNA fluoreszieren. Wenn SYBR® Green I während einer Amplifikation vorhanden ist, nimmt die Fluoreszenz zu, je mehr dsDNA gebildet wird. Ein verwirrender Thermocyclingeffekt ist jedoch die inverse Proportionalität der Fluoreszenz zur Temperatur, wie in aus den 42A und 42B hervorgeht. Wenn die Fluoreszenz als Funktion von Temperatur und Zeit kontinuierlich während einer PCR verfolgt wird, bilden die Daten eine in 12 dargestellte, dreidimensionale Spirale. Wie oben bereits ausgeführt, kann die in 12 gezeigte 3D-Kurve auf 2D-Plots von Temperatur gegen Zeit, Fluoreszenz gegen Zeit und Fluoreszenz gegen Temperatur projiziert werden. Die Projektion von Temperatur gegen Zeit in 12 wiederholt sich jeden Zyklus. Ihre vertraute Form ist in 42B unten deutlicher gezeigt. Die Fluoreszenz-Zeit-Projektion von 12 ist ein skaliertes Spiegelbild des Temperatur-Zeit-Plots früher Zyklen, der in 42B gezeigt ist. Wenn Produkt akkumuliert, nimmt die Fluoreszenz zu, außer bei Denaturierungstemperaturen, bei denen die Fluoreszenz auf die Grundlinie abfällt, wie aus 12 hervorgeht.
  • Projektionen von Fluoreszenz gegen Temperatur zeigen die Temperaturabhängigkeit des Strangzustands während einer PCR (siehe 24 und 24A). Wenn die Amplifikation fortschreitet, erscheinen die Temperaturzyklen als ansteigende Schleifen zwischen Annealing- und Denaturierungstemperaturen. Wenn die Probe aufgeheizt wird, ist die Fluoreszenz solange hoch, bis Denaturierung eintritt. Wenn die Probe abgekühlt wird, nimmt die Fluoreszenz aufgrund der Bildung von dsDNA zu, was Produktreannealing anzeigt. Wenn die Temperatur während der Extension konstant bleibt, korreliert die zunehmende Fluoreszenz mit zusätzlicher DNA-Synthese. Die Daten von Fluoreszenz gegen Temperatur können transformiert werden, um den Einfluss der Temperatur auf die Fluoreszenz zu eliminieren (siehe 24). Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Produkt-Tm und Schmelzkurven dazu verwendet, um die Spezifität der Amplifikation festzustellen. In vielen Fällen ist mit diesem Verfahren keine Synthese von Hybridisierungssonden mehr nötig. Eine Unterscheidung auf der Grundlage von Hybridisierungstemperaturen ist ein leistungsstarkes Werkzeug bei der Identifizierung und Quantifizierung und kann in Verbindung mit oder anstelle von spektraler Unterscheidung durch Mehrfarbenanalyse eingesetzt werden.
  • Überblick über Sonden zur kontinuierlichen Überwachung einer PCR. Die folgende Tabelle vergleicht dsDNA-Farbstoffe, Hydrolysesonden und Hybridisierungssonden, die zur kontinuierlichen Überwachung einer PCR nützlich sind. Die Fluoreszenz von dsDNA-Farbstoffen hängt vom Strangzustand der DNA ab. Die doppelt markierten Hydrolysesonden werden gequencht, solange sie intakt sind. Die Fluoreszenz der gequenchten Fluorophore nimmt zu, wenn die Sonde hydrolysiert wird. Hybridisierungssonden hängen von erhöhtem Resonanzenergietransfer ab, wenn 2 Fluorophore aufgrund von Hybridisierung näher zueinander kommen.
  • Überblick über Fluoreszenzsonden zum kontinuierlichen Monitoring einer PCR
    Figure 00460001
  • Der Fachmann erkennt, dass der in 11 dargestellte schnelle Thermocycler mit Fluoreszenznachweis 300 die vorteilhaften Eigenschaften einer Fluorimetervorrichtung mit schneller Temperatursteuerung umfasst, eine Kombination, die bislang im Stand der Technik nicht vorgeschlagen wurde. PCR kann in zehn bis 20 Minuten Thermocycling durchgeführt und analysiert werden. Die Kombination der vorliegenden Erfindung aus 1) kontinuierlicher Fluoreszenzüberwachung in jedem Temperaturzyklus und 2) Analyse der Temperatur- und Zeitabhängigkeit einer Hybridisierung bietet anders nicht erhältliche Vorteile.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Einfarbenfluoreszenzverfahren zur Überwachung von Produktreinheit, zur Quantifizierung von Templat und zum Nachweis von Mutationen bei einer PCR zur Verfügung. Farbstoffe, die den Strangzustand der DNA verfolgen, werden zur Beobachtung beim Thermocycling zu den PCR-Reaktionen gegeben. SYBR® Green I ist ein empfindlicher Farbstoff, der nur stark fluoresziert, wenn er einen Komplex mit doppelsträngiger DNA bildet. Wenn eine PCR-Reaktion von Extensions- auf Denaturierungstemperaturen aufgeheizt wird, kann Denaturierung als Abfall der Fluoreszenz von SYBR® Green I beobachtet werden. Die Schmelzkurve ist für das denaturierte Produkt charakteristisch. Für kleine PCR-Produkte erfolgt der Schmelzübergang in einem engen Temperaturbereich; die Mitte des Schmelzvorgangs wird als Tm bezeichnet. Die Fluoreszenzschmelzkurven drei verschiedener gereinigter PCR-Produkte sind in 43A gezeigt. Die Daten der 43A wurden durch Fluoreszenz-Monitoring mit SYBR® Green I erhalten, während die Temperatur mit einer Geschwindigkeit von 0,2 °C/s erhöht wurde. Die relativen Schmelzpositionen können aus empirischen Gleichungen vorhergesagt werden, die den GC-Gehalt und die Länge mit Tm in Beziehung setzen. Die apparente Tm von PCR-Produkten hängt von der Aufheizgeschwindigkeit ab, wie in 43 zu sehen ist. Wenn die Aufheizgeschwindigkeit abnimmt, verschiebt sich die Schmelzkurve zu niedrigeren Temperaturen und bekommt eine schärfere Form. Für maximale Details der Schmelzkurven und eine genaue Abschätzungen von Tm müssen die kinetischen Effekte der Aufheizgeschwindigkeit minimiert werden. Die apparente Tm von PCR-Produkten hängt auch von der Konzentration des dsDNA-Farbstoffs ab, wie in 44 gezeigt ist. Größere Konzentrationen des Farbstoffs erhöhen die Stabilität der Duplex und die beobachtete Tm.
  • Die Eigenschaften verschiedener dsDNA-Farbstoffe werden zuerst diskutiert, um einen optimalen Farbstoff für Schmelzkurven bei der PCR auszuwählen, und anschließend folgt eine Diskussion der Schmelzkurven, um die Reinheit des PCR-Produkts festzustellen und Mutationen während der Amplifikation zu erfassen. Abschließend wird die Verwendung von dsDNA-Farbstoffen bei kompetitiver quantitativer PCR und absoluter Produktquantifizierung erläutert werden.
  • Im Folgenden werden verschiedene dsDNA-Farbstoffe diskutiert. Es gibt viele doppelstrangspezifische Farbstoffe, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Ein bevorzugter Farbstoff ist SYBR® Green I, der gegenüber Ethidiumbromid bevorzugt wird, da sein Anregungsspektrum demjenigen von Fluorescein ähnelt. Eine Vielzahl doppelsträngiger Farbstoffe wurde getestet auf: 1) Inhibierung der PCR, 2) Nachweisempfindlichkeit, 3) Einfluss der Aufheizgeschwindigkeit auf die Schmelzkurve und 4) Einfluss der Farbstoffkonzentration auf die Schmelzkurve. Zuerst wurde die höchste Farbstoffkonzentration bestimmt, die mit einer Rapid-Cycle-PCR kompatibel ist. Diese Konzentration kann dazu verwendet werden, die Nachweisempfindlichkeit durch kontinuierliche Überwachung einer PCR mit optimalen optischen Filtern festzustellen. Der Einfluss von Übergangsgeschwindigkeiten und Farbstoffkonzentration auf die Schmelzkurven ist farbstoffspezifisch. Daten werden erfasst und wie in den 43 und 44 dargestellt. Die unten angegebenen Farbstoffe werden mit SYBR® Green I verglichen:
  • Alternative dsDNA-Farbstoffe für Schmelzkurven
    • (siehe Fu, Y.-H., D.P.A. Kuhl, A. Pizzute, M. Pieretti, J.S. Sutcliffe, S. Richards, A.J.M.H. Verkerk, J.J.A. Holden, R.G. Fenwick, S.T. Warren, B.A. Oostra, D.L. Nelson und C.T. Caskey, Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox, Cell, 67:1047–1058, 1991)
  • Figure 00480001
  • Für SYBR® Green I werden bevorzugt Verdünnungen von 1:7.000–1:30.000 mit Aufheizgeschwindigkeiten von 0,1–0,5 °C/s verwendet. Schmelzkurven gereinigter PCR-Produkte mit hohem GC-Gehalt und niedrigem GC-Gehalt werden für jeden Farbstoff erhalten. Schmelzkurven mit verschiedenen Farbstoffen können abhängig von deren AT/GC-Präferenz und Bindungsart variieren. Farbstoffe können sich beim Aufschmelzen verschiedener DNA-Domänen neu verteilen, wie es für Ethidiumbromid bekannt ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der beste Farbstoff, dessen Konzentration und die für die Schmelzkurven erforderliche Aufheizgeschwindigkeit bestimmt werden.
  • Im Folgenden wird die Produktreinheit diskutiert. Aufgrund der Heterogenität in Größe und GC-Gehalt können PCR-Produkte über einen Bereich von 40–50 °C schmelzen. Beispielsweise sollten Primerdimere bei niedrigen Temperaturen schmelzen, heterogene unspezifische Produkte sollten über einen breiten Bereich schmelzen, und ein reines PCR-Produkt sollte exakt bei einer bestimmten Tm schmelzen. Diese Eigenschaften werden hier durch einen Vergleich von Fluoreszenzschmelzkurven mit Agarosegelelektrophorese von PCR-Amplifikationen gezeigt, die dazu optimiert wurden, das/die gewünschte/n Produkt/e zu liefern. Lange PCR-Produkte können interne Schmelzdomänen aufweisen, die als Fingerprint zur Identifizierung verwendet werden könnten, kleinere DNA-Fragmente (< 300 bp) schmelzen jedoch gewöhnlich in einem Übergang. Abhängig von der Sequenz können DNA-Schmelzdomänen zwischen 40 und 600 Basenpaaren variieren.
  • Ein Mutationsnachweis sollte gemäß der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen werden. Die Fähigkeit von Schmelzkurven zum Nachweis genetischer Polymorphismen und Mutationen wird bestimmt werden. Repeat-Polymorphismen (VNTRs, Dinukleotid-Repeats) variieren in ihrer Größe, aber nicht wesentlich in ihrer Sequenz. Homozygote Punktmutationen (Basensubstitutionen) in DNA-Fragmenten können durch denaturierende Gradientengelelektrophorese und Temperaturgradientengelelektrophorese nachgewiesen werden, die Temperaturverschiebung ist jedoch gewöhnlich < 1 °C, ein Unterschied, der nur mit Hilfe on Präzisionsmethoden nachgewiesen werden kann. Wenn das DNA-Target bei der PCR jedoch heterozygot ist, werden beim Abkühlen Heteroduplizes gebildet und die beobachteten Temperaturverschiebungen betragen 1–5 °C. Der Großteil der heterozygoten Mutationen kann mit der vorliegenden Erfindung durch einfache Schmelzkurven bei der PCR nachgewiesen werden. Die die Stelle der 3-Basenpaar-Deletion umgebende Region der am häufigsten vorkommenden cystischen Fibrosemutation (ΔF508) wird gemäß der vorliegenden Erfindung aus zuvor typisierter DNA amplifiziert. Schmelzkurven von homozygotem Wildtyp, heterozygotem ΔF508 und homozygotem ΔF508 werden hier ebenfalls verglichen. Die homozygoten Proben werden nahezu ununterscheidbar sein, aber die Heterozygotenkurve zeigt ein Schmelzen der Heteroduplex mit niedrigem Tm, worauf ein normales „Homoduplex"-Schmelzen folgt. Der Effekt tritt mit kleineren Amplikons deutlicher hervor.
  • Der am häufigsten auftretende, bekannte genetische Risikofaktor für Thrombose ist eine einzelne Punktmutation auf dem Faktor V-Gen. Zuvor typisierte homozygote und heterozygote DNA, die die Mutation umgibt, wird amplifiziert und die Schmelzkurven werden erhalten. Homozygote Mutationen werden über Coamplifikation mit einer gleichen Menge an Wildtyp-DNA nachgewiesen. Die beobachtete, gemischte Schmelzkurve sollte zu einer identisch erscheinen, die aus einer heterozygoten Amplifikation hervorgeht. Wenn Wildtyp-DNA routinemäßig in einem Verhältnis von 1:2 mit den Testproben vermischt wird, sollten Heterozygote ein Schmelzen im Verhältnis von 2:1 von Wildtyp:Mutante zeigen und eine homozygote Mutante wäre 1:2 von Wildtyp:Mutante.
  • BRCA1 ist das erste Brustkrebsgen, bei welchem eine Prädisposition identifiziert wurde, was sich bei etwa 5 % aller Brustkrebsfälle bestätigt hat. Die meisten Mutationen sind Substitutionen, Insertionen oder Deletionen von nur ein oder zwei Basen, und die Prädisposition kommt durch Heterozygosität für eine Mutation zustande. Heterozygote können über automatische Sequenzierung nachgewiesen werden, eine klinische Untersuchung, die über 5.000 codierende Basen sequenziert, ist teuer und mit Vorrichtungen und Verfahren des Standes der Technik schwer auszuführen. Zehn bekannte BCRA1-Mutationen werden mit Hilfe der vorliegenden Erfindung getestet, indem die betroffenen Amplikons amplifiziert werden, Schmelzkurven beobachtet werden und mit dem Wildtyp verglichen werden. Die Primer und bekannten DNA-Proben sind technisch von Myriad Diagnotics erhältlich.
  • Kompetitive quantitative PCR erfolgt ebenfalls mit Hilfe der vorliegenden Erfindung. Die Möglichkeit, Unterschiede in der Schmelztemperatur des Produkts nachzuweisen, wird durch die vorliegende Erfindung für eine quantitative PCR ausgenützt, um zwischen einem PCR-Produkt und einem Kompetitor zu unterscheiden. Die Anzahl anfänglicher Templatkopien wird durch kompetitive Amplifikation mit einem Kontrolltemplat quantifiziert, für das die gleichen Primer verwendet werden, das sich aber in seiner Schmelztemperatur vom natürlichen Amplikon unterscheidet. Die Vorteile dieses Ansatzes sind in den 45 und 46 gezeigt. 45 zeigt die Schmelzkurve, die erhalten wird, wenn zwei gereinigte PCR-Produkte, die sich in ihrer Tm um etwa 2 °C unterscheiden, miteinander gemischt werden. Durch Korrektur des Einflusses der Temperatur auf die Fluoreszenz und Auftragen der Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur kann die relative Menge jedes PCR-Produkts quantifiziert werden, wie in 46 gezeigt ist.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein kompetitives Templat für die Amplifikation eines 180- Basenpaar-Fragments des Hepatitis B-Oberflächenantigengens mit den oben beschrieben Primern konstruiert. Ein kompetitives Templat mit einem Unterschied in der Tm von 3 °C kann durch Änderung der Templatlänge, des GC-Gehalts oder einer Kombination von beidem erhalten werden. Durch PCR-Amplifikation kleinerer Hepatitis B-Fragmente und anschließende Ligation über endständige Überlappungen wurden die folgenden Template synthetisiert: Kompetitive Hepatitis B-PCR-Template mit einem Tm-Unterschied zum Wildtyp von 3 °C
    Figure 00500001
  • Die alternativen Template wurden über ihre A260 quantifiziert und die Amplifikationseffizienz wurde durch „Once-per-cycle"-Überwachung mit SYBR® Green I bestimmt. Kompetitive Quantifizierung von Wildtyp-DNA mit allen drei alternativen Templaten wird hier mit einem klinischen Standardverfahren verglichen, bei welchem Hybridisierung verwendet wird.
  • Absolute Produktquantifizierung erfolgt ebenfalls vorteilhaft mit der vorliegenden Erfindung. Kontinuierliche Überwachung der Bildung doppelsträngiger DNA ermöglicht eine direkte, absolute Quantifizierung der DNA mittels Reannealingkinetik. Die Probentemperatur wird schnell von der Denaturierungstemperatur abgesenkt und auf einer niedrigeren Temperatur konstant gehalten, die noch hoch genug ist, ein Primerannealing zu verhindern. Die Geschwindigkeit des Produktreannealings folgt dann einer Kinetik zweiter Ordnung. Wenn verschiedene DNA-Konzentrationen getestet werden, ist die Form der Reannealingkurve für die DNA-Konzentration charakteristisch (siehe 26). Für jedes gegebene PCR-Produkt und jede Temperatur kann eine Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung gemessen werden. Wenn die Geschwindigkeitskonstante bekannt ist, kann jede unbekannte DNA-Konzentration aus den experimentell ermittelten Reannealingdaten bestimmt werden. Das Prinzip ist in 27 dargestellt. Die Kurven können über nichtlineare Regression kleinster Quadrate während des Thermocycling in Echtzeit mit Hilfe der LabView-Programmierumgebung, die oben erläutert wurde, angepasst werden. Das Abkühlen erfolgt nicht unverzüglich, so dass ein gewisses Maß an Reannealing erfolgt bevor eine konstante Temperatur erreicht wurde, die Regressionsanalyse lässt dies gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch zu (siehe 27). Die Methode erfordert reine PCR-Produkte, aber dies kann durch ebenfalls während des Thermocycling erhaltene Schmelzkurven sichergestellt werden. Quantifizierung mittels Reannealingkinetik hängt nicht von der Signalstärke ab und wird von kleineren Unterschieden in den Proben nicht beeinflusst.
  • Die Annahme einer Kinetik zweiter Ordnung beim Produktreannealing wird durch Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante bei verschiedenen DNA-Konzentrationen bestätigt. Einige Fluoreszenzfarbstoffe beeinflussen das Reannealing abhängig von ihrer Konzentration. Die Relation ist definiert und eine Quantifizierung ist möglich. Die Quantifizierung mittels Reannealingkinetik wird am Ende jeder Extensionsphase mit einer Quantifizierung mittels Fluoreszenz verglichen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Zweifarbenfluoreszenzverfahren zum sequenzspezifischen Nachweis bei einer PCR bereit, die von Sondenhybridisierung (nicht Hydrolyse) abhängen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Resonanzenergietransfer zwischen benachbarten Hybridisierungssonden, die mit Fluorescein und Cy5 markiert sind, zur Überwachung einer Amplifikation verwendet werden. Der Einfluss von Sondenlänge, Sondenkonzentration und optimalem Abstand zwischen den Sonden sollten jedoch auch berücksichtig werden, wenn erfindungsgemäße Ausführungsformen eingesetzt werden.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch die Optimierung von benachbarten Hybridisierungssonden. Der Einfluss des Abstands zwischen den Sonden wird bestimmt. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Synthese von 5 3'-Fluorescein-markierten 30-meren und 5 5'-Cy5-markierten 30-meren mit Fluorescein-gesteuertem Pore Glass (erhältlich von Glen Research) und Cy5-Amiditen (erhältlich von Pharmacia) durchgeführt. Die Sonden sind so konstruiert, dass sie an den gleichen Strang in der β-Globinregion hybridisieren, wobei zwischen den Sonden Abstände von 0 bis 25 Basen zwischen Fluorescein und Cy5 liegen. Zur Reinigung wird Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Tandem-Extinktion und Fluoreszenzmonitoren verwendet. Die Reinheit wird vorzugsweise durch analytische Gelelektrophorese und A260:A490- oder A260:A650-Verhältnisse überprüft. Die Sonden sind bei der PCR mit einer Konzentration von 0,2 μM enthalten und es wird ein 2-Temperaturen-Cycling verwendet. Die Änderung des Fluoreszenzverhältnisses während der PCR wird gegen den Abstand zwischen den Sonden aufgetragen, um den optimalen Abstand zwischen den Sonden zu bestimmen.
  • Mit Hilfe des oben bestimmten, optimalen Abstands zwischen den Sonden werden Sonden mit einer Länge von 20, 25 und 30 Basen synthetisiert und mit den 30-mer-Sonden verglichen. Die Schmelztemperatur dieser Sonden wird während der PCR beobachtet und gegen die Sondenlänge aufgetragen. Die Verwendung längerer Sonden ermöglicht die Verwendung eines 3-Temperaturen-Zyklus, wobei einem Sondenannealingschritt ein Primerannealingschritt vorausgeht. Der Einfluss der Probenkonzentration auf die Nachweisempfindlichkeit und Signalstärke während einer PCR wird gemessen.
  • Die Verwendung eines markierten Primers zum Resonanzenergietransfer auf eine Hybidisierungssonde entspricht einem Aspekt der vorliegenden Erfindung. Eine der benachbarten Resonanzenergietransfersonden kann, wie in 39 gezeigt, in einen PCR-Primer eingebaut werden. In dem gezeigten Fall hybridisiert eine markierte Sonde an ein einzelsträngiges PCR-Produkt, das den markierten Primer beinhaltet. Die markierten Primer werden mit einem modifizierte dT-Amidit mit einem Aminolinker (erhältlich von Glen Research) zur manuellen Kupplung an Cy5 (erhältlich von Amersham/BDS) synthetisiert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Bestimmung, wie nah das modifizierte Cy5-dT zum 3'-Ende des Primers liegen kann, ohne dass es die PCR inhibiert. Diese Bestimmung erfordert mehrere markierte Primer, bei denen sich die markierte Base an verschiedenen Positionen befindet. Anschließend stellt man den optimalen Abstand zwischen den Fluorophoren fest, indem man mehrere an 3' mit Fluorescein markierte Sonden synthetisiert.
  • Es liegt auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, andere Formate zum Nachweis der Hybridisierung mittels Resonanzenergietransfer zu verwenden. In einem bevorzugten Verfahren wird das Schema benachbarter Hybridisierungssonden als „nichtkompetitives Format" bezeichnet. Diese stellt das Gegenteil eines „kompetitiven Formats" dar, bei welchem zwei komplementäre Oligonukleotide einzeln mit Fluorophoren markiert werden. Die Sonden hybridisieren entweder miteinander (was zum Energietransfer oder Quenching führt) oder mit einem konkurrierenden Target, welches in unserem Fall akkumulierendes PCR-Produkt wäre. Synthese und Testen von 5' mit Cy5 und 3' mit Fluorescein markierten komplementären 20-, 25- und 30-mer-Sonden bei der PCR kann erfindungsgemäß erfolgen.
  • Das „Interkalator-Format" von Morrison erfordert eine markierte Sonde, die nach der Hybridisierung mit einem doppelstrangspezifischen Farbstoff in Wechselwirkung tritt. Siehe Monison, L.E., „Detection of energy transfer and fluorescence quenching", in L.J. Kricka (Hrsg.) "Nonisotopic DNA probe techniques", Academic Press, San Diego, S. 311–352, 1992.
  • Die Synthese von 20-, 25- und 30-mer-Sonden, die am 3'- und 5'-Ende mit Cy5 markiert sind, und die Verwendung von SYBR® Green I als doppelstrangspezifischem Farbstoff liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Die Bildung des PCR-Produkts führt zu Hybridisierung, die sich als erhöhte Emission von Cy5 beobachten lässt. Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass sequenzspezifisches Produkt und doppelsträngige DNA zur gleichen Zeit überwacht werden können.
  • Die vorliegende Erfindung setzt auch sequenzspezifische Zweifarbenverfahren zum Mutationsnachweis, zur kompetitiven quantitativen PCR und zur Produktquantifizierung ein. Die Tm der Hybridisierungssonden verschiebt sich bei Vorliegen einer einzelnen Basenfehlpaarung um etwa 10 °C. Wenn eine Hybridisierungssonde an einer Mutationsstelle positioniert ist, sind einzelne Basenmutationen beim Sondenschmelzen als Verschiebungen um 10 °C nachweisbar. Heterozygote Mutationen sollten zu einer dazwischenliegenden Schmelzkurve führen. Die Unterscheidung einzelner Basen wird mit Hilfe der oben erwähnten Faktor V-Mutation und benachbarten Fluorescein/Cy5-Sonden gezeigt.
  • Kompetitive PCR-Template können mit internen Basenaustauschen konstruiert werden. Wenn Nachweissonden verwendet werden, die bei verschiedenen Temperaturen nacheinander von verschiedenen Targets abschmelzen, ist eine relative Quantifizierung möglich. Absolute Produktquantifizierung ist durch Verfolgen der Annealingkinetik der Sonden möglich. Wenn ein markierter Primer und eine Hybridisierungssonde verwendet werden, sollte die Annealingkinetik pseudo-erster Ordnung sein, wobei diese Vorhersage anhand bekannter Templatkonzentrationen getestet wird.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet auch eine Fluoreszenz-Rückkopplung zur Echtzeitsteuerung und Optimierung einer Amplifikation. Echtzeitüberwachung von Fluoreszenz wird zur Steuerung eines Thermocyclings eingesetzt. Mit doppelstrangspezifischen Farbstoffen kann die Extension in jedem Zyklus beendet werden, wenn die Fluoreszenz nicht mehr ansteigt. Zur Denaturierung muss die Temperatur nur so lange steigen, bis das Produkt vollständig geschmolzen ist. Das Thermocycling kann schließlich automatisch beendet werden, wenn eine bestimmte Menge Produkt hergestellt wurde. Diese Echtzeitsteuerung wird als Optionen in einen Fluoreszenzthermocycler einprogrammiert.
  • Die vorliegende Erfindung bietet auch eine Echtzeitüberwachung und Steuerung des Annealings. Wenn einer der Primer 3' mit Cy5 markiert ist, kann keine Extension eintreten. Wenn markierter Primer (1–10 %) mit unmarkiertem Primer (80–99 %) vermischt wird, fällt die Amplifikationseffizienz leicht ab, das Annealing kann jedoch als Fluoreszenzenergietransfer von einem doppelstrangspezifischen Farbstoff auf Cy5 beobachtet werden. Dies ist das zuvor oben beschriebene „Interkalator-Format". Der Primer mit der niedrigsten Tm (wie bestimmt mittels Thermodynamik der nächsten Nachbarn) wird mit SYBR® Green I als doppelstrangspezifischem Farbstoff markiert. Amplifikationseffizienz und Cy5-Fluoreszenz während des Annealing werden mit dem Prozentsatz an markiertem Primer verglichen.
  • Direktes Monitoring mit der erfindungsgemäßen Ausführungsform kann direkt mit einem mit Cy5 markierten Primer oder indirekt mit äquivalenten komplementären Oligonukleotiden durchgeführt werden. Ein Oligonukleotid mit gleicher Länge und gleicher Tm wie der am tiefsten schmelzende Primer wird so konstruiert, dass zu der amplifizierten Sequenz keine Komplementarität besteht. Dieses Oligonukleotid ist 5' mit Cy5 markiert und dessen Komplement ist 3' mit Fluorescein markiert. Die Hybridisierung dieses Paares wird über Resonanzenergietransfer auf Cy5 verfolgt. Das mit Fluorescein markierte Oligonukleotid (0,005 μM) und das mit Cy5 markierte Oligonukleotid (0,5 μM) zeigen eine Annealingkinetik pseudo-erster Ordnung, die in etwa der Annealingkinetik des Primers entspricht. Auf diese Weise kann die Annealingeffizienz verfolgt und zur Steuerung von Annealingtemperatur und -zeiten eingesetzt werden. Eine Steuerung der Annealingbedingungen durch Monitoring der Annealingeffizienz ist gegebenenfalls in der Steuervorrichtung enthalten.
  • Konventionelle PCR wird durchgeführt, indem man vor Amplifikationsbeginn alle Thermocyclingparameter einprogrammiert. Zur kontinuierlichen Überwachung erfolgt die Bestimmung der Erfordernisse des Thermocycling während der Amplifikation auf Basis der kontinuierliche Beobachtung von Annealing, Extension und Denaturierung. Mit komplementären Oligonukleotiden, die zu dem am tiefsten schmelzenden Primer äquivalent sind, wird die Annealingeffizienz sogar während der frühen Zyklen gesteuert. Extension und Denaturierung können jedoch nur in späten Zyklen mit dsDNA-Farbstoffen überwacht werden, wenn eine ausreichende Menge an Produkt hergestellt wurde. Dies stellt gewöhnlich kein Problem dar, da die Bedingungen von Denaturierung und Extension so gewählt werden, dass die meisten Produkte amplifiziert werden, und die Daten der ersten Amplifikation können dazu verwendet werden, nachfolgende Durchläufe zu optimieren.
  • Weitere Beispiele für die Produktdifferenzierung durch Analyse von DNA-Schmelzkurven während einer Polymerasekettenreaktion werden im Folgenden gegeben.
  • Die PCR wurde in 50 mM Tris, pH 8,5 (25 °C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,5 mM jedes Desoxynucleosidphosphats, 0,5 μM Primern und 0,2 U Taq-Polymerase pro 5 μl-Probe durchgeführt. SYBR® Green I war in einer 1:20.000-Verdünnung ebenfalls enthalten, soweit nicht anders angegeben.
  • Amplifikationsprodukte, die als Template verwendet wurden, wurden durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Ethanolfällung und anschließendes wiederholtes Waschen durch einen Centricon 30-Mikrokonzentrator (erhältlich von Amicon, Danvers, Massachusetts) gereinigt. Templatkonzentrationen wurde durch Extinktion bei 260 nm bestimmt und zeigten A260/A280-Verhältnisse von größer 1,7.
  • Primer wurden mittels übliche Phosphoramiditchemie (erhältlich von Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus, Piscataway, New Jersey) synthetisiert. Die Primer für die Amplifikation des 180 Basenpaare langen Hepatitis B-Oberflächenantigengens waren
    5'-CGTGGTGGAC TTCTCTCAAT-3' (SEQ ID NO:1) und
    5'-AGAAGATGAG GCATAGCAGC-3' (SEQ ID NO:2).
  • Die Primer für die Amplifikation des 292 Basenpaare langen prostataspezifischen Antigengens waren
    5'-CTGTCCGTGA CGTGGATT-3' (SEQ ID NO:7) und
    5'-AAGTCCTCCG AGTATAGC-3' (SEQ ID NO:8).
  • Die Primer für die Amplifikation des 536 Basenpaare langen humanen β-Globingens waren RS42 und KM29.
  • DNA-Schmelzkurven wurden mit einem Mikrovolumen-Fluorimeter erfasst, das gemäß der Ausführungsform der 8A&B in einen 24 Proben fassenden Thermocycler integriert und zur Erfassung der Fluoreszenz von SYBR® Green I mit einem optischen Modul (Modellnummer 2210, erhältlich bei Idaho Technology, Idaho Falls, Idaho) ausgestattet war. Die PCR-Reagenzien (5 μl Volumen) wurden in die offenen Plastikreservoirs von Reaktionsröhrchen aus Verbundglas/Plastik pipettiert, bei niedriger Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Probe in die Spitze der Glaskapillare zu bringen, und diese anschließend mit einem Plastikstopfen versiegelt. Die PCR wurde gemäß einer der oben beschriebenen Ausführungsformen durchgeführt. Fluoreszenzdaten für Schmelzkurven wurden durch Integrieren des Signals über 0,25–2,0 Sekunden während eines linearen Temperaturübergangs auf 95 °C mit 0,1–10,0 °C/s erfasst. Die Daten wurden mit Hilfe der oben erwähnten Steuereinrichtungen kontinuierlich angezeigt.
  • Eine Reihe von Transformationen wurde verwendet, um die Schmelzkurve in Schmelzpeaks umzurechnen (siehe 49). Durch Anwendung linearer Regression (L1) auf die Schmelzkurve oberhalb der Schmelztemperatur des gereinigten PCR-Produkts wurde die Background-Fluoreszenz eliminiert (T1). Mit guter Annäherung (R2 = 0,96 bei der in 49 gezeigten Schmelzkurve) gibt diese Linie die Background-Fluoreszenz als Funktion der Temperatur wieder. Eine lineare Regression (L2) auf die Schmelzkurve unterhalb der Schmelztemperatur des Produkts wird angewandt, um den Einfluss der Temperatur auf die Fluoreszenz zu eliminieren. Die Daten werden schließlich von einer Schmelzkurve zu einem Schmelzpeak (T2) umkartiert, indem man die Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur (-dF/dT) aufträgt, und zwar mit Verfahren ähnlich denen, die zur Umwandlung spektrometrischer Schmelzkurven in Schmelzpeaks verwendet werden. Integrieren der Schmelzpeakkurve über den erwarteten Schmelzbereich des spezifischen Produkts, geteilt durch das Integral über den gesamten Schmelzpeaks, gibt einen oberen Grenzwert für das Verhältnis von erwünschtem zu unspezifischem Produkt.
  • Das Auftragen der Fluoreszenz von dsDNA-spezifischen Farbstoffen als eine Funktion der Temperatur (siehe 50) während der PCR ermöglichte die Überwachung des Strangszustands während einzelner Reaktionszyklen. Frühe Temperaturzyklen erschienen als Background-Fluoreszenz am unteren Rand des Plots. Wenn Amplifikationsprodukt akkumulierte, nahm die Fluoreszenz in jedem Zyklus während des Übergangs zur Annealingtemperatur und wenn durch Polymeraseaktivität neues Produkt synthetisiert wurde zu. Beim Aufheizen auf Denaturierungstemperatur fiel die Fluoreszenz über eine kleine Gradspanne plötzlich auf das Niveau des Backgrounds ab, was die Denaturierung des Produkts anzeigte. Diese Abfolge resultierte im der im Uhrzeigersinn verlaufenden Spiralstruktur, die für Fluoreszenz-Temperatur-Plots bei der PCR charakteristisch sind.
  • Nach 25 Temperaturzyklen wurde mit der Erfassung eines Schmelzkurvenzyklus begonnen (siehe 51). Das Produkt wurde denaturiert, es erfolgte ein vollständiges Annealing und anschließend eine langsames Erwärmen mit 0,2 °C/s über die Denaturierungstemperatur hinaus. Das Aufschmelzen begann bei 85 °C und die Fluoreszenz fiel bei 87 °C auf das Niveau des Backgrounds ab.
  • Die absolute Lage der Schmelzkuren des PCR-Produkts wurden durch die Konzentration von SYBR® Green I beeinflusst (siehe 52A). Wenn die Konzentration des Farbstoffs erhöht wurde, verschoben sich die Schmelzkurven zu höheren Temperaturen hin. Konzentrationen über 1 bis 7.000 verhinderten eine Amplifikation durch PCR.
  • Schnelle Temperaturübergänge über die Denaturierungstemperatur hinaus verschoben die Schmelzkurven aufgrund kinetischer Effekte zu höherer apparenter Tm (siehe 52B). Temperaturübergangsgeschwindigkeiten von mehr als 5 °C/s verschoben die apparente Tm um fast 3 °C. Wenn die Übergangsgeschwindigkeit von 0,1 auf 0,2 °C/s erhöht wurde, wurde die apparente Tm um 0,2 °C verschoben. Die nachfolgende Schmelzkurvenanalyse wurde mit einer Übergangsgeschwindigkeit von 0,2 °C/s durchgeführt. Eine Schmelzkurvenanalyse mit dieser Geschwindigkeit erhöhte die in 50 gezeigte 8-minütige Reaktion um 30 Sekunden.
  • Schmelzkurven wurden für drei verschiedene gereinigte PCR-Produkte erfasst (siehe 53). Alle drei Produkte, die in einem Bereich von 2 °C schmolzen, zeigten exakt verlaufende Schmelzkurven. Die apparente Tm des 180 Basenpaare langen Hepatitis B-Fragments (50,0 % GC) lag etwa zwei Grad unter der Tm des 536 Basenpaare langen β-Globin-Fragments (53,2 % GC), und diese beiden waren daher leicht zu unterscheiden. Die apparente Tm des 292 Basenpaare langen prostataspezifischen Antigen-Fragments (60,3 % GC) zeigte eine fast fünf Grad über der Schmelztemperatur des größeren β-Globin-Fragments liegende Schmelztemperatur.
  • Wenn gereinigte PCR-Produkte miteinander vermischt wurden, überlappten sich ihre Schmelzkurven (siehe 54). Nach Umrechnung in Schmelzpeaks war es möglich, Mischungen von Reaktionsprodukten in getrennte Schmelzpeaks aufzulösen, die sich in ihrer Tm um weniger als 2 °C unterschieden (siehe 55).
  • Schmelzkurvenanalyse wurde zur Unterscheidung zwischen erwünschtem Produkt und unspezifischen Produkten wie beispielsweise Primerdimeren verwendet (siehe 56). Primerdimere zeigten breite Schmelzpeaks im Bereich von 75–85 °C, was sich sehr von den exakten Schmelzpeaks spezifischer PCR-Amplifikationsprodukte unterscheidet. Größere heterogene Produkte, die daraus resultierten, dass viele Zyklen bei niedriger Annealingstringenz laufen gelassen wurden, zeigten im Vergleich mit reinem PCR-Produkt niedrigere und breitere Schmelzkurven.
  • Der Ansatz der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung der Produktreinheit wurde zur Verbesserung der quantitativen, auf einer „Once-per-cycle"-Fluoreszenzüberwachung von dsDNA-spezifischen Farbstoffen basierenden PCR eingesetzt. Fluoreszenz wurde für eine Reihe von Reaktionen, die sich in ihrer anfänglichen Templatkonzentration unterschieden, einmal pro Zyklus nach der Extension des Produkts mit Polymerase erfasst (siehe 57). Der log-lineare Anstieg über der Background-Fluoreszenz beginnt bei einer von der anfänglichen Templatkonzentration abhängigen Zykluszahl. Die Plots der fünf Reaktionen, die von 106 bis 102 Kopien pro Reaktion reichten, waren durch etwa vier Zyklen getrennt. Die Reaktion mit durchschnittlich 102 Kopien pro Reaktion zeigte einen Abfall der Reaktionseffizienz, und die Reaktionen mit einer anfänglichen Kopienzahl von weniger als 100 führten zu weniger nützlichen Fluoreszenzprofilen. Die Fluoreszenzprofile für die Reaktionen mit 10 und 1 (durchschnittlichen) Kopien steigen in umgekehrter Reihenfolge an, und die negative Kontrolle zeigte eine Amplifikation nach etwa 30 Zyklen. Dies ist eine Folge der Amplifikation von Primerdimeren und anderen unspezifischen Amplifikationsprodukten, die durch „Once-per-cycle"-Fluoreszenz-Monitoring von dsDNA-spezifischen Farbstoffen nicht vom erwünschten Produkt unterschieden werden können.
  • Für jede Probe wurden Schmelzpeaks erfasst (siehe 58), und es stellte sich heraus, dass diese gut mit den Elektrophoreseergebnissen korrelierten (60). Die Reaktionen mit null und einer durchschnittlichen anfänglichen Templatkopie lieferte keine unterscheidbare Elektrophoresebande an der erwarteten Position bei 536 Basenpaaren. Die Reaktionen mit 10 und 100 anfänglichen Templatkopien zeigten schwache Elektrophoresebanden. Dies stimmt mit der Schmelzpeakanalyse überein, bei welcher für die Reaktionen mit null und einer anfänglichen Kopie im Bereich des erwünschten Produkts (90–92 °C) kein Aufschmelzen zu erkennen ist und für 10 und 100 Kopien kleinere Peaks in diesem Temperaturbereich auftreten. Starke Elektrophoresebanden für Reaktionen mit 103-104 anfänglichen Kopien korrelieren gut mit großen Schmelzpeaks im erwarteten Bereich von 90–92 °C.
  • Das Verhältnis von erwünschtem Produkt zur Gesamtmenge an Produkt, das durch Schmelzpeakintegration bestimmt wurde, reichte von 0,28 bei 105 Kopien bis 0,0002 bei null anfänglichen Templatkopien. Jeder Datenpunkt der 57 wurde mit dem entsprechenden Verhältnis multipliziert, um den korrigierten Plot zu erhalten (59). Diese Vorgehensweise erweitert den effektiven dynamischen Bereich der Quantifizierung um den Bereich zwischen 10 und 1 anfänglichen Templatkopien.
  • Wie sich aus den obigen Ausführungen ergibt, sollten Nachweis und Analyse des PCR-Produkts bei einem Thermocycling während einer Amplifikation idealerweise gleichzeitig stattfinden. Wenn eine grundlegende DNA-Eigenschaft, wie beispielsweise Produktgröße, Sequenz oder Schmelzprofil, das Produkt während einer PCR spezifisch identifizieren könnte, wäre keine weitere Analyse notwendig.
  • Ein sequenzspezifischer Nachweis während der Amplifikation kann mit Fluoreszenzsonden erhalten werden. Eine einzelne Sonde kann mit zwei Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)-Farbstoffen markiert sein. Hydrolyse der Sonde aufgrund von Polymerase-Exonucleaseaktivität hebt das Quenchen des Donor-Farbstoffs auf. Wenn die Amplifikation fortschreitet, nimmt die Fluoreszenz des Donor-Farbstoffs kumulativ zu. Alternativ dazu können sich FRET-Farbstoffe auf 2 einfach markierten, nebeneinander hybridisierenden Sonden befinden.
  • Die Helix/Coil-Stabilität kann auch zur spezifischen Identifizierung von PCR-Produkten eingesetzt werden. Beispielsweise trennen Einzelstrangkonformationspolymorphismus, denaturierende Grandientengelelektrophorese und Temperaturgradientengelelektrophorese jeweils Produkte auf Basis der Stabilität unterschiedlicher Konformationen auf. Die Stabilität der Hybridisierung kann mit FRET in Echtzeit überwacht werden. Die Überwachung von Schmelzkurven wurde ebenfalls als eine weitere unterscheidende Dimension bei der Sequenzbestimmung durch Hybridisierungsmethoden verwendet.
  • Das Ethidium-Homodimer und Ethidiumbromid werden zur Überwachung der DNA-Denaturierung verwendet. PCR ist mit vielen dsDNA-spezifischen Farbstoffe, einschließlich Ethidiumbromid und SYBR® Green I, kompatibel. Diese Farbstoffe sind kommerziell erhältlich und kostengünstig; eine Sondensynthese ist nicht erforderlich. Wenn Ethidiumbromid an einer PCR beteiligt ist, erfolgt ein Anstieg in der Fluoreszenz der Proben in den Probenglaskapillarröhrchen. Es liegt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, PCR-Reaktionen in ihrem Ablauf mit Ultraviolett-Beleuchtung und einer CCD-Kamera zu überwachen. Da Produktidentität bewiesen wurde, sollte eine Überwachung mit diesen generischen Farbstoffen einen separaten Analyseschritt nach der Amplifikation überflüssig machen. Absolute Sequenzspezifität ist selten nötig, eine Unterscheidung der Produkte ist jedoch üblicherweise erforderlich.
  • PCR-Produkte können während der Amplifikation unterschieden werden, indem ihre Schmelzkurven, deren Form eine Funktion des GC-Gehalts, der Länge und der Sequenz ist, analysiert werden. Die Temperatur, bei der PCR-Produkte schmelzen, variiert über einen weiten Bereich. Wenn im Stand der Technik bekannte, empirische Formeln verwendet werden, sagt der Einfluss des GC-Gehalts auf die Schmelztemperatur (Tm) von DNA voraus, dass eine Duplex mit 0 % GC 41 °C tiefer schmelzen wurde als eine Duplex mit 100 % GC. Wenn beide den gleichen GC-Gehalt haben, würde ein 40 Basenpaare langes Primerdimer 12 °C unter einem 1000 bp-Produkt schmelzen. Daher umfasst der Tm-Bereich für potentielle PCR-Produkte wenigstens 50 °C. Dieser breite Bereich ermöglicht eine Unterscheidung der meisten PCR-Produkte über ihre Schmelzkurven. Aufgrund ihrer Längenunterschiede schmelzen Primerdimere gewöhnlich bei einer tieferen Temperatur als erwünschte PCR-Produkte. Heterogene Produkte schmelzen über einen breiteren Bereich als reine PCR-Produkte. Lange PCR-Produkte können interne Schmelzdomänen aufweisen, die als Fingerprint zur Identifizierung verwendet werden könnten, wenn auch kleinere PCR-Produkte, einschließlich der hier getesteten (siehe 53) in einem Hauptübergang schmelzen.
  • Anders als Gelelektrophorese kann eine Schmelzkurvenanalyse Produkte mit gleicher Länge aber unterschiedlichem GC/AT-Verhältnis unterscheiden. Daneben hätten zwei Produkte mit gleicher Länge und gleichem GC-Gehalt, die sich jedoch in ihrer GC-Verteilung unterscheiden (Gleichverteilung gegenüber einer GC-Klammer an einem Ende), sehr unterschiedliche Schmelzkurven. Kleine Sequenzunterschiede können beispielsweise sogar bei der Amplifikation heterozygoter DNA zu beobachten sein, bei der Heteroduplizes gebildet werden. Unterschiede in einzelnen Basen in heterozygoter DNA führen im Vergleich zu vollständig komplementärer DNA zu Temperaturverschiebungen von 1–5 °C bei Heteroduplizes.
  • PCR-Produkte, die sich um weniger als 2 °C unterscheiden, können mit Hilfe der vorliegenden Erfindung in Mischungen aufgetrennt werden (siehe 56). Zudem können diese Schmelzkurven in Produktpeaks aufgelöst werden, um Abschätzungen der relativen Mengen an verschiedenen vorhandenen Produkten vornehmen zu können (siehe 61). Die Möglichkeit, relative Mengen verschiedener PCR-Produkte bestimmen zu können, ist sehr nützlich. Mit der Kenntnis der relativen Menge an erwünschtem Produkt im Vergleich mit gesamter dsDNA lassen sich unspezifische Amplifikationen beseitigen, wenn die Reaktionen mit dsDNA-Farbstoffen überwacht werden. Mit Ethidiumbromid oder SYBR® Green I ist eine Quantifizierung über 6–8 Größenordnungen anfänglicher Templatkonzentration möglich. Die Empfindlichkeit wird durch unspezifische Amplifikation mit einer geringen Zahl anfänglicher Templatkopien limitiert (siehe 57). Schmelzkurven (siehe 58) zeigen verschiedene PCR-Produkte, insbesondere bei niedrigen anfänglichen Kopienzahlen, und dies korreliert gut mit den verschiedenen Produkten, die nach einer Gelelektrophorese zu sehen sind (siehe 59). Das Verhältnis von Produkt, das im erwarteten Bereich schmilzt, zu gesamtem Produkt kann verwendet werden, um unspezifische Amplifikation zu korrigieren (siehe 58). Dieses Verhältnis gibt eine obere Grenze für die zu erwartende Menge gegenüber gesamtem Produkt. So wie es möglich ist, Elektrophoreseergebnisse aufgrund von Comigration zweier oder mehrerer Produkte falsch zu interpretieren, ist es möglich, dass ein Teil des Produkts, das im erwarteten Bereich schmilzt, nicht das erwünschte Produkt ist. Wenn jedoch keine dsDNA im Bereich des erwarteten Produkts schmilzt, lässt sich schließen, dass kein erwartetes Produkt vorhanden ist.
  • Die Schmelzkurvenanalyse kann verwendet werden, um den dynamischen Bereich der Quantifizierung auf geringere anfängliche Kopienzahlen zu erweitern. Noch wichtige ist, dass eine Schmelzpeakanalyse ein höhere Sicherheit bietet, dass die Fluoreszenz vom erwünschten Produkt stammt und nicht von einer unspezifischen Amplifikation. Die Nützlichkeit der Fluoreszenzüberwachung einer PCR ist begrenzt, wenn eine Gelelektrophorese notwendig ist, um die Identität des Produkts zu überprüfen. Die Schmelzpeakanalyse ermöglicht eine Identifizierung des Produkts während der PCR ohne anschließende Elektrophorese.
  • Die Möglichkeit, die relativen Mengen von 2 PCR-Produkten aufzulösen, sollte auch bei einer kompetitiven quantitativen PCR nützlich sein. Kompetitive Template mit den gleichen Primern werden erfindungsgemäß mit einer Schmelztemperatur konstruiert, die 2–3 °C von der des natürlichen Amplikons abweicht, indem man das GC/AT-Verhältnis oder die Länge des Produkts variiert. Bekannten Mengen des Kompetitors sollten zu unbekannten Mengen des natürlichen Templats gegeben, die Template amplifiziert, die Schmelzkurven erfasst und die Produktpeaks aufgelöst werden. Unter der Annahme, dass die Produkte mit der gleichen Effizienz amplifiziert werden, entspricht das Verhältnis der Produkte zueinander dem Verhältnis der anfänglichen Template.
  • Die Schmelzkurvenanalyse hat verschiedene Einschränkungen. Die absolute Lage und die Breite der Schmelzkurven werden durch Temperaturübergangsgeschwindigkeiten (siehe 52B) und Farbstoffkonzentration (52A) beeinflusst. Die Zugabe von Interkalatoren wie Ethidiumbromid erhöht die Schmelztemperatur und verbreitert den Schmelzübergang. Obwohl Schmelzkurven oft mit Geschwindigkeiten von etwa 0,5 °C/Minute erhalten werden, um den Gleichgewichtszustand sicherzustellen, können Geschwindigkeiten von 12 °C/Minute (0,2 °C/s) verwendet werden, um Produkte voneinander zu unterscheiden, die sich in ihrer Schmelztemperatur um 2 °C oder weniger unterscheiden (siehe 53). Eine feinere Auflösung ist mit niedrigeren Übergangsgeschwindigkeiten und/oder größerer Homogenität der Probentemperatur möglich.
  • Die Schmelzpeakanalyse der vorliegenden Erfindung bietet ein vollständig in eine PCR integriertes Verfahren zur Produktunterscheidung. Ähnlich der Größenbestimmung bei einer Gelelektrophorese misst die Schmelzpeakanalyse eine grundlegende Eigenschaft der DNA und kann zur Identifizierung amplifizierter Produkte eingesetzt werden. Die Kombination aus Fluoreszenzüberwachung der PCR und Schmelzkurvenanalyse bietet einen vielversprechenden Ansatz für die gleichzeitige Durchführung von Amplifikation, Nachweis und Unterscheidung von PCR-Produkten.
  • Informationen zu einem On-line-DNA-Analysesystem mit schnellem Thermocycling sind in der U.S. Patentanmeldung 08/381,703, eingereicht am 31. Januar 1995 zu finden, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird.
  • Der als Anhang angefügte Programmiercode folgt ab der nächsten Seite.
  • Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001

Claims (11)

  1. Verfahren zur Echtzeitüberwachung einer Amplifikation einer Zielnukleinsäuresequenz in einer biologischen Probe durch Polymerasekettenreaktion, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Amplifikation der Zielsequenz durch Polymerasekettenreaktion in Gegenwart zweier Nukleinsäuresonden, die an nebeneinander liegende Bereiche der Zielsequenz hybridisieren, wobei eine der beiden Sonden mit einem Akzeptorfluorophor markiert ist und die andere Sonde mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzenergietransfer-Paares markiert ist, so dass die Donor- und Akzeptorfluorophore bei Hybridisierung der beiden Sonden mit der Zielsequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden voneinander vorliegen, wobei die Polymerasekettenreaktion die Schritte umfasst: Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz zu der biologischen Probe und Thermocycling der biologischen Probe zwischen mindestens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur; Anregung der biologischen Probe mit Licht einer vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und Nachweis der Emission von der biologischen Probe.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Überwachung der temperaturabhängigen Fluoreszenz von der biologischen Probe.
  3. erfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Überwachung von Fluoreszenzemissionen dieser Probe; und Einstellung der Temperatur- und Zeitparameter gemäß den aus der Überwachung erzeugten Daten zur Optimierung der Produktausbeute oder Spezifität.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Resonanzenergietransfer-Paar Fluorescein als Donor und Cy5 als Akzeptor umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt des Positionierens der biologischen Probe in ein Kapillarröhrchen, welches ein optisch transparentes Material umfasst; und wobei der Nachweisschritt weiterhin den Nachweis der Fluoreszenz durch ein Ende des Kapillarröhrchens umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Anregungsschritt weiterhin die Beleuchtung der Probe durch ein Ende des Kapillarröhrchens umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Anregungsschritt weiterhin die Beleuchtung der Probe entlang des optischen Wegs der nachgewiesenen Fluoreszenz umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 5, 6 oder 7, wobei das Verhältnis der Oberfläche zum Volumen des Kapillarröhrchens größer oder gleich 4 mm 1 ist.
  9. Verfahren zur Analyse einer Ziel-DNA-Sequenz einer biologischen Probe auf DNA-Sequenzpolymorphismen, -heterozygotie oder -mutationen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Zugabe einer wirksamen Menge von zwei Nukleinsäureprimern und einer Nukleinsäuresonde zur biologischen Probe, wobei einer der Primer und die Sonde jeweils beide mit einem Teil eines ein Akzeptorfluorophor und ein Donorfluorophor umfassenden Fluoreszenzenergietransferpaares markiert sind, und wobei die markierte Sonde an eine amplifizierte Kopie der Zielnukleinsäuresequenz innerhalb von 0 bis 25 Nukleotiden des markierten Primers hybridisiert; (b) Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz durch Polymerasekettenreaktion, wobei die Polymerasekettenreaktion die Schritte der Zugabe einer thermostabilen Polymerase und von Primern für die Zielnukleinsäuresequenz und des Thermocyclings der biologischen Probe zwischen mindestens einer Denaturierungstemperatur und einer Elongationstemperatur umfasst; (c) Beleuchten der biologischen Probe mit Licht einer ausgewählten, vom Donorfluorophor absorbierten Wellenlänge und Nachweis der Fluoreszenzemission der Probe.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, weiterhin umfassend den Schritt der Überwachung der temperaturabhängigen Fluoreszenz der Probe.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Resonanzenergietransfer-Paar Fluorescein als Donor und Cy5 als Akzeptor umfasst.
DE69734587T 1996-06-04 1997-06-04 Gerät und verfahren zur fluoreszenzmessung der dna-amplifikation Expired - Lifetime DE69734587T2 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US65899396A 1996-06-04 1996-06-04
US658993 1996-06-04
PCT/US1997/009620 WO1997046707A2 (en) 1996-06-04 1997-06-04 System and method for monitoring for dna amplification by fluorescence

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