JP3598123B2 - 核酸の変性検出装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸の構造解析に係わり、特に核酸の変性の検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはこれらのハイブリッド）の変性条件の相違を１塩基置換による変性条件の差という精度で測定する技術が注目されている。
【０００３】
こうした、相同な２本鎖状の核酸の間における１塩基置換のようなわずかな相違が検出可能な方法として、変性勾配ゲル電気泳動法と称される方法が提案されている（Ｓ． Ｇ． Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｌ． Ｓ． Ｌｅｒｍａｎ ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８０， ｐｐ．１５７９−１５８３， Ｍａｒｃｈ １９８３ ）。この方法では、まず、ポリメラーゼ連鎖反応（以後、ＰＣＲ法と呼ぶ）などの標準的な手法により増幅した、測定対象の２本鎖核酸を調製する。次に、この２本鎖核酸をゲル支持体に投入し、ゲル支持体について空間的に設定した変性条件（温度あるいは水素イオン濃度（ｐＨ）など）勾配下で電気泳動を施す。なお、この測定では、測定対象の２本鎖核酸に加えて基準となる２本鎖核酸を同時に電気泳動を施し、双方の変性条件の相違を観測することも可能である。
【０００４】
図９は、従来の核酸の変性検出方法の説明図である。図９（ａ）は、例えば変性条件として温度を選択した場合、昇温により核酸が変性する様子を示す。一般に、周囲温度を高くすると２本鎖核酸は変性する。この変性温度は２本鎖核酸の塩基組成によって異なる。また、特定の１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全に相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸は、前述の特定１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全ではないがほぼ相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸よりも変性温度が高い。従来の装置は、この現象を利用したものであり、ゲル支持体について空間的に変性条件の勾配を設定してゲル電気泳動を施す。略相補鎖を含むサンプルの場合、図９（ｂ）の測定結果が示すように、変性点が２点存在する場合は、より温度の低い変性条件を示すものが測定対象の２本鎖核酸であり、より温度の高い変性条件を示すものが基準となる２本鎖核酸である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の変性勾配ゲル電気泳動法による核酸の変性検出では、変性条件（温度、あるいはｐＨ）の変化勾配下のゲル中でサンプル核酸を電気泳動させる必要があったので、繁雑であり長い時間（数十分〜数時間；サンプル核酸の分子量に依存する）を要するという問題点があった。また、変性勾配ゲル電気泳動法による核酸変性の検出感度は安定性あるいは勾配量などの変性条件の制御や電気泳動条件の制御の精度に依存する。しかし、これらの条件の制御の精度を現状よりも高めることは困難であり、変性の検出感度および検出精度を向上が望めないという問題点があった。
【０００６】
本発明は、上記のような状況を鑑みてなされたものであり、核酸の変性を迅速かつ精度良く検出できる核酸の変性検出装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸の変性検出装置では、エネルギ供与体が付加された塩基またはヌクレオチドで構成される１本鎖核酸と、この１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有しエネルギ受容体が付加された塩基またはヌクレオチドで構成された１本鎖核酸とを結合して変性条件の測定対象となる２本鎖核酸を調製し、この２本鎖核酸に励起光を照射したときに発生する特定波長の蛍光を検出・測定する。２本鎖状態でエネルギ供与体からエネルギ受容体へのエネルギ移動が起こる場合と、変性して１本鎖状態となりエネルギ移動が起こらない場合とでは、発生する蛍光の波長−強度分布あるいは発生する蛍光の寿命などの蛍光特性が変化する。本発明の核酸の変性検出装置は、変性条件を制御しながら発生蛍光の特性値を計測し、発生蛍光の特性の変化を検出することにより、変性を認識するとともに測定対象の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の核酸の変性検出装置は、（ａ）第１の標識分子が付加された塩基からなる第１の１本鎖核酸と、第１の１本鎖核酸と略相補的な塩基配列を有し、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からなる第２の１本鎖核酸と、が結合した２本鎖核酸が第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とに分離する変性の条件を制御する変性条件制御手段と、（ｂ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の第１の１本鎖核酸および第２の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、（ｄ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測して２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の第２の核酸の変性検出装置は、上記の本発明の第１の核酸の変性検出装置に変性測定対象の２本鎖核酸の調製手段を加えたものであり、（ａ）測定対象である第１の２本鎖核酸の所定部分を、第１の標識分子が付加された塩基からなる、第１の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第３の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第４の１本鎖核酸とを多数生成する第１の核酸増幅手段と、（ｂ）第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準となる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分を、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からなる、第５の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖核酸と第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第８の１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手段と、（ｃ）第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とを抽出後に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第３の２本鎖核酸を生成する核酸生成手段と、（ｄ）第３の２本鎖核酸が第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とに分離する変性の環境を制御する変性条件制御手段と、（ｄ）所定波長の励起光を発生し、変性前の第３の２本鎖核酸と変性後の第３の１本鎖核酸および第８の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｅ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、（ｆ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、第３の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【００１０】
上記の第１および第２の核酸の変性検出装置においては、▲１▼変性条件は温度であり、前記変性条件制御手段は温度調節器である、ことを特徴としてもよいし、▲２▼変性条件は水素イオン濃度であり、前記変性条件制御手段は水素イオン濃度調節器である、ことを特徴としてもよい。また、▲１▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に発生する第１の蛍光と第１の標識分子と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光とを含む波長範囲の光を波長を含めて検出し、処理手段は夫々の変性条件に対する各波長の光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、▲２▼蛍光検出手段は蛍光波形測定器であり、処理手段は蛍光波形測定器が検出した蛍光波形から蛍光寿命を算出する、ことを特徴としてもよい。更に、▲３▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、処理手段は夫々の変性条件に対する第１の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、▲４▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光を選択的に検出し、処理手段は夫々の変性条件に応じた第２の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよい。
【００１１】
【作用】
本発明の第１の核酸の変性検出装置では、あらかじめ調製された、蛍光エネルギ供与体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とエネルギ受容体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とが結合した測定対象の２本鎖核酸を、変性条件（例えば、温度など）の制御が可能な測定点に配置する。変性条件の初期値は変性が起きない値に設定する。この状態で励起光を照射し、発生した蛍光を測定する。測定対象量は、▲１▼エネルギ受容体の特性蛍光の発生量、▲２▼エネルギ供与体の特性蛍光の発生量、あるいは▲３▼エネルギ供与体の蛍光寿命である。以後、処理部の制御のもとで変性条件を変化させながら測定対象量を測定して、各変性条件値における測定対象量を蓄積する。測定後、エネルギ受容体の特性蛍光の発生量の場合には変性後の消光度を、エネルギ供与体の特性蛍光の発生量の場合には増光度を、エネルギ供与体の蛍光寿命の場合には寿命変化に着目して変性点を求める。
【００１２】
本発明の第２の核酸の変性検出装置では、基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する。この装置は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとを、一方はエネルギ供与体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ供与体付加塩基でポリメライズ）し、他方はエネルギ受容体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ受容体付加塩基でポリメライズ）する。これらの増幅された核酸から互いに相補関係にある１本鎖核酸を夫々個別に抽出し、混合して測定対象核酸を調製する。以後、この調製された測定対象核酸に対して、第１の核酸の変性検出装置と同様の測定を行って変性点を求める。
【００１３】
【実施例】
本発明の実施例の説明に先立って、本発明の核酸の変性検出装置の測定原理の概要を説明する。図１は、本発明の装置が核酸の変性検出に利用する現象の説明図である。核酸を構成する塩基に結び付く蛍光分子には、２種の蛍光分子同士の距離が約７ｎｍ以下の場合には蛍光エネルギ移動が発生する組み合わせが知られている（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ ： Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７８， ｖｏｌ．４７， ｐｐ８１９−８４６ ）。また、一方の１本鎖核酸にエネルギ供与体を付加し、他方の１本鎖核酸にエネルギ受容体を付加して２本鎖核酸を構成すれば、図１（ａ）のように、２本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体（Ｄ）とエネルギ受容体（Ａ）との間の距離は約２ｎｍ程度となる対を形成可能であり、変性後のばらばらになった１本鎖核酸間の平均距離は７ｎｍよりも遥かに大きくなる。
【００１４】
単体のエネルギ供与体が蛍光を発生するような励起光を照射すると、▲１▼変性前の２本鎖核酸の状態では、励起光が照射されたエネルギ供与体からエネルギ受容体へエネルギ移動が起こり、エネルギ受容体からの蛍光（波長＝λＡ ；以後、λＡ 蛍光と呼ぶ）が発生し、▲２▼変性後の１本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体とエネルギ受容体との間の距離が大きいので、エネルギ移動が起こらずエネルギ供与体からの蛍光（波長＝λＤ ；以後、λＤ 蛍光と呼ぶ）のみが発生する。図１（ｂ）は、変性前の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の強度−波長分布、および変性後の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の強度−波長分布を示す。図１（ｂ）から明らかなように、変性前から変性後への変化では、λＡ 蛍光の強度は減少し、λＤ 蛍光の強度は増大する。また、図示はしていないが、λＤ 蛍光の蛍光寿命は、変性前と変性後とで変化する。
【００１５】
本発明の核酸の変性検出装置は、上記の変性前と変性後の発生蛍光の特性の相違を測定して核酸の変性を検出する。
【００１６】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１７】
（第１実施例）
図２は、本発明の第１実施例に係る核酸の変性検出装置の構成図であり、エネルギ供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分子を使用し、ローダミンの特性蛍光（λＡ 蛍光；波長＝５８０ｎｍ）の強度（あるいは発生頻度）を測定するものである。この装置は、（ａ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の１本鎖核酸と（以後、総称して測定対象核酸と呼ぶ）に照射する励起光照射部１００と、（ｂ）変性条件である測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出部３００と、（ｄ）変性条件制御部に設定温度の指示を発行する蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理部４００と、を備える。
【００１８】
ここで、励起光照射部１００は、▲１▼励起光の波長を含む波長領域の光を発生する光源１１０と、▲２▼光源１１０の発生した光を集光する集光レンズ１２０と、▲３▼励起光付近の波長域の光のみを透過するフィルタ１３０と、から構成される。
【００１９】
また、変性条件制御部は、▲１▼測定対象核酸の収納器２１０と、▲２▼収納器２１０を囲む熱伝導材２２０と、▲３▼外部からの指示により熱伝導材２２０の温度を指示温度に設定する可変熱源２３０と、から構成される。なお、熱伝導材２２０には励起光が測定対象核酸に照射され、且つ、特定方向へ進行する発生蛍光が出射するように一部が光透過性（含、空洞）に構成される。また、可変熱源２３０にはヒータなどが利用される。
【００２０】
また、蛍光検出部３００は、▲１▼λＡ 蛍光の波長付近の光を選択的に透過するフィルタ３３０と、▲２▼フィルタ３３０を透過した光を集光する集光レンズ３２０と、▲３▼集光レンズ３２０を介した光を受光して電気信号に変換する光検出器３１０と、から構成される。
【００２１】
この装置では、以下のようにして核酸の変性の検出が実施される。
【００２２】
まず、測定対象核酸を調製して収納器２１０に入れる。このとき、処理部４００が変性条件制御部２００に対して指示する設定温度は、収納器２１０内の温度が測定対象核酸が変性を起こさない温度とする。この状態で励起光照射部１００を駆動して、測定対象核酸に励起光を照射する。励起光の照射を受けた測定対象核酸に付与されたフルオレセイン分子は励起状態へ遷移する。
【００２３】
励起状態になったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分子が存在しない場合には、フルオレセイン分子は特性蛍光（λＤ 蛍光；波長＝５２０ｎｍ）を発生して基底状態へ遷移する。また、励起状態になったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分子が存在する場合には、フルオレセイン分子がエネルギ供与体となり、ローダミン分子がエネルギ受容体となって、エネルギ移動が起こる。このエネルギ移動が起こると、フルオレセイン分子はλＤ 蛍光を発生せずに基底状態に遷移し、ローダミン分子は励起状態へ遷移後、λＡ 蛍光を発生して基底状態へ遷移する。
【００２４】
発生したλＡ 蛍光は、フィルタ３３０を透過後、集光レンズ３２０を介して光検出器３１０に入力する。光検出器３１０は、受光した光を検出し電気信号に変換して処理部４００へ出力する。処理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、設定温度とともに蓄積する。
【００２５】
次に、処理部４００が変性条件制御部２００に対して設定温度の変更（前回の測定時よりも高い温度）を指示する。この状態で、励起光照射部１００が駆動されて、測定対象核酸に励起光が照射され、上記と同様にして発生するλＡ 蛍光が測定される。このとき、処理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、新たな設定温度とともに蓄積する。
【００２６】
引き続き、処理部４００の指示により変性条件制御部２００の設定温度を順次昇温しながら、各設定温度で発生するλＡ 蛍光が測定される。各設定温度の状態で光検出器３１０が出力する受光信号は、処理部４００に入力され、設定温度とともに蓄積される。
【００２７】
図３は上記の測定動作で得られた測定結果を示す図である。図３（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、λＡ 蛍光強度（λＡ 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図３（ｂ）は、図３（ａ）を基にして温度を横軸に、λＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を縦軸にプロットしたグラフである。図３（ａ）に示す通り、変性前のλＡ 蛍光強度は変性後のλＡ 蛍光強度よりも大きく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にしてλＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図３（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００２８】
本実施例において、測定量をλＤ 蛍光強度としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透過波長帯をλＤ 蛍光の波長付近のものを使用して、上記と同様の測定を実施する。図４はこの測定動作で得られた測定結果を示す図である。図４（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、λＤ 蛍光強度（λＤ 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図４（ｂ）は、図４（ａ）を基にして温度を横軸に、λＤ 蛍光強度の温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。図４（ａ）に示す通り、変性前のλＤ 蛍光強度は変性後のλＤ 蛍光強度よりも小さく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にしてλＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図４（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００２９】
また、本実施例において、測定量を蛍光寿命としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透過波長帯がλＤ 蛍光の波長付近を含むものを使用して、光検出器３１０としてストリークカメラのような光波形計測器を用いる。そして、上記と同様の測定を実施し、処理部４００は設定温度とともに蛍光寿命値を蓄積する。図５はこの測定動作で得られた測定結果を示す図である。図５（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命を縦軸にプロットしたグラフである。図５（ｂ）は、図５（ａ）を基にして温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命の温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。図５（ａ）に示す通り、変性前の平均蛍光寿命は変性後の平均蛍光寿命よりも大きく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にして蛍光寿命の温度に関する微分値を算出すれば、図５（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００３０】
（第２実施例）
図６は、本発明の第２実施例に係る核酸の変性検出装置の構成図である。上記の第１実施例では測定対象核酸はあらかじめ調製されたものを使用することとしているが、本実施例では基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する装置である。なお、第１実施例と同様に、エネルギ供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分子を使用する。
【００３１】
すなわち、本実施例の装置は、（ａ）基準となる２本鎖核酸と検査対象２本鎖核酸との夫々対応する部分を含むサンプルを調製後に、一方の２本鎖核酸に対してはフルオレセイン分子が付加された塩基またはヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅し、他方の２本鎖核酸に対してはローダミン分子が付加された塩基を用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅部と、（ｂ）核酸増幅部で増幅された２種類の２本鎖核酸に関して、一方の２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸を抽出するとともに、この１本鎖核酸と相補関係にある１本鎖核酸を他方の２本鎖核酸から抽出する抽出部と、（ｃ）抽出部で抽出された２種の１本鎖核酸を入力し、混合して、測定対象核酸を生成するとともにゲル支持体とも混合する混合部と、（ｄ）混合部で生成された測定対象核酸を測定点に導くゲル電気泳動部と、（ｅ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸あるいは変性後の１本鎖核酸に照射する励起光照射部１００と、（ｆ）変性条件である測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、（ｇ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出部３００と、（ｈ）変性条件制御部に設定温度の指示を発行し、装置全体の動作制御を行うとともに、蛍光検出部３００の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理部４５０と、を備える。
【００３２】
ここで、核酸増幅部は、▲１▼基準となる核酸サンプルとフルオレセイン分子が付加された塩基とを収納する収納器５１１と、▲２▼検査対象となる核酸サンプルとローダミン分子が付加された塩基とを収納する収納器５１２と、▲３▼収納器５１１、５１２を囲む熱伝導材５２０と、▲４▼外部からの指示により熱伝導材５２０の温度を指示温度に設定する可変熱源５３０と、から構成される。
【００３３】
また、抽出部は、▲１▼収納器５１１とバルブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリクス材を収納した収納器６１１と、▲２▼収納器５１２とバルブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリクス材を収納した収納器６１２と、▲３▼収納器６１１および収納器６１２にバルブを介して連結され、抽出用溶液である変性剤の機能を有するホルムアミド（８０％）を収納する収納器６２０と、から構成される。
【００３４】
また、混合部は、▲１▼収納器６１１および収納器６１２とバルブを介して連結され、抽出された２種の１本鎖核酸を混合する混合容器７１０と、▲２▼混合容器７１０とバルブを介して連結され、混合容器７１０内の溶液を排出するポンプ７２１と、▲３▼ポンプ７２１が排出した溶液を収納する収納器７２２と、から構成される。
【００３５】
また、ゲル電気泳動部は、▲１▼印加電圧を供給する電源８１０と、▲２▼電源８１０に接続された負側電極８１１と、▲３▼電源８１０に接続された正側電極８１２と、▲４▼混合容器７１０にバルブを介して連結され、ゲル支持体を収納する収納器８２０と、▲５▼混合容器７１０と一方の端がバルブを介して連結された細管状のカラム８３０と、▲６▼カラム８３０の他方の端側に配設された、ゲル支持体を収納する収納器８４０と、から構成される。
【００３６】
励起光照射部１００、変性条件制御部２００、および蛍光検出部３００は第１実施例と同様に構成される。処理部４５０は、第１実施例の処理部４００に加えて、核酸増幅部に対して設定温度を指示する増幅制御機能および装置内のバルブ制御機能を有し、これらに対して制御信号を出力する。
【００３７】
この装置では、まず、測定対象核酸を調製する。図７および図８は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとから測定対象核酸を調製する手順を示した図である。これらの図を参照しながら測定対象核酸の調製動作を説明する。
【００３８】
基準核酸および検査核酸に夫々２種のプライマを投与し、所定の部位を含む基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとを生成する。このとき、基準核酸に投与する一方のプライマにビオチンを付加し、検査核酸に投与する他方のプライマにビオチンを付加しておく（図７（ａ））。
【００３９】
生成された各サンプルに関して、基準核酸サンプルはフルオレセイン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納器５１１内で、検査核酸サンプルはローダミン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納器５１２内で、処理部４５０による可変熱源５３０および熱伝導材５２０を介した温度制御によってＰＣＲ増幅される。この結果、フルオレセインが付加された塩基からなる基準核酸とローダミンが付加された塩基からなる検査核酸とが多量に生成される（図７（ｂ））。
【００４０】
増幅された夫々の核酸は、処理部４５０のバルブ制御によって、収納器６１１あるいは収納器６１２に導かれる。ここで、ビオチンの付加した所定部位は、収納器６１１、６１２にあらかじめ収納されたマトリクス剤に付着したアビジンと結びついて、収納器６１１、６１２の内部に留まるが、他のものは収納器６１１、６１２を通り抜ける（図７（ｃ）および図８（ａ））。この通り抜けた溶液は、混合器７１０に蓄えられた後、処理部４５０の指示により、ポンプ７２１によって収納器７２２へ排出される。
【００４１】
次に、収納器６１１、６１２に収納器６２０からホルムアミド（８０％）が導入され、ビオチンが付加していないプライマ側の１本鎖核酸が溶出される（図８（ｂ））。溶出された１本鎖核酸は、処理部４５０のバルブ制御によって、混合器７１０に導入され、混合後にアニール処理を受けて測定対象核酸となる（図８（ｃ）。このとき、混合器７１０およびカラム８３０にはゲル支持体が導入されている。
【００４２】
電源８１０からの電圧供給により、測定対象核酸は混合器７１０、カラム８３０を移動して、変性条件制御部２００の配設された測定点へ至る。以後、第１実施例と同様にして、特性蛍光が計測されて、変性が検出される。
【００４３】
本発明は、上記の実施例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施例では変性条件として温度を使用したが、ホルムアミドのような変性剤をもちいて、濃度を徐々に変化するようにしてもよい。また、エネルギ供与体とエネルギ受容体とは、フルオレセインとローダミンの組み合わせに限られず、他のエネルギ移動を生じる組み合わせで、特性蛍光波長の異なるものを使用してもよい。また、第２実施例における測定対象核酸の調製方法は一例であり、既存の他の方法を用いてもよい。
【００４４】
【発明の効果】
以上、詳細に説明した通り、本発明の第１の核酸の変性検出装置によれば、準静的に測定点の変性条件を制御しながら核酸に付加した蛍光分子の特性蛍光を測定することにしたので、変性条件の勾配を持たせたゲル支持体中を電気泳動させる必要がないので、従来よりも迅速かつ精度良く変性検出が可能である。
【００４５】
また、本発明の第２の核酸の変性検出装置によれば、基準核酸サンプルと検査対象核酸サンプルとを出発点として、測定対象核酸を調製後、第１の核酸の変性検出装置と同様の蛍光測定を行うので、更に、効率的な一貫測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸の検出装置で利用するエネルギ移動現象の説明図である。
【図２】本発明の核酸の検出装置の第１実施例の構成図である。
【図３】λＡ 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図である。
【図４】λＤ 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図である。
【図５】蛍光寿命の計測による変性点検出の説明図である。
【図６】本発明の核酸の検出装置の第２実施例の構成図である。
【図７】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（前半）の説明図である。
【図８】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（後半）の説明図である。
【図９】従来の核酸の変性検出の方法の説明図である。
【符号の説明】
１００…励起光照射部、１１０…光源、１２０…集光レンズ、１３０…フィルタ、２００…変性条件制御部、２１０…測定対象核酸用収納器、２２０…熱伝導材、２３０…可変熱源、３００…蛍光検出部、３１０…光検出器、３２０…集光レンズ、３３０…フィルタ、４００，４５０…処理部、５１１，５１２…ＰＣＲ増幅用収納器、５２０…熱伝導材、５３０…可変熱源、６１１，６１２…吸着材用収納器、６２０…溶出変性剤用収納器、７１０…混合器、７２０…ポンプ、７３０…排出液用収納器、８１０…電源、８１１，８１２…電極、８２０，８４０…ゲル支持体用収納器、８３０…カラム
【産業上の利用分野】
本発明は、核酸の構造解析に係わり、特に核酸の変性の検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはこれらのハイブリッド）の変性条件の相違を１塩基置換による変性条件の差という精度で測定する技術が注目されている。
【０００３】
こうした、相同な２本鎖状の核酸の間における１塩基置換のようなわずかな相違が検出可能な方法として、変性勾配ゲル電気泳動法と称される方法が提案されている（Ｓ． Ｇ． Ｆｉｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｌ． Ｓ． Ｌｅｒｍａｎ ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， Ｖｏｌ．８０， ｐｐ．１５７９−１５８３， Ｍａｒｃｈ １９８３ ）。この方法では、まず、ポリメラーゼ連鎖反応（以後、ＰＣＲ法と呼ぶ）などの標準的な手法により増幅した、測定対象の２本鎖核酸を調製する。次に、この２本鎖核酸をゲル支持体に投入し、ゲル支持体について空間的に設定した変性条件（温度あるいは水素イオン濃度（ｐＨ）など）勾配下で電気泳動を施す。なお、この測定では、測定対象の２本鎖核酸に加えて基準となる２本鎖核酸を同時に電気泳動を施し、双方の変性条件の相違を観測することも可能である。
【０００４】
図９は、従来の核酸の変性検出方法の説明図である。図９（ａ）は、例えば変性条件として温度を選択した場合、昇温により核酸が変性する様子を示す。一般に、周囲温度を高くすると２本鎖核酸は変性する。この変性温度は２本鎖核酸の塩基組成によって異なる。また、特定の１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全に相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸は、前述の特定１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全ではないがほぼ相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸よりも変性温度が高い。従来の装置は、この現象を利用したものであり、ゲル支持体について空間的に変性条件の勾配を設定してゲル電気泳動を施す。略相補鎖を含むサンプルの場合、図９（ｂ）の測定結果が示すように、変性点が２点存在する場合は、より温度の低い変性条件を示すものが測定対象の２本鎖核酸であり、より温度の高い変性条件を示すものが基準となる２本鎖核酸である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来の変性勾配ゲル電気泳動法による核酸の変性検出では、変性条件（温度、あるいはｐＨ）の変化勾配下のゲル中でサンプル核酸を電気泳動させる必要があったので、繁雑であり長い時間（数十分〜数時間；サンプル核酸の分子量に依存する）を要するという問題点があった。また、変性勾配ゲル電気泳動法による核酸変性の検出感度は安定性あるいは勾配量などの変性条件の制御や電気泳動条件の制御の精度に依存する。しかし、これらの条件の制御の精度を現状よりも高めることは困難であり、変性の検出感度および検出精度を向上が望めないという問題点があった。
【０００６】
本発明は、上記のような状況を鑑みてなされたものであり、核酸の変性を迅速かつ精度良く検出できる核酸の変性検出装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明の核酸の変性検出装置では、エネルギ供与体が付加された塩基またはヌクレオチドで構成される１本鎖核酸と、この１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有しエネルギ受容体が付加された塩基またはヌクレオチドで構成された１本鎖核酸とを結合して変性条件の測定対象となる２本鎖核酸を調製し、この２本鎖核酸に励起光を照射したときに発生する特定波長の蛍光を検出・測定する。２本鎖状態でエネルギ供与体からエネルギ受容体へのエネルギ移動が起こる場合と、変性して１本鎖状態となりエネルギ移動が起こらない場合とでは、発生する蛍光の波長−強度分布あるいは発生する蛍光の寿命などの蛍光特性が変化する。本発明の核酸の変性検出装置は、変性条件を制御しながら発生蛍光の特性値を計測し、発生蛍光の特性の変化を検出することにより、変性を認識するとともに測定対象の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【０００８】
すなわち、本発明の第１の核酸の変性検出装置は、（ａ）第１の標識分子が付加された塩基からなる第１の１本鎖核酸と、第１の１本鎖核酸と略相補的な塩基配列を有し、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からなる第２の１本鎖核酸と、が結合した２本鎖核酸が第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とに分離する変性の条件を制御する変性条件制御手段と、（ｂ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の第１の１本鎖核酸および第２の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、（ｄ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測して２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の第２の核酸の変性検出装置は、上記の本発明の第１の核酸の変性検出装置に変性測定対象の２本鎖核酸の調製手段を加えたものであり、（ａ）測定対象である第１の２本鎖核酸の所定部分を、第１の標識分子が付加された塩基からなる、第１の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第３の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第４の１本鎖核酸とを多数生成する第１の核酸増幅手段と、（ｂ）第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準となる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分を、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からなる、第５の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖核酸と第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第８の１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手段と、（ｃ）第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とを抽出後に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第３の２本鎖核酸を生成する核酸生成手段と、（ｄ）第３の２本鎖核酸が第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とに分離する変性の環境を制御する変性条件制御手段と、（ｄ）所定波長の励起光を発生し、変性前の第３の２本鎖核酸と変性後の第３の１本鎖核酸および第８の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｅ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、（ｆ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、第３の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【００１０】
上記の第１および第２の核酸の変性検出装置においては、▲１▼変性条件は温度であり、前記変性条件制御手段は温度調節器である、ことを特徴としてもよいし、▲２▼変性条件は水素イオン濃度であり、前記変性条件制御手段は水素イオン濃度調節器である、ことを特徴としてもよい。また、▲１▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に発生する第１の蛍光と第１の標識分子と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光とを含む波長範囲の光を波長を含めて検出し、処理手段は夫々の変性条件に対する各波長の光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、▲２▼蛍光検出手段は蛍光波形測定器であり、処理手段は蛍光波形測定器が検出した蛍光波形から蛍光寿命を算出する、ことを特徴としてもよい。更に、▲３▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、処理手段は夫々の変性条件に対する第１の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、▲４▼蛍光検出手段は第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光を選択的に検出し、処理手段は夫々の変性条件に応じた第２の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴としてもよい。
【００１１】
【作用】
本発明の第１の核酸の変性検出装置では、あらかじめ調製された、蛍光エネルギ供与体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とエネルギ受容体分子が付加された塩基からなる１本鎖核酸とが結合した測定対象の２本鎖核酸を、変性条件（例えば、温度など）の制御が可能な測定点に配置する。変性条件の初期値は変性が起きない値に設定する。この状態で励起光を照射し、発生した蛍光を測定する。測定対象量は、▲１▼エネルギ受容体の特性蛍光の発生量、▲２▼エネルギ供与体の特性蛍光の発生量、あるいは▲３▼エネルギ供与体の蛍光寿命である。以後、処理部の制御のもとで変性条件を変化させながら測定対象量を測定して、各変性条件値における測定対象量を蓄積する。測定後、エネルギ受容体の特性蛍光の発生量の場合には変性後の消光度を、エネルギ供与体の特性蛍光の発生量の場合には増光度を、エネルギ供与体の蛍光寿命の場合には寿命変化に着目して変性点を求める。
【００１２】
本発明の第２の核酸の変性検出装置では、基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する。この装置は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとを、一方はエネルギ供与体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ供与体付加塩基でポリメライズ）し、他方はエネルギ受容体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ受容体付加塩基でポリメライズ）する。これらの増幅された核酸から互いに相補関係にある１本鎖核酸を夫々個別に抽出し、混合して測定対象核酸を調製する。以後、この調製された測定対象核酸に対して、第１の核酸の変性検出装置と同様の測定を行って変性点を求める。
【００１３】
【実施例】
本発明の実施例の説明に先立って、本発明の核酸の変性検出装置の測定原理の概要を説明する。図１は、本発明の装置が核酸の変性検出に利用する現象の説明図である。核酸を構成する塩基に結び付く蛍光分子には、２種の蛍光分子同士の距離が約７ｎｍ以下の場合には蛍光エネルギ移動が発生する組み合わせが知られている（Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ ： Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７８， ｖｏｌ．４７， ｐｐ８１９−８４６ ）。また、一方の１本鎖核酸にエネルギ供与体を付加し、他方の１本鎖核酸にエネルギ受容体を付加して２本鎖核酸を構成すれば、図１（ａ）のように、２本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体（Ｄ）とエネルギ受容体（Ａ）との間の距離は約２ｎｍ程度となる対を形成可能であり、変性後のばらばらになった１本鎖核酸間の平均距離は７ｎｍよりも遥かに大きくなる。
【００１４】
単体のエネルギ供与体が蛍光を発生するような励起光を照射すると、▲１▼変性前の２本鎖核酸の状態では、励起光が照射されたエネルギ供与体からエネルギ受容体へエネルギ移動が起こり、エネルギ受容体からの蛍光（波長＝λＡ ；以後、λＡ 蛍光と呼ぶ）が発生し、▲２▼変性後の１本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体とエネルギ受容体との間の距離が大きいので、エネルギ移動が起こらずエネルギ供与体からの蛍光（波長＝λＤ ；以後、λＤ 蛍光と呼ぶ）のみが発生する。図１（ｂ）は、変性前の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の強度−波長分布、および変性後の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の強度−波長分布を示す。図１（ｂ）から明らかなように、変性前から変性後への変化では、λＡ 蛍光の強度は減少し、λＤ 蛍光の強度は増大する。また、図示はしていないが、λＤ 蛍光の蛍光寿命は、変性前と変性後とで変化する。
【００１５】
本発明の核酸の変性検出装置は、上記の変性前と変性後の発生蛍光の特性の相違を測定して核酸の変性を検出する。
【００１６】
以下、添付図面を参照して、本発明の実施例を説明する。なお、図面の説明において同一要素には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１７】
（第１実施例）
図２は、本発明の第１実施例に係る核酸の変性検出装置の構成図であり、エネルギ供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分子を使用し、ローダミンの特性蛍光（λＡ 蛍光；波長＝５８０ｎｍ）の強度（あるいは発生頻度）を測定するものである。この装置は、（ａ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の１本鎖核酸と（以後、総称して測定対象核酸と呼ぶ）に照射する励起光照射部１００と、（ｂ）変性条件である測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出部３００と、（ｄ）変性条件制御部に設定温度の指示を発行する蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理部４００と、を備える。
【００１８】
ここで、励起光照射部１００は、▲１▼励起光の波長を含む波長領域の光を発生する光源１１０と、▲２▼光源１１０の発生した光を集光する集光レンズ１２０と、▲３▼励起光付近の波長域の光のみを透過するフィルタ１３０と、から構成される。
【００１９】
また、変性条件制御部は、▲１▼測定対象核酸の収納器２１０と、▲２▼収納器２１０を囲む熱伝導材２２０と、▲３▼外部からの指示により熱伝導材２２０の温度を指示温度に設定する可変熱源２３０と、から構成される。なお、熱伝導材２２０には励起光が測定対象核酸に照射され、且つ、特定方向へ進行する発生蛍光が出射するように一部が光透過性（含、空洞）に構成される。また、可変熱源２３０にはヒータなどが利用される。
【００２０】
また、蛍光検出部３００は、▲１▼λＡ 蛍光の波長付近の光を選択的に透過するフィルタ３３０と、▲２▼フィルタ３３０を透過した光を集光する集光レンズ３２０と、▲３▼集光レンズ３２０を介した光を受光して電気信号に変換する光検出器３１０と、から構成される。
【００２１】
この装置では、以下のようにして核酸の変性の検出が実施される。
【００２２】
まず、測定対象核酸を調製して収納器２１０に入れる。このとき、処理部４００が変性条件制御部２００に対して指示する設定温度は、収納器２１０内の温度が測定対象核酸が変性を起こさない温度とする。この状態で励起光照射部１００を駆動して、測定対象核酸に励起光を照射する。励起光の照射を受けた測定対象核酸に付与されたフルオレセイン分子は励起状態へ遷移する。
【００２３】
励起状態になったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分子が存在しない場合には、フルオレセイン分子は特性蛍光（λＤ 蛍光；波長＝５２０ｎｍ）を発生して基底状態へ遷移する。また、励起状態になったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分子が存在する場合には、フルオレセイン分子がエネルギ供与体となり、ローダミン分子がエネルギ受容体となって、エネルギ移動が起こる。このエネルギ移動が起こると、フルオレセイン分子はλＤ 蛍光を発生せずに基底状態に遷移し、ローダミン分子は励起状態へ遷移後、λＡ 蛍光を発生して基底状態へ遷移する。
【００２４】
発生したλＡ 蛍光は、フィルタ３３０を透過後、集光レンズ３２０を介して光検出器３１０に入力する。光検出器３１０は、受光した光を検出し電気信号に変換して処理部４００へ出力する。処理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、設定温度とともに蓄積する。
【００２５】
次に、処理部４００が変性条件制御部２００に対して設定温度の変更（前回の測定時よりも高い温度）を指示する。この状態で、励起光照射部１００が駆動されて、測定対象核酸に励起光が照射され、上記と同様にして発生するλＡ 蛍光が測定される。このとき、処理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、新たな設定温度とともに蓄積する。
【００２６】
引き続き、処理部４００の指示により変性条件制御部２００の設定温度を順次昇温しながら、各設定温度で発生するλＡ 蛍光が測定される。各設定温度の状態で光検出器３１０が出力する受光信号は、処理部４００に入力され、設定温度とともに蓄積される。
【００２７】
図３は上記の測定動作で得られた測定結果を示す図である。図３（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、λＡ 蛍光強度（λＡ 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図３（ｂ）は、図３（ａ）を基にして温度を横軸に、λＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を縦軸にプロットしたグラフである。図３（ａ）に示す通り、変性前のλＡ 蛍光強度は変性後のλＡ 蛍光強度よりも大きく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にしてλＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図３（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００２８】
本実施例において、測定量をλＤ 蛍光強度としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透過波長帯をλＤ 蛍光の波長付近のものを使用して、上記と同様の測定を実施する。図４はこの測定動作で得られた測定結果を示す図である。図４（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、λＤ 蛍光強度（λＤ 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図４（ｂ）は、図４（ａ）を基にして温度を横軸に、λＤ 蛍光強度の温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。図４（ａ）に示す通り、変性前のλＤ 蛍光強度は変性後のλＤ 蛍光強度よりも小さく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にしてλＡ 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図４（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００２９】
また、本実施例において、測定量を蛍光寿命としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透過波長帯がλＤ 蛍光の波長付近を含むものを使用して、光検出器３１０としてストリークカメラのような光波形計測器を用いる。そして、上記と同様の測定を実施し、処理部４００は設定温度とともに蛍光寿命値を蓄積する。図５はこの測定動作で得られた測定結果を示す図である。図５（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容を、温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命を縦軸にプロットしたグラフである。図５（ｂ）は、図５（ａ）を基にして温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命の温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。図５（ａ）に示す通り、変性前の平均蛍光寿命は変性後の平均蛍光寿命よりも大きく、かつ特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にして蛍光寿命の温度に関する微分値を算出すれば、図５（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００３０】
（第２実施例）
図６は、本発明の第２実施例に係る核酸の変性検出装置の構成図である。上記の第１実施例では測定対象核酸はあらかじめ調製されたものを使用することとしているが、本実施例では基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する装置である。なお、第１実施例と同様に、エネルギ供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分子を使用する。
【００３１】
すなわち、本実施例の装置は、（ａ）基準となる２本鎖核酸と検査対象２本鎖核酸との夫々対応する部分を含むサンプルを調製後に、一方の２本鎖核酸に対してはフルオレセイン分子が付加された塩基またはヌクレオチドを用いてＰＣＲ増幅し、他方の２本鎖核酸に対してはローダミン分子が付加された塩基を用いてＰＣＲ増幅する核酸増幅部と、（ｂ）核酸増幅部で増幅された２種類の２本鎖核酸に関して、一方の２本鎖核酸を形成している１本鎖核酸を抽出するとともに、この１本鎖核酸と相補関係にある１本鎖核酸を他方の２本鎖核酸から抽出する抽出部と、（ｃ）抽出部で抽出された２種の１本鎖核酸を入力し、混合して、測定対象核酸を生成するとともにゲル支持体とも混合する混合部と、（ｄ）混合部で生成された測定対象核酸を測定点に導くゲル電気泳動部と、（ｅ）所定波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸あるいは変性後の１本鎖核酸に照射する励起光照射部１００と、（ｆ）変性条件である測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、（ｇ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出部３００と、（ｈ）変性条件制御部に設定温度の指示を発行し、装置全体の動作制御を行うとともに、蛍光検出部３００の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理部４５０と、を備える。
【００３２】
ここで、核酸増幅部は、▲１▼基準となる核酸サンプルとフルオレセイン分子が付加された塩基とを収納する収納器５１１と、▲２▼検査対象となる核酸サンプルとローダミン分子が付加された塩基とを収納する収納器５１２と、▲３▼収納器５１１、５１２を囲む熱伝導材５２０と、▲４▼外部からの指示により熱伝導材５２０の温度を指示温度に設定する可変熱源５３０と、から構成される。
【００３３】
また、抽出部は、▲１▼収納器５１１とバルブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリクス材を収納した収納器６１１と、▲２▼収納器５１２とバルブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリクス材を収納した収納器６１２と、▲３▼収納器６１１および収納器６１２にバルブを介して連結され、抽出用溶液である変性剤の機能を有するホルムアミド（８０％）を収納する収納器６２０と、から構成される。
【００３４】
また、混合部は、▲１▼収納器６１１および収納器６１２とバルブを介して連結され、抽出された２種の１本鎖核酸を混合する混合容器７１０と、▲２▼混合容器７１０とバルブを介して連結され、混合容器７１０内の溶液を排出するポンプ７２１と、▲３▼ポンプ７２１が排出した溶液を収納する収納器７２２と、から構成される。
【００３５】
また、ゲル電気泳動部は、▲１▼印加電圧を供給する電源８１０と、▲２▼電源８１０に接続された負側電極８１１と、▲３▼電源８１０に接続された正側電極８１２と、▲４▼混合容器７１０にバルブを介して連結され、ゲル支持体を収納する収納器８２０と、▲５▼混合容器７１０と一方の端がバルブを介して連結された細管状のカラム８３０と、▲６▼カラム８３０の他方の端側に配設された、ゲル支持体を収納する収納器８４０と、から構成される。
【００３６】
励起光照射部１００、変性条件制御部２００、および蛍光検出部３００は第１実施例と同様に構成される。処理部４５０は、第１実施例の処理部４００に加えて、核酸増幅部に対して設定温度を指示する増幅制御機能および装置内のバルブ制御機能を有し、これらに対して制御信号を出力する。
【００３７】
この装置では、まず、測定対象核酸を調製する。図７および図８は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとから測定対象核酸を調製する手順を示した図である。これらの図を参照しながら測定対象核酸の調製動作を説明する。
【００３８】
基準核酸および検査核酸に夫々２種のプライマを投与し、所定の部位を含む基準核酸サンプルと検査核酸サンプルとを生成する。このとき、基準核酸に投与する一方のプライマにビオチンを付加し、検査核酸に投与する他方のプライマにビオチンを付加しておく（図７（ａ））。
【００３９】
生成された各サンプルに関して、基準核酸サンプルはフルオレセイン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納器５１１内で、検査核酸サンプルはローダミン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納器５１２内で、処理部４５０による可変熱源５３０および熱伝導材５２０を介した温度制御によってＰＣＲ増幅される。この結果、フルオレセインが付加された塩基からなる基準核酸とローダミンが付加された塩基からなる検査核酸とが多量に生成される（図７（ｂ））。
【００４０】
増幅された夫々の核酸は、処理部４５０のバルブ制御によって、収納器６１１あるいは収納器６１２に導かれる。ここで、ビオチンの付加した所定部位は、収納器６１１、６１２にあらかじめ収納されたマトリクス剤に付着したアビジンと結びついて、収納器６１１、６１２の内部に留まるが、他のものは収納器６１１、６１２を通り抜ける（図７（ｃ）および図８（ａ））。この通り抜けた溶液は、混合器７１０に蓄えられた後、処理部４５０の指示により、ポンプ７２１によって収納器７２２へ排出される。
【００４１】
次に、収納器６１１、６１２に収納器６２０からホルムアミド（８０％）が導入され、ビオチンが付加していないプライマ側の１本鎖核酸が溶出される（図８（ｂ））。溶出された１本鎖核酸は、処理部４５０のバルブ制御によって、混合器７１０に導入され、混合後にアニール処理を受けて測定対象核酸となる（図８（ｃ）。このとき、混合器７１０およびカラム８３０にはゲル支持体が導入されている。
【００４２】
電源８１０からの電圧供給により、測定対象核酸は混合器７１０、カラム８３０を移動して、変性条件制御部２００の配設された測定点へ至る。以後、第１実施例と同様にして、特性蛍光が計測されて、変性が検出される。
【００４３】
本発明は、上記の実施例に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施例では変性条件として温度を使用したが、ホルムアミドのような変性剤をもちいて、濃度を徐々に変化するようにしてもよい。また、エネルギ供与体とエネルギ受容体とは、フルオレセインとローダミンの組み合わせに限られず、他のエネルギ移動を生じる組み合わせで、特性蛍光波長の異なるものを使用してもよい。また、第２実施例における測定対象核酸の調製方法は一例であり、既存の他の方法を用いてもよい。
【００４４】
【発明の効果】
以上、詳細に説明した通り、本発明の第１の核酸の変性検出装置によれば、準静的に測定点の変性条件を制御しながら核酸に付加した蛍光分子の特性蛍光を測定することにしたので、変性条件の勾配を持たせたゲル支持体中を電気泳動させる必要がないので、従来よりも迅速かつ精度良く変性検出が可能である。
【００４５】
また、本発明の第２の核酸の変性検出装置によれば、基準核酸サンプルと検査対象核酸サンプルとを出発点として、測定対象核酸を調製後、第１の核酸の変性検出装置と同様の蛍光測定を行うので、更に、効率的な一貫測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の核酸の検出装置で利用するエネルギ移動現象の説明図である。
【図２】本発明の核酸の検出装置の第１実施例の構成図である。
【図３】λＡ 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図である。
【図４】λＤ 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図である。
【図５】蛍光寿命の計測による変性点検出の説明図である。
【図６】本発明の核酸の検出装置の第２実施例の構成図である。
【図７】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（前半）の説明図である。
【図８】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（後半）の説明図である。
【図９】従来の核酸の変性検出の方法の説明図である。
【符号の説明】
１００…励起光照射部、１１０…光源、１２０…集光レンズ、１３０…フィルタ、２００…変性条件制御部、２１０…測定対象核酸用収納器、２２０…熱伝導材、２３０…可変熱源、３００…蛍光検出部、３１０…光検出器、３２０…集光レンズ、３３０…フィルタ、４００，４５０…処理部、５１１，５１２…ＰＣＲ増幅用収納器、５２０…熱伝導材、５３０…可変熱源、６１１，６１２…吸着材用収納器、６２０…溶出変性剤用収納器、７１０…混合器、７２０…ポンプ、７３０…排出液用収納器、８１０…電源、８１１，８１２…電極、８２０，８４０…ゲル支持体用収納器、８３０…カラム
Claims (7)
- 第１の標識分子が付加された塩基からなる第１の１本鎖核酸と、前記第１の１本鎖核酸と相補的あるいは略相補的な塩基配列を有し、所定距離内の前記第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からなる第２の１本鎖核酸と、が結合した前記２本鎖核酸が前記第１の１本鎖核酸と前記第２の１本鎖核酸とに分離する変性の条件を制御する変性条件制御手段と、
所定波長の励起光を発生し、変性前の前記２本鎖核酸と変性後の前記第１の１本鎖核酸および前記第２の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、
前記励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、
を備え、前記変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、前記２本鎖核酸の変性条件を計測することを特徴とする核酸の変性検出装置。 - 検査対象である第１の２本鎖核酸の所定部分を第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸に分離し、第１の標識分子が付加された塩基またはヌクレオチドからなる、前記第１の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第３の１本鎖核酸と前記第２の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第４の１本鎖核酸とを多数生成する第１の核酸増幅手段と、
前記第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準となる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分を、前記第１の１本鎖核酸と同一あるいは略同一の第５の１本鎖核酸と前記第２の１本鎖核酸と同一あるいは略同一の第６の１本鎖核酸に分離し、所定距離内の前記第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基またはヌクレオチドからなる、前記第５の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖核酸と前記第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第８の１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手段と、
前記第３の１本鎖核酸と前記第８の１本鎖核酸とを抽出後に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第３の２本鎖核酸を生成する核酸調製手段と、
前記第３の２本鎖核酸が前記第３の１本鎖核酸と前記第８の１本鎖核酸とに分離する変性の環境を制御する変性条件制御手段と、
所定波長の励起光を発生し、変性前の前記第３の２本鎖核酸と変性後の前記第３の１本鎖核酸および前記第８の１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、
前記励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、
を備え、前記変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、前記第３の２本鎖核酸の変性条件を計測することを特徴とする核酸の変性検出装置。 - 前記変性条件は温度であり、前記変性条件制御手段は温度調節器である、ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
- 前記変性条件は水素イオン濃度であり、前記変性条件制御手段は水素イオン濃度調節器である、ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
- 前記蛍光検出手段は前記第１の標識分子と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、前記処理手段は夫々の変性条件に対する前記第１の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
- 前記蛍光検出手段は前記第１の標識分子と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光を選択的に検出し、前記処理手段は夫々の変性条件に応じた前記第２の蛍光の発生量を算出する、ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
- 前記蛍光検出手段は蛍光波形測定器であり、前記処理手段は前記蛍光波形測定器が検出した蛍光波形から蛍光寿命を算出する、ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
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