KR100764559B1 - Ｅｐｓｐｓ 유전자 검색에 활용할 수 있는 ｆｒｅｔ형광검출용 프로브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 유전자의 검출을 위한 프라이머 쌍에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유전자 변형(genetically modified, GM) 식물의 EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 유전자의 인접한 염기서열에 상보적인 프라이머 (primer) 쌍에 에너지 공여체 (donor) 및 에너지 수여체(acceptor)로 작용하는 형광체가 각각 결합된 EPSPS 유전자 검출 및 분석용 프로브 쌍에 관한 것이다.

본 발명에 의한 프로브 쌍을 세포 내에 도입하고 혼성화 시킨 후 레이저 형광 계측기술을 이용하여 세포단위로 생체세포를 분석함으로써 유전자 변형 식물의 EPSPS 유전자를 보유하는 세포를 검출하고 더 나아가 함유율을 절대 정량할 수 있다.

FRET, EPSPS, 유전자 검색, 유전자 변형, 대두

Description

ＥＰＳＰＳ 유전자 검색에 활용할 수 있는 ＦＲＥＴ 형광검출용 프로브{FRET probes for fluorescent detection of the EPSPS gene}

도 1은 FRET법을 이용하여 세포의 혼합물에서 특정 유전자 보유세포를 구분하는 과정을 보여주는 개념도.

도 2는 수여체와 수여체의 형광을 quenching하는 발색체를 양 말단에 각각 표지한 수여체 프로브를 이용하여 특정 유전자를 검출하는 과정을 보여주는 개념도.

도 3은 FRET법을 이용하여 세포 내 EPSPS 유전자를 검출함에 있어 여러 쌍의 프로브를 사용하여 신호를 증폭시키는 원리를 보여주는 개념도.

도 4는 플라스미드 pCRB-EPSPS1.8의 개열지도.

도 5는 본 발명에 의한 S1/S2 프로브 쌍을 이용한 EPSPS 유전자의 검출을 보여주는 스펙트럼.

도 6은 본 발명에 의한 S3/S4 프로브 쌍을 이용한 EPSPS 유전자의 검출을 보여주는 스펙트럼.

도 7은 본 발명에 의한 S5/S6 프로브 쌍을 이용한 EPSPS 유전자의 검출을 보여주는 스펙트럼.

도 8은 본 발명에 의한 S7/S8 프로브 쌍을 이용한 EPSPS 유전자의 검출을 보여주는 스펙트럼.

도 9는 본 발명에 의한 S7/S8 프로브 쌍을 이용하여 (a) 일반 대두 세포와 (b) 외래 유전자인 EPSPS가 존재하는 유전자 변형 대두세포가 구분되는 것을 보여주는 스펙트럼.

도 10은 다수의 세포를 대상으로 한 세포 내 EPSPS 유전자 검출을 보여주는 스펙트럼과 FRET 형광비율 도시 예.

본 발명은 특정 유전자의 검출 및 분석 시약에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 레이저 형광 계측기술을 이용하여 세포단위로 생체세포를 분석함으로써 유전자 변형 대두의 EPSPS 유전자를 보유하는 세포를 검출하고 더 나아가 함유율을 절대 정량할 수 있는 형광 검출 시약에 관한 것이다.

최근 첨단과학 분야의 기술개발이 BT 산업 분야에 집중됨에 따라 생물학 분석기술의 중요성이 날로 강조되고 있으나, 생체시료를 대상으로 하는 측정 및 분석과정에는 생명현상의 특성상 다양한 생체분자들이 동시에 관여하기 때문에 정확한 측정기술을 개발하기가 매우 어렵다. 이러한 이유로 인해 생물학 분야의 표준측정 기술은 개발과정에서 많은 난제들을 포함하고 국제적으로도 아직 확립되어있지 않 다. 기존의 생물학 측정 방식의 골격을 그대로 유지하면서 일부 실험방법의 개선이나 고가의 연구장비 도입을 통해 생물학 분야의 표준측정기술을 개발하려는 시도는 한계가 있기 때문에 신뢰성 있는 생체분석 기술 확립을 위해서는 새로운 측정원리에 바탕을 둔 기술을 개발할 필요가 있다.

기존의 특정 유전자나 단백질의 존재여부를 확인하기 위한 분석법으로는 각각 PCR(Polymerase Chain Reaction)과 ELISA(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay) 등이 있으나, 이들은 세포를 대상으로 하는 것이 아니라 시료를 대상으로 하는 것이다. 세포를 대상으로 한 세포단위에서의 특정 유전자/단백질의 존재유무 확인 기술은 기존의 분석법보다 향상된 분석 정확도를 제공할 수 있다.

한편, 최근들어 유전자 조작 식품에 대한 관심이 고조되면서 유전자 조작 여부를 간편하고 신뢰성 있게 분석할 수 있는 방법이 요구되어지고 있다.

본 발명은 레이저 형광 계측 기술을 이용하여 세포단위로 생체세포를 분석함으로써 GM soybean의 EPSPS 유전자를 보유하는 세포를 검출하고, 더 나아가 함유율을 절대 정량할 수 있는 형광 검출 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.

전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍은

(A) EPSPS 유전자와 혼성화되었을 때 인접하게 되는 3′-말단과 5′-말단에 각각 에너지 공여체 (이하, '공여체'라 한다) 및 에너지 수여체(이하, '수여체'라 한다)가 표지되어 있고, (B) EPSPS 유전자와 혼성화되었을 때 상기 에너지 공여체 및 에너지 수여체가 FRET이 가능한 거리에 위치되는 한 쌍의 프라이머로 이루어 진 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로 상기 프라이머 쌍은 하기 표 1에 기재된 서열을 갖는 것을 특징으로 하며, DNA나 RNA 또는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 올리고머일 수 있다.

각 프라이머 쌍에 표지된 형광체로서 공여체로는 FAM(5-carboxy fluorescein)을, 수여체로는 TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 공명에 의해 형광 에너지가 전달될 수 있는 것이라면 어떠한 공여체와 수여체의 쌍을 이용하여도 무방하다.

본 발명의 실시예에서는 PNA와 Invitrogen사에서 판매하는 형광체 표지를 위한 활성 화합물(active compounds)을 결합시킴으로서 PNA 올리고머에 형광체를 도입하여 표지하였다. 구체적으로 활성 화합물로는 FAM의 도입을 위해서는 5-FAM, SE(5-carboxyfluorescein, succinimidyl ester)를, TAMRA를 도입하기 위하여는 TAMRA, SE(5-carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester)를 사용하였다.

도 1은 본 발명에 의한 프로브 쌍의 FRET 형광 측정을 이용하여 EPSPS 유전자를 보유한 세포를 검출할 수 있음을 개념적으로 설명한 그림이다. FRET 형광 측정법은 공여체와 수여체로 일컬어지는 두 개의 형광체가 공명을 일으켜 형광 에너지가 전달될 때 에너지 전달 효율이 공여체/수여체 거리의 6제곱에 반비례한다는 사실을 밝혀낸 Forster의 이론에 바탕을 둔 측정기술이다. FRET 형광이 나타나려면 공여체와 수여체에 해당하는 두 형광체가 매우 짧은 거리 내(3~4 nm 이내)에 위치해야 한다. 본 발명의 프로브 쌍은 수용액 또는 세포 내에서 EPSPS 유전자와 결합하지 않은 상태에서는 공여체와 수여체의 평균거리가 멀어서 FRET 형광을 나타내지 않는다. 그러나, 프로브쌍이 EPSPS 유전자와 결합하는 경우, 공여체와 수여체간의 거리가 짧은 거리 내에 고정되므로 공여체를 여기시키는 경우 공여체에서 수여체로 형광 에너지 전이가 유발되어 수여체의 특이적인 형광을 나타내게 된다.

상기 프로브 쌍에서 수여체가 표지된 프로브는 수여체가 표지된 반대쪽 말단에 수여체의 형광을 quenching할 수 있는 발색체가 표지되어 있는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에서는 수여체로 TAMRA가 5'-말단에 표지된 프로브의 3'-말단에 TAMRA의 형광을 quenching하는 Invitrogen 사의 QSY

7을 공유결합으로 표지하였다. QSY

7을 PNA 프로브의 3'-말단에 도입하기 위해서는 QSY

7 succinimidyl ester를 사용하였다.

PNA는 분자 구조상 소수성 환경을 선호하며, 수용액 내에서는 움츠러드는 형태를 가지는 경향이 있다(H. Kuhn et al. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 1097). 도 2의 (a)에서 보는 바와 같이 수여체 프로브가 수용액 상에서 자유롭게 떠다니거나 EPSPS 유전자가 아닌 다른 생체분자에 붙어있을 때에는 프로브의 양쪽 말단 간의 거리가 가까워진 구조를 선호한다. 따라서 양 끝에 표지되어있는 TAMRA와 QSY

7의 거리가 가까워서 TAMRA로부터 발산되는 형광이 대부분 QSY

7에 quenching된다. 한편 수여체 프로브가 표적유전자와 결합을 하면 도 2의 (b)처럼 곧게 펴진 모양을 가지게 되고 TAMRA와 QSY

7의 거리가 멀어지게 되어 형광이 효과적으로 발산되게 된다. 따라서 상기 구조의 프로브는 표적유전자와 결합하지 않은 상태에서는 수여체로부터 발생하는 형광이 quenching되는 원리로 인해 표적유전자와의 결합여부에 따라 수여체로부터 발생하는 형광이 QSY

7을 표지하지 않은 수여체 프로브에 비해 훨씬 크게 변화하게 된다. 이와 같이 수여체가 표지된 반대쪽 말단에 수여체의 형광을 quenching할 수 있는 발색체가 표지된 프로브를 사용하여 표적유전자를 검출하면, 세포 내 표적유전자 존재유무 판별에 있어 높은 대비도를 얻을 수 있으므로 표적유전자의 검출효율을 높일 수 있다.

프로브 쌍은 한 쌍보다는 표적유전자의 총 길이에 걸쳐서 여러 위치에 결합할 수 있도록 여러 쌍의 프로브를 사용하는 것이 표적유전자의 검출에 유리하다(도 3). 특히 표적유전자가 염색체 또는 DNA와 같이 단일 또는 소수인 경우에는 다수 쌍의 프로브를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 세포를 대상으로 하는 형광분석에서는 세포 내에 존재하는 자연 형광 물질들이 background를 크게 높일 수 있다. 단일 또는 소수의 유전자 가닥에 결합하는 한 쌍의 프로브는 세포 내의 다른 자연형광물질들에 비해 상대적으로 약한 신호를 발생할 수 있으므로 세포의 자연 형광에 묻힐 수 있다(도 3의 a). 이러한 문제를 해결하기 위하여 표적유전자의 여러 위치에 동시에 결합하는 여러 쌍의 프로브를 세포 내로 도입시키면 여러 곳에서 FRET 형광이 발생하고 결과적으로 표적유전자의 존재에 따른 검출신호의 세기가 증대되어 자연 형광과의 구분이 용이해질 수 있다(도 3의 b).

유전자 변형 식물에서의 EPSPS 유전자 검출은 (A) 본 발명에 의한 프로브 쌍을 세포 내로 도입하고 표적유전자의 해당 염기서열과 프로브 쌍의 프라이머를 혼성화하는 단계; (B) 레이저유발 형광 측정법으로 EPSPS 유전자가 존재하는지를 확인하는 단계로 이루어진다. 상기 방법에 의한 세포내 EPSPS 유전자를 검출하는 과정을 도 1에 나타내었다.

이하 본 발명에 의한 EPSPS 유전자 검출 과정을 각 단계별로 상세히 설명한다.

(A) 프로브 쌍의 세포 내 도입 및 혼성화 단계

EPSPS 유전자의 분석을 위하여 본 발명에 의한 프로브 쌍을 세포 내로 도입하고 표적유전자와 혼성화되도록 하는 단계이다. 전술한 바와 같이 프로브 쌍은 한 쌍을 세포 내로 도입할 수도 있으나, 표적유전자의 검출 효능을 높이기 위하여 두 개 이상의 프로브 쌍을 세포 내로 도입하여 분석하는 것이 더욱 바람직하다.

EPSPS 유전자 분석 시에 대두세포 내에는 외부로부터 유입되는 빛에 의해 활성화 될 수 있는 형광체(클로로필 등)가 존재할 수 있기 때문에 빛을 차단한 상태에서 1주일 이상 배양한 세포를 분석시료로 사용함으로써 광유발 형광체의 농도를 최소화하는 것이 바람직하다.

프로브 쌍을 세포 내로 도입하는 방법은 기존에 널리 알려진 화학적인 방법이나 바이러스의 벡터를 이용하는 방법 또는 물리적인 방법 중 어떤 것을 사용하여도 무관하다. 이는 본 발명의 내용에 해당하는 것은 아니므로, 자세한 설명은 생략한다. 본 실시예에서는 물리적인 방법 중 전기천공법(electroporation)을 이용하여 프로브 쌍을 세포 내로 도입하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기의 형광 검출 시료는 전술한 바와 같이 세포 단위 측정에 이용될 수 있으나, 시험관 내에서도 검출이 가능한 것은 당연하다.

(B) 형광측정에 의한 분석 단계

분석 샘플의 세포 내에 EPSPS 유전자가 존재하는지를 FRET 형광의 원리를 이용하여 분석하는 단계이다.

EPSPS 유전자의 인접한 일부분과 상보적 염기서열을 가지는 프라이머 쌍에 공여체와 수여체에 해당하는 형광체를 각각 표지한 프로브 쌍을 세포 내로 도입하면, EPSPS 유전자가 없는 경우에는 세포질 내에서 각각의 프로브가 서로 위치적 연관성을 가지지 않으므로 공여체와 수여체의 평균거리가 멀어서 FRET 형광을 나타내지 않는다. 그러나 EPSPS 유전자가 존재하는 세포 내에서는 공여체와 수여체를 표지한 프로브가 둘 다 EPSPS 유전자와 상보적 결합을 이루면서 서로 가까이 존재하게 되어 FRET 형광이 발생할 수 있게 된다. 따라서 FRET 형광을 측정하면 세포 내에 EPSPS 유전자가 존재하는 지의 여부를 쉽게 분석할 수 있다. 더 나아가, 이 원리를 이용하여 생체세포 혼합물에서 EPSPS 유전자를 보유한 세포의 함유율을 세포 수 계수 방법으로 정량 분석할 수 있다.

대부분의 경우, 공여체 여기를 위해 조사하는 레이저광의 파장에서 수여체의 흡수가 0이 아니기 때문에 레이저 여기에 의한 수여체의 형광세기에는 공여체로부터의 FRET에 의한 요소 뿐만 아니라 수여체 자체의 흡수에 의한 영향도 일정 정도 기여한다. 예를 들어, 실시예 1의 실험조건에서는 공여체로부터의 에너지 전달로 인해 수여체 형광세기가 증가되는 배수가 8배 정도이므로 검출대상 용액 내의 수여체 농도를 모르면 수여체의 농도가 8배 증가한 경우와 FRET이 일어난 경우를 구분하기 어렵다. 특히, 형광검출을 위한 공여체와 수여체 프로브의 쌍이 세포 내로 도입되는 경우에는 세포 내로 도입된 수여체의 농도를 측정하여 보정해 주는 것이 보다 정확한 분석을 위해 필요하다.

대상세포에 수여체만을 선택적으로 여기시킬 수 있는 파장의 레이저광을 조사하면 공여체를 선택적으로 여기시키는 레이저광을 사용할 경우와는 달리 공여체에 의한 흡수는 거의 없고, 수여체가 레이저광을 직접 흡수하기 때문에 수여체 형광의 세기는 세포 내로 도입된 수여체의 농도에 비례해서 나타나게 된다. 따라서, 대상세포를 수여체 흡수파장에서 선택적으로 여기하였을 때 발산되는 수여체 형광세기를 측정하여 세포마다 달라지는 수여체 형광검출시약의 농도를 분석하는 것이 가능하며, 이 결과를 이용해서 얻은 수여체 농도 값으로 공여체 여기로부터 얻은 수여체 형광세기를 나누어 줌으로써 FRET 형광의 정도를 보정해 주면 세포 내로 도입되는 형광검출시약의 농도변화에 따른 신호의 모호성을 제거할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시예에서는 편의상 유전자 변형 대두(GM soybean)을 선정하였으나, 어떤 식물이건 본 발명에 의한 프로브 쌍과 실험방법에 의해 EPSPS 유전자를 검출하여 분석할 수 있음은 당연하다.

실시예

실시예 1 : FRET 측정기술을 이용한 용액 내 EPSPS 유전자 검출

본 발명에 의한 프로브 쌍을 이용하여 유전자 변형 생물체인 Roundup Ready

RR) soybean에 도입된 제초제저항성 유전자 EPSPS의 염기서열을 가진 DNA의 존재 여부를 완충용액 내에서 확인하여 분석방법의 유용성을 확인하였다.

검출대상이 되는 EPSPS 염기서열을 함유하는 DNA를 확보하기위해 다음의 단계를 거쳤다. 우선 RR soybean의 genomic DNA를 주형으로 하여 EPSPS 유전자에 해당하는 2 kbp 가량의 구간이 증폭될 수 있도록 PCR 프라이머를 채택함으로써 순수하게 EPSPS 유전자를 가진 DNA를 확보하였다. 증폭을 위한 PCR forward primer로는 35S3F(5'AAGATGCCTCTGCCGACA3': 18-mer, 서열번호 9)를 사용하였고 reverse primer로는 NOS3R(5'ATGTATAATTGCGGGACTCTAATCA3': 25-mer, 서열번호 10)을 사용하였다. 이 과정에서 증폭된 DNA를 유전자조작을 통하여 DNA vector(pCR^ⓡ-Blunt; 3.5 kb, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 삽입함으로써 새로운 플라스미드(pCRB-EPSPS1.8; 약 5.5 kbp)를 제조하였다(도 4).

EPSPS 유전자에 해당하는 2 kbp 가량의 DNA가 다량으로 필요한 경우에는 새로운 플라스미드 DNA pCRB-EPSPS1.8을 주형으로 사용하고 상기와 동일한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR tube 한 개당 총 100 ㎕의 반응을 주형 DNA pCRB-EPSPS1.8 (10 ng/㎕) 3 ㎕, forward primer 35S3F (20 μM) 5 ㎕, reverse primer NOS3R (100 μM) 5 ㎕, dNTP (25 mM) 10 ㎕, 10 × buffer 10 ㎕, MgCl₂ (25 mM) 16 ㎕, Taq polymerase (5 U/㎕) 0.8 ㎕를 넣고 나머지는 증류수로 채워서 set-up하였다. PCR 반응은 denaturation step, 94 ℃, 5 min; 35 cycles의 amplification step, (94 ℃, 20 s; 45 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min); final elongation step, 72 ℃, 10 min의 조건으로 setup된 gradient cycler PTC-0225를 사용하여 수행하였다.

표적유전자에 결합하여 FRET 형광을 일으키기 위한 FRET용 형광 검출시약으로 표 1에 나타낸 바와 같은 set 조합을 각각 사용하였다. 공여체와 수여체 프로브 쌍의 프라이머 부분은 표적유전자인 RR soybean의 EPSPS DNA에 결합할 수 있도록 염기서열을 정한 PNA 올리고머이며, 결합 시에는 4개의 염기를 사이에 두고 공여체/수여체 형광물질이 인접하게 위치하도록 설계하였다.

우선 형광검출시약(공여체 농도: 1 μM, 수여체 농도: 3 μM)만 일정한 부피비(공여체:수여체 = 1:1)로 혼합한 시험관과 표적유전자(농도 : 1,250 ng/㎖)와 형광검출시약(공여체 농도: 1 μM, 수여체 농도: 3 μM)을 일정한 부피비(DNA:공여체:수여체 = 1:1:1)로 혼합한 시험관을 각각 준비하였다.

용액 속의 표적유전자는 이중나선구조를 이루고 있으므로 그대로는 형광검출 시약과 쉽게 결합할 수 없기 때문에 형광검출시약과 표적유전자가 결합하는 것을 돕기 위해 우선 혼합용액을 95 ℃에서 3분간 가열하여 표적유전자의 이중나선구조가 풀리도록 하였다. 혼합용액의 온도를 45 ℃까지 -6 ℃/min의 속도로 냉각시킨 후 유전자검출시약이 가닥이 풀린 표적유전자의 목표위치에 가서 잘 결합할 수 있도록 45℃에서 24시간 동안 incubation을 하였다.

24시간 incubation 이후에 용액을 채취하여 공여체를 주로 여기시키는 442 nm의 레이저광으로 여기 시키면서 형광스펙트럼을 측정하였다. 공여체 프로브는 442 nm에서 최대 흡광도를 가지고 있는 반면 수여체는 553 nm에서 최대 흡광도를 가진다. 또한 공여체 형광물질은 530 nm보다 긴 파장영역에서는 거의 흡수가 없고, 수여체는 440 nm 부근에서 흡수가 매우 약한 광학적 성질을 가지고 있다.

형광스펙트럼의 측정을 위해서는 300 gr/mm의 grating이 장착되어있는 150 mm 초점거리의 spectrograph의 출력단에 장착되어있는 CCD 광검출기를 사용하여 280 ~ 850 nm 영역의 스펙트럼을 동시에 관찰하였다. 형광스펙트럼의 기록을 위해서는 시료용액에 30초간 레이저광을 조사하면서 발산되는 형광을 2회 측정한 후 평균을 취하여 결과를 구하였다.

도 5 ~ 8에서 보여주는 바와 같이, EPSPS DNA가 없는 용액에서는 590 nm 근방에서 나타나는 수여체의 형광이 530 nm 근방에서 나타나는 공여체의 형광보다 약하지만, DNA가 있는 용액에서는 프로브와 DNA의 결합에 의해 FRET 형광이 발생되어 590 nm 근방의 형광이 현저히 증가함을 볼 수 있었다.

이로부터, 본 발명에 의한 프로브 쌍을 이용하여 FRET 형광 측정법에 의해 용액 내에서 표적유전자를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 분석방법은 표적유전자를 검출할 때 프로브를 표적유전자와 반응시킨 후 형광물질을 다시 제거하지 않고 그 상태로 분석을 실시하므로 생체세포 내에서도 특정유전자를 효과적으로 검출할 수 있을 것으로 추측하고 실시예 2를 통하여 확인하였다.

실시예 2 : FRET 측정기술을 이용한 생체 세포 내 EPSPS 유전자 확인

1) FAM과 TAMRA가 각각 표지된 프로브쌍에 의한 EPSPS 유전자 확인

일반 대두와 EPSPS 염기서열을 가지는 유전자 변형 RR soybean 세포를 대상으로 단위세포 별로 EPSPS 염기서열을 보유한 유전자의 존재여부를 판단할 수 있는지를 시험해 보았다.

우선 검출대상이 되는 일반 대두와 EPSPS 유전자를 함유한 RR soybean의 FRET 형광검출을 위하여 S7/S8의 세트를 사용하여 실험하였다.

약 10⁶개의 배양세포를 50 ㎕의 electroporation 용액 (10 mM HEPES, 1 mM CaCl₂ 용액)에 넣고, 프로브(공여체 농도 : 0.6 μM, 수여체 농도 : 3 μM)를 각각 50 ㎕ 씩 첨가한 후 220 V의 electric pulse를 가하여 전기천공을 1회 실시하여 공여체와 수여체 프로브를 세포 내로 도입하였다. 프로브의 프라이머가 표적유전자의 목표위치에 가서 잘 결합할 수 있도록 25 ℃에서 1 시간 동안 배양한 후 세포를 cover glass에 고정시킨 후 20 μW의 442 nm와 3 μW의 514.5 nm 레이저광으로 교차하여 여기 시키면서 개별적인 세포에서 발산되는 형광스펙트럼을 측정하였다.

도 9에서 볼 수 있듯이 일반 대두세포(a)와 유전자 변형 RR 대두세포(b)를 대상으로 수여체 농도를 보정해 준 후 FRET 형광을 비교한 결과, 표적유전자인 EPSPS 염기서열의 유전자를 보유한 세포에서 3배 가량 강한 형광이 나타나는 것을 관찰할 수 있었다. 이로부터 표적유전자의 존재여부를 FRET 형광으로 판단하는 것이 유용한 분석방법임을 확인할 수 있었다.

이 원리를 이용해서 생체혼합물을 개별적인 세포단위로 분리시키고 각각의 세포 내에 표적유전자가 존재하는 지의 여부를 검출시약의 형광을 통해 확인함으로써 특정세포의 혼합비율을 계수법을 이용한 절대정량 기술로 측정할 수 있다.

2) FAM을 표지한 공여체 프로브 및 TAMRA와 QSY

7을 양 말단에 표지한 수여체 프로브에 의한 EPSPS 유전자 확인

세포 내 표적유전자를 검출하는데 있어 보다 유리한 구조로 개선된 프로브를 이용하여 일반 대두와 EPSPS 염기서열을 가지는 유전자 변형 RR soybean 세포를 대상으로 단위세포 별로 EPSPS 염기서열을 보유한 유전자의 존재여부를 판단할 수 있는지를 시험해 보았다.

우선 검출대상이 되는 일반 대두와 EPSPS 유전자를 함유한 RR soybean의 FRET 형광검출을 위하여 S7/S8'의 세트를 사용하여 실험하였다. 여기서 S7은 표 1에 나타난 것과 같은 구조의 공여체이고, S8'은 표 1에 나타난 것과 같은 염기서열을 가진 PNA의 5'-말단에 TAMRA를 3'-말단에는 QSY

7을 표지한 개선된 구조의 수여체이다.

약 10⁶개의 배양세포를 200 ㎕의 electroporation 용액 (10 mM HEPES, 1 mM CaCl₂ 용액)에 넣고 프로브(공여체 농도 :3 μM, 수여체 농도 : 6 μM)를 각각 200 ㎕ 씩 첨가한 후 220 V의 electric pulse를 가하여 전기천공을 1회 실시하여 공여체와 수여체를 세포 내로 도입하였다. 프로브가 표적유전자의 목표위치에 가서 잘 결합할 수 있도록 25 ℃에서 1 시간 동안 정치한 후 세포를 cover glass에 고정시키고 10 μW의 442 nm와 5 μW의 543 nm 레이저광으로 교차하여 여기 시키면서 개별적인 세포에서 발산되는 형광스펙트럼을 측정하였다. 도 10 (a)에 그 중 대표적인 하나의 세포 형광 스펙트럼을 GM 세포 측정의 전형적인 예로서 도시하였다.

도 10의 (a)는 하나의 GM 세포를 대상으로 442 nm와 543 nm의 레이저광으로 각각 여기 시켜 얻은 형광스펙트럼을 보여주고 있다. 하나의 세포에서 얻은 형광스펙트럼으로부터 세포 내에 EPSPS 유전자가 존재하는 지의 여부를 판단하기 위해 특정파장범위에서 측정된 형광세기를 이용하여 식 (1)에서 정의된 FRET 형광비율을 구하는 것이 필요하다.

R = I_da/I_dd × I_aa/I_dd (1)

여기서, 각각의 형광세기는 도 10의 (a)에 표현되어있으며, I_dd는 442 nm 여기/520±30 nm 측정, I_da는 442 nm 여기/610±30 nm 측정, I_aa는 543 nm 여기/610±30 nm 측정에 의한 형광세기를 의미한다. 식 (1)의 첫 번째 인자인 I_da/I_dd는 FRET이 발생하면 공여체 형광은 줄어들고, 수여체 형광이 증가하므로 이에 비례하는 값을 계산하기 위해 도입된 변수이다. 두 번째 인자인 I_aa/I_dd는 수여체가 EPSPS 유전자와 결합함에 따라 quenching이 사라지고 형광의 세기가 증가하는 경향에 비례하는 값을 계산하기 위해 도입하였으며, 공여체의 형광세기로 수여체의 형광세기를 나누어 줌으로써 세포 내로 도입된 형광검출시약의 농도를 normalize 하고자 하였다.

이와 같은 계산식을 이용하여 110 개의 GM과 nonGM 세포를 대상으로 단일세포의 레이저 여기 형광스펙트럼을 측정하고, 이 결과를 이용하여 각 세포별로 식 (1)을 이용하여 R 값을 계산하였다. 각각의 세포에서 구한 R 값을 도 10의 (b)에 도시하였다. 도 10의 (b)에서 보는 바와 같이 EPSPS 유전자를 보유한 GM세포와 보유하지 않은 nonGM세포에서 관찰되는 R 값은 매우 다르게 분포하는 것을 알 수 있다. 두 가지 세포군에 대해 R 값의 평균을 구해보면 GM 세포군에서 구한 R 값의 평균이 nonGM 세포군에서 구한 R 값의 평균의 12배인 결과를 얻을 수 있었다. 단일세포 수준에서 R 값을 기준으로 판별할 경우 신뢰도가 GM 세포의 경우 95.5 %, nonGM 세포에서는 94.9 %로 나타난다. 이 결과는 유전자의 염기서열에 따라 분류될 수 있는 세포 혼합물에서 특정 염기서열을 가진 세포의 함유율을 약 95 %의 신뢰도를 가지고 절대정량할 수 있음을 의미한다.

본 발명에 의한 형광 검출 시약을 이용한 유전자 분석방법은 유전자 변형 식 물체가 함유된 원료식품 중 유전자 변형 원료의 함량을 정확하게 산출하는데 활용될 수 있다. 식품원료물질을 개별적 세포 단위로 분리시킨 후 다수의 세포(예를 들어 10,000개 이상)를 대상으로 세포가 재조합유전자를 보유하고 있는지를 검사함으로써 재조합유전자 보유 세포의 수를 계수하여 함량을 절대적으로 정량할 수 있다.

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Claims (8)

1. 다음의 조건을 만족하는 한 쌍의 프라이머로 이루어지는 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍.

   (A) 서열번호 1-서열번호 2, 서열번호 3-서열번호 4, 서열번호 5-서열번호 6 및 서열번호 7-서열번호 8의 프라이머 쌍으로 구성된 군으로부터 선택되는 것.

   (B) EPSPS 유전자와 혼성화되었을 때 인접하게 되는 프라이머의 3'-말단과 타프라이머의 5'-말단에 각각 에너지 공여체 및 에너지 수여체가 표지되어 있을 것.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 에너지 수여체가 표지된 프라이머의 다른 말단에 에너지 수여체의 형광을 quenching할 수 있는 발색체가 추가로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 프라이머 쌍은 DNA, RNA 또는 PNA 올리고머로 된 프라이머 쌍인 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍.
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 에너지 공여체는 FAM(5-carboxy fluorescein)이고, 에너지 수여체는 TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)인 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍.
6. 제 2 항에 있어서,

   상기 에너지 공여체는 FAM(5-carboxy fluorescein)이고, 에너지 수여체는 TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)이며, 에너지 수여체의 형광을 quenching할 수 있는 발색체는 QSY

   

   7인 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출용 프로브 쌍.
7. (A) 제 1 항 또는 제 2 항에 의한 프로브 쌍을 세포내에 도입하고 표적유전자의 해당 염기서열과 프로브의 프라이머를 혼성화하는 단계; 및

   (B) 레이저유발 형광 측정법으로 EPSPS 유전자가 존재하는지를 확인하는 단계;

   로 이루어 지는 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출 방법.
8. 제 7 항에 있어서,

   (A) 단계에서 상기 프로브 쌍은 2쌍 이상의 프로브 쌍을 동시에 세포 내에 도입하여 표적유전자와 각 프로브 쌍의 해당 프라이머를 혼성화 하는 것을 특징으로 하는 EPSPS 유전자 검출 방법.

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