BR112014018427B1

BR112014018427B1 - Oligonucleotídeos moduladores de rna com características melhoradas para o tratamento da distrofia muscular de duchenne e becker

Info

Publication number: BR112014018427B1
Application number: BR112014018427-5A
Authority: BR
Inventors: Peter Christian De Visser; Judith Christina Theodora Van Deutekom
Original assignee: Biomarin Technologies B.V.
Priority date: 2012-01-27
Filing date: 2013-01-28
Publication date: 2021-11-03
Also published as: JP2021192609A; CA3120918A1; AU2020257111B2; WO2013112053A1; HK1203835A1; CN112251436A; JP2023179431A; US20210108204A1; EP2806900B1; US20190194656A1; US10913946B2; AU2018203832B2; BR112014018427A2; CA2862628C; AU2020257111A1; ES2907250T3; EP4043039A1; CN104203289B; CN111893117A; NZ627896A

Abstract

oligonucleotídeos moduladores de rna com características melhoradas para o tratamento da distrofia muscular de duchenne e becker. a presente invenção fornece um oligonucleotídeo melhorado, e seu uso para tratar, melhorar, prevenir, e/ou atrasar a dmd ou dmb.

Description

Campo da invenção

[1] A invenção refere-se ao campo da genética humana, mais especificamente dos distúrbios neuromusculares. A invenção, em particular, refere-se ao uso de um oligonucleotídeo com características melhoradas aumentando a aplicabilidade clínica, conforme aqui ainda definido.

Antecedentes da Invenção

[2] As doenças neuromusculares são caracterizadas pelo funcionamento debilitado dos músculos, devido a qualquer músculo ou patologia do nervo (miopatias e neuropatias). As miopatias incluem distrofias musculares genéticas que se caracterizam por uma fraqueza progressiva e degeneração do esqueleto, do coração, e/ou do músculo liso. Distrofia Muscular de Duchenne (DMM) e Distrofia Muscular de Becker (BMD) são as formas mais comuns de distrofia muscular na infância. DMD é um distúrbio severo, letal e neuromuscular, resultando na dependência do apoio de cadeira de rodas antes da idade de 12, e os pacientes geralmente morrem antes da idade de trinta anos devido à insuficiência respiratória ou cardíaca. É causada por deleções de mudança no quadro de leitura (~67%) duplicações (~7%) de um ou mais éxons, ou por mutações pontuais (~25%) 2,24 Mb no gene DMD, resultando na ausência da distrofina funcional. BMD também é causada por mutações no gene DMD, mas esta mantém o quadro de leitura aberto, produz proteínas de distrofina semi-funcionais, e resulta em um fenótipo tipicamente muito mais suave, e uma maior vida útil. Durante a última década, a modificação de splicing específica a fim de restaurar o quadro de leitura da transcrição interrompido, emergiu como uma terapia promissora para a DMD (van Ommen et al., 2008; Yokota et al., 2007; van Deutekom et al., 2007; Goemans et al., 2011; Cirak et al., 2011). Utilizando oligonucleotídeos anti- sensos altamente sequência-específicos (AONs), que se ligam ao éxon flanqueando ou contendo a mutação, e que interferem com os sinais de splicing, o salto deste éxon pode ser induzido durante o processamento do pré-mRNA de DMD. Apesar da transcrição truncada resultante, o quadro de leitura aberta é restaurado e uma proteína é introduzida, a qual é semelhante a aquelas encontradas nos pacientes com BMD. O salto do éxon induzido por AON fornece uma mutação específica, e assim, uma abordagem terapêutica personalizada para pacientes com DMD. Vários oligonucleotídeos estão sendo desenvolvidos atualmente para o salto dos éxons mais relevantes do pré-mRNA da distrofina, como os éxons 2, 8, 9, 17, 29, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 a 63, 71 a 78, conforme descrito em WO 02/024906, WO2004/083446, WO2006/112705, WO2007/135105, WO 2009/139630, WO 2010/050801 ou WO 2010/050802.

[3] Como a maioria dos grupamentos de mutações em torno dos éxons 45 a 55, o salto de um éxon específico pode ser terapêutico para muitos pacientes com diferentes mutações. O salto do éxon 51 aplica-se ao maior subconjunto de pacientes (~13%), incluindo aqueles com deleções dos éxons 45 a 50, 48 a 50, 50, ou 52. Os AONs aplicados são quimicamente modificados para resistir às exonucleases, endonucleases e RNaseH, e para promover a ligação do RNA e dupla estabilidade. Duas químicas de AON diferentes estão sendo desenvolvidas atualmente para o salto do éxon 51 em DMD: AONs 2'-O-metil-fosforotioato RNA (2OMePS, GSK2402968/PRO051) e oligômeros de morfolino fosforodiamidato (PMO, AVI-4658) (Goemans et al., 2011; Cirak et al., 2011.). Em dois estudos de fases I/II independentes, ambos foram mostrados para induzir especificamente o salto do éxon 51, e restaurar pelo menos em parte a expressão da distrofina nas membranas da fibra muscular após a administração sistêmica. Embora AONs não sejam normalmente bem aceitos por fibras musculares saudáveis, a deficiência da distrofina em DMD resultando em membranas danificadas e, portanto, fibra mais permeável, na verdade promove a captação. Em estudos no modelo de camundongo mdx deficiente de distrofina, os oligonucleotídeos de 2'-O-metil-fosforotioato RNA demonstraram captação até 10 vezes maior em diferentes grupos musculares quando comparadas com a dos camundongos de tipo selvagem (Heemskerk et al., 2010). Embora os resultados das fases I/II recentes com ambos AONs de 2'-O- metil-fosforotioato RNA e de morfolino fosforodiamidato em pacientes com DMD confirmem esta captação reforçada no músculo distrófico, as diferentes modificações químicas parecem resultar em uma captação diferencial por, e distribuição através do músculo. Os níveis de distrofina nova em ambos os estudos após 3 meses de tratamento foram promissores, mas ainda moderados, e desafiam o campo técnico a investigar a próxima geração da oligoquímica.

[4] As características particulares de uma química escolhida, pelo menos em parte, afeta a entrega de um AON para a transcrição alvo: via de administração, bioestabilidade, biodistribuição, distribuição intra- tecidual, captação celular e tráfico. Além disso, a otimização adicional da química do oligonucleotídeo é concebida para aumentar a afinidade de ligação e estabilidade, aumentar a atividade, melhorar a segurança, e/ou para reduzir o custo dos produtos, através da redução do comprimento ou a melhoria dos procedimentos de síntese e/ou de purificação. Várias modificações químicas têm se tornado geral e/ou comercialmente disponíveis para a comunidade de pesquisa (como pirimidinas de 2'-O-metil RNA e 5-substituídas, e 2,6-diaminopurinas), enquanto a maioria das outras ainda apresentam esforço de síntese significativo para se obter. Resultados preliminares encorajadores foram especialmente obtidos utilizando 2'-O- metil fosforotioato RNA contendo modificações nas bases de pirimidina e purina, tal como aqui identificado.

[5] Em conclusão, para melhorar a aplicabilidade terapêutica de AONs para DMD, existe uma necessidade de AONs com outras características melhoradas.

Descrição da Invenção Oligonucleotídeo

[6] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de 2’-O-metil RNA e uma cadeia principal de fosforotioato, ou consistindo de monômeros de 2’-O-metil RNA ligados através de cadeias principais de fosforotioato, e compreendendo uma base 5- metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina, preferencialmente para uso no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker.

[7] Logo, a invenção fornece um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de 2’-O-metil RNA, uma cadeia principal de fosforotioato, e uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina preferencialmente para uso como medicamento no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker.

[8] De acordo, a invenção também fornece um oligonucleotídeo consistindo de monômeros de 2’-O-metil RNA, uma cadeia principal de fosforotioato e compreende uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina, preferencialmente para uso como medicamento no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker.

[9] É evidente para o técnico especialista no assunto que um "monômero de RNA", tal como presente em um oligonucleotídeo da invenção, também pode ser identificado como sendo "um resíduo de nucleotídeo de RNA". Ambos os termos podem ser usados indistintamente em todo o pedido.

[10] Dentro do contexto da invenção, "um" em cada uma das expressões seguintes significa "pelo menos um": um monômero de 2’-O-metil RNA, um resíduo de nucleotídeo de 2’-O-metil RNA, um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, uma base 5-metilpirimidina, uma base 2,6- diaminopurina.

[11] Dentro do contexto da invenção, é claro para um técnico especialista no assunto que "um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de 2'-O-metil RNA, uma cadeia principal de fosforotioato" poderia ser substituído por "um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de 2'-O-metil RNA ligado através de cadeias principais de fosforotioato". O mesmo vale para "um oligonucleotídeo consistindo de monômeros de 2'-O-metil RNA e uma cadeia principal de fosforotioato", que poderia ser substituído por "um oligonucleotídeo consistindo de monômero de 2'-O-metil RNA ligado às cadeias principais de fosforotioato".

[12] No contexto da invenção, a expressão "para o uso como um medicamento para o tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker" poderia ser substituída pela expressão "para o uso no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker".

[13] De preferência, um oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo com menos de 34 nucleotídeos. O referido oligonucleotídeo pode ter 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos. Tais oligonucleotídeos podem também ser identificados como um tendo entre 10 e 33 nucleotídeos.

[14] De acordo, um oligonucleotídeo da invenção compreende um monômero de 2'-O-metil RNA e uma cadeia principal de fosforotioato, e compreende menos de 34 nucleotídeos (isto é, compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos).

[15] De acordo, um oligonucleotídeo da invenção consiste em monômeros de 2'-O-metil RNA ligados através da cadeia principal de fosforotioato, e compreende menos de 34 nucleotídeos (isto é, compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos).

[16] De acordo, um oligonucleotídeo da invenção compreende um monômero de 2'-O-metil RNA, uma cadeia principal de fosforotioato, e compreende menos de 34 nucleotídeos (isto é, compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos) e uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina.

[17] De acordo, um oligonucleotídeo da invenção consiste em monômeros de 2'-O-metil RNA ligados através da cadeia principal de fosforotioato, e compreende menos de 34 nucleotídeos (isto é, compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos) e uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina.

[18] Cada um destes oligonucleotídeos é para o uso, ou podem ser para o uso como um medicamento para o tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker.

[19] Um oligonucleotídeo da presente invenção compreende ou é constituído por um monômero de 2'-O-metil RNA fosforotioato. Tal oligonucleotídeo compreende um monômero de 2'-O-metil RNA conectado através, ou ligado através de uma cadeia principal de fosforotioato, ou consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA. De preferência, tal oligonucleotídeo é constituído por um 2'-O-metil- fosforotioato RNA. Tal química é conhecida por um técnico especialista no assunto. Ao longo do pedido, um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de 2'-O-metil RNA e uma cadeia principal de fosforotioato pode ser substituído por um oligonucleotídeo compreendendo um 2'-O- metil-fosforotioato RNA. Ao longo do pedido, um oligonucleotídeo consistindo de monômeros de 2'-O-metil RNA ligados através, ou conectados através de cadeias principais de fosforotioato pode ser substituído por um oligonucleotídeo consistindo de 2'-O-metil fosforotioato RNA.

[20] No contexto da invenção, a "cadeia principal" é usada para identificar a ligação entre duas unidades de açúcar ou versões modificadas de uma unidade de açúcar ou porção como aqui definido posteriormente (isto é, ligação de internucleosídeos). Ao longo da descrição, as palavras "cadeia principal", "ligação internucleosídeo" e "ligação" podem ser usadas de forma intercambiável. Assim, um oligonucleotídeo com 10 nucleotídeos contém 9 cadeias principais que ligam as 10 unidades de açúcar, ou versões modificadas de uma unidade ou grupo de açúcar, como aqui definidos posteriormente em conjunto. Pelo menos uma das cadeias principais do oligonucleotídeo, de acordo com a invenção, consiste de uma porção de fosforotioato que liga duas unidades de açúcar, ou versões modificadas de uma unidade ou grupo de açúcar como aqui definido posteriormente. Assim, pelo menos uma das cadeias principais de fosfodiéster presente no RNA é substituída pelo radical fosforotioato. Uma ligação ou cadeia principal de internucleosídeo de ocorrência natural é uma ligação 3' a 5'de fosfodiéster.

[21] Além disso, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender uma modificação de base que aumenta a afinidade de ligação aos filamentos alvos, aumenta a temperatura de fusão da dupla resultante do referido oligonucleotídeo com o seu alvo, e/ou reduz os efeitos imunoestimulantes, e/ou aumenta a bioestabilidade, e/ou melhora a biodistribuiçãoe/ou a distribuição intra-tecidual, e/ou a captação etráfico celular . Em uma modalidade mais preferida, umoligonucleotídeo da invenção compreende uma base 5-metilpirimidina e/ou 2,6-diaminopurina. Uma base 5-metilpirimidina é selecionada a partir de uma 5-metilcitosina e/ ou uma 5-metiluracila e/ou uma timina, emque a timina é idêntica a 5-metiluracila.

[22] De acordo, a expressão "compreende uma base 5- metilcitosina e/ou uma 5-metiluracila e/ou uma 2,6- diaminopurina" no contexto do oligonucleotídeo modificado da invenção, pode ser substituída por "compreende uma modificação de base selecionada a partir do grupo que consiste em: uma base 5-metilcitosina, uma 5-metiluracila e uma 2,6-diaminopurina".

[23] Sempre que um oligonucleotídeo da invenção tiver duas ou mais destas modificações de bases, as referidas modificações de bases podem ser idênticas, por exemplo, todas estas bases modificadas no oligonucleotídeo são 5- metilcitosina, ou as referidas modificações de bases podem ser combinações de modificações de bases diferentes, por exemplo, o oligonucleotídeo pode ter uma ou mais 5- metilcitosinas e uma ou mais 5-metiluracilas.

[24] "Timina" e "5-metiluracila" podem ser intercambiáveis ao longo do documento. Em analogia, a 2,6- diaminopurina é idêntica a 2-aminoadenina, e estes termos podem ser intercambiáveis ao longo do documento. O uso da 2,6-diaminopurina foi descrito em outro contexto em US 7,745,420.

[25] O termo "modificação de base" ou "base modificada" como identificado aqui, se refere à modificação de uma base existente (isto é, base pirimidina ou purina), ou à síntese "de novo" de uma base. Essa base sintetizada "de novo" poderia ser qualificada como "modificada" em comparação com uma base existente. Um oligonucleotídeo da invenção compreendendo uma base 5-metilcitosina e/ou uma 5- metiluracila e/ou uma 2,6-diaminopurina significa que pelo menos uma das nucleobases de citosina do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 5 do anel de pirimidina com um grupo metil, isto é, uma citosina 5-substituída, e/ou que pelo menos uma das nucleobases uracila do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 5 do anel de pirimidina com um grupo metil (isto é, uma 5- metiluracila), e/ou que pelo menos uma das nucleobases adenina do referido oligonucleotídeo foi modificada por substituição do próton na posição 2 com um grupo amino (isto é, uma 2,6-diaminopurina), respectivamente. Dentro do contexto da presente invenção, a expressão "a substituição de um próton com um grupo metil na posição 5 do anel de pirimidina" pode ser substituída pela expressão "a substituição de uma pirimidina com uma 5-metilpirimidina", com pirimidina se referindo apenas à uracila, apenas à citosina ou a ambas. Do mesmo modo, dentro do contexto da invenção, a expressão "a substituição de um próton com um grupo amino na posição 2 da adenina" pode ser substituída pela expressão "substituição de uma adenina com uma 2,6- diaminopurina." Se o referido oligonucleotídeo compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citosinas, uracilas, e/ou adeninas, pelo menos uma, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais citocinas, uracilas e/ou adeninas respectivamente foram modificadas dessa forma. De preferência, todas as citosinas, uracilas e/ou adeninas foram modificadas desta forma, ou substituídas por 5-metilcitosina, 5-metiluracila e/ou 2,6-diaminopurina, respectivamente. Não é necessário dizer que este aspecto da invenção poderia ser aplicado aos oligonucleotídeos que compreendem, pelo menos, uma citosina, uracila, ou adenina, respectivamente, nas suas sequências. Um oligonucleotídeo compreendendo, pelo menos uma 5-metilcitosina, 5-metiluracila e/ou 2,6-diaminopurina pode ser chamado de um oligonucleotídeo modificado por referência à sua contraparte não-modificada, compreendendo nenhuma 5-metilcitosina, nenhuma 5-metiluracila, e nenhuma 2,6-diaminopurina. Uma contraparte não-modificada também pode ser identificada como sendo um oligonucleotídeo compreendendo citosinas não modificadas, uracilas não modificadas, e adeninas não modificadas. Sequências não modificadas preferidas são representadas por uma das seguintes sequências de bases ou nucleotídeos compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 91, 93 a 170.

[26] Foi descoberto que a presença de uma 5- metilcitosina, 5-metiluracila, e/ou uma 2,6-diaminopurina em um oligonucleotídeo da invenção, tem um efeito positivo em pelo menos um dos parâmetros dos referidos oligonucleotídeos. Neste contexto, os parâmetros podem incluir: afinidade de ligação e/ou cinética, atividade de salto do éxon, bioestabilidade, distribuição (intra- tecidual), captação celular e/ou tráfico, e/ou a imunogenicidade do referido oligonucleotídeo, tal como explicado abaixo. O referido efeito positivo pode ser correlacionado com o número, ou a porcentagem de modificações de bases incorporadas. Para o parâmetro da atividade de salto do éxon, foi descoberto que para alguns oligonucleotídeos, tal modificação das nucleobases não é necessária por si só para se obter níveis relativamente elevados do salto de éxon. Isto pode estar relacionado com o papel específico (e resistência) da sequência alvo específica dentro do éxon no seu processo de splicing.

[27] A afinidade de ligação e a cinética dependem das propriedades termodinâmicas dos AON. Eles são, pelo menos em parte, determinados através da temperatura de fusão dos referidos oligonucleotídeos (Tm; calculada com, por exemplo, a calculadora de propriedades de oligonucleotídeo (http://www.unc.edu/~cail/biotool/oligo/index.html ou http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/) para RNA de cadeia simples usando a Tm básica, e o modelo de vizinho mais próximo) e/ou a energia livre do complexo de éxon de oligonucleotídeo-alvo (utilizando a estrutura do RNA versão 4.5 ou RNA mfold versão 3.5) Se uma Tm é aumentada, a atividade de salto do éxon normalmente aumenta, mas quando a Tm é muito alta, o AON é esperado em se tornar menos sequência-específico. Uma Tm e energia livre aceitável dependem da sequência do oligonucleotídeo. Portanto, é difícil fornecer intervalos preferidos para cada um desses parâmetros.

[28] A atividade de salto do éxon é preferencialmente medida através da análise total do RNA isolado a partir de culturas de células musculares ou tecido muscular tratados com AON, pela reação em cadeia de polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) usando primers específicos do gene DMD, flanqueando o éxon alvo conforme descrito em (Aartsma-Rus et al., 2003). Os produtos de RT-PCR são analisados em géis de agarose 1 a 2%, ou com o bioanalisador Agilent 2010 (Agilent Technologies, Holanda). A razão dos fragmentos transcritos mais curtos representando os transcritos os quais o éxon alvo é saltado para o total de produtos de transcrição, é avaliada (calculada como porcentagem do salto do éxon induzido por um AON). Fragmentos mais curtos também podem ser sequenciados para determinar a exatidão e a especificidade do salto do éxon alvo. Um aumento na porcentagem do salto de éxon pode ser detectado por um oligonucleotídeo modificado da invenção (ou seja, um oligonucleotídeo que compreende um monômero 2'-O-metil RNA, uma cadeia principal de fosforotioato e uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6- diaminopurina) em comparação com a sua contraparte não modificada (ou seja, um oligonucleotídeo que compreende um monômero de 2'-O-metil, uma cadeia principal de fosforotioato, e não compreende qualquer base 5- metilpirimidina e qualquer 2,6-diaminopurina). O referido aumento é, de preferência, um aumento detectável avaliado como explicado acima, utilizando RT-PCR. O referido aumento é, de preferência um aumento de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000%, ou pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 vezes maior, ou mesmo 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 vezes maior ou mais.

[29] Biodistribuição e bioestabilidade são, de preferência, pelo menos em parte determinadas por um ensaio de ligação de hibridização validado, adaptado de Yu et al., 2002. Em uma modalidade, as amostras de plasma ou de tecidos homogeneizados foram incubadas com uma sonda de oligonucleotídeo de captura específica. Após a separação, o oligonucleotídeo marcado com DIG é ligado ao complexo, e a detecção seguinte usando uma peroxidase ligada ao anticorpo anti-DIG. A análise farmacocinética não-compartimental é realizada usando o pacote de software WINNONLIN (modelo 200, versão 5.2, Pharsight, Mountainview, CA). Os níveis de AON (μg) por ml de plasma ou mg de tecido são monitorizados ao longo do tempo para avaliar a área sob a curva (AUC), a concentração máxima (Cmax), tempo para a concentração máxima (Tmax), a meia vida terminal, e o tempo de demora da absorção (tlag). Tal ensaio preferido foi descrito na parte experimental.

[30] Os AONs podem estimular uma resposta imune inata por ativação dos receptores do tipo Toll (TLR), incluindo TLR9 e TLR7 (Krieg et al., 1995). A ativação de TLR9 normalmente ocorre devido à presença de sequências de CG não metiladas presentes nos oligodeoxinucleotídeos (ODN), imitando o DNA bacteriano que ativa o sistema imune inato através da liberação de citocinas mediada por TLR9. A modificação de 2'-O-metil, no entanto, sugeriu para reduzir significativamente o efeito possível. TLR7 foi descrito para reconhecer as repetições de uracila no RNA (Diebold et al., 2006).

[31] A ativação de TLR9 e TLR7 resulta em um conjunto de respostas imunes coordenadas que incluem a imunidade inata (macrófagos, células dendríticas (DC), e as células NK) (Krieg et al, 1995;. Krieg, 2000). Várias quimo- e citocinas, tais como IP-10, TNFα, IL-6, MCP-1 e IFNα (Wagner, 1999; Popovic et al., 2006) têm sido implicadas neste processo. As citocinas inflamatórias atraem as células de defesas adicionais do sangue, tais como as células T e B. Os níveis destas citocinas podem ser investigados por testes in vitro. Em suma, o sangue humano total é incubado com concentrações crescentes de AONs, após as quais os níveis de citocinas são determinados por kits padrão de ELISA disponíveis comercialmente. Tal ensaio preferido foi descrito na parte experimental. Uma redução da imunogenicidade, de preferência, corresponde a uma diminuição detectável da concentração de, pelo menos, uma das citocinas mencionadas acima por comparação com a concentração da citocina correspondente, em um ensaio de uma célula tratada com um oligonucleotídeo compreendendo, pelo menos, uma 5-metilcitosina em comparação com uma célula tratada com um oligonucleotídeo correspondente que não disponha de 5-metilcitosinas.

[32] De acordo, um oligonucleotídeo preferido da invenção tem um parâmetro melhorado, tal como uma imunogenicidade aceitável ou diminuída, e/ou uma melhor biodistribuição e/ou cinética de ligação de RNA aceitável ou melhorada, e/ou as propriedades termodinâmicas, em comparação com um oligonucleotídeo correspondente que consiste de um 2'-O-metil fosforotioato RNA sem uma 5- metilcitosina, uma 5-metiluracila e uma 2,6-diaminopurina (isto é, o chamado oligonucleotídeo não modificado). O referido oligonucleotídeo não modificado também pode ser identificado como sendo um oligonucleotídeo compreendendo citosinas não modificadas, uracilas não modificadas, e adeninas não modificadas. Cada um destes parâmetros pode ser avaliado usando ensaios conhecidos do técnico especialista no assunto ou, de preferência, tal como aqui divulgado.

[33] A seguir, outras químicas e modificações do oligonucleotídeo da invenção são definidas. Estas químicas e modificações adicionais podem estar presentes em combinação com a química já definida para o referido oligonucleotídeo, ou seja, a presença de uma 5- metilcitosina, uma 5-metiluracila, e/ou uma 2,6- diaminopurina, e o oligonucleotídeo que compreende ou que consiste em um 2'-O-metil RNA fosforotioato.

[34] Um oligonucleotídeo preferido da invenção compreende ou consiste em uma molécula de RNA, ou uma molécula de RNA modificada. Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo é de cadeia simples. Um técnico especialista no assunto entenderá que, contudo, é possível que um oligonucleotídeo de cadeia simples possa formar uma estrutura de cadeia dupla interna. No entanto, esse oligonucleotídeo é ainda denominado como um oligonucleotídeo de cadeia simples no contexto dessa invenção.

[35] Além das modificações descritas acima, oligonucleotídeo da invenção pode compreender modificações adicionais, tais como tipos diferentes de monômeros de ácido nucléico ou nucleotídeos, conforme descrito abaixo. Tipos diferentes de monômeros de ácido nucleico podem ser usados para gerar um oligonucleotídeo da invenção. O referido oligonucleotídeo pode ter pelo menos uma cadeia principal, e/ou modificação de açúcar, e/ou pelo menos uma modificação de base comparada com um oligonucleotídeo baseado em RNA.

[36] Uma modificação de base inclui uma versão modificada das bases purina e pirimidina naturais (por exemplo, adenina, uracila, guanina, citosina, e timina), tais como hipoxantina, ácido orótico, agmatidina, lisidina, 2-tiopirimidina (por exemplo, 2-tiouracila, 2-tiotimina), G-clamp e seus derivados, pirimidina 5-substituída (por exemplo, 5-halouracila, 5-propiniluracila, 5- propinilcitosina, 5-aminometiluracila, 5- hidroximetiluracila, 5-aminometilcitosina, 5- hidroximetilcitosina, Super T), 7-deazaguanina, 7- deazaadenina, 7-aza-2,6-diaminopurina, 8-aza-7- deazaguanina, 8-aza-7-deazaadenina, 8-aza-7-deaza-2,6- diaminopurina, Super G, Super A, e N4-etilcitosina, ou derivados dos mesmos; N2-ciclopentilguanina (cPent-G), N2- ciclopentil-2-aminopurina (cPent-AP), e N2-propil-2- aminopurina (Pr-AP), pseudouracila ou derivados das mesmas; e bases degeneradas ou universais, como 2,6-difluorotolueno ou bases ausentes, tais como sítios abásicos (por exemplo, 1-desoxirribose, 1,2-didesoxirribose, 1-desoxi-2-O- metilrribose, ou derivados da pirrolidina, em que o oxigênio do anel foi substituído com nitrogênio (azaribose)). Exemplos de derivados de Super A, Super G e Super T podem ser encontrados na patente norte-americana 6,683,173 (Epoch Biosciences), que é aqui incorporada integralmente por referência. cPent-G, cPent-AP e Pr-AP foram mostrados para reduzir os efeitos imunoestimulantes quando incorporados no siRNA (Peacock H. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200).

[37] Uma pseudouracila é uma versão isomerizada de ocorrência natural da uracila com um C-glicosídeo, ao invés do N-glicosídeo regular como na uridina. A pseudouridina contendo mRNA sintético pode ter um perfil seguro melhorado, comparada com a uridina contendo mRNA (WO 2009127230, que é aqui incorporado integralmente por referência).

[38] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção compreende um sítio abásico ou um monômero abásico. Dentro do contexto da invenção, tal monômero pode ser chamado de um sítio abásico ou um monômero abásico. Um sítio abásico ou um monômero abásico é um monômero ou um bloco de construção que carece de uma nucleobase, em comparação com um monômero correspondente compreendendo uma nucleobase. Dentro do contexto da invenção, um monômero abásico é, portanto, uma parte de um bloco de construção de um oligonucleotídeo, mas que carece de uma nucleobase. Tal monômero abásico pode estar presente, ou acoplado, ou ligado, ou conjugado com um terminal livre de um oligonucleotídeo.

[39] Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção compreende de 1 a 20 ou mais monômeros abásicos. Portanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais monômeros abásicos podem estar presentes em um oligonucleotídeo da invenção.

[40] Um monômero abásico pode ser de qualquer tipo conhecido e concebível por um técnico especialista no assunto, exemplos não limitativos dos quais são descritos abaixo:

[41] Aqui, R1 e R2 são independentemente H, um oligonucleotídeo ou outro sítio(s) abásico, desde que R1 e R2 não sejam ambos H, e R1 e R2 sejam ambos um oligonucleotídeo. Um monômero(s) abásico pode estar ligado em qualquer um ou ambos os terminais do oligonucleotídeo, conforme especificado anteriormente. Deve ser notado que um oligonucleotídeo ligado a um ou dois sítio(s) abásicos ou monômero(s) abásicos, pode compreender menos do que 10 nucleotídeos. A este respeito, o oligonucleotídeo de acordo com a invenção pode compreender pelo menos 10 nucleotídeos, opcionalmente incluir um ou mais sítios abásicos ou monômeros abásicos em um ou ambos os terminais.

[42] Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 modificações de base. Também está englobado pela invenção a introdução de mais do que uma modificação de base distinta no referido oligonucleotídeo.

[43] Uma modificação de açúcar inclui uma versão modificada do grupo ribosil, tal como RNA 2'-O-modificado tais como 2'-O-alquil ou 2'-O-(substituído)alquil, por exemplo, 2'-O-metil, 2'-O-(2-cianoetil), 2'-O-(2- metóxi)etil (2'-MOE), 2'-O-(2-tiometil)etil, 2 '-O-butiril, 2'-O-propargil, 2'-O-alil, 2'-O-(3-amino)propil, 2'-O- (3(dimetilamino) propil), 2'-O-(2-amino)etil, 2'-O-(2 (dimetilamino)etil); 2'-desóxi (DNA); 2'-O- (haloalcóxi)metil (Arai K. et al. Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285) por exemplo, 2'-O-alquil (2-cloroetoxi)metil (MCEM), 2'-O-alquil (2,2-dicloroetóxi)metil (DCEM); 2'-O- alcoxicarbonil, por exemplo, 2'-O-[2 (metoxicarbonil)etil] (MOCE), 2'-O-[2 (N-metilcarbamoil)etil] (MCE), 2'-O-[2- (N,N-dimetilcarbamoil)etil] (DCME); 2'-halo, por exemplo, 2'-F, FANA (ácido nucleico 2'-F arabinosil); carba-açúcar, sulfa e sulfo-açúcar, e modificações aza-açúcar; 3'-O- alquil, por exemplo, 3'-O-metil, 3'-O-butiril, 3'-O- propargil; 4'-carboxi, por exemplo, 4'-carboxitimidina (Hari et al. ); e derivados dos mesmos.

[44] Outra modificação de açúcar inclui ácido nucleico "em ponte" ou "bicíclico" (BNA), por exemplo, ácido nucleico bloqueado (LNA), xilo-LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, cEt (2'-O,4'-C etil restrito) LNA, cMOEt (2'-O,4'-C metóxi-etil restrito) LNA, ácido nucleico em ponte de etileno (ENA), DNA tricíclico (TcDNA, tc-PS-DNA por exemplo, pedido de patente norte-americano 20120149756); 3'-S fosforotiolato DNA (por exemplo, Org. Biol. Chem. 2013, 11, 966); ácido nucleico duplamente restrito (tri-NA, e.g. Hanessian et al.); ácido nucleico não bloqueado (UNA); ácido nucleico ciclohexenil (CeNA), ácido nucleico altriol (ANA), ácido nucleico hexitol (HNA), HNA fluorinatado (F-HNA), pirasonil-RNA (p-RNA), 3'-desoxipiranosil-DNA (p-DNA); morfolino (como por exemplo, em PMO, PPMO, PMOPlus, PMO-X); e derivados dos mesmos. Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 modificações de açúcar. Também está englobado pela invenção a introdução de mais do que uma modificação de açúcar distinta no referido oligonucleotídeo. Em uma modalidade, um oligonucleotídeo conforme definido aqui, compreende ou consiste de um LNA ou derivado do mesmo. Derivados de BNA são, por exemplo, descritos em WO 2011/097641, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência. Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção é inteiramente 2'-O-metil modificado. Exemplos de PMO-X são descritos em WO2011150408, que é aqui incorporado em sua totalidade por referência.

[45] Uma modificação de cadeia principal inclui uma versão modificada de um fosforodiéster presente no RNA, tal como fosforotioato (PS), fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfonoacetato, tiofosfonoacetamida, pró-fármaco fosforotioato, H- fosfonato, metil fostonato, metil fosfonotioato, metil fosfato, metil fosforotioato, etil fosfato, etil fosforotioato, boranofosfato, boranofosforotioato, metil boranofosfato, metil boranofosforotioato, metil boranofosfonato, metil boranofosfonotioato, e derivados dos mesmos. Outras modificações incluem fosforamidita, fosforamidato, fosforamidato N3’P5’, fosforodiamidato, fosforotiodiamidato, sulfamato, dimetilenosulfóxido, sulfonato, triazol, oxalil, carbamato, metileneimino (MMI), 3’-S-fosforotiolato (Org. Biol. Chem. 2013, 11, 966) e ácido nucleico tioacetamido (TANA); e derivados dos mesmos. Dependendo do seu comprimento, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 modificações de cadeia principal. Também está englobada pela invenção a introdução de mais do que uma modificação na cadeia principal distinta no referido oligonucleotídeo.

[46] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos uma modificação de fosforotioato. Em uma modalidade mais preferida, um oligonucleotídeo da invenção é inteiramente fosforotioato modificado.

[47] Outras modificações químicas de um oligonucleotídeo da invenção incluem o ácido nucleico de base peptídica (PNA), PNA modificado no grupamento boro, ácido nucleico óxi-peptídeo baseado em pirrolidina (POPNA), ácido nucleico baseado em glicol ou glicerol (GNA), ácido nucleico baseado em treose (TNA), ácido nucleico baseado em treoninol acíclico (aTNA), ácido nucleico baseado em morfolino (PMO, PPMO, PMO-X), oligômeros baseado em morfolino catiônico (PMOPlus), oligonucleotídeos com bases integradas e cadeias principais (ONIBs), oligonucleotídeos pirrolidina-amida (POMs); e derivados dos mesmos.

[48] Em outra modalidade, um oligonucleotídeo compreende um ácido nucleico peptídico e/ou um fosforodiamidato morfolino, ou um derivado do mesmo.

[49] Em outra modalidade, um oligonucleotídeo compreende um grupo monotiofosfato na posição de 5' do resíduo terminal 5', e/ou um grupo monotiofosfato na posição 3' do resíduo do terminal 3'. Estes grupos monotiofosfatos foram mostrados para melhorar a estabilidade do oligonucleotídeo (por exemplo, pedido de patente norte-americano 20120148664 - miRagen).

[50] Com o advento da tecnologia mimetizando o ácido nucleico, tornou-se possível gerar moléculas que possuem características de hibridização semelhantes, de preferência iguais em espécie, não necessariamente em quantidade, como o próprio ácido nucleico. Estes equivalentes funcionais são, naturalmente, também adequados para uso na invenção.

[51] O técnico especialista no assunto vai entender que nem todo açúcar, base, e/ou cadeia principal pode ser modificado da mesma forma. Diversos açúcares, bases e/ou cadeias principais modificados de formas distintas podem ser combinados em um único oligonucleotídeo da invenção.

[52] Um técnico especialista no assunto irá reconhecer que existem muitos derivados sintéticos dos oligonucleotídeos. Uma modificação na cadeia principal inclui uma versão modificada do fosforodiéster presente no RNA, tal como fosforotioato (PS), fosforotioato quiralmente puro, fosforoditioato (PS2), fosfonoacetato (PACE), fosfonoacetamida (PACA), tiofosfonoacetato, tiofosfonoacetamida, pró-fármaco fosforotioato, H- fosfonato, metil fostonato, metil fosfonotioato, metil fosfato, metil fosforotioato, etil fosfato, etil fosforotioato, boranofosfato, boranofosforotioato, metil boranofosfato, metil boranofosforotioato, metil boranofosfonato, metil boranofosfonotioato, e derivados dos mesmos. Outra modificação inclui fosforamidita, fosforamidato, fosforamidato N3’P5’, fosfordiamidato, fosforotiodiamidato, sulfamato, dimetilenosulfóxido, sulfonato, triazol, oxalil, carbamato, metileneimino (MMI), 3’-S-fosforotiolato.

[53] De preferência, o referido oligonucleotídeo compreende RNA, como cadeias duplas RNA/RNA são muito estáveis. É preferido que um oligonucleotídeo de RNA compreenda uma modificação fornecendo o RNA com uma propriedade adicional, por exemplo, resistência às endonucleases, exonucleases e RNaseH, força de hibridização adicional, estabilidade aumentada (por exemplo, em um fluido corporal), aumento ou diminuição da flexibilidade, atividade aumentada, toxicidade reduzida, transporte intracelular aumentado, especificidade de tecido, etc. Além disso, o mRNA complexado com o oligonucleotídeo da invenção não é, de preferência, suscetível à clivagem da RNaseH. Modificações preferidas foram identificadas acima.

[54] De acordo, a invenção fornece um oligonucleotídeo compreendendo um monômero 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consistindo de 2'-O-metil fosforotioato RNA e compreendendo uma base 5-metilpirimidina e/ou uma 2,6-diaminopurina. Mais preferencialmente, este oligonucleotídeo consiste de monômeros de 2'-O-metil RNA ligados através de uma cadeia principal de fosforotioato e todas as suas citocinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, independentemente, foram substituídas por 5-metilcitosina, 5-metiluracila, e/ou 2,6-diaminopurina, respectivamente. Os oligonucleotídeos preferidos modificados e não modificados englobados pela invenção e aqui descritos, compreendem ou consistem em uma sequência de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir de uma das SEQ ID NO: 14 a 90 conforme identificadas na tabela 1. A expressão "oligonucleotídeo representado por uma sequência de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NO: 14 a 90", poderia ser substituída pela expressão "oligonucleotídeo representado por uma sequência de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir de uma das SEQ ID NO: 14 a 90", ou pela expressão "oligonucleotídeo representado por uma sequência de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir da lista de SEQ ID NO: 14 a 90". O mesmo se aplica a outros grupos de SEQ ID NO aqui referidos. Os oligonucleotídeos preferidos não modificados que são derivados a partir de uma das SEQ ID NO: 14 a 90, e englobados pela presente invenção e aqui descritos, compreendem ou consistem de uma das sequências de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NO: 91, 93 a 170. Os oligonucleotídeos modificados que são preferencialmente derivados de uma das SEQ ID NO: 14 a 90, e englobados pela presente invenção e descritos aqui, compreendem ou consistem de uma das sequências de bases ou de nucleotídeos selecionada a partir de SEQ ID NO: 92, 171 a 213, 215. Por favor note que as duas SEQ ID NO presentes na listagem de sequências são idênticas: SEQ ID NO: 91 é idêntica à SEQ ID NO: 132. SEQ ID NO: 92 é idêntica à SEQ ID NO: 199.

[55] A sequência representando cada um destes oligonucleotídeos está descrita nas Tabelas 1 a 3 e na listagem de sequências. Posteriormente na descrição, os oligonucleotídeos mais preferidos são descritos em mais detalhe.

[56] Assim, um oligonucleotídeo da invenção pode ter:• Pelo menos uma, e de preferência todas as citosinas substituídas com 5-metilcitosinas,• Pelo menos uma e de preferência todas as citosinas substituídas com 5-metilcitosinas e pelo menos uma e de preferência todas as uracilas substituídas com 5- metiluracilas,• Pelo menos uma e de preferência todas as citosinas substituídas com 5-metilcitosinas e pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas com 2,6-diaminopurinas,citosinas substituídas com 5-metilcitosinas, e pelo menos uma e de preferência todas as uracilas substituídas com 5- metiluracilas, e pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas com 2,6-diaminopurinas,• Pelo menos uma e de preferência todas as uracilas substituídas com 5-metiluracilas,• Pelo menos uma e de preferência todas as uracilas substituídas com 5-metiluracilas, e pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas com 2,6- diaminopurinas, ou• Pelo menos uma e de preferência todas as adeninas substituídas com 2,6-diaminopurinas.

[57] No entanto, um oligonucleotídeo pode também ter pelo menos uma ou, pelo menos duas, ou pelo menos metade, ou todas as suas citosinas substituídos com 5- metilcitosinas. Se um oligonucleotídeo não modificado, da invenção preferencialmente baseado na SEQ ID NO: 14 a 90 tem x citosinas, sendo x um número inteiro variando de 1 a 33, um oligonucleotídeo modificado correspondente da invenção pode ter 1, 2, 3,..., (x-2), (x-1), x 5- metilcitosinas.

[58] Se x for 3 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2 ou 3.

[59] Se x for 4 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2, 3 ou 4.

[60] Se x for 5 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2, 3, 4 ou 5.

[61] Se x for 6 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

[62] Se x for 6 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7.

[63] Se x for 8 em tal oligonucleotídeo não modificado, o número de 5-metilcitosinas em um oligonucleotídeo modificado correspondente é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8.

[64] O mesmo é válido para uracilas substituídas com 5-metiluracilas, e adeninas substituídas com 2,6- diaminopurinas.

[65] Preferencialmente, um oligonucleotídeo da invenção é para uso como um medicamento para a DMD, mais preferencialmente o referido oligonucleotídeo é para uso na modulação terapêutica de RNA. Portanto, um oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo anti-senso (AON). Um oligonucleotídeo anti-senso é um oligonucleotídeo que é complementar reverso a uma sequência específica de pré-mRNA de DMD ou distrofina, derivado da cadeia com sentido codificante de um DNA de um indivíduo. Este oligonucleotídeo se liga, e/ou alveja, e/ou hibridiza, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar a referida sequência do referido pré-mRNA. O objetivo da modulação do RNA para a DMD é para saltar um ou mais éxons específicos no pré-mRNA de DMD ou distrofina, a fim de restaurar o quadro de leitura aberta do transcrito, e para induzir a expressão de uma menor, mas (mais) funcional proteína de distrofina, com o objetivo final de ser capaz de interferir com o curso da doença.

[66] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção é, portanto, utilizado para a indução do salto do éxon no pré-mRNA de DMD ou distrofina em uma célula, em um órgão, em um tecido e/ou em um indivíduo. O salto do éxon resulta no RNA de DMD ou distrofina maduro, que não contém um éxon saltado, e, portanto, quando o referido éxon codifica para aminoácidos, pode levar à expressão de um produto de proteína mais curto. O salto de um éxon é preferencialmente induzido pela ligação de um AON às sequências internas de éxon específicas compreendendo elementos reguladores de splicing, os sítios de splicing, e/ou sequências de ponto de derivação intrônico.

[67] Conforme aqui definido, um pré-RNA de DMD preferencialmente significa um pré-mRNA de um gene DMD codificando para uma proteína de distrofina. Um pré-RNA de DMD corresponde a um pré-RNA de um paciente BMD ou DMD com uma mutação quando comparado a um pré-RNA de DMD tipo selvagem de uma pessoa não afetada, resultando em (níveis reduzidos de) uma proteína anômala (BMD), ou a ausência de distrofina funcional (DMD). Um pré-RNA de DMD é também nomeado um pré-RNA de distrofina. Um gene DMD pode também ser nomeado um gene de distrofina. Distrofina e DMD podem ser usados intercambiavelmente através do pedido.

[68] Um paciente é preferencialmente pretendido a significar um paciente tendo DMD ou BMD, conforme definido aqui posteriormente, ou um paciente suscetível a desenvolver DMD ou BMD devido ao seu antecedente genético. No caso de um paciente DMD, um oligonucleotídeo usado corrigirá preferencialmente uma mutação conforme presente no gene DMD do referido paciente, e criará uma proteína que será semelhante a uma proteína BMD: a referida proteína será preferencialmente uma distrofina funcional ou semi- funcional, conforme aqui definido posteriormente. No caso de um paciente BMD, um oligonucleotídeo conforme usado corrigirá preferencialmente uma mutação conforme presente no gene BMD do referido paciente, e criará uma distrofina que será mais funcional do que a distrofina a qual estava originalmente presente no referido paciente BMD.

[69] Conforme aqui definido, uma distrofina funcional é preferencialmente uma distrofina de tipo selvagem correspondente a uma proteína tendo a sequência de aminoácido conforme identificada na SEQ ID NO: 1. Conforme definido aqui, uma distrofina semi-funcional é preferencialmente uma distrofina semelhante à BMD, correspondendo a uma proteína tendo um domínio de ligação atuante em sua parte N terminal (primeiros 240 aminoácidos do N terminal), um domínio rico em cisteína (3361 até 3685 aminoácidos), e um domínio C terminal (últimos 325 aminoácidos do C terminal), cada um desses domínios sendo presente em uma distrofina tipo selvagem, conforme conhecido pelo técnico especialista no assunto. Os aminoácidos aqui identificados correspondem aos aminoácidos da distrofina do tipo selvagem, sendo representados pela sequência SEQ ID NO: 1. Em outras palavras, uma distrofina funcional ou semi-funcional é uma distrofina que exibe pelo menos em alguma extensão, uma atividade da distrofina do tipo selvagem. "Pelo menos em alguma extensão" preferencialmente significa pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 100% de atividade selvagem. Neste contexto, uma atividade de uma distrofina funcional é, preferencialmente, a ligação à actina para o complexo de glicoproteína associada à distrofina (DAPC ou DGC)(Ehmsen J et al, 2002).

[70] A ligação da distrofina para a actina e para o complexo DGC ou DAPC pode ser visualizada tanto por co- imunoprecipitação usando extratos de proteína total, ou análise de imunofluorescência de seções transversais usando vários anticorpos que reagem com os diferentes membros do complexo, a partir de uma biopsia do controle (não-DMD) de um músculo suspeito de ser distrófico, pré e/ou pós- tratamento, tal como é conhecido pelo técnico especialista no assunto.

[71] Os indivíduos ou pacientes que sofrem de Distrofia Muscular de Duchenne normalmente têm uma mutação no gene que codifica a distrofina (gene DMD ou da distrofina), o que impede a síntese da proteína completa, ou seja, um códon prematuro de parada impede a síntese do C-terminal. Na Distrofia Muscular de Becker, o gene da distrofina também compreende uma mutação em comparação com o tipo selvagem, mas a mutação normalmente não resulta em um códon prematuro de parada, e o C-terminal é normalmente sintetizado. Como resultado, é sintetizada uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional que tem, pelo menos, a mesma atividade em espécie da proteína de tipo selvagem, embora não necessariamente a mesma quantidade de atividade.O genoma de um paciente BMD normalmente codifica uma proteína distrofina que compreende a parte N-terminal (os primeiros 240 aminoácidos do N-terminal), um domínio rico em cisteína (aminoácido 3361 até 3685), e um domínio C- terminal (últimos 325 aminoácidos do C-terminal), mas na maioria dos casos, o seu domínio em forma de bastonete é mais curto do que o da distrofina de um tipo selvagem (Monaco et al., 1988). O salto de éxon induzido por oligonucleotídeo anti-senso para o tratamento de DMD é normalmente dirigido para superar a parada prematura no pré-mRNA através do salto do éxon, preferencialmente no domínio em forma de domínio de haste central, para corrigir o quadro de leitura aberto e permitir a síntese do restante da proteína de distrofina incluindo o C-terminal, embora a proteína seja um pouco menor como resultado de um domínio de haste menor. Em uma modalidade preferida, um indivíduo tendo DMD e sendo tratado por um oligonucleotídeo como aqui definido, será fornecido com uma distrofina que exibe, pelo menos em alguma extensão, uma atividade de uma distrofina de tipo selvagem. Mais preferencialmente, se o referido indivíduo é um paciente com Duchenne ou é suspeito de ser um paciente com Duchenne, uma distrofina funcional ou semi- funcional é uma distrofina de um indivíduo tendo BMD: normalmente a referida distrofina é capaz de interagir com ambos actina e DCG ou DAPC, mas seu domínio em forma de bastonete pode ser mais curto do que o de uma distrofina do tipo selvagem (Monaco et al., 1988). O domínio de bastonete da distrofina de tipo selvagem compreende 24 repetições semelhantes à espectrina. Por exemplo, um domínio em forma de bastonete da distrofina, conforme aqui fornecido, pode compreender de 5 a 23, 10 a 22 ou 12 a 18 repetições semelhantes à espectrina, contanto que possa se ligar à actina e ao DGC.

[72] O alívio de um ou mais sintoma (s) da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker de um indivíduo utilizando um oligonucleotídeo da invenção, pode ser avaliado por qualquer dos seguintes ensaios: prolongamento do tempo para a perda da caminhada, melhora da força muscular, melhora da capacidade de levantar peso, melhora do tempo necessário para levantar do chão, melhora no tempo de caminhada de nove metros, melhora no tempo gasto para subida de quatro escadas, melhora do grau de função perna, melhora da função pulmonar, melhora da função cardíaca, a melhora da qualidade de vida. Cada um desses ensaios é conhecido pelo técnico especialista no assunto. Como um exemplo, a publicação de Manzur et al (2008) fornece uma explicação extensiva de cada um desses ensaios. Para cada um desses ensaios, quanto mais cedo uma melhora ou prolongação detectável de um parâmetro medido em um ensaio foi encontrada, significará preferencialmente que um ou mais sintomas da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker foi aliviado em um indivíduo usando um oligonucleotídeo da invenção. A melhora ou prolongação detectável é preferencialmente uma melhora ou prolongação estatisticamente significante conforme descrito por Hodgetts et al. (2006). Alternativamente, o alívio de um ou mais sintoma(s) da Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker pode ser avaliado pela medida de uma melhora, integridade, e/ou sobrevivência da função da fibra muscular. Em um método preferido, um ou mais sintoma(s) de um paciente com DMD ou BMS é/são aliviados, e/ou uma ou mais característica(s) de uma ou mais células musculares de um paciente com DMD ou BMS é/são melhoradas. Tais sintomas ou características podem ser avaliados por nível celular, tecidual, ou no próprio paciente.

[73] Um alívio de uma ou mais características de uma célula muscular de um paciente pode ser avaliado por qualquer um dos seguintes ensaios em uma célula miogênica ou célula muscular de um paciente: captação reduzida de cálcio pelas células musculares, diminuição da síntese de colágeno, morfologia alterada, biossíntese lipídica alterada, estresse oxidativo diminuído, e/ou função da fibra muscular melhorada, integridade, e/ou a sobrevivência. Estes parâmetros são normalmente avaliados através de imunofluorescência e/ou análise histoquímica de seções transversais de biópsias musculares.

[74] A melhora da função das fibras musculares, a integridade e/ou a sobrevivência podem ser avaliadas usando pelo menos um dos seguintes ensaios: diminuição detectável de creatina quinase no sangue, diminuição detectável de necrose da fibra muscular em um corte transversal de uma biópsia do músculo suspeito de ser distrófico, e/ou um aumento detectável da homogeneidade do diâmetro das fibras musculares em uma secção transversal de uma biópsia de um músculo suspeito de ser distrófico. Cada um desses ensaios é conhecido pelo técnico especialista no assunto.

[75] A creatina quinase pode ser detectada no sangue, conforme descrito em Hodgetts et al. (2006). Uma diminuição detectável da proteína quinase pode significar uma diminuição de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, comparada com a concentração de queratina quinase no mesmo paciente com DMD ou BMD antes do tratamento.

[76] Uma diminuição detectável de necrose das fibras musculares é avaliada preferencialmente em uma biópsia muscular, mas preferencialmente conforme descrito em Hodgetts et al. (2006), usando seções transversais de biópsia. Uma diminuição detectável de necrose pode ser uma diminuição de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais da área em que a necrose foi identificada usando seções transversais de biópsia. A diminuição é medida em comparação com a necrose, conforme avaliada no mesmo paciente com DMD ou BMD antes do tratamento.

[77] Um aumento detectável da homogeneidade do diâmetro da fibra muscular é preferencialmente avaliado em uma seção transversal da biópsia muscular, mais preferencialmente conforme descrito em Hodgetts et al. (2006). O aumento é medido em comparação com a homogeneidade do diâmetro da fibra muscular no mesmo paciente com DMD ou BMD antes do tratamento.

[78] Preferencialmente, um oligonucleotídeo da invenção fornece ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou uma semi-funcional (normalmente no caso de DMD), e é capaz de, durante, pelo menos em parte, reduzir a produção de uma proteína distrofina anômala no referido indivíduo (tipicamente, no caso de BMD).

[79] A diminuição da produção de um RNAm de distrofina anômala, ou proteína de distrofina anômala, de preferência, significa que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% ou menos do quantidade inicial de RNAm da distrofina anômala, ou proteína distrofina anômala, ainda é detectável por RT-PCR (RNAm) ou imunofluorescência ou western blot (proteína). Um mRNA ou proteína de distrofina anômala também é aqui referido como um menos comparação com um tipo selvagem da proteína distrofina funcional, tal como aqui anteriormente definido), ou um RNAm ou proteína de distrofina não-funcional. Uma proteína não-funcional é preferencialmente uma proteína de distrofina que não é capaz de ligar actina e/ou membros do complexo de proteína DGC. Uma proteína distrofina não- funcional ou mRNA de distrofina normalmente não possui ou não codifica uma proteína de distrofina com um C-terminal intacto da proteína. A detecção de um mRNA ou proteína de distrofina funcional ou semi-funcional pode ser feita como para um mRNA, ou proteína de distrofina anômala.

[80] Uma vez que um paciente com DMD é fornecido com uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional, pelo menos parte da causa do DMD é retirada. Por isso, seria esperado, portanto, que os sintomas da DMD sejam pelo menos parcialmente aliviados. A frequência de salto reforçada também aumenta o nível de uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional produzida em uma célula muscular de um indivíduo com DMD ou BMD.

[81] Os éxons contêm uma ou mais sequências específicas compreendendo elementos reguladores de splicing, que têm mostrado serem alvos eficazes para os oligonucleotídeos anti-senso (Aartsma-Rus et al, 2010). Uma modalidade, portanto, fornece um oligonucleotídeo para fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional, em que o referido oligonucleotídeo compreende uma sequência que é especificamente ligada, dirigida, e/ou hibridizada com, e/ou bloqueia esses elementos reguladores de splicing no éxon de pré-mRNA da distrofina. O referido oligonucleotídeo é também capaz de se ligar, e/ou alvejar, e/ou hibridizar com, e/ou bloquear esses elementos reguladores de splicing em um pré-mRNA de distrofina. Além disso, uma vez que um éxon será apenas incluído no mRNA resultando quando ambos os sítios de splicing são reconhecidos pelo complexo de spliceossoma, os sítios de splicing são outros alvos para um oligonucleotídeo da invenção. Uma modalidade, portanto, fornece um oligonucleotídeo para fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou semi- funcional, em que o referido oligonucleotídeo compreende uma sequência que é especificamente ligada, dirigida, e/ou hibridizada com, e/ou bloqueia um ou ambos os sítios de splicing de um éxon de um pré-mRNA de distrofina. O referido oligonucleotídeo é também capaz de se ligar, e/ou alvejar, e/ou hibridizar com, e/ou bloquear um ou ambos desses sítios de splicing de um éxon de um pré-mRNA de distrofina. Normalmente, um sítio de splicing de um éxon compreende 1, 2, 3 ou mais nucleotídeos presentes no referido éxon, e 1, 2, 3 ou mais nucleotídeos presentes no íntron adjacente ou vizinho. Em uma modalidade, é usado um oligonucleotídeo que é unicamente ligado a, e/ou dirigido, e/ou hibridizado com uma região de íntron de um pré-mRNA de distrofina. O referido oligonucleotídeo é também capaz de se ligar, e/ou capaz de alvejar e/ou capaz de hibridizar com a referida região de íntron. Isso, no entanto, não é necessário: é também possível usar um oligonucleotídeo que alveja, e/ou é capaz de se ligar, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com uma sequência de íntron específica, bem como uma sequência de éxon específica. Evidentemente, um oligonucleotídeo não está necessariamente ligando a, e/ou direcionando, e/ou hibridizando com a sequência inteira de um éxon ou íntron de distrofina. O referido oligonucleotídeo também não é necessariamente capaz de se ligar, e/ou capaz de alvejar, e/ou capaz de hibridizar com a sequência inteira de um éxon ou íntron de distrofina. Oligonucleotídeos que estão especificamente ligando, direcionando, e/ou hibridizando com, e/ou que são especificamente capazes de se ligar, e/ou capazes de dirigir, e/ou capazes de hibridizar parte do referido éxon ou íntron, são preferidos. Um oligonucleotídeo é usado, o referido oligonucleotídeo é preferencialmente complementar reverso a, e/ou se liga a, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com pelo menos parte de um éxon e/ou íntron, a referida parte tendo 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos.

[82] O splicing de um pré-mRNA de distrofina ocorre através de reações de transesterificação sequenciais, envolvendo um ponto de ramificação intrônico e um sítio de splicing de um íntron adjacente. Assim, um oligonucleotídeo é utilizado para o salto do éxon, em que o referido oligonucleotídeo contém uma sequência que está ligando, e/ou direcionando, e/ou hibridizando com, ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de se dirigir, e/ou é capaz de hibridizar com tal ponto de ramificação e/ou sítio de splicing. Preferencialmente, o referido ponto de ramificação e/ou sítio de splicing está presente em um pré- mRNA de distrofina.

[83] Uma vez que os locais de junção contêm sequências de consenso, o uso de uma parte do oligonucleotídeo, ou um equivalente funcional do mesmo compreendendo uma sequência que é capaz de ligação a, e/ou capaz de se ligar a, e/ou capaz de se dirigir, e/ou capaz de hibridizar, e/ou se liga a, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com um sítio de splicing, envolve o risco de hibridização promíscua. A hibridização do referido oligonucleotídeo com outros sítios de splicing diferentes dos sítios do éxon a ser saltado, poderia facilmente interferir com a precisão do processo de splicing. Para superar estes e outros problemas potenciais relacionados com o uso de um oligonucleotídeo que está ligando, e/ou hibridizando, e/ou direcionando, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de se dirigir, e/ou é capaz de hibridizar um sítio de splicing, a modalidade mais preferida fornece um oligonucleotídeo para fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional, em que o referido oligonucleotídeo ou um equivalente funcional do mesmo se liga, e/ou hibridiza com, e/ou se dirige, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de hibridizar, e/ou é capaz de alvejar uma parte específica de um éxon de pré-mRNA de distrofina. Os éxons contêm sequências codificantes que são normalmente mais específicas do que as sequências de íntron não- codificantes. Preferencialmente, o referido oligonucleotídeo ligando a, e/ou hibridizando com, e/ou direcionando, e/ou capaz de se ligar a, e/ou capaz de hibridizar com, e/ou capaz de se dirigir uma parte específica de um éxon de pré-mRNA de distrofina, é capaz de especificamente bloquear, interferir, e/ou inibir a sequência reguladora de splicing, e/ou a estrutura do éxon antecipado no referido pré-mRNA de distrofina. A interferência com tal sequência reguladora de splicing e/ou estrutura, tem a vantagem de que tais elementos estão localizados dentro do éxon. Os riscos para efeitos fora do alvo relacionados à sequência são, portanto, limitados. Através do fornecimento de um oligonucleotídeo para o interior do éxon a ser saltado, é possível encobrir o éxon do aparelho de splicing. A falha do aparelho de splicing para reconhecer o éxon a ser saltado, conduz assim, à exclusão do éxon do mRNA final. Esta modalidade não interfere diretamente com o processo enzimático da maquinaria de splicing (junção dos éxons). É pensado que isto permite que o método seja mais específico, e/ou confiável. Foi verificado que um oligonucleotídeo capaz de ligação a, e/ou capaz de se ligar a, e/ou capaz de alvejar, e/ou capaz de hibridizar, e/ou se ligar, e/ou hibridizar com, e/ou dirigir um éxon em qualquer ponto, pode ser capaz de induzir o salto do referido éxon.

[84] Dentro do contexto da invenção, um oligonucleotídeo da invenção pode compreender um equivalente funcional ou um equivalente de um oligonucleotídeo. Um equivalente funcional ou um equivalente de um oligonucleotídeo significa de preferência um oligonucleotídeo, tal como aqui definido, em que um ou mais nucleotídeos foram substituídos, e em que uma atividade do referido equivalente funcional ou equivalente é retida em pelo menos em alguma extensão Preferencialmente, uma atividade do referido oligonucleotídeo compreendendo um equivalente funcional ou um equivalente de um oligonucleotídeo, é fornecer uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional. A referida atividade do referido oligonucleotídeo compreendendo um equivalente funcional ou um equivalente de um oligonucleotídeo é, por conseguinte, de preferência, avaliada quantificando-se a quantidade de uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional. Uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional é aqui preferencialmente definida como sendo uma distrofina capaz de ligar actina e membros do complexo de proteínas DGC (ou DAPC). A avaliação da referida atividade do referido equivalente funcional de um oligonucleotídeo é preferencialmente feita por meio de RT-PCR e sequenciamento (no nível RNA; para detecção do salto de éxon específico), ou por imunofluorescência e análise de Western blot (no nível de proteína: para a detecção de restauração de proteína). A referida atividade é preferencialmente mantida a, pelo menos em alguma extensão, quando ela representa, pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95% ou mais da atividade correspondente do referido oligonucleotídeo, do equivalente funcional ou do equivalente derivado do mesmo. Ao longo deste pedido, quando o termo oligonucleotídeo é utilizado, este pode ser substituído por um equivalente funcional do mesmo ou um equivalente do mesmo, tal como aqui definido. Em uma modalidade, um equivalente funcional ou um equivalente de um oligonucleotídeo da invenção compreende uma modificação. Ao longo deste pedido, quando o termo oligonucleotídeo é utilizado, este pode ser substituído por um oligonucleotídeo anti-senso conforme definido aqui, a menos que indicado de outra forma.

[85] Por isso, o uso de um oligonucleotídeo ou um equivalente funcional do mesmo, ou um equivalente do mesmo compreendendo um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, consistindo de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e compreendendo uma 5-metilpirimidina (ou seja um anel de 5- metilcitosina e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma base de 2,6-diaminopurina, e sendo representado por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de uma sequência que é complementar reversa a, e/ou se liga a, e/ou direciona, e/ou hibridiza, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de dirigir, e/ou é capaz de hibridizar com um éxon de pré-mRNA de distrofina, é assumido para ter um efeito positivo em pelo menos um dos parâmetros do referido oligonucleotídeo, tal como foi já definido aqui quando comparado com os seus homólogos que não compreendem qualquer 5-metilcitosina, 5-metiluracila e 2,6- diaminopurina (isto é, o chamado oligonucleotídeo não modificado) tal como indicado aqui anteriormente, e é, por conseguinte, assumido que exibe um resultado terapêutico melhorado em uma célula DMD ou uma BMD de um paciente, e/ou em um paciente DMD ou um BMD. Tal resultado terapêutico pode ser caracterizado por:- alívio de um ou mais sintoma(s) de DMD ou BMD, e/ou- alívio de uma ou mais característica(s) de uma célula muscular a partir de um paciente, e/ou- fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional, e/ou- pelo menos em parte, diminuir a produção de uma proteína distrofina anômala no referido indivíduo.

[86] Cada uma dessas características já foi definida aqui.

[87] Preferencialmente, um oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos que compreende ou consiste de uma sequência que está se ligando a, e/ou se direcionando a, e/ou sendo complementar reversa a, e/ou está hibridizando com, e/ou que é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar a, e/ou é capaz de se hibridizar com, e/ou é complementar reversa a pelo menos uma parte dos éxons 44 a 55 de pré-mRNA de distrofina, o referido oligonucleotídeo tendo um comprimento de pelo menos 10 nucleotídeos. No entanto, o comprimento do referido oligonucleotídeo por ser pelo menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 oligonucleotídeos. Ao longo da invenção, a referida sequência representando o oligonucleotídeo também pode ser chamada de uma base ou uma sequência de nucleotídeo.

[88] Preferencialmente, um oligonucleotídeo da invenção é representado por uma sequência de nucleotídeos ou uma sequência de bases, que compreende ou consiste de uma sequência que é capaz de se ligar a, e/ou se dirigir, e/ou ser complementar reversa a, e/ou hibridizar com, e/ou ser capaz de se ligar, e/ou ser capaz de hibridizar com, e/ou ser capaz de dirigir uma parte de um éxon do pré-mRNA de distrofina. Tal parte de ligação ou direcionamento pode ser pelo menos 50% do comprimento do oligonucleotídeo da invenção, ou pelo menos 60%, ou, pelo menos 70%, ou, pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou 98% e até 100%. Um oligonucleotídeo pode ser representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases, a referida sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo uma sequência que se liga a, e/ou se dirige a, e/ou é complementar reversa a, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de se hibridizar com, e/ou é capaz de alvejar a pelo menos uma parte dos éxons 44 a 55 do pré-mRNA de distrofina conforme aqui definido, e sequências flanqueadoras adicionais. Em uma modalidade mais preferida, o comprimento da referida parte de ligação ou alvo do referido oligonucleotídeo é de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Diversos tipos de sequência flanqueadoras podem ser usadas. Preferencialmente, as sequências flanqueadoras são usadas para modificar a ligação de uma proteína ao referido oligonucleotídeo, ou para modificar uma propriedade termodinâmica do referido oligonucleotídeo, mais preferencialmente para modificar a afinidade de ligação do RNA alvo. Em outra modalidade preferida, as sequências flanqueadoras adicionais são complementares reversas para as sequências do pré-mRNA de distrofina que não estão presentes no referido éxon. Tais sequências flanqueadoras são preferencialmente capazes de se ligar a, e/ou se dirigir a sequências compreendendo ou consistindo de sequências de consenso doadoras ou aceptoras de ramificação e/ou sítios de splicing do referido éxon. Em uma modalidade preferida, tais sequências flanqueadoras são capazes de se ligar a, e/ou sequências de direcionamento compreendendo ou consistindo em sequências de um íntron do pré-RNAm de distrofina que é adjacente ao referido éxon.

[89] Uma modalidade preferida fornece um oligonucleotídeo para fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional, o referido oligonucleotídeo ou um equivalente funcional do mesmo, ou um equivalente mesmo, sendo representado por uma sequência ou uma sequência de bases que compreende: - uma sequência que se liga, é capaz de se ligar, se dirige, hibridiza, ou é complementar inversa a uma região de um éxon de pré-mRNA de distrofina que é hibridizado com outra parte de um éxon de pré-mRNA de distrofina(estrutura fechada), e- uma sequência que se liga, e/ou se dirige, e/ou hibridiza, e/ou é complementar reversa a, e/ou é capaz de se ligar, e/ou é capaz de dirigir, e/ou é capaz de hibridizar com uma região de um éxon de pré-mRNA de distrofina que não é hibridizada no referido pré-mRNA de distrofina (estrutura aberta).

[90] Para essa modalidade, é feito referência ao pedido de patente WO 2004/083446. As moléculas de RNA apresentam estruturas secundárias fortes, principalmente devido ao pareamento de bases de trechos complementares ou parcialmente complementares dentro do mesmo RNA. Tem sido pensado já há muito tempo, que as estruturas do RNA desempenham um papel na função do RNA. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que a estrutura secundária do RNA de um éxon desempenha um papel na estruturação do processo de splicing. Através da sua estrutura, um éxon é reconhecido como uma parte que deve ser incluída no mRNA. Em uma modalidade, um oligonucleotídeo é capaz de interferir com a estrutura do éxon e, por conseguinte, é capaz de interferir com o aparelho de splicing do referido éxon, mascarando o éxon do aparelho de splicing e, assim, induzindo o salto do referido éxon. Verificou-se que muitos oligonucleotídeos de fato compreendem esta capacidade, alguns um pouco mais eficazes do que os outros. Sem estar ligado por teoria, é pensado que a sobreposição com uma estrutura aberta melhora a eficiência de invasão do oligonucleotídeo (ou seja, aumenta a eficiência com a qual o oligonucleotídeo pode entrar na estrutura), ao passo que a sobreposição com a estrutura fechada aumenta a eficiência de interferir com a estrutura secundária do RNA do éxon. Foi verificado que o comprimento da complementaridade parcial reversa tanto para a estrutura fechada quanto para a abertura, não é extremamente restrito. Foram observadas altas eficiências com compostos compreendendo oligonucleotídeos com comprimentos variáveis de complementaridade reversa em qualquer estrutura. O termo complementaridade (reversa) é aqui utilizado para referir- se a um trecho de ácidos nucleicos que podem hibridizar com outro trecho de ácidos nucleicos em condições fisiológicas. As condições de hibridização são aqui definidas posteriormente. É, portanto, não absolutamente necessário que todas as bases da região de complementaridade sejam capazes do emparelhamento com bases na cadeia oposta. Por exemplo, ao projetar um oligonucleotídeo anti-senso, pode- se querer incorporar, por exemplo, um resíduo que não faz par de bases com a base no filamento complementar. Os desemparelhamentos podem em certa medida ser permitidos, se nas circunstâncias na célula, o trecho de nucleotídeos é capaz de hibridizar para a parte complementar.

[91] Em uma modalidade preferida, uma parte complementar reversa de um oligonucleotídeo anti-senso (ou a referida estrutura aberta ou a referida fechada) compreende pelo menos 3, e mais preferencialmente, pelo menos, 4 nucleotídeos consecutivos. As regiões complementares reversas são preferencialmente projetadas de tal modo que, quando combinadas, elas são específicas para um éxon de um pré-mRNA. Tal especificidade pode ser criada com vários comprimentos das regiões complementares reversas, conforme isto depende das sequências reais no outro pré-mRNA no sistema. O risco de que também um ou vários outros pré-RNAm será capaz de hibridizar, para um oligonucleotídeo diminui com o aumento do tamanho do referido oligonucleotídeo. É claro que um oligonucleotídeo anti-senso compreendendo desemparelhamentos na região de complementaridade reversa, mas que retém a capacidade para hibridizar com a região(ões) alvo do pré-RNAm, pode ser utilizado na presente invenção. No entanto, preferencialmente, pelo menos, as partes complementares reversas não compreendem tais desemparelhamentos, como estes tipicamente têm uma maior eficiência e uma maior especificidade do que os oligonucleotídeos tendo tais desemparelhamentos em uma ou mais regiões complementares reversas. É pensado que as forças mais elevadas de hibridização (ou seja, o aumento do número de interações com a cadeia oposta) são favoráveis para o aumento da eficiência do processo de interferir com a maquinaria de splicing do sistema. Preferencialmente, a complementaridade reversa é de 90 a 100%. Em geral, isso permite para 1 ou 2 desemparelhamento(s) em um oligonucleotídeo de 20 nucleotídeos, ou 1 a 4 desemparelhamentos em um oligonucleotídeo de 40 nucleotídeos. Portanto, podemos ter 1, 2, 3, 4, 5 desemparelhamentos em um oligonucleotídeo de 10 a 50 nucleotídeos. Preferencialmente, 0, 1 ou 2 desemparelhamentos estão presentes em um oligonucleotídeo de 10 a 50 nucleotídeos.

[92] A estrutura (isto é, as estruturas abertas e fechadas) é mais bem analisada no contexto do pré-mRNA em que o éxon reside. Essa estrutura pode ser analisada no RNA real. Contudo, é atualmente possível prever a estrutura secundária de uma molécula de RNA (em menores custos de energia) completamente bem, utilizando programas de modelagem-estrutura. Exemplos não-limitativos de um programa adequado são RNA structure versão 4.5, ou RNA mfold versão 3.5 (Zuker et al., 2003). Um técnico reprodutibilidade adequada, uma estrutura susceptível de um éxon, dada uma sequência de nucleotídeos. Melhores predições são obtidas ao fornecer tais programas de modelagem com ambos éxon e sequências de íntrons adjacentes referidos. Isso não é normalmente necessário para modelar a estrutura de todo o pré-mRNA.

[93] A estrutura aberta e a fechada para as quais o oligonucleotídeo de um oligonucleotídeo é dirigido são preferencialmente adjacentes uma a outra. É pensado que desta forma a hibridização entre os ácidos nucleicos do oligonucleotídeo com a estrutura aberta induz a abertura da estrutura fechada, quando então a hibridização entre os ácidos nucleicos avança nessa estrutura fechada. Através desta ação, a estrutura previamente fechada assume uma conformação diferente. No entanto, quando as sequências aceptoras e/ou doadoras de splicing (polimorfismo) potenciais estão presentes dentro do éxon alvo, ocasionalmente um novo sinal de inclusão de éxon ou sequência reguladora de splicing, elemento, estrutura, ou sinal é gerado definindo um éxon diferente (novo), ou seja, com um 5' terminal diferente, um 3' terminal diferente, ou ambos. Este tipo de atividade está dentro do escopo da presente invenção, como o éxon alvo é excluído do mRNA. A presença de um novo éxon contendo parte do éxon alvo no mRNA, não altera o fato de que o éxon alvo, como tal, é excluído. A inclusão de um novo éxon pode ser vista como um efeito colateral que ocorre apenas ocasionalmente. Existem duas possibilidades quando o salto do éxon é usado para restaurar (parte de) um quadro de leitura aberta da distrofina, que é interrompido como um resultado de uma mutação. Uma delas é que o novo éxon é funcional na recuperação do quadro de leitura, enquanto que no outro caso, o quadro de leitura não é restaurado. Ao selecionar um composto compreendendo um oligonucleotídeo para restauração dos quadros de leitura da distrofina por meio do salto de éxon, é naturalmente evidente que nestas condições apenas os compostos compreendendo os oligonucleotídeos são selecionados, o que na verdade resulta em salto de éxon que restabelece o quadro de leitura aberta da distrofina, com ou sem um novo éxon.

[94] Ainda é fornecido um oligonucleotídeo para fornecer ao referido indivíduo uma proteína distrofina funcional ou uma semi-funcional, em que o referido oligonucleotídeo, ou um equivalente funcional do mesmo, ou um equivalente do mesmo, compreende um monômero de 2'-O- metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6-diaminopurina, e é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo uma sequência que é complementar reversa, e/ou se liga, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com um sítio de ligação para uma proteína serina-arginina (SR) no RNA de um éxon de um pré-mRNA de distrofina. No pedido de patente WO 2006/112705 foi revelada a presença de uma correlação entre a efetividade de um oligonucleotídeo anti-senso de éxon interno em induzir o salto do éxon, e a presença de um (por exemplo, por ESEfinder) sítio de ligação previsto no sítio do pré-mRNA alvo do referido AON. Portanto, em uma modalidade, é gerado um oligonucleotídeo compreendendo a determinação de um sítio de ligação (putativo) para uma proteína SR (Ser-Arg) no RNA de um éxon da distrofina, e produzindo um composto correspondente compreendendo o oligonucleotídeo que é complementar reverso, e/ou se liga, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar o referido RNA, e que pelo menos sobrepõe parcialmente o referido sítio de ligação (putativo). O termo "pelo menos sobrepõe parcialmente" é aqui definido como para compreender uma sobreposição de apenas um único nucleotídeo de um sítio de ligação SR, bem como vários nucleotídeos do referido sítio de ligação, bem como uma sobreposição completa do referido local de ligação. Esta modalidade preferencialmente compreende ainda a determinação de uma estrutura secundária do referido RNA, uma região que hibridiza com outra parte do referido RNA (estrutura fechada), e uma região que não é hibridizada na referida estrutura (estrutura aberta), e, subsequentemente gera um oligonucleotídeo que, pelo menos parcialmente, sobrepõe o referido sítio de ligação (putativo) e que sobrepõe pelo menos parte da referida estrutura fechada, e sobrepõe pelo menos parte da referida estrutura aberta. Deste modo, foi aumentada a probabilidade de se obter um oligonucleotídeo que é capaz de interferir com a inserção do éxon do pré- RNAm no RNAm. É possível que uma primeira região de ligação da SR selecionada não tenha a estrutura aberta-fechada requerida, no caso em que outro (segundo) sítio de ligação da proteína SR é selecionado, que é, em seguida, subsequentemente testado para a presença de uma estrutura aberta-fechada. Este processo continua até que seja identificada uma sequência que contém um sítio de ligação da proteína SR, bem como uma estrutura aberta-fechada (parcialmente sobreposta). Esta sequência é então utilizada para projetar um oligonucleotídeo que é complementar reverso à referida sequência.

[95] Tal método para a geração de um oligonucleotídeo anti-senso também é realizado invertendo a ordem descrita, ou seja, em primeiro lugar gerar um oligonucleotídeo secundária de RNA a partir de um éxon de distrofina, uma região que assume uma estrutura que é hibridizada com outra parte do referido RNA (estrutura fechada), e uma região que não é hibridizada na referida estrutura (estrutura aberta), e, subsequentemente, gerar um oligonucleotídeo, em que pelo menos uma parte do referido oligonucleotídeo é complementar reversa para a referida estrutura fechada, e em que pelo menos outra parte do referido oligonucleotídeo é complementar reversa para a referida estrutura aberta. Isto é seguido pela determinação de que se um sítio de ligação da proteína SR pelo menos sobrepõe com a referida estrutura aberta/fechada. Desta forma, o método do WO 2004/083446 é melhorado. Em ainda outra modalidade, as seleções são realizadas simultaneamente.

[96] Sem desejar estar ligado por qualquer teoria, é pensado atualmente que a utilização de um oligonucleotídeo dirigido a, ou se dirigindo a um sítio de ligação da proteína SR, resulta na (pelo menos parcialmente) dificultação da ligação de uma proteína de SR para o sítio de ligação de uma proteína SR, o que resulta no splicing interrompido ou prejudicado.

[97] De preferência, uma estrutura aberta/fechada e um sítio de ligação da proteína SR se sobrepõem parcialmente, e ainda mais preferível, uma estrutura aberta/fechada sobrepõe completamente um sítio de ligação da proteína SR, ou um sítio de ligação da proteína SR sobrepõe completamente uma estrutura aberta/fechada. Isto permite uma melhora da perturbação da inclusão de éxon.

[98] Além do sítio de splicing consenso e sequências intrônicas ramificadas, muitos (se não todos) os éxons contêm emendas regulatórias de splicing, tais como, mas não limitado às sequências de estimulador exônico de splicing (ESE) para facilitar o reconhecimento dos locais de splicing genuínos pelo spliceossoma (Cartegni et al., 2002; e Cartegni et al., 2003). Um subgrupo de fatores de splicing, chamado de proteínas SR, pode ligar-se a estes ESEs e recrutar outros fatores de splicing, como U1 e U2AF para os sítios de splicing (fracamente definido). Os sítios de ligação das quatro proteínas SR mais abundantes (SF2/ASF, SC35, SRp40 e SRp55) foram analisados em detalhes, e esses resultados são implementados no ESEfinder, uma fonte web que prediz os sítios de ligação em potencial para essas proteínas SR (Cartegni et al., 2002; e Cartegni et al., 2003). Há uma correlação entre a eficácia de um oligonucleotídeo e a presença/ausência de um SF2/ASF, SC35 e SRp40 no sítio de ligação no sítio alvo pelo referido oligonucleotídeo. Em uma modalidade, a invenção então fornece um oligonucleotídeo conforme descrito acima, que é reverso complementar a, e/ou se dirige, e/ou se liga a, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de alvejar a, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de se hibridizar com um sítio de ligação para uma proteína SR. Preferencialmente, a referida proteína SR é SF2/ASF ou SC35 ou SRp40.

[99] Em uma modalidade, um paciente DMD é fornecido com uma proteína distrofina funcional ou semi-funcional utilizando um oligonucleotídeo ou um equivalente funcional do mesmo ou um equivalente do mesmo, compreendendo um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA ou consistindo de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e compreendendo uma base 5- metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5- metiluracilo) e/ou uma 2,6-diaminopurina, e sendo capaz especificamente da ligação ou do direcionamento, e/ou sendo capaz de se ligar, e/ou sendo capaz de alvejar, e/ou sendo capaz de hibridizar uma sequência reguladora de RNA, que é necessária para o splicing correto de um éxon de distrofina em um transcrito. Diversas sequências de RNA cis-atuantes são necessárias para o splicing correto de éxons em uma transcrição. Em particular, os elementos tais como um estimulador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou um silenciador exônico de splicing (ESS) são identificados para regular o splicing específico e eficiente de éxons alternativos e constitutivos. Usando um oligonucleotídeo anti-senso de sequência específica ou um oligonucleotídeo anti-senso de base específica (AON) que se liga a, e/ou se dirige, e/ou é complementar reverso a, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de dirigir os elementos, sua função regulatória é perturbada, de modo que o éxon é saltado, conforme mostrado para DMD. Consequentemente, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo ou um equivalente funcional do mesmo, ou um equivalente do mesmo é usado, que é complementar reverso a, e/ou se liga a, e/ou se dirige a, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar a, e/ou é capaz de hibridizar com um estimulador exônico de splicing (ESE), uma sequência de reconhecimento de éxon (ERS), e/ou um silenciador exônico de splicing (ESS).

[100] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo da invenção compreende ou consiste de uma sequência ou uma sequência de base que é que é complementar reversa a, e/ou se liga a, e/ou se dirige a, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar a, e/ou é capaz de hibridizar com pelo menos uma parte do éxon 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, ou 55 de pré-mRNA de distrofina, a referida parte tendo pelo menos 10 nucleotídeos. No entanto, a referida parte também pode ter pelo menos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou, 33 nucleotídeos. Para os éxons de distrofina identificados acima, foi fornecido o estiramento dos nucleotídeos (SEQ IDNO: 2 a 13 identificados abaixo) do referido éxon, ao qual um oligonucleotídeo se liga a, e/ou é complementar reverso a, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com5’-GCGAUUUGACAGAUCUGUUGAGAAAUGGCGGCGUUUUCAUUAUGAUAUAAAGAUAUUUA AUCAGUGGCUAACAGAAGCUGAACAGUUUCUCAGAAAGACACAAAUUCCUGAGAAUUGG GAACAUGCUAAAUACAAAUGGUAUCUUAAG-3’ (SEQ ID NO: 2) para o salto do éxon 44;5’-GAACUCCAGGAUGGCAUUGGGCAGCGGCAAACUGUUGUCAGAACAUUGAAUGCAACUGG GGAAGAAAUAAUUCAGCAAUCCUCAAAAACAGAUGCCAGUAUUCUACAGGAAAAAUUGG GAAGCCUGAAUCUGCGGUGGCAGGAGGUCUGCAAACAGCUGUCAGACAGAAAAAAGAG- 3’ (SEQ ID NO: 3) para o salto do éxon 45;5’-GCUAGAAGAACAAAAGAAUAUCUUGUCAGAAUUUCAAAGAGAUUUAAAUGAAUUUGUUU UAUGGUUGGAGGAAGCAGAUAACAUUGCUAGUAUCCCACUUGAACCUGGAAAAGAGCAG CAACUAAAAGAAAAGCUUGAGCAAGUCAAG-3’ (SEQ ID NO: 4) para o salto do éxon 46;5’-UUACUGGUGGAAGAGUUGCCCCUGCGCCAGGGAAUUCUCAAACAAUUAAAUGAAACUGGAGGACCCGUGCUUGUAAGUGCUCCCAUAAGCCCAGAAGAGCAAGAUAAACUUGA AAAUAAGCUCAAGCAGACAAAUCUCCAGUGGAUAAAG-3’ (SEQ ID NO: 5) para o salto do éxon 47 GUUUCCAGAGCUUUACCUGAGAAACAAGGAGAAAUUGAAGCUCAAAUAAAAGAC CUUGGGCAGCUUGAAAAAAAGCUUGAAGACCUUGAAGAGCAGUUAAAUCAUCUGCUGCU GUGGUUAUCUCCUAUUAGGAAUCAGUUGGAAAUUUAUAACCAACCAAACCAAGAAGGAC CAUUUGACGUUCAG-3’ (SEQ ID NO: 6) para o salto do éxon 48 5’-GAAACUGAAAUAGCAGUUCAAGCUAAACAACCGGAUGUGGAAGAGAUUUUGUCUAAAGGGCAGCAUUUGUACAAGGAAAAACCAGCCACUCAGCCAGUGAAG-3’ (SEQ ID NO: 7) para o salto do éxon 495’-AGGAAGUUAGAAGAUCUGAGCUCUGAGUGGAAGGCGGUAAACCGUUUACUUCAAGAGCUGAGGGCAAAGCAGCCUGACCUAGCUCCUGGACUGACCACUAUUGGAGCCU-3’ (SEQ ID NO: 8) para o salto do éxon 50;5’-CUCCUACUCAGACUGUUACUCUGGUGACACAACCUGUGGUUACUAAGGAAACUGCCAUC UCCAAACUAGAAAUGCCAUCUUCCUUGAUGUUGGAGGUACCUGCUCUGGCAGAUUUCAA CCGGGCUUGGACAGAACUUACCGACUGGCUUUCUCUGCUUGAUCAAGUUAUAAAAUCAC AGAGGGUGAUGGUGGGUGACCUUGAGGAUAUCAACGAGAUGAUCAUCAAGCAGAAG-3’ (SEQ ID NO: 9) para o salto do éxon 51;5’-GCAACAAUGCAGGAUUUGGAACAGAGGCGUCCCCAGUUGGAAGAACUCAUUACCGCUGC CCAAAAUUUGAAAAACAAGACCAGCAAUCAAGAGGCUAGAACAAUCAUUACGGAUCGAA -3’ (SEQ ID NO: 10) para o salto do éxon 52;5’-UUGAAAGAAUUCAGAAUCAGUGGGAUGAAGUACAAGAACACCUUCAGAACCGGAGGCAACAGUUGAAUGAAAUGUUAAAGGAUUCAACACAAUGGCUGGAAGCUAAGGAAGAAGCUGA GCAGGUCUUAGGACAGGCCAGAGCCAAGCUUGAGUCAUGGAAGGAGGGUCCCUAUACAG UAGAUGCAAUCCAAAAGAAAAUCACAGAAACCAAG-3’ (SEQ ID NO: 11) para o salto do éxon 53;5’-CAGUUGGCCAAAGACCUCCGCCAGUGGCAGACAAAUGUAGAUGUGGCAAAUGACUUGGC CCUGAAACUUCUCCGGGAUUAUUCUGCAGAUGAUACCAGAAAAGUCCACAUGAUAACAG AGAAUAUCAAUGCCUCUUGGAGAAGCAUUCAUAAAAG-3’(SEQ ID NO: 12) para o salto do éxon 54;5’-GGUGAGUGAGCGAGAGGCUGCUUUGGAAGAAACUCAUAGAUUACUGCAACAGUUCCCCC UGGACCUGGAAAAGUUUCUUGCCUGGCUUACAGAAGCUGAAACAACUGCCAAUGUCCUA CAGGAUGCUACCCGUAAGGAAAGGCUCCUAGAAGACUCCAAGGGAGUAAAAGAGCUGAU GAAACAAUGGCAA-3’ (SEQ ID NO: 13) para o salto do éxon 55;

[101] Portanto, um oligonucleotídeo preferido compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (por exemplo, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6-diaminopurina, se liga a, e/ou se dirige, e/ou hibridiza com, e/ou é capaz de se ligar, e/ou de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com um trecho contínuo de pelo menos 10 até 33 nucleotídeos dentro de uma das sequências de nucleotídeos de éxon seguintes, selecionadas a partir da SEQ ID NO: 2 a 13.

[102] Os oligonucleotídeos preferidos também são definidos como a seguir:- compreendem um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consistem de 2'-O-metil fosforotioato RNA;- se ligam a, e/ou são complementares reversos a, e/ou alvejam, e/ou hibridizam com, e/ou é capaz de se ligar a, e/ou é capaz de alvejar, e/ou é capaz de hibridizar com um estiramento contínuo de pelo menos 10 e até 33 nucleotídeos dentro de uma das seguintes sequências de nucleotídeos de éxon selecionadas a partir das SEQ ID NO: 2 a 13 conforme identificado acima.

[103]Mais preferencialmente, tais oligonucleotídeos compreendem uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6- diaminopurina, tal como aqui definido anteriormente.

[104] Mais preferencialmente, os oligonucleotídeos compreendem um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA ou consistem de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreendem uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, e são representado por uma sequência de base ou nucleotídeos compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 14 a 90, ou por uma sequência de base ou nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento das SEQ ID NO: 14 a 90. As SEQ ID NO: 14 a 90 são identificadas na Tabela 1. Neste contexto, "uma 5- metilpirimidina" significa, pelo menos, um 5- metilpirimidina. De acordo, "pelo menos uma 5- metilpirimidina" significa pelo menos uma 5-metilcitosina, e/ou pelo menos uma 5-metiluracila.

[105] De acordo, os oligonucleotídeos não modificados preferidos são preferencialmente derivados de uma das sequências de base ou nucleotídeos SEQ ID NO: 14 a 90 com X = C, Y = L, Z = A), e/ou são representados pela SEQ ID NO: 91, 93, 94 a 170. Cada um destes oligonucleotídeos não modificados compreende nenhuma 5- metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5- metiluracila), e nenhuma 2,6-diaminopurina. Por favor note que a SEQ ID NO: 91 é idêntica à SEQ ID NO: 132.

[106] De acordo, os oligonucleotídeos modificados preferidos são preferencialmente derivados de uma das sequências de base ou nucleotídeos SEQ ID NO: 14 a 90, e compreendem pelo menos uma 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina (isto é, pelo menos um X é m5C = X1 e/ou pelo menos um Y é m5U = Y1 e/ou pelo menos um Z é a2A =Z1. Por favor note que a SEQ ID NO: 92 é idêntica à SEQ ID NO: 199. Os oligonucleotídeos modificados mais preferidos são representados por um nucleotídeo ou sequência de bases compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 92, 171 a 213, 215, 217, 218, 219. Os oligonucleotídeos modificados ainda mais preferidos (todos X = m5C = X1 e/ou todos Y = m5U = Y1 e/ou todos Z = a2A =Z1) são derivados das sequências de base ou nucleotídeo mais preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52, e 57) e são representadas por SEQ ID NO: 92, 171 a 174, 185 a 188, 199, 200, 202 a 215, 217, 218, 219. Os oligonucleotídeos modificados mais preferidos são descritos na Tabela 3.

[107] Dentro do contexto da presente invenção, um fragmento da SEQ ID NO: 14 a 90, ou um fragmento da SEQ ID NO: 91 a 219 significam preferencialmente um nucleotídeo ou uma sequência de bases compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos das referidas SEQ ID NO: 14 a 90, ou das referida SEQ ID NO: 91 a 219.

[108] Tais oligonucleotídeos mais preferidos também são definidos como a seguir:- compreendem um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consistem de 2'-O-metil fosforotioato RNA e- são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de base compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 14 a 90, 91, 93 a 170, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo em um fragmento de SEQ ID NO: 14 a 90, 91, 93 a 170.

[109]Mais preferencialmente, tais oligonucleotídeos compreendem uma 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma base de 2,6-diaminopurina, tal como aqui anteriormente definido.

[110] Os oligonucleotídeos ainda mais preferidos compreendem um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA ou consistem de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreendem uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 14 a 90, 92, 171 a 215, 217, 218, 219, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento das SEQ ID NO: 14 a 90, 92, 171 a 215, 217, 218, 219, e tendo um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. As sequências preferidas (isto é, sequências de nucleotídeos ou de bases preferidas) dentre a SEQ ID NO: 14 a 90, 92 e 171 a 215, 217, 218, 219 incluem a SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 43, 52, 57, 59, 171-174, 185 a 188, 199, 200, 202 a 213, 215, 217, 218, 219, mais preferencialmente SEQ ID NO: 40, 43, 52, 57, 59, 208, 207, 200, 210, 206, 171, 173, 199, 213, 185, 187.

[111] Tais oligonucleotídeos ainda mais preferidos são definidos como a seguir:- compreendem um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA ou consistem de 2'-O-metil fosforotioato RNA; - são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 14 a 90, 91, 93 a 170, 216, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento das SEQ ID NO: 14 a 90, 91, 93 a 170, e tendo um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Mais preferencialmente, tais oligonucleotídeos compreendem uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente.

[112] Ainda mais preferencialmente, tais oligonucleotídeos modificados são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 92, 171 a 213, 215, 217, 218, 219, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento das SEQ ID NO: 92, 171 a 213, 215, 217, 218, 219, e tendo um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos modificados ainda mais preferidos são derivados das sequências de nucleotídeos ou de bases mais preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52, e 57), e são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 92, 171 a 174, 185 a 188, 199, 200, 202 a 213, 215, 217, 218, 219, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento das SEQ ID NO: 92, 171 a 174, 185 a 188, 199, 200, 202 a 213, 215, 217, 218, 219, e tendo um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[113] Os oligonucleotídeos preferidos para a indução do salto do éxon 44 a partir do pré-mRNA de distrofina, são como mostrado abaixo.

[114] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 14 e tem um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 14 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 14.

[115] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 14 é representado pela SEQ ID NO: 94, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 94 é representado pela SEQ ID NO: 143.

[116] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendo SEQ ID NO: 94 e tem um comprimento de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 94 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 94.

[117]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 14 compreende a SEQ ID NO: 63 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 94 compreende a SEQ ID NO: 143, e cada um dos referidos fragmentos preferidos tem um comprimento de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[118] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metil citosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem todas as suas citocinas e/ou todas as suas uracilas e/ou em todas as suas adeninas que se encontram substituídas ou modificadas, tal como aqui definido.

[119] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 15 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 15 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 15.

[120] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 15 é representado pela SEQ ID NO: 95.

[121] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 95 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 95 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 95.

[122]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 15 compreende SEQ ID NO: 64 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 95 compreende SEQ ID NO: 144, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[123] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases, compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 15 ou 95 ou 64 ou 144 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo em um fragmento das SEQ ID NO: 15 ou 95 ou 64 ou 144, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases de SEQ ID NO: 15 ou 95 ou 64 ou 144.

[124]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme aqui definido anteriormente

[125]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 15 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 15 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 15. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[126]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 204 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 204 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 204. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32 ou 33 nucleotídeos.

[127]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 208 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 208 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 208. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[128]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas e todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 205 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 205 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 205. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[129]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 207 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 207 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 207. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[130] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 16 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 16 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 16.

[131] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 16 é representado pela SEQ ID NO: 96.

[132] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 96 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 96 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 96.

[133]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[134] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[135] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 17 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 17 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos ou bases de SEQ ID NO: 17.

[136] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 17 é representado pela SEQ ID NO: 97, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 97 é representado pela SEQ ID NO: 145.

[137] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 97 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 97 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 97.

[138]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[139]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 17 compreende SEQ ID NO: 65 e um fragmento preferido de SEQ ID NO: 97 compreende SEQ ID NO: 145, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[140] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[141] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 18 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 18 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 18.

[142] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 18 é representado pela SEQ ID NO: 98, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 98 é representado pela SEQ ID NO: 146.

[143]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 18 compreende SEQ ID NO: 66 e um fragmento preferido de SEQ ID NO: 98 compreende SEQ ID NO: 146, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[144] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 98 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 98 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 98.

[145] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[146] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 19 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 19 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 19.

[147] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 19 é representado pela SEQ ID NO: 99.

[148] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 99 e tem um comprimento de 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 99 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 99.

[149]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[150] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[151] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 20 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 20 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 20.

[152] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 20 é representando pela SEQ ID NO: 100, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 100 é representado pelas SEQ ID NO: 147, 148 ou 149.

[153] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 100 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 100 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 100.

[154]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 20 compreende SEQ ID NO: 67 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 100 compreende SEQ ID NO: 147, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 20 compreende SEQ ID NO: 68 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 100 compreende SEQ ID NO: 148, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 20 compreende SEQ ID NO: 69 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 100 compreende SEQ ID NO: 149, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[155] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[156] Os oligonucleotídeos preferidos para induzir o salto do éxon 45 a partir do pré-mRNA de distrofina, são conforme definido abaixo.

[157] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 21 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 21 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 21.

[158] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 21 é representando pela SEQ ID NO: 101, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 101 é representado pelas SEQ ID NO: 150, 151 ou 152.

[159] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 101 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 101 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 101.

[160]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 21 compreende SEQ ID NO: 70 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 101 compreende SEQ ID NO: 150, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 21 compreende SEQ ID NO: 71, e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 101 compreende SEQ ID NO: 151, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 21 compreende SEQ ID NO: 72 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 101 compreende SEQ ID NO: 152, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[161] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[162] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 21 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 21, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases da SEQ ID NO: 21.

[163]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente.

[164]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 21 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 21 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 21.

[165] De acordo, o referido oligonucleotídeo é particularmente representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 200 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 200 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 200.

[166]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[167]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas, e todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 209 em particular, e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 21 ou 209 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 21 ou 209. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[168]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 210 em particular, e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 21 ou 210 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 21 ou 210. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[169] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 22, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 22 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 22.

[170] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 22 é representado pela SEQ ID NO: 102.

[171] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 102, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 102 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 102.

[172]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[173] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas.

[174] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 23 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 23 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 23.

[175] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 23 é representado pela SEQ ID NO: 103.

[176]De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 103 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 103 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 103.

[177]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[178] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[179] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 24 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 24 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 24.

[180] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 24 é representado pela SEQ ID NO: 104.

[181] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 104, e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 104 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 104.

[182]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[183] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[184] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 25, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 25 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 25.

[185] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 25 é representado pela SEQ ID NO: 105.

[186] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 105, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 105 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 105.

[187]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[188] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[189] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 26, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 26 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 26.

[190] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 26 é representado pela SEQ ID NO: 106.

[191] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 106, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 106 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 106.

[192]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[193] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[194] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 27, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 27 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 27.

[195] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 27 é representado pela SEQ ID NO: 107.

[196] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 107, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 107 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 107.

[197]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[198] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[199] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 28 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 28 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 28.

[200] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 28 é representado pela SEQ ID NO: 108. Cada uma das SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 108 identificadas na tabela 1 compreendem uma base hipoxantina na posição 7.

[201] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 108 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 108 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 108.

[202]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[203] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[204] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 29 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 29 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 29.

[205] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 29 é representado pela SEQ ID NO: 109.

[206] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 109 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 109 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 109.

[207]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[208] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[209] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 30 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 30 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 30.

[210] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 30 é representado pela SEQ ID NO: 110.

[211] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 110 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 110 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 110.

[212]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[213] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[214] Os oligonucleotídeos preferidos para a indução do salto do éxon 51 a partir do pré-mRNA de distrofina, são conforme definido abaixo.

[215] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5- metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5- metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 31 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 31 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 31.

[216] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 31 é representado por SEQ ID NO: 111, e um fragmento preferido é representado por SEQ ID NO: 153 ou 154.

[217] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 111 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 111 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 111.

[218]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 31 compreende SEQ ID NO: 73 e um fragmento preferido de SEQ ID NO: 111 compreende SEQ ID NO: 153, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 31 compreende SEQ ID NO: 74 e um fragmento preferido de SEQ ID NO: 111 compreende SEQ ID NO: 154, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[219] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[220] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir: [1] compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e [2] é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 31, e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 31, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases da SEQ ID NO: 31.

[221]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente.

[222]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[3] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[4] todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,[5] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 215 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 31 ou SEQ ID NO: 215, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 31 ou da SEQ ID NO: 215. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[223]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[6] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, [7] todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,[8] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 202 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 202 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 202. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[224]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[9] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[10] todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,[11] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 203 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 203 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 203. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[225]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[12] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[13] todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,[14] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 206 e tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 206 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 206. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[226] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 32 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 32 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 32.

[227] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 32 é representado pela SEQ ID NO: 112.

[228] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 112 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 112 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 112.

[229]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[230] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[231] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 33, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 33 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 33.

[232] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 33 é representado pela SEQ ID NO: 113.

[233] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 113, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 113 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 113.

[234]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[235] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[236] Em outra modalidade, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e é representado por uma sequência de bases ou de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 34, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 34 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 34.

[237] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 34 é representado pela SEQ ID NO: 114.

[238] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e é representado por uma sequência de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 114, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 114 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos contíguos da SEQ ID NO: 114.

[239] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[240]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 34 compreende ou consiste da SEQ ID NO: 93 (PS1116: 5’- CAACAUCAAGGAAGAUGGCAUUUCU-3’).

[241] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 34 ou 93 ou 114, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 34 ou 93 ou 114, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 34 ou 93 ou 114.

[242]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme aqui definido anteriormente

[243]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 34, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 34 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 34. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[244]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, - todas as adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 34, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 34 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 34. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[245] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 35 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 35 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 35.

[246] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 35 é representado pela SEQ ID NO: 115.

[247] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 115 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 115 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 115.

[248]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[249] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[250] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 36 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 36 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 36.

[251] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 36 é representado pela SEQ ID NO: 116, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 116 é representado pela SEQ ID NO: 155 ou 156 ou 157.

[252] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 116 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 116 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 116.

[253]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 36 compreende SEQ ID NO: 75 ou um fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 compreende SEQ ID NO: 155, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 36 compreende SEQ ID NO: 76 ou um fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 compreende SEQ ID NO: 156, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 36 compreende SEQ ID NO: 77 ou um fragmento preferido de SEQ ID NO: 116 compreende SEQ ID NO: 157, e cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[254] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[255] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 37 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 37 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 37.

[256] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 37 é representado pela SEQ ID NO: 117.

[257] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 117 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 117 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 117.

[258]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[259] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[260] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 38 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 38 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 38.

[261] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 38 é representado pela SEQ ID NO: 118.

[262] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 118 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 118 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 118.

[263]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[264] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[265] Os oligonucleotídeos preferidos para a indução do salto do éxon 52 a partir do pré-mRNA de distrofina, são conforme definido abaixo.

[266] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 39 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 39 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 39.

[267] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 39 é representado pela SEQ ID NO: 119.

[268] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 119 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 119 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 119.

[269] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[270]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[271]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 201 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 201 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 201. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[272] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 40 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 40 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 40. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[273] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 40 é representado pela SEQ ID NO: 120, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 120 é representado pela SEQ ID NO: 158 ou 159 ou 160.

[274] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 120, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 120 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 120.

[275]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 40 compreende SEQ ID NO: 78, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 120 compreende a SEQ ID NO: 158, cada um dos fragmentos tem um comprimento de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 40 compreende SEQ ID NO: 78, e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 120 compreende a SEQ ID NO: 159, cada um dos fragmentos tem um comprimento de 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 40 compreende SEQ ID NO: 80, e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 120 compreende a SEQ ID NO: 160, cada um dos fragmentos tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[276] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[277] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 40 ou 120, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 40 ou 120, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases das SEQ ID NO: 40 ou 120.

[278]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme aqui definido anteriormente

[279]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 40, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 40 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 40. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 171, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 171 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 171. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 4 citosinas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 171. Está englobado que 1, 2 ou 3 destas citosinas são modificadas.

[280]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 172, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 172 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 172. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 7 uracilas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 172. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas são modificadas.

[281]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 173, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 173 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 173. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 173. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas são modificadas.

[282]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 174, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 174 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 174. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 174, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 174 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 174. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 4 citosinas e nem todas as 7 uracilas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 174. Está englobado que 1, 2 ou 3 destas citosinas e/ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas, são modificadas.

[283]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6-diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 175, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 175 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 175. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 175, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 175 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 175. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. É também englobado que nem todas as 4 citosinas e nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 40, são modificadas como representado na SEQ ID NO: 175. Está englobado que 1, 2 ou 3 destas citosinas e/ou 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas são modificadas.

[284]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 176, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 176 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 176. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 adeninas e nem todas os 7 uracilas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 176. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas e/ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas são modificadas.

[285]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 177, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 177 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 177. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 4 citosinas, e nem todas as 7 uracilas, e nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 40 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 177. Está englobado que 1, 2 ou 3 destas citosinas e/ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas e/ou 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas são modificadas.

[286] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero 2'-O-metil RNA fosforotioato, ou consiste de RNA 2'-O-metil-fosforotioato, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou uma base compreendendo a SEQ ID NO: 41, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 41 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 41.

[287] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 41 é representado pela SEQ ID NO: 121.

[288] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 121 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 121 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 121.

[289]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[290] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[291] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 42 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 42 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 42.

[292] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 42 é representado pela SEQ ID NO: 122.

[293] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 122 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 122 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 122.

[294]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[295] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[296] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 43, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 43 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 43.

[297]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[298] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 43 ou 123 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 43 ou 123, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 43 ou 123. De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 43 é representado por SEQ ID NO: 123, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 123 é representado por SEQ ID NO: 161.

[299] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 123, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 123 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 123.

[300]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente. Ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem todas as suas citocinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas que foram substituídas ou modificadas, tal como definido aqui.

[301]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,

[302] - todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 43 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 43 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 43. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. De acordo, o referidooligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 178, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 178 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 178. Também está englobado que nem todas as 6 citosinas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 178. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas citosinas são modificadas.

[303]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 43 compreende SEQ ID NO: 81 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 123 compreende a SEQ ID NO: 161, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[304]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 179, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 179 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 179. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 11 uracilas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 179. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 destas uracilas são modificadas.

[305]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 180, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 180 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 180. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 2 adeninas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 180. Está englobado que 1 destas adeninas são modificadas.

[306]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 181, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 181 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 181. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 181 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 181 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 181. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 citosinas e nem todas as 11 uracilas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 181. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas citosinas e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 destas uracilas são modificadas.

[307]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo: - consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, - todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6-diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 182, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 182 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 182. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 182 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 182 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 182. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 citosinas e nem todas as 2 adeninas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 182. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas citosinas e/ou 1 destas adeninas são modificadas.

[308]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 183, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 183 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 183. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 2 adeninas e nem todas as 11 uracilas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 183. Está englobado que 1 destas adeninas e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 destas uracilas são modificadas.

[309]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 184, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 184 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 184. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 citosinas, e nem todas as 11 uracilas, e nem todas as 2 adeninas da SEQ ID NO: 43 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 184. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas citosinas e/ou 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 destas uracilas e/ou 1 destas adeninas são modificadas.

[310] Os oligonucleotídeos preferidos para induzir o salto do éxon 53 a partir do pré-mRNA de distrofina, são como se segue abaixo.

[311] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 44, e tem um comprimento de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 44 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 44.

[312] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 44 é representado pela SEQ ID NO: 124.

[313] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 124, e tem um comprimento de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 124 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 124.

[314]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[315] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[316] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 45 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 45 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 45.

[317] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 45 é representado pela SEQ ID NO: 125.

[318] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 125, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 125 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 125.

[319]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[320] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[321] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 46, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 46 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 46.

[322] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 46 é representado pela SEQ ID NO: 126.

[323] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 126, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 126 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 126.

[324]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[325] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[326] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 47, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 47 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 47.

[327] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 47 é representado pela SEQ ID NO: 127.

[328] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 127, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 127 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 127.

[329]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[330] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[331] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 48, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 48 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 48.

[332] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 48 é representado pela SEQ ID NO: 128.

[333] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 128, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 128 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 128.

[334]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[335] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[336] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 49, e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 49 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 49.

[337] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 49 é representado pela SEQ ID NO: 129.

[338] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 129 e tem um comprimento de 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 129 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 129.

[339]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[340] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[341] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 50, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 50 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 50.

[342] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 50 é representado pela SEQ ID NO: 130.

[343] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 130, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 130 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 130.

[344]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[345] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[346] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 51, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 51 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 51.

[347] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 51 é representado pela SEQ ID NO: 131.

[348] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 131 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 131 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 131.

[349]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[350] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[351] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 52, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 52 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 52.

[352] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 52 é representada por SEQ ID NO: 91 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 91 é representado por SEQ ID NO: 162, 163 ou 164. SEQ ID NO: 91 é idêntica à SEQ ID NO: 132.

[353] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 91 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 191 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 91.

[354]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[355] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[356] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:

[357] compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e

[358] é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases, compreendendo ou consistindo das SEQ ID NO: 52 ou 91 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 52 ou 91, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases das SEQ ID NO: 52 ou 91.

[359]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente.

[360]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 52 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 52 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 52. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[361]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 52 compreende SEQ ID NO: 82, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 91 compreende a SEQ ID NO: 162, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 52 compreende SEQ ID NO: 83, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 91 compreende a SEQ ID NO: 163, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 52 compreende a SEQ ID NO: 84, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 91 compreende a SEQ ID NO: 164, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Um fragmento mais preferido da SEQ ID NO: 52 compreende ou consiste da SEQ ID NO: 91 (PS229L: 5’-GUUGCCUCCGGUUCUGAAGGUGUUC-3’). Outro fragmento mais preferido da SEQ ID NO: 52 compreende ou consiste da SEQ ID NO: 92 (PS524: 5’-GUUGXXUXXGGUUXUGAAGGUGUUX-3’; onde X é 5- metilcitosina).

[362] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91 ou 92 ou 162 ou 163 ou 164, e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo em um fragmento de SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91 ou 92 ou 162 ou 163 ou 164, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases das SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91, ou 92 ou 162, 163 ou 164.

[363]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme aqui definido anteriormente

[364]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, - tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 82, 83, 84, 91 ou 92 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento de SEQ ID NO: 82, 83, 84, ou 92 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos das SEQ ID NO: 82, 83, 84, ou 92. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. SEQ ID NO: 92 é idêntica à SEQ ID NO: 199. Também está englobado que nem todas as 6 citosinas da SEQ ID NO: 52 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 92. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas citosinas são modificadas.

[365]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- duas das suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 218 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 218 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 218. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[366]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- três das suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 219 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 219 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 219. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[367]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- quatro das suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 217 e tem um comprimento de 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 217 compreendendo ouconsistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 217. Tal fragmento tempreferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[368]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 211 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 211 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 211. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 211 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 211 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 211. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 9 uracilas da SEQ ID NO: 52 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 211. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 destas uracilas são modificadas.

[369]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 212 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 212 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 212. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 212, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 212 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 212. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas os 6 citosinas e nem todas as 9 uracilas de SEQ ID NO: 52 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 212. Está englobado que 1, 2, 3, 4, ou 5 destas citocinas e/ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 destas uracilas são modificadas.

[370]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 213 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 213 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 213. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 2 adeninas da SEQ ID NO: 52 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 213. Está englobado que 1 destas adeninas são modificadas.

[371] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 53, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 53 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 53.

[372] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 53 é representado pela SEQ ID NO: 133.

[373] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 133 e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 133 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 133.

[374]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[375] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[376] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 54 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 54 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 54.

[377] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 54 é representado pela SEQ ID NO: 134.

[378] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 134 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 134 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 134.

[379]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[380] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[381] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2'-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2'-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 55 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 55 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 55.

[382] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 55 é representado pela SEQ ID NO: 135.

[383] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 135 e tem um comprimento de 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 135 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 135.

[384]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[385] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[386] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 56 e tem um comprimento de 33, 34, ou 35 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 56 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 56.

[387] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 56 é representado pela SEQ ID NO: 136.

[388] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 136 e tem um comprimento de 33, 34, ou 35 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 136 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 136.

[389]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[390] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[391] Os oligonucleotídeos preferidos para indução do salto do éxon 55 a partir do pré-mRNA de distrofina é como se segue abaixo.

[392] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 57, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 57 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 57. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[393] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 57, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 57, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases da SEQ ID NO: 57.

[394] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado de SEQ ID NO: 57 é representada pela SEQ ID NO: 137, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 137 é representado pela SEQ ID NO: 165 ou 166.

[395] Deste modo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e é representado por um nucleotídeo ou uma sequência de bases compreendendo a SEQ ID NO: 137, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 137 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 137.

[396]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente. Ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem todas as suas citocinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas que foram substituídas ou modificadas, tal como definido aqui.

[397]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 57, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 57 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 57.

[398] De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 185, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 185 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 185. Também está englobado que nem todas as 8 citosinas da SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 185. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 destas citosinas são modificados.

[399]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[400]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 57 compreende SEQ ID NO: 85, e um fragmento preferido das SEQ ID NO: 137 compreende a SEQ ID NO: 165, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 57 compreende SEQ ID NO: 86 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 137 compreende SEQ ID NO: 166, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[401]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 186 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 186, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 186. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 7 uracilas da SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 186. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas são modificadas.

[402]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 187, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 187, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 187. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 187. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destes adeninas são modificadas.

[403]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 188, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 188, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 187. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 188, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 188 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 188. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas os 8 citosinas e nem todas as 7 uracilas de SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 188. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 destas citosinas, ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas são modificadas.

[404]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6-diaminopurinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 189, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 189 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 189. Por conseguinte, o referido oligonucleotídeo é representado por um nucleotídeo ou uma sequência de bases compreendendo a SEQ ID NO: 189, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 189 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 189. Este fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 8 citosinas, e nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 57 são modificadas, conforme representado na SEQ ID NO: 189. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 destas citosinas e/ou 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas são modificadas.

[405]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 190, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 190 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 190. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 adeninas e nem todas as 7 uracilas da SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 190. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas e/ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas são modificadas.

[406]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 191, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 191, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 191. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 8 citosinas, e nem todas as 7 uracilas, e nem todas as 5 adeninas da SEQ ID NO: 57 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 191. Está englobado que 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 destas citosinas ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 destas uracilas, e/ou 1, 2, 3 ou 4 destas adeninas são modificadas.

[407] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 58, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 58, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 58.

[408] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 58 é representado pela SEQ ID NO: 138.

[409] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 138, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 138, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 138.

[410]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[411] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[412] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e- é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 58 ou 138, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 58 ou 138, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases das SEQ ID NO: 58 ou 138.

[413]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme aqui definido anteriormente

[414]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 58, e tem um comprimento de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 58 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 58. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[415] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 59, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 59, compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 59. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[416] Tal oligonucleotídeo preferido é também definido como a seguir:- compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e - é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 59, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por uma sequência de nucleotídeos compreendendo ou consistindo de um fragmento da SEQ ID NO: 59, o referido fragmento compreendendo ou consistindo de pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos contíguos ou bases da SEQ ID NO: 59.

[417] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 59 é representado por SEQ ID NO: 139, e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 139 é representado pela SEQ ID NO: 167 ou 168 ou 169 ou 170.

[418] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo a SEQ ID NO: 139, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 139 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 139.

[419]Mais preferencialmente, tal oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5- metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila) e/ou uma 2,6- diaminopurina, conforme definido aqui anteriormente. Ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo tem todas as suas citocinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas que foram substituídas ou modificadas, tal como definido aqui.

[420]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:- consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,- todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas,- tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 59, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 59 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 59.

[421] De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 192, e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 192 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 192. Também está englobado que nem todas as 5 citosinas da SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 192. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas citosinas são modificadas.

[422]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[423]Um fragmento preferido da SEQ ID NO: 59 compreende SEQ ID NO: 87 e um fragmento preferido da SEQ ID NO: 139 compreende SEQ ID NO: 167, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 59 compreende SEQ ID NO: 88 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 139 compreende SEQ ID NO: 168, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 59 compreende SEQ ID NO: 89 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 139 compreende SEQ ID NO: 169, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 59 compreende SEQ ID NO: 90 e outro fragmento preferido da SEQ ID NO: 139 compreende SEQ ID NO: 170, cada um dos referidos fragmentos tem um comprimento de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32

[424]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[1] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[2] todas as suas uracilas foram substituídas por 5- metiluracilas,[3] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 193, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 193 compreendendo ou consistindo em pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos de SEQ ID NO: 193. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 uracilas da SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 193. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas uracilas são modificadas.

[425]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[4] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[5] todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas,[6] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 194, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 194 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 194. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 adeninas da SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 194. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas adeninas são modificadas.

[426]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[7] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[8] todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,[9] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 195, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 195 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 195. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 195, e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por um fragmento da SEQ ID NO: 195 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 195. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas os 5 citosinas e nem todas as 6 uracilas de SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 195. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas citosinas e/ou 1, 2, 3, 4 ou 5 destas uracilas são modificadas.

[427]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[10] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[11] todas as suas citosinas foram substituídas por 5- metilcitosinas, e todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6-diaminopurinas,[12] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 196 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 196 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 196. De acordo, o referido oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 196 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 196 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 196. Este fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 citosinas, e nem todas as 6 adeninas da SEQ ID NO: 59 são modificadas, conforme representado na SEQ ID NO: 196. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas citocinas e/ou 1, 2, 3, 4 ou 5 destas adeninas são modificadas.

[428]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[13] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[14] todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,[15] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 197 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 197 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 197. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 6 adeninas e nem todas as 6 uracilas da SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 197. Está englobado que 1, 2, 3, 4 ou 5 destas adeninas e/ou 1, 2, 3, 4 ou 5 destas uracilas são modificadas.

[429]Mais preferencialmente, um oligonucleotídeo:[16] consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA,[17] todas as suas adeninas foram substituídas por 2,6- diaminopurinas, todas as suas citosinas foram substituídas por 5-metilcitosinas, e todas as suas uracilas foram substituídas por 5-metiluracilas,[18] tal oligonucleotídeo é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 198 e tem um comprimento de 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 198 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 198. Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos. Também está englobado que nem todas as 5 citosinas, e nem todas as 6 uracilas, e nem todas as 6 adeninas da SEQ ID NO: 59 são modificadas conforme representado na SEQ ID NO: 198. Está englobado que 1, 2, 3 ou 4 destas citocinas e/ou 1, 2, 3, 4 ou 5 destas uracilas e/ou 1, 2, 3, 4 ou 5 destas adeninas são modificadas.

[430] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 60 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 60 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 60.

[431] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 60 é representado pela SEQ ID NO: 140.

[432] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 140 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 140 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 140.

[433]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[434] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[435] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 61 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 61 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 61.

[436] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 61 é representado pela SEQ ID NO: 141.

[437] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 141 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 141 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 141.

[438]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[439] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), e/ou uma 2,6-diaminopurina. De acordo, ainda mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

[440] Em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA, ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, e mais preferencialmente, compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 62 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 62 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 62.

[441] De acordo, um oligonucleotídeo não modificado derivado da SEQ ID NO: 62 é representado pela SEQ ID NO: 142.

[442] De acordo, em uma modalidade preferida, um oligonucleotídeo compreende um monômero de 2’-O-metil fosforotioato RNA ou consiste de 2’-O-metil fosforotioato RNA, é representado por uma sequência de nucleotídeos ou de bases compreendendo SEQ ID NO: 142 e tem um comprimento de 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, ou 33 nucleotídeos, ou por fragmento da SEQ ID NO: 142 compreendendo ou consistindo de pelo menos 10 nucleotídeos ou bases contíguos da SEQ ID NO: 142.

[443]Tal fragmento tem preferencialmente um comprimento de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33 nucleotídeos.

[444] De acordo, mais preferencialmente, o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilpirimidina (isto é, uma 5-metilcitosina, e/ou uma 5-metiluracila), preferencialmente, o referido oligonucleotídeo possui todas as suas citosinas, e/ou todas as suas uracilas, e/ou todas as suas adeninas, que foram substituídas ou modificadas conforme aqui definido.

Composição

[445] Em um segundo aspecto, é fornecida uma composição compreendendo um oligonucleotídeo conforme descrito na seção anterior intitulada "Oligonucleotídeo". Essa composição preferencialmente compreende ou consiste de um oligonucleotídeo conforme definido anteriormente.

[446] Em uma modalidade preferida, a referida composição é para o uso como um medicamento. A referida composição é assim, uma composição farmacêutica. Uma composição farmacêutica compreende normalmente um veículo, diluente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade preferida, uma composição da presente invenção compreende um composto tal como aqui definido e, opcionalmente, compreende ainda uma formulação, agente de enchimento, conservante, solubilizante, veículo, diluente, excipiente, sal, adjuvante e/ou solvente farmaceuticamente aceitáveis. Tais veículo, agente de enchimento, conservante, solubilizante, diluente, sal, adjuvante, solvente e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis podem, por exemplo, serem encontrados em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. O composto como descrito na invenção pode possuir pelo menos um grupo ionizável. Um grupo ionizável pode ser uma base ou ácido, e pode ser carregado ou neutro. Um grupo ionizável pode estar presente como par de íons com um contra-íon adequado que carrega a carga oposta(s). Exemplos de contra-íons catiônicos são o sódio, potássio, césio, Tris, lítio, cálcio, magnésio, trialquilamônio, trietilamônio, e tetraalquilamônio. Exemplos de contra-íons aniônicos são o cloreto, brometo, iodeto, lactato, mesilato, acetato, trifluoroacetato, dicloroacetato, e citrato. Exemplos de contra-íons foram descritos [por exemplo, Kumar, de 2008, que é incorporada aqui em sua totalidade por referência].

[447] Em uma modalidade preferida, uma composição compreende o oligonucleotídeo da invenção e sódio como contra-íon. O referido oligonucleotídeo presente na referida composição pode também ser denominado como um oligonucleotídeo na sua forma de sódio.

[448] Em uma modalidade preferida, uma composição compreende o oligonucleotídeo da invenção, cálcio e/ou magnésio como contra-íon. O referido oligonucleotídeo presente na referida composição pode ser denominado como oligonucleotídeo em seu cálcio ou magnésio, ou na forma de cálcio/magnésio misturados.

[449]Tal tipo de composição compreendendo oligonucleotídeo da invenção e um contra-íon pode ser obtida ou através da formulação do sal de contra-íon do oligonucleotídeo, ou através da adição de quantidades apropriadas do referido sal a um oligonucleotídeo. Um efeito positivo dos sais de cálcio presentes na composição compreendendo um oligonucleotídeo, com respeito aos efeitos imunoestimulatórios dos referidos oligonucleotídeos, foi descrito (por exemplo, pedido de patente WO 2012021985 (Replicor), incorporado aqui em sua totalidade por referência).

[450]Uma composição farmacêutica pode compreender uma ajuda na melhoria da estabilidade, solubilidade, absorção, biodisponibilidade, atividade, farmacocinética, farmacodinâmica, e absorção celular do referido composto, em particular, um excipiente capaz de formar complexos, nanopartículas, micropartículas, nanotubos, nanogéis, hidrogéis, poloxâmeros ou plurônicos, polimersomas, colóides, microbolhas, vesículas, micelas, lipoplexos, e/ou lipossomas. Exemplos de nanopartículas incluem nanopartículas poliméricas, nanopartículas de ouro, nanopartículas magnéticas, nanopartículas de sílica, nanopartículas lipídicas, partículas de açúcar, nanopartículas de proteína e nanopartículas de peptídeos.

[451]Uma composição preferida compreende pelo menos um excipiente que pode ajudar ainda mais a melhorar o alvejamento e/ou entrega da referida composição e/ou do referido oligonucleotídeo para um tecido, e/ou célula, e/ou em um tecido, e/ou uma célula. Um tecido preferido ou célula é um tecido ou célula muscular.

[452]Muitos destes excipientes são conhecidos no estado da técnica (por exemplo, ver Bruno, 2011), e podem ser categorizados como um primeiro tipo de excipiente. Exemplos do primeiro tipo de excipientes incluem polímeros (por exemplo, polietilenoimina (PEI), poli-2- hidroxipropileneimina (pHP), polipropileneimina (PPI), derivados de dextrano, butilcianoacrilato (PBCA), hexilcianoacrilato (PHCA), poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poliaminas (por exemplo, espermina, espermidina, putrescina, cadaverina), quitosana, poli (amido aminas) (PAMAM), poli (amina éster), éter polivinílico, polivinilpirrolidona (PVP), polietileno glicol (PEG) ciclodextrinas, ácido hialurônico, ácido colomínico, e derivados dos mesmos), dendrímeros (por exemplo, poli (amidoamina)), lipídeos {por exemplo, 1,2- dioleoil-3-dimetilamônio propano (DODAP), cloreto de dioleoildimetilamônio (DODAC), derivados de fosfatidilcolina [por exemplo, 1,2-distearoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DSPC)], derivados de liso-fosfatidilcolina [por exemplo, 1-estearoil-2-liso-sn-glicero-3-fosfocolina (S-LysoPC)], esfingomielina, 2-{3-[Bis-(3-amino-propil)- amino]-propilamino}-N-ditetracedil-carbamoil metilacetamida (RPR209120), derivados de fosfoglicerol [por exemplo, 1,2- dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol, sais de sódio (DPPG-Na), derivados de ácido fosfatídico [ácido 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfatídico, sal de sódio (DSPA), derivados de fosfatidiletanolamina [por exemplo, dioleoil- L-R-fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-distearoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DPhyPE),], N-[1-(2,3- dioleoilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTAP), N-[1- (2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), 1,3- di-oleoilóxi-2-(6-carbóxi-espermil)-propilamida (DOSPER), (1,2-dimiristiolxipropil-3-dimetilhidroxi etil amônio (DMRIE), (n1-colesteriloxicarbonil-3,7-diazanonana-1,9- diamina (CDAN), brometo de dimetildioctadecilamônia (DDAB), 1-palmotoil-2-oleoil-sn-glicerol-3-fosfocolina (POPC), (ácido b-L-Arginil-2,3-L-diaminopropiônico N-palmitil-N- olelil-amida triclorato (AtuFECT01), 1, derivados de N,N- dimetil-3-aminopropano [por exemplo, 1,2-distearoilóxi-N,N- dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1,2-dioleilóxi-N,N-dimetil- 3-aminopropano (DoDMA), 1,2-Dilinoleilóxi-N,N-3- dimetilaminopropano (DLinDMA), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil [1,3]-dioxolano (DLin-K_DMA), derivados de fosfatidilserina [1,2-dioleil-sn-glicero-3-fosfo-L- serina, sais de sódio (DOPS)], colesterol, proteínas (por exemplo, albumina, gelatinas, atelocolágeno), e peptídeos (por exemplo, protamina, PepFects, NickFects, poliarginina, polilisina, CADY, MPG).

[453] Outra composição preferida pode compreender pelo menos um excipiente categorizado como um segundo tipo de excipiente. Um segundo tipo de excipiente pode compreender ou conter um grupo conjugado conforme aqui descrito, para melhorar o alvejamento e/ou entrega da composição e/ou do oligonucleotídeo da invenção para um tecido, e/ou célula, e/ou em um tecido, e/ou célula como, por exemplo, um tecido e/ou célula muscular. Ambos os tipos de excipientes podem ser combinados em conjunto em uma única composição, tal como aqui identificado.

[454]Um técnico especialista no assunto pode selecionar, combinar, e/ou adaptar um ou mais dos excipientes acima ou outros alternativos e sistemas de entrega para formular e entregar o composto para uso na presente invenção.

[455]Tal composição farmacêutica da invenção pode ser administrada em uma concentração eficaz em conjunto de tempos para um animal, preferencialmente um mamífero. O mamífero mais preferido é um ser humano. Um oligonucleotídeo ou uma composição como aqui definidos, para uso de acordo com a invenção, podem ser adequados para a administração direta a uma célula, tecido e/ou um órgão in vivo de indivíduos afetados por, ou em risco de desenvolver uma doença ou patologia tal como aqui identificado, e podem ser administrados diretamente in vivo, ex vivo ou in vitro. A administração pode ser por via tópica, sistêmica e/ou parenteral, por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, ocular, nasal, urogenital, intradérmica, dérmica, enteral, intravítrea, intracavernosa, intracerebral, intratecal, epidural ou via oral.

[456] De preferência, tal composição farmacêutica da invenção pode ser encapsulada sob a forma de uma emulsão, suspensão, pílula, comprimido, cápsula ou gel mole para administração por via oral, ou sob a forma de aerossol ou de pó seco para entrega ao trato respiratório e pulmões.

[457] Em uma modalidade, um oligonucleotídeo da invenção pode ser utilizado em conjunto com outro composto já conhecido em ser utilizado para o tratamento da referida doença. Estes outros compostos podem ser utilizados para reduzir à inflamação, preferencialmente, para a redução da inflamação do tecido muscular, e/ou um composto adjuvante para melhorar a função das fibras musculares, a integridade e/ou a sobrevivência e/ou melhorar, aumentar ou restaurar a função cardíaca. Exemplos são, mas não limitados a, um esteroide, preferencialmente um (glico)corticosteróide, um inibidor da ECA (preferencialmente perindopril), um do receptor tipo 1 de angiotensina II (preferencialmente losartana), um inibidor do fator de necrose tumoral alfa (TNFα), um inibidor de TGFβ (preferencialmente decorina), biglicano humano recombinante, uma fonte de mIGF-1, um inibidor de miostatina, manose-6-fosfato, um antioxidante, um inibidor do canal iônico, um inibidor de protease, um inibidor de fosfodiesterase (preferencialmente um inibidor de PDE5, tais como sildenafil ou tadalafil), um inibidor de deacetilase histona (inibidor HDAC, modulador do receptor androgênio, creatina, creatina fosfato, e/ou L-arginina. Tal uso combinado pode ser um uso sequencial: cada componente é administrado em uma composição distinta. Alternativamente, cada composto pode ser usado em conjunto em uma única composição.

Uso

[458] Em um aspecto adicional, é fornecido o uso de uma composição ou um oligonucleotídeo conforme descrito nas seções anteriores para uso como um medicamente ou parte da terapia, ou aplicações em que o referido oligonucleotídeo exerce sua atividade intracelular.

[459] Preferencialmente, um oligonucleotídeo ou composição da invenção é para o uso como medicamento ou parte de uma terapia para prevenir, atrasar, curar, aliviar e/ou tratar DMD ou BMD.

Método

[460] Em outro aspecto, é fornecido um método para prevenir, tratar, curar, aliviar e/ou atrasar uma doença ou patologia, tal como definido na seção anterior, em um indivíduo, em uma célula, tecido ou órgão do referido indivíduo. O método compreende a administração de um oligonucleotídeo ou de uma composição da invenção ao referido indivíduo ou um sujeito em necessidade do mesmo.

[461] O método de acordo com a invenção em que um oligonucleotídeo ou uma composição como aqui definido, pode ser adequado para administração in vivo a uma célula, tecido e/ou um órgão de indivíduos afetados por qualquer uma das doenças aqui definias, e pode ser administrado in vivo, ex vivo ou in vitro. Um indivíduo ou sujeito em necessidade é, preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um ser humano.

[462] Em outro aspecto, é fornecido um método para o diagnóstico, em que o oligonucleotídeo da invenção é fornecido com um marcador radioativo ou um marcador fluorescente.

[463] Em uma modalidade, em um método da invenção, uma concentração de um oligonucleotídeo ou composição é variada de 0,01 nM a 1. Mais preferencialmente, a concentração utilizada é de 0,05 a 500 nM, ou de 0,1 a 500 nM, ou de 0,02 a 500 nM, ou de 0,05 a 500 nM, ainda mais preferencialmente de 1 a 200 nM.

[464] Os intervalos de doses de um oligonucleotídeo ou composição de acordo com a invenção são, preferencialmente, concebidos com base em estudos de dose crescente em ensaios clínicos (uso in vivo), para os quais existem requisitos protocolares rigorosos. Um oligonucleotídeo, tal como aqui definido, pode ser utilizado em uma dose que é variada de 0,01 a 200 mg/kg ou 0,05 a 100 mg/kg, ou 0,1 a 50 mg/kg, ou 0,1 a 20 mg/kg, de preferência de 0,5 a 10 mg/kg.

[465] Os intervalos de concentração ou de dose do oligonucleotídeo ou composição tal como fornecidos acima, são concentrações ou doses preferidas para o uso in vitro ou ex vivo. O técnico especialista no assunto vai entender que, dependendo da identidade do oligonucleotídeo utilizado, a célula alvo a ser tratada, o gene-alvo e os seus níveis de expressão, o meio utilizado e a condições de transfecção e de incubação, a concentração ou a dose do oligonucleotídeo utilizado podem ainda variar, e podem precisar ser otimizados ainda mais.

[466]Neste documento e em suas reivindicações, o verbo "compreender" e suas conjugações são usados em seu sentido não limitativo para significar que os itens seguindo a palavra estão incluídos, mas os itens não especificamente mencionados não são excluídos. Além disso, o verbo "consistir" pode ser substituído por "consistir essencialmente em" significando que um oligonucleotídeo ou uma composição como aqui definido, podem compreender componente(s) adicional do que os especificamente identificados, o referido componente(s) adicional não alterando a característica única da invenção. Além disso, a referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais do que um dos elementos está presente, a menos que o contexto claramente exija que seja um, e apenas um dos elementos. Os artigos indefinidos "um" ou "uma", portanto, geralmente significam "pelo menos um".

[467] Cada uma das modalidades tais como aqui identificadas podem ser combinadas entre si, a menos que indicado de outra forma. Todas as referências de patentes e literaturas citadas no presente relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Definições

[468]Ao longo do pedido, os termos "se liga", "alveja", "hibridiza" poderiam ser utilizados alternadamente quando utilizados no contexto de um oligonucleotídeo anti-senso, que é complementar reverso para uma parte de um pré-RNAm, tal como aqui identificado.

[469]Além disso, ao longo de todo o pedido, os termos "capaz de se ligar", "capaz de alvejar", "capaz de hibridizar" podem ser utilizadas alternadamente, quando utilizadas no contexto de um oligonucleotídeo anti-senso que é complementar reverso para uma parte de um pré-RNAm tal como aqui identificado, e para que as condições pudessem ser encontradas, em que o referido oligonucleotídeo pode se ligar, ou alvejar, ou hibridizar com a referida parte do referido pré-RNAm.

[470]Tal como aqui utilizado, "hibridização" refere-se ao emparelhamento de compostos oligoméricos complementares (por exemplo, um composto anti-senso e o seu ácido nucleico alvo). Embora não limitado a um mecanismo particular, o mecanismo mais comum de emparelhamento envolve ligações de hidrogênio, as quais podem ser de Watson-Crick, de Hoogsteen ou de ligação de hidrogênio de Hoogsteen invertida, entre o nucleosídeo complementar ou bases nucleotídicas (nucleobases). Por exemplo, a adenina base natural é nucleobase complementar às nucleobases naturais timina e uracila, que se emparelham através da formação de ligações de hidrogênio. A guanina base natural é nucleobase complementar às nucleobases naturais citosina e 5- metilcitosina. A hibridização pode ocorrer sob circunstâncias variadas.

[471]Tal como aqui utilizado, "hibridiza especificamente" refere-se à capacidade de um composto oligomérico de se hibridizar a um sítio do ácido nucleico, com uma afinidade maior do que se hibridiza com outro sítio do ácido nucleico. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo anti-senso hibridiza especificamente com mais do que um sítio alvo.

[472]No contexto da invenção, "hibridiza" é utilizado sob condições fisiológicas em uma célula, preferencialmente uma célula muscular, a menos que indicado de outra forma.

[473]Tal como aqui utilizado, "nucleosídeo" refere-se a um composto compreendendo um grupo de base heterocíclica e uma unidade de açúcar. Os nucleosídeos incluem, mas não estão limitados a, nucleosídeos de ocorrência natural (como encontrados no DNA e RNA), nucleosídeos abásicos, nucleosídeos modificados, e nucleosídeos modificados com açúcar. Os nucleosídeos podem ser modificados com qualquer um de uma variedade de substituintes.

[474]Tal como aqui utilizado, "unidade de açúcar" significa um grupo de açúcar natural (furanosil), um grupo de açúcar modificado, ou um substituto do açúcar.

[475]Tal como aqui utilizado, "grupo de açúcar modificado" significa um açúcar furanosil quimicamente modificado, ou um grupo de açúcar não-furanosil. Além disso, abraçados por este termo estão os análogos e derivados de açúcar furanosil, incluindo açúcares tricíclicos, açúcares bicíclicos, tetrahidropiranos, morfolinos, açúcares 2' modificados, açúcares 4' modificados, açúcares 5' modificados, e açúcares 4' substituídos.

[476]Tal como aqui utilizado, "nucleosídeo modificado com açúcar" significa um nucleosídeo compreendendo um grupo de açúcar modificado.

[477]Tal como aqui utilizado o termo "substituto de açúcar" refere-se a uma estrutura que é capaz de substituir o anel de furanose de um nucleosídeo de ocorrência natural. Em certas modalidades, os substitutos de açúcar são anéis não-furanose (ou furanose 4'-substituídos), ou sistemas de anéis ou sistemas abertos. Essas estruturas incluem mudanças simples em relação ao anel de furanose natural, tais como um anel de seis membros, ou podem ser mais complicadas, como é o caso com o sistema de não-anel utilizado no ácido nucleico de peptídeo. Os substitutos do açúcar incluem, sem limitação, morfolinos e ciclohexenils e ciclohexitols. Na maior parte dos nucleosídeos possuindo um grupo substituto do açúcar, o grupo base heterocíclico é geralmente mantido para permitir a hibridização.

[478]Tal como aqui utilizado, "nucleotídeo" refere-se a um nucleosídeo compreendendo ainda um grupo de ligação de fosfato modificado ou não modificado, ou uma ligação de internucleosídeos não-fosfato.

[479]Tal como aqui utilizado, "nucleosídeos ligados" podem ou não estar ligados por ligações de fosfato e, assim, incluem nucleotídeos "ligados".

[480]Tal como aqui utilizado, "nucleobase" refere-se à porção de base heterocíclica de um nucleosídeo. As nucleobases podem ocorrer naturalmente ou podem ser modificadas e, portanto, incluem, mas não estão limitadas a adenina, citosina, guanina, uracila, timina e análogos dos mesmos, tais como 5-metilcitosina. Em certas modalidades, uma nucleobase pode compreender qualquer átomo ou grupo de átomos capazes de ligação de hidrogênio a uma base de outro ácido nucleico.

[481]Tal como aqui utilizado, "nucleosídeo modificado" refere-se a um nucleosídeo compreendendo pelo menos uma modificação em relação aos nucleosídeos de RNA ou DNA de ocorrência natural. Tal modificação pode ser no grupo de açúcar e/ou nas nucleobases.

[482]Tal como aqui utilizado, "Tm" significa a temperatura de fusão em que está a temperatura das duas cadeias de uma dupla de ácido nucleico em separado. Tm é muitas vezes utilizada como uma medida da estabilidade duplex ou da afinidade de ligação de um composto anti-senso em relação a uma molécula de RNA complementar.

[483]Tal como aqui utilizado, "2'-modificado" ou "2'- substituído" refere-se a um nucleosídeo contendo um açúcar compreendendo um substituinte em outra posição 2' diferente de H ou OH. Os nucleosídeos 2'-modificados incluem, mas não estão limitados aos nucleosídeos bicíclicos em que a ponte ligando dois átomos de carbono do anel de açúcar liga o carbono 2' e outro carbono do anel de açúcar; e nucleosídeos com substituintes-2' não de ponte, tais como alil, amino, azido, tio, O-alil, O-C1-C10 alquil, -OCF3, O- (CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), ou O-CH2- C(=O)-N(Rm)(Rn), em que cada Rm e Rn é, independentemente, H ou alquil C1-C10 substituído ou não substituído. Os nucleosídeos 2'-modificados podem ainda incluir outras modificações, por exemplo, em outras posições do açúcar e/ou da nucleobase.

[484]Tal como aqui utilizado, "2'-OMe" ou "2'-OCH3" ou "2'-O-metil" referem-se cada um a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um grupo -OCH3 na posição 2'do anel de açúcar.

[485]Tal como aqui utilizado, "MOE" ou "2'-MOE" ou "2'-OCH2CH2OCH3" ou "2'-O-metoxietila" referem-se cada um a um nucleosídeo compreendendo um açúcar compreendendo um grupo -OCH2CH2OCH3 na posição 2' do anel de açúcar.

[486]Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de adenina" significa uma nucleobase de purina quimicamente modificada que, quando incorporada em um oligômero, é capaz de formar um par de bases de Watson-Crick ou com uma timina ou uracila de uma cadeia complementar de RNA ou de DNA.

[487]Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de uracila" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada em um oligômero, é capaz de formar um par de bases de Watson- Crick com uma adenina de uma cadeia complementar de RNA ou de DNA.

[488]Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de timina" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada em um oligômero, é capaz de formar um par de bases de Watson-Crick com uma adenina de uma cadeia complementar de RNA ou de DNA.

[489]Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de citosina" significa uma nucleobase de pirimidina quimicamente modificada que, quando incorporada em um oligômero, é capaz de formar um par de bases de Watson- Crick com uma guanina de uma cadeia complementar de RNA ou de DNA. Por exemplo, o análogo de citosina pode ser uma 5- metilcitosina.

[490]Tal como aqui utilizado, o termo "análogo de guanina" significa uma nucleobase de purina quimicamente modificada que, quando incorporada em um oligômero, é capaz de formar um par de bases de Watson-Crick com uma citosina de uma cadeia complementar de RNA ou de DNA.

[491]Tal como aqui utilizado, o termo "guanosina" refere-se a um nucleosídeo ou nucleosídeo com açúcar modificado compreendendo uma guanina ou nucleobase analóga de guanina.

[492]Tal como aqui utilizado, o termo "uridina" refere-se a um nucleosídeo ou nucleosídeo com açúcar modificado compreendendo uma uracila ou nucleobase analóga de uracila.

[493]Tal como aqui utilizado, o termo "timidina" refere-se a um nucleosídeo ou nucleosídeo com açúcar modificado compreendendo uma timina ou nucleobase analóga de timina.

[494]Tal como aqui utilizado, o termo "citidina" refere-se a um nucleosídeo ou nucleosídeo com açúcar modificado compreendendo uma citosina ou nucleobase analóga de citosina.

[495]Tal como aqui utilizado, o termo "adenosina" refere-se a um nucleosídeo ou nucleosídeo com açúcar modificado compreendendo uma adenina ou nucleobase analóga de adenina.

[496]Tal como aqui utilizado, "oligonucleotídeo" refere-se a um composto compreendendo uma pluralidade de nucleosídeos ligados. Em certas modalidades, a uma ou mais pluralidade de nucleosídeos é modificada. Em certas modalidades, um oligonucleotídeo compreende um ou mais ribonucleosídeos (RNA) e/ou desoxirribonucleosídeos (DNA).

[497]Tal como aqui utilizado, "oligonucleosídeo" refere-se a um oligonucleotídeo em que nenhuma das ligações internucleosídicas contém um átomo de fósforo. Tal como oligonucleosídeos.

[498]Tal como aqui utilizado, "oligonucleotídeo modificado" ou "oligonucleotídeo quimicamente modificado" refere-se a um oligonucleotídeo compreendendo pelo menos um açúcar modificado, uma nucleobase modificada e/ou uma ligação internucleosídica modificada ou cadeia principal.

[499]Tal como aqui utilizado, "ligação internucleosídica" ou "cadeia principal" referem-se a uma ligação covalente entre os nucleosídeos adjacentes.

[500]Tal como aqui utilizado, "ligação internucleosídica de ocorrência natural" refere-se a uma ligação de fosfodiéster 3' para 5'.

[501]Tal como aqui utilizado, "ligação internucleosídica modificada" refere-se a qualquer outra ligação internucleosídica diferente de uma ligação internucleosídica de ocorrência natural.

[502]Tal como aqui utilizado, "composto oligomérico" refere-se a uma estrutura polimérica compreendendo duas ou mais subestruturas. Em certas modalidades, um composto oligomérico é um oligonucleotídeo. Em certas modalidades, um composto oligomérico é um oligonucleotídeo de fita simples. Em certas modalidades, um composto oligomérico é um duplex de dupla fita compreendendo dois oligonucleotídeos. Em certas modalidades, um composto oligomérico é oligonucleotídeo de fita simples ou de fita dupla compreendendo um ou mais grupos conjugados e/ou grupos terminais.

[503]Tal como aqui utilizado, "conjugado" refere-se a um átomo ou grupo de átomos ligados a um oligonucleotídeo ou composto oligomérico. Em geral, os grupos de conjugado modificam uma ou mais propriedades do composto ao qual eles estão ligados, incluindo, mas não limitado à farmacodinâmica, farmacocinética, ligação, absorção, distribuição celular, captação celular, carga e depuração. Grupos conjugados são rotineiramente usados na técnica da química, e estão ligados diretamente ou através de um grupo de ligação opcional ou grupo de ligação ao composto de origem, tal como um composto oligomérico. Em certas modalidades, os grupos conjugados incluem sem limitação, intercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietileno glicóis, tioéteres, poliéteres, colesteróis, tiocolesteróis, grupos de ácido eólico, ácido fólico, lípidos, fosfolípidos, biotina, fenazina, fenantridina, antraquinona, adamantano, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Em certas modalidades, os conjugados são grupos terminais. Em certas modalidades, os conjugados são ligados a um nucleosídeo terminal 3 'ou 5', ou a um nucleosídeo interno de um oligonucleotídeo.

[504]Tal como aqui utilizado, "grupo de ligação conjugado" refere-se a qualquer átomo ou grupo de átomos utilizados para ligar um conjugado de um oligonucleotídeo ou composto oligomérico. Os grupos de ligação ou grupos de ligação bi funcionais, tais como os que são conhecidos na técnica, são propícios para a presente invenção.

[505]Tal como aqui utilizado, "composto anti-senso" refere-se a um composto oligomérico, pelo menos uma porção da qual é pelo menos parcialmente complementar a um ácido nucleico alvo ao qual se hibridiza, e modula a atividade, processamento ou expressão do referido ácido nucleico alvo.

[506]Tal como aqui utilizado, "expressão" refere-se ao processo pelo qual um gene, finalmente, resulta em uma proteína. A expressão inclui, mas não está limitada a, transcrição, splicing, modificação pós-transcrição e tradução.

[507]Tal como aqui utilizado, "oligonucleotídeo anti- senso" refere-se a um composto anti-senso que é um oligonucleotídeo.

[508]Tal como aqui utilizado, "atividade anti-senso" refere-se a qualquer atividade detectável e/ou mensurável atribuível à hibridização de um composto anti-senso para o seu ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, essa atividade pode ser um aumento ou uma diminuição no valor de um ácido nucleico ou proteína. Em certas modalidades, essa atividade pode ser uma alteração na razão de variantes de splicing de um ácido nucleico ou proteína. A detecção e/ou medição da atividade anti-senso pode ser direta ou indireta. Em certas modalidades, a atividade anti-senso é avaliada pela observação de uma alteração fenotípica em uma célula ou animal.

[509]Tal como aqui utilizado, "ácido nucleico alvo" refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico, a expressão, quantidade, ou atividade, dos quais é capaz de ser modulado por um composto anti-senso. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é DNA ou RNA. Em certas modalidades, o RNA alvo é RNAm, pré-RNAm, RNA não- codificante, pri-microRNA, pré-microRNA, microRNA maduro, RNA dirigido pelo promotor, ou transcritos anti-senso naturais. Por exemplo, o ácido nucleico alvo pode ser um gene celular (ou transcrito de RNAm do gene), cuja expressão está associada a uma doença particular ou estado de doença, ou uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso. Em certas modalidades, o ácido nucleico alvo é um ácido nucleico viral ou bacteriano.

[510]Tal como aqui utilizado, "mRNA alvo" refere-se a uma molécula de RNA pré-selecionada que codifica uma proteína.

[511]Tal como aqui utilizado, "alvo" ou "alvejado" referem-se à associação de um composto anti-senso a uma molécula de ácido nucleico alvo específico ou uma região específica de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico alvo. Um composto anti-senso tem como alvo um ácido nucleico alvo, se for suficientemente complementar ao ácido nucleico alvo para permitir a hibridização sob condições fisiológicas.

[512]Tal como aqui utilizado, "sítio alvo" refere-se a uma região de um ácido nucleico alvo que está ligada por um composto anti-senso. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro da região não traduzida 3' de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro da região não traduzida 5' de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro da região de codificação de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro de um éxon de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro de um íntron de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro do sítio alvo de microRNA de uma molécula de RNA. Em certas modalidades, um sítio alvo está pelo menos parcialmente dentro de uma região repetida de uma molécula de RNA.

[513]Tal como aqui utilizado, "proteína alvo" refere- se a uma proteína, a expressão da qual é modulada por um composto anti-senso. Em certas modalidades, uma proteína- alvo é codificada por um ácido nucleico alvo. Em certas modalidades, a expressão de uma proteína-alvo é influenciada de outra forma por um ácido nucleico alvo.

[514]Tal como aqui utilizado, "complementaridade", em referência às nucleobases, refere-se a uma nucleobase que é capaz de emparelhamento de bases com outra nucleobase. Por exemplo, no DNA a adenina (A) é complementar à timina (T). Por exemplo, no RNA a adenina (A) é complementar à uracila (U). Em certas modalidades, as nucleobase complementar refere-se a uma nucleobase de um composto anti-senso de que é capaz de emparelhamento de base com uma nucleobase do seu ácido nucleico alvo. Por exemplo, se uma nucleobase em uma determinada posição de um composto anti-senso é capaz de ligação de hidrogênio com uma nucleobase em uma determinada posição de um ácido nucleico alvo, em seguida, a posição de ligação de hidrogênio entre o oligonucleotídeo e o ácido nucleico alvo é considerada complementar a esse par de nucleobases. As nucleobases compreendendo certas modificações podem manter a capacidade de se emparelhar com uma nucleobase de contraparte e, assim, ainda são capazes da complementaridade de nucleobase.

[515]Tal como aqui utilizado, "não-complementar", em referência às nucleobases refere-se a um par de nucleobases que não forma ligações de hidrogênio com outro, ou suporta a hibridização de outra forma.

[516]Tal como aqui utilizado, "complementar", em referência a nucleosídeos, oligonucleotídeos ligados ou ácidos nucleicos, refere-se à capacidade de um composto oligomérico para hibridizar com outro composto oligomérico ou ácido nucleico através da complementaridade da nucleobase. Em certas modalidades, um composto anti-senso e o seu alvo são complementares um ao outro quando um número suficiente de posições correspondentes em cada molécula são ocupados por nucleobases que podem ligar entre si para permitir a associação estável entre o composto anti-senso e o alvo. Um técnico especialista no assunto reconhece que a inclusão de desemparelhamentos é possível, sem eliminar a capacidade dos compostos oligoméricos de permanecerem em associação. Portanto, são aqui descritos compostos anti- senso que podem incluir até cerca de 20% de nucleotídeos que estão desemparelhados (isto é, não são nucleobases complementar aos nucleotídeos correspondentes do alvo). De preferência, os compostos anti-senso contêm não mais do que cerca de 15%, mais preferencialmente não mais do que cerca de 10%, mais preferencialmente não mais do que 5% ou nenhum desemparelhamento. Os nucleotídeos restantes são nucleobases complementar ou de outra forma não atrapalham a hibridização (por exemplo, bases universais). Um técnico especialista no assunto reconheceria que os compostos aqui fornecidos são pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% complementares a um ácido nucleico alvo.

[517]Tal como aqui utilizado, "modulação" refere-se a uma perturbação da quantidade ou da qualidade de uma função ou atividade quando comparada com a função ou atividade antes da modulação. Por exemplo, a modulação inclui a alteração, ou um aumento (estimulação ou indução) ou uma diminuição (inibição ou redução) na expressão do gene. Como outro exemplo, a modulação da expressão pode incluir a desorientação do sítio de splicing do processamento de pré- RNAm, resultando em uma alteração na quantidade de uma variante de splicing particular presente, em comparação com as condições que não foram perturbadas. Como outro exemplo, a modulação inclui perturbar a tradução de uma proteína.

[518]Tal como aqui utilizado, "motivo" refere-se a um padrão de modificações em um composto oligomérico ou uma região do mesmo. Os motivos podem ser definidos por modificações em certos nucleosídeos e/ou em certos grupos de ligação de um composto oligomérico.

[519]Tal como aqui utilizado, "motivo de nucleosídeo" refere-se a um padrão de modificações de nucleosídeos em um composto oligomérico ou uma região do mesmo. As ligações de tal composto oligomérico podem ser modificadas ou não modificadas. A menos que indicado de outra forma, os motivos descrevendo aqui apenas nucleosídeos são destinados a serem motivos de nucleosídeos. Assim, em alguns exemplos, as ligações são não limitadas.

[520]Tal como aqui utilizado, "motivos de ligação" se refere a um padrão de modificações de ligação em um composto oligomérico ou região do mesmo. Os nucleosídeos de tal composto oligomérico podem ser modificados ou não modificados. A menos que indicado de outra forma, os motivos aqui descrevendo apenas ligações, são destinados a serem motivos de ligação. Assim, em alguns exemplos, os nucleosídeos são não limitados.

[521]Tal como aqui utilizado, "as modificações iguais" se referem às modificações em relação às moléculas de ocorrência natural que são iguais uma com a outra, incluindo a ausência de modificações. Assim, por exemplo, dois nucleosídeos e DNA não modificados possuem "a mesma modificação", apesar do nucleosídeo de DNA ser modificado.

[522] Como aqui utilizado, "tipo de modificação", em referência a um nucleosídeo ou um nucleosídeo de um "tipo" refere-se à modificação de um nucleosídeo, e inclui nucleosídeos modificados e não modificados. Por conseguinte, a menos que indicado de outra forma, um "nucleosídeo tendo uma modificação de um primeiro tipo" pode ser um nucleosídeo não modificado.

[523]Tal como aqui utilizado, "região separada" refere-se a uma porção de um composto oligomérico, em que os nucleosídeos e ligações internucleosídicas dentro na região, compreendem todos as mesmas modificações; e os nucleosídeos e/ou ligações internucleosídicas de quaisquer porções vizinhas incluem, pelo menos, uma modificação diferente.

[524]Tal como aqui utilizado, "sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se aos sais dos compostos ativos que retêm a atividade biológica desejada do composto ativo, e não conferem os efeitos toxicológicos indesejáveis dos mesmos.

[525]Tal como aqui utilizado, "estrutura cap" ou "grupo de cap terminal" refere-se às modificações químicas incorporadas em qualquer uma das extremidades de um composto anti-senso.

[526]Tal como aqui utilizado, o termo "independentemente" significa que cada ocorrência de uma variável repetitiva dentro de um oligonuc1eotídeo reivindicado é selecionada, independentemente de outra. Por exemplo, cada uma das variáveis repetitivas podem ser selecionadas de modo que (i) cada uma das variáveis repetitivas são as mesmas, (ii) duas ou mais são as mesmas, ou (iii) cada uma das variáveis repetitivas podem ser diferentes.

Definições Químicas Gerais

[527]Tal como aqui utilizado, "alquil" refere-se a um hidrocarboneto saturado de cadeia linear ou ramificada, ou um substituinte ou radical de hidrocarboneto, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupos alquil incluem, mas não estão limitados a, metil, etil, propil, butil, isopropil, n-hexil, octil, decil, dodecil e semelhantes. Grupos alquil normalmente incluem a partir de 1 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente a partir de 1 a 12 átomos de carbono (alquil C1-C12) com a partir de 1 a 6 átomos de carbono (alquil C1-C6) sendo mais preferidos. O termo "alquil inferior", tal como aqui utilizado, inclui de 1 a 6 átomos de carbono (alquil C1C6). Os grupos alquil tal como aqui utilizados podem incluir, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes adicionais.

[528]Tal como aqui utilizado, "alquenil" refere-se a uma cadeia radical ou substituinte de hidrocarboneto linear ou ramificada, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono, e tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Exemplos de grupos alquenil incluem, mas não estão limitados a, etenil, propenil, butenil, 1-metil- 2-buten-l-il, dienos tais como 1,3-butadienil, e semelhantes. Os grupos alquenil tipicamente incluem de 2 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a 12 átomos de carbono com de 2 a 6 átomos de carbono sendo os mais preferidos. Os grupos alquenil, tal como aqui utilizados, podem incluir, opcionalmente, um ou mais grupos substituintes adicionais.

[529]Tal como aqui utilizado, o termo "alquinil" refere-se a uma cadeia radical ou substituinte de hidrocarboneto linear ou ramificada, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono, e tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de grupos alquinil incluem, mas não estão limitados a, etinil, 1- propinil, 1-butinil, e semelhantes. Grupos alquinil tipicamente incluem de 2 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a 12 átomos de carbono com a partir de 2 a 6 átomos de carbono sendo os mais preferidos. Os grupos alquinil como aqui utilizado podem opcionalmente incluir um ou mais outros grupos substituintes

[530]Tal como aqui utilizado, "aminoalquil" refere-se a um radical ou substituinte amino substituído. O termo é destinado a incluir grupos alquil C1-C12 possuindo um substituinte amino em qualquer posição, e em que o grupo aminoalquil é ligado à molécula de origem através da sua porção alquil. As porções alquil e/ou amino do grupo aminoalquil podem ser ainda substituídas com grupos substituintes.

[531]Tal como aqui utilizado, "alifático" refere-se a um radical ou substituinte de hidrocarboneto linear ou ramificado, contendo tipicamente até vinte e quatro átomos de carbono, em que a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação simples, dupla ou tripla. Um grupo alifático contém preferencialmente de 1 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a 12 átomos de carbono com 1 a 6 átomos de carbono sendo o mais preferido. A cadeia linear ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida com um ou mais heteroátomos, que incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Tais grupos alifáticos interrompidos por heteroátomos incluem, sem limitação polialcóxis, tais como polialquileno-glicóis, poliaminas, e poliiminas. Grupos alifáticos, como aqui utilizados, podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[532]Tal como aqui utilizado, "alicíclico" ou "aliciclil" refere-se a um substituinte ou radical cíclico, em que o sistema de anel é um grupo alifático. O sistema de anel pode compreender um ou mais anéis, em que pelo menos um anel é um grupo alifático. Grupos alicíclicos preferidos incluem anéis com 5 a 9 átomos de carbono no anel. Os grupos acíclicos conforme aqui utilizados podem opcionalmente incluir ainda grupos substituintes.

[533]Tal como aqui utilizado, "alcóxi" refere-se a um radical ou substituinte compreendendo um grupo alquil e um átomo de oxigênio, em que o grupo alcóxi está ligado a uma molécula de origem através do seu átomo de oxigênio. Exemplos de grupos alcóxi incluem, mas não estão limitados a, metóxi, etóxi, propóxi, isopropóxi, n-butóxi, sec- butóxi, terc-butóxi, n-pentóxi, neopentóxi, n-hexoxi e semelhantes. Os grupos alcóxi tal como aqui utilizado podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[534]Tal como aqui usado, "halo", "haleto" e "halogênio" referem-se a um átomo, ou radical substituinte selecionado a partir de flúor, cloro, bromo e iodo.

[535]Tal como aqui utilizado, "aril" e "aromático" referem-se a um radical ou substituinte compreendendo um sistema de anel carbocíclico mono- ou policíclico tendo um ou mais anéis aromáticos. Exemplos de grupos aril incluem, mas não estão limitados a, fenil, naftil, tetra- hidronaftil, indanil, idenil e semelhantes. Sistemas de anel aril preferidos possuem de 5 a 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Grupos aril tal como aqui utilizado podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[536]Tal como aqui utilizado, "aralquil" e "arilalquil" referem-se a um radical ou substituinte compreendendo um grupo alquil e um grupo aril, em que o grupo aralquil ou arilalquil está ligado a uma molécula de origem através do seu grupo alquil. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, benzil, fenetil, e semelhantes. Os grupos aralquil, tal como aqui utilizado podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes ligados ao grupo alquil, aril ou ambos os grupos que formam o radical ou substituinte.

[537]Tal como aqui utilizado, "heterociclilo" refere- se a um radical ou substituinte compreendendo um sistema de anel mono ou policíclico que inclui pelo menos um heteroátomo e é insaturado, parcialmente saturado ou totalmente saturado, incluindo assim grupos heteroaril. Heterociclil também se destina a incluir porções do sistema de anéis fundidos em que um ou mais dos anéis fundidos contêm pelo menos um heteroátomo, e os outros anéis podem conter um ou mais heteroátomos, ou, opcionalmente, não contêm heteroátomos. Um grupo heterocíclico inclui, tipicamente, pelo menos um átomo selecionado a partir de enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupos heterocíclicos incluem [1, 3]dioxolano, pirrolidinil, pirazolinil, pirazolidinil, imidazolinil, imidazolidinil, piperidinil, piperazinil, oxazolidinil, isoxazolidinil, morfolinil, tiazolidinil, isotiazolidinil, quinoxalinil, piridazinonil, tetrahidrofuril e semelhantes. Os grupos heterocíclicos como aqui utilizado podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[538]Tal como aqui utilizado, "heteroaril" e "heteroaromático" refere-se a um radical ou substituinte compreendendo um anel aromático mono ou policíclico, ou sistema de anel ou sistema de anel fundido em que pelo menos um dos anéis é aromático e inclui um ou mais heteroátomo. Heteroaril também se destina a incluir sistemas de anel fundidos, incluindo sistemas em que um ou mais dos anéis fundidos não contêm heteroátomos. Grupos heteroaril incluem, normalmente, um átomo de anel selecionado a partir de enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupos heteroaril incluem, mas não estão limitados a, piridinil, pirazinil, pirimidinil, pirrolil, pirazolil, imidazolil, tiazolil, oxazolil, isooxazolil, tiadiazolil, oxadiazolil, tiofenil, furanil, quinolinil, isoquinolinil, benzimidazolil, benzoxazolil, quinoxalinil, e semelhantes. Os radicais heteroaril ou substituintes podem ser ligados a uma molécula de origem diretamente, ou através de um grupo de ligação, tal como um grupo alifático ou um heteroátomo. Os grupos heteroaril, tal como aqui utilizado, podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[539]Tal como aqui utilizado, "heteroarilalquil" refere-se a radical ou substituinte compreendendo um grupo heteroaril conforme anteriormente definido e um radical alquil, em que o grupo heteroarilalquil é ligado a uma molécula de origem através do seu grupo alquil. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, piridinilmetil, pirimidiniletil, naftidinilpropil e semelhantes. Os grupos heteroarilalquil, tal como aqui utilizados, podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes em uma ou ambas as porções heteroaril ou alquil.

[540]Tal como aqui utilizado, "mono ou policíclico" refere-se a quaisquer sistemas de anel, tal como um anel único ou um sistema policíclico tendo anéis que são fundidos ou ligados, e é concebido para ser incluído em sistemas de anéis simples ou misturados selecionados individualmente a partir de alifáticos, alicíclicos, aril, heteroaril, aralquil, arilalquil, heterocíclico, heteroaril, heteroaromático e heteroarilalquil. Tais estruturas mono e policíclicas podem conter anéis que têm um grau de saturação variável ou uniforme, incluindo os anéis totalmente saturados, parcialmente saturados ou totalmente insaturados. Cada anel pode conter átomos de anel selecionados a partir de C, N, O e S para dar origem aos anéis heterocíclicos, bem como anéis compreendendo apenas átomos do anel de C. Heterocíclicos e todos os anéis de carbono podem estar presentes em um motivo misto, tal como, por exemplo, benzimidazol, em que um anel do sistema de anel fundido tem apenas átomos de carbono no anel e o outro anel tem dois átomos de nitrogênio. As estruturas mono ou policíclicos podem ainda ser substituída com grupos substituintes, tais como, por exemplo, ftalimida, que tem dois grupos oxo (=O) ligados a um dos anéis. Em outro aspecto, as estruturas mono ou policíclicas podem ser ligadas a uma molécula de origem diretamente através de um átomo de anel, através de um grupo substituinte, ou um radical de ligação bifuncional.

[541]Tal como aqui utilizado, "acil" refere-se a um radical ou substituinte compreendendo um grupo carbonila (C=O ou -C(O)-) e outro substituinte X, em que o grupo acil está ligado a uma molécula de origem através do seu grupo carbonila. Como tal, o grupo acil é formalmente obtido por remoção de um grupo hidroxila de um ácido orgânico, e tem a fórmula geral -C(O)-X, em que X é tipicamente alifático, alicíclico ou aromático. O termo "acil" também se destina a incluir radicais ou substituintes heteroacil de fórmula geral -Y(O)n-X, em que X é como definido acima, e Y(O)n é tipicamente sulfonila, sulfinila ou fosfato. Exemplos de grupos acil incluem grupos carbonila alifático, carbonila aromático, sulfonila alifático, sulfinila aromático, sulfinila alifático, fosfato aromático, fosfato alifático, e semelhante. Grupos acil tal como aqui utilizado podem incluir, opcionalmente, outros grupos substituintes.

[542]Tal como aqui utilizado, "substituinte" e "grupo substituinte" incluam grupos que são tipicamente adicionados a outros substituintes ou compostos de origem para melhorar as propriedades desejadas ou gerar os efeitos desejados. Os grupos substituintes podem ser protegidos ou desprotegidos, e podem ser ligados a um sítio disponível ou a vários sítios disponíveis em um composto de origem. Os grupos substituintes também podem ser adicionalmente substituídos com outros grupos substituintes, e podem ser ligados diretamente ou através de um grupo de ligação tal como um grupo alquil ou um grupo hidrocarbil de um composto de origem. Aqui, "hidrocarbil" refere-se a qualquer grupo compreendendo: C, S e H. Estão incluídos os grupos lineares, ramificados e cíclicos com qualquer grau de saturação. Tais grupos hidrocarbil podem incluir um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, e podem ser ainda substituídos com um ou mais grupos substituintes.

[543]A menos que indicado de outra forma, o termo substituído ou "opcionalmente substituído" refere-se à presença opcional de qualquer um dos seguintes substituintes: halogênio, hidroxila, alquil, alquenil, alquinil, acil (-C(O)Raa), carboxil (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, alcóxi, oxo substituído (-O-Raa), aril, aralquil, heterocíclico, heteroaril, heteroarilalquil, amino (-NRbbRcc), imino (=NRbb), amido (-C(O)NRbbRcc ou - N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)NRbbRccou -N(Rbb)C(O)ORaa), ureído (- N(Rbb)C(O)NRbbRcc), tioureído (-N(Rbb)C(S)NRbbRcc), guanidinil (-N(Rbb)C(=NRbb)NRbbRcc), aminidil (-C(=NRbb)NRbbRcc ou - sulfonil (-S(O)2Rbb), sulfonamidil (-S(O)2NRbbRcc ou - N(Rbb)S(O)2Rbb), e grupos conjugados. Aqui, cada um de Raa, Rbb e Rcc é independentemente, H, um grupo funcional químico opcionalmente ligado ou um grupo substituinte adicional, preferencialmente, mas sem limitação, escolhido a partir do grupo que consiste em H, alquil, alquenil, alquinil, alifático, alcóxi, acil, aril, aralquil, heteroaril, alicíclico, heterocíclico e heteroarilalquil. Os substituintes selecionados dentro dos compostos aqui descritos estão presentes em um grau recursivo.

[544]Neste contexto, "substituinte recursivo" significa que um substituinte pode recitar outro exemplo de si mesmo. Devido à natureza recursiva de tais substituintes, teoricamente, um grande número pode estar presente em qualquer reivindicação dada. Um técnico especialista no assunto da química medicinal e da química orgânica compreende que o número total de tais substituintes é razoavelmente limitado pelas propriedades desejadas do composto pretendido. Essas propriedades incluem, a título de exemplo e não de limitação, as propriedades físicas tais como peso molecular, solubilidade ou log P, propriedades de aplicação tal como atividade contra o alvo pretendido, e as propriedades práticas, tal como a facilidade de síntese.

[545] Os substituintes recursivos são um aspecto pretendido da invenção. Um técnico especialista no assunto da química medicinal e da química orgânica compreende a versatilidade de tais substituintes. Na medida em que os substituintes recursivos estão presentes em uma reivindicação da presente invenção, o número total será determinado como descrito acima.

[546] Os termos "composto estável" e "estrutura estável" tal como aqui utilizados, pretendem indicar um composto que é suficientemente robusto para sobreviver ao isolamento em um grau útil de pureza a partir de uma mistura de reação, e formulação em um agente terapêutico eficaz. Apenas compostos estáveis são contemplados aqui.

[547]Tal como aqui utilizado, um zero (0), em um intervalo de número indicando uma determinada unidade, significa que a unidade pode estar ausente. Por exemplo, um composto oligomérico compreendendo de 0 a 2 regiões de um motivo específico, significa que o composto oligomérico pode compreender uma ou duas dessas regiões que têm o motivo em particular, ou o composto oligomérico pode não ter quaisquer regiões que possuem o motivo em particular. Nos casos em que uma porção interna de uma molécula está ausente, as porções que flanqueiam a porção ausente estão ligadas diretamente a uma outra. Da mesma forma, o termo "nenhum", tal como aqui usado, indica que uma determinada característica não está presente.

[548]Tal como aqui utilizado, "análogo" ou "derivado" significa ou um composto ou grupo semelhante em estrutura, mas diferente em relação à composição elementar a partir do composto de origem independentemente da forma como o composto é feito. Por exemplo, um análogo ou derivado do composto não necessita de serem feitos a partir do composto de origem como um material de partida químico.

[549] Os exemplos seguintes são oferecidos apenas para fins ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da presente invenção de forma alguma.

Legendas para a figura Figura 1

[550] Comparação dos AONs com ou sem a citosina para substituição da 5-metilcitosina nas células musculares diferenciadas saudáveis in vitro após a transfecção com (A) PS229L/PS524, SEQ ID NO: 52 (correspondente a SEQ ID NO: 91 para a sequência não modificada, correspondente a SEQ ID NO: 92 em que todas as citosinas são modificadas) ou (B) PS220/PS339 (SEQ ID NO: 21, correspondente a SEQ ID NO: 101 para a sequência não modificada, correspondente a SEQ ID NO: 200, em que todas as citosinas são modificadas) ou (C) PS524/PS1317/PS1318/PS1319, SEQ ID NO: 52 (correspondente a SEQ ID NO: 92 (PS524) em que todas as 6 citosinas são modificadas, a SEQ ID NO: 217 (PS1317) em que 4 das 6 citosinas são modificadas, a SEQ ID NO: 218 (PS1318) em que 2 das 6 citosinas são modificadas, e a SEQ ID NO: 219 (PS1319) em que 3 das 6 citosinas são modificadas (SEQ NO:217). As médias das porcentagens de salto foram calculadas a partir transfecções em triplo (n=3) ou duplo (n=2) por concentração. As linhas sólidas referem-se aos AONs com 5-metilcitosinas, as linhas pontilhadas aos AONs com citosinas não-substituídas (A,B).

Figura 2

[551]Resumo do estudo farmacocinético nos camundongos de tipo selvagem (controle) e mdx, comparando os perfis de plasma e tecido muscular dos AONs com 5-metilcitosinas (PS524, SEQ ID NO: 52 (isto é, correspondente a SEQ ID NO: 92 em que todas as citosinas são modificadas) e PS652, SEQ ID NO: 57 (isto é, correspondente a SEQ ID NO: 185 em que todas as citosinas são modificadas) e AONs com citosinas não modificadas (não metiladas) (PS229L, SEQ ID NO: 52 correspondente a SEQ ID NO: 91 para a sequência não modificada, e PS531, SEQ ID NO: 57 correspondente a SEQ ID NO: 137 para a sequência não modificada). (A) Análise farmacocinética do tecido: 1) a razão entre os níveis médios de AON no músculo de camundongos mdx versus camundongos de controle após uma única injeção sc; 2) os níveis dos AONs (μg/g) em vários músculos mdx (dia = diafragma, gastroc = gastrocnêmio, quadr = quadríceps, tric = tríceps) em 14 dias; 3) a relação do músculo/rim e níveis músculo/fígado no dia 14, e 4) a meia-vida estimada dos diferentes AONs no tríceps. B) Análise farmacocinética do plasma de 1) Tmax (tempo a que Cmax foi atingida, apenas dois pontos de tempo de análise incluídos (15 ou 60 min), 2) Cmax (concentração máxima de plasma atingido), 3) AUC (área sob a curva); indicativo para a biodisponibilidade) e 4) depuração no plasma com 24 horas.

Figura 3

[552]Análise dos níveis de citocinas no sangue total humano mediante incubação com 0, 10, 25, ou 50μg/ml de AONs com citosinas não modificadas PS232 (SEQ ID NO: 39, correspondente a SEQ ID NO: 119 para a sequência não modificada) e PS534 (SEQ ID NO: 59, correspondente a SEQ ID NO: 139 para a sequência não modificada) (barras pretas) ou AONs com 5-metilcitosinas PS648 (SEQ ID NO: 39, correspondente a SEQ ID NO: 201, em todas as citocinas são modificadas) e and PS653 (SEQ ID NO: 59, para SEQ ID NO: 192 em que todas as citocinas são modificadas) (barras cinzas). Os níveis de TNF-α (A, B), MCP-1 (D, E), IP-10 (E, F), e IL6 (G, H) foram determinados usando kits de ELISA disponíveis comercialmente. Cada experimento foi repetido por quatro vezes (n=4). Os dados são apresentados para a resposta mais pronunciada de cada citocina.

Figura 4

[553]Comparações da atividade de AONs com 5-metilcitosinas e/ou 5-metiluracilas com AONs correspondentes sem essas modificações de base, (A) Transfecção de 200 nM, em duplo, em células musculares saudáveis diferenciadas in vitro. A atividade foi expressa como média da porcentagem do éxon 51 (PS43, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 111, PS559 correspondente a SEQ ID NO: 202, em que todas as uracilas são modificadas, PS1106 correspondente a SEQ ID NO: 203, em que todas as citosinas e todas as uracilas são modificadas. Todas as sequências são derivadas de SEQ ID NO: 31), éxon 44 (PS188, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 95, PS785, correspondente a SEQ ID NO: 204, em que todas as uracilas são modificadas, PS1107: correspondente a SEQ ID NO: 205, em que todas as citosinas e todas as uracilas são modificadas. Todas as sequências são derivadas de SEQ ID NO 15); ou éxon 52 (PS235, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 120, PS786, correspondente a SEQ ID NO: 172, em que todas as uracilas são modificadas. Todas as sequências são derivadas SEQ ID NO 40) do salto (n = 2). Sequências de AON (5' para 3') e modificações de bases (nucleotídeos negrito, sublinhado) são mostrados na tabela embaixo. (B) A injeção intramuscular de 20μg de PS49 (sequência não modificada, SEQ ID NO: 216) ou PS959 (sequência modificada em que todas as uracilas são modificadas, SEQ ID NO: 214) nos músculos gastrocnêmio de camundongos mdx. A atividade foi expressa como porcentagem média do salto do éxon 23 murino (n = 4). As sequências AON (5’ a 3’) e as modificações de base (nucleotídeos negrito, sublinhado) são mostradas na tabela embaixo.

Figura 5

[554] Comparações da atividade de AONs com 2,6- diaminopurinas com AONs correspondentes sem essas modificações de base. (A) Transfecção de 200 nM, em duplo, em células musculares saudáveis diferenciadas in vitro. A atividade foi expressa como média da porcentagem do éxon 51 (PS43, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 111, PS403, correspondente a SEQ ID NO: 206, em que todas as adeninas foram modificadas. Todas as sequências são derivadas de SEQ ID NO: 31), éxon 52 (PS235, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 120, PS897: correspondente a SEQ ID NO: 173, em que todas as adeninas foram modificadas. Todas as sequências são derivadas de SEQ ID NO: 40), ou éxon 44 (PS188, sequência não modificada representada por SEQ ID NO: 95, PS733: correspondente a SEQ ID NO: 207, em que todas as adeninas foram modificadas. Todas as sequências são derivadas de salto SEQ ID NO: 15) (n=2). As sequências AON (5’ a 3’) e as modificações de base (nucleotídeos negrito, sublinhado) são mostradas na tabela embaixo. (B) e (C) O efeito da substituição de todas as adeninas não modificadas (PS188, SEQ ID NO: 95) com 2,6- diaminopurinas (PS733; SEQ ID NO: 207) na segurança in vitro. Como marcadores da ativação da via do complemento alternativa, os fatores de separação C3a (B) e Bb (C) foram medidos no plasma do macaco.Exemplos

[555] Os oligonucleotídeos não modificados preferidos (X = C, Y = U, Z = A) são mais preferencialmente derivados de cada uma das sequências de bases de oligonucleotídeos (SEQ ID NO: 14 a 90), e são representados por uma sequência de nucleotídeos ou de bases SEQ ID NO: 91, 93 a 170.

[556] Os oligonucleotídeos modificados preferidos derivados de sequências de nucleotídeos ou de bases SEQ ID NO: 14 a 90, e compreendendo pelo menos um X é m5C e/ou pelo menos um Y é m5U e/ou pelo menos um Z é a2A são representados por sequências de nucleotídeos ou de bases que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 92, 171 a 213,215, 217, 218, 219. Os oligonucleotídeos modificados ainda mais preferidos (todos X = m5C = X1 e/ou Y = m5U = Y1 e/ou Z = a2A =Z1) são derivados de sequências de nucleotídeos ou de bases mais preferidas (SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52, e 57), e são representados por SEQ ID NO: 92, 171 a 174, 185 a 188, 199, 200, 202 a 213, 215, 217, 218, 219. Os oligonucleotídeos mais preferidos são mostrados na Tabela 3.

EXEMPLO 1 Material e Métodos AONs

[557]Todos os oligonucleotídeos (PS220/PS399, com base na SEQ ID NO: 21, correspondendo a SEQ ID NO: 101 para a sequência não modificada (PS220) e a SEQ ID NO: 200, em que todas as citosinas são modificadas (PS399); PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319, com base na SEQ ID NO: 52 correspondem à SEQ ID NO: 91 para a sequência não modificada (PS229L), à SEQ ID NO: 92 (PS524) em que todos as 6 citosinas são modificadas, à SEQ ID NO: 217 (PS1317) em que 4 das 6 citosinas são modificadas, à SEQ ID NO: 218 (PS1318) em que 2 das 6 citosinas são modificadas e à SEQ ID NO: 219 (PS1319) em que 3 das 6 citosinas são modificadas; PS232/PS648, com base na SEQ ID NO: 39 correspondente à SEQ ID NO: 119 para a sequência não modificada (PS232) e à SEQ ID NO: 201, em que todas as citosinas são modificadas (PS648); PS531/PS652, com base na SEQ ID NO: 57 corresponde à SEQ ID NO: 137 para a sequência não modificada (PS531) e à SEQ ID NO: 185, em que todas as citosinas são modificadas (PS652); PS534/PS653, com base na SEQ ID NO: 59 corresponde à SEQ ID NO: 139 para a sequência não modificada (PS534) e à SEQ ID NO: 192, em que todas as citosinas que são modificadas (PS653)) eram 2'-O-metil fosforotioato RNA, e sintetizados utilizando um sintetizador de OP-10 (GE/Akta OligoPilot), por meio de protocolos convencionais de fosforamidita, ou obtidos a partir de fornecedores comerciais, em escala de síntese 40nmol a 4,5 mmol. Os oligonucleotídeos Prosensa sintetizados foram clivados e desprotegidos em uma sequência de duas etapas (DIEA, seguido por tratamento com NH4OH concentrado), purificados por HPLC e dissolvidos em água, e um excesso de NaCl foi adicionado à troca de íons. Após a evaporação, os compostos foram dissolvidos novamente em água, desalinizados por FPLC ou ultrafiltração, e liofilizados. A espectrometria de massa confirmou a identidade de todos os compostos, e a pureza (determinada por UPLC) foi considerada aceitável para todos os compostos (> 75 a 80%); os compostos obtidos a partir de fontes comerciais foram utilizados como recebidos: PS399 (ChemGenes, escala de síntese lμmol, usado como recebido), PS1317, PS1318, PS1319 e (ChemGenes, escala de síntese 200nmol, usado como recebido), PS229L, PS232, PS524, PS648 e (Eurogentec, escala de síntese 40nmol, usado como recebido), PS229L (Prosensa, 5,9g de material obtido, 81% de pureza), PS524 (Avecia, escala de síntese 4,5mmol, 93% de pureza), PS534 (Prosensa, escala de síntese 2μmol, 86% de pureza), PS653 (Prosensa, escala de síntese 40 nmol, 77% de pureza), PS531 (Avecia, 4,6g de material obtido, 85% de pureza), PS652 (Avecia, 2,4g de material obtido, 84% de pureza, e 3,8g de material obtido, 82% de pureza). Para os experimentos de transfecção in vitro aqui descritos, as soluções de trabalho de 50 μm de AONs foram preparadas em 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0). Para os ensaios inteiros de liberação de citocinas no sangue neste exemplo, as concentrações das soluções de estoque (preparadas em água destilada isenta de DNase/RNase (Invitrogen)) variaram: PS232 (8,75 mg/mL), PS534 (7,02 mg/mL), PS648 (8,55 mg/mL), PS653 (8,12 mg/mL).

Análise de transfecção e RT-PCR

[558]As células saudáveis musculares humanas diferenciadas de controle (miotubos) foram transcritas em placas com 6 poços com uma série de concentração de AON triplo de 0-100-200-400 nM (Fig. 1A, PS229L/PS524, SEQ ID NO: 91/92) ou 0-50-100-200-400-800 nM (Fig 1b, PS220/PS399, SEQ ID NO: 101/200) ou com uma concentração in duplo de 400 nM (Fig. 1c, PS524/PS1317/PS1318/PS1319, SEQ ID NO: 92/217/218/219), de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP. Para a transfecção, a polietilenimina (ExGen500, Fermentas) foi usada (2 μl por μg AON, em 0,15M NaCl). Os procedimentos de transfecção acima mencionados foram adaptados do material e dos métodos anteriormente relatados (Aartsma-Rus et al., 2003). Em 24 horas após a transfecção, o RNA foi isolado e analisado por RT-PCR. Resumidamente, para gerar cDNA específico de distrofina, um primer reverso específico para o gene DMD no éxon 55 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319) foi usado na reação da transcriptase reversa (RT) em 1000 ng de RNA de entrada. A análise de PCR foi, subsequentemente, feita em 3 μl de cDNA de distrofina para cada amostra, e incluiu um PCR inicial e aninhado, utilizando os primers específicos do gene DMD no flanqueamento de éxons do éxon 45 (PS220/PS399) ou 53 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319). O isolamento do RNA e a análise de RT-PCR foram realizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP, conforme descrito (Aartsma-Rus et al., 2003). Os produtos de RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel (2% de géis de agarose). Os fragmentos de RT-PCR resultantes foram quantificados através da análise DNA Lab-on-a-Chip (Agilent). Os dados foram processados pelo software “Agilent 2100 Bioanalyzer” e Excel 2007. A razão entre o produto menor transcrito (contendo o éxon 45(PS220/PS399), ou salto do 53 (PS229L/PS524/PS1317/PS1318/PS1319)) para a quantidade total de produtos de transcrição foi avaliada (representando as eficiências do salto do éxon 45 ou 53 em porcentagem), e diretamente comparada com a das células não transfectadas.

Estudos de farmacocinética em camundongos mdx e de tipo selvagem

[559] Os camundongos Mdx (C57Bl/10ScSn-Dmdmdx/J) e de tipo selvagem (C57Bl/10ScSnJ) com 5 semanas de idade foram obtidos de Jackson Laboratory (Maine USA). Os AONs (PS229L/PS524 correspondentes à SEQ ID NO: 91/92, PS531/PS652 correspondente à SEQ ID NO: 137/185) foram administrados em solução salina fisiológica, em uma dose de 100 mg/kg por injeção subcutânea, três vezes por semana durante duas semanas. Para determinar o perfil plasmático de AONs, amostras de plasma foram retiradas de dois animais por ponto de tempo (por grupo de AON), nos seguintes tempos para os animais: 15 min, 1h, 2h, 6h e 24 horas após a dosagem. Para se obter o plasma, o sangue venoso foi recolhido em tubos de Li-heparina, centrifugado e mantido à -80°C até a análise. Para análise da distribuição, sete órgãos (coração, córtex renal, fígado, diafragma, gastrocnêmio, quadríceps & tríceps) foram colhidos no sacrifício dos animais. Os tecidos foram congelados e armazenados a -80°C até a análise.

Ensaio de hibridização de AON

[560] Para determinar as concentrações dos AONs (PS229L/PS524 correspondente à SEQ ID NO: 91/92, PS531/PS652 correspondente à SEQ ID NO: 137/185) no plasma e no tecido, um ensaio de hibridização de AON foi usado, que é baseado no ensaio descrito em Yu et al., 2002. Para a análise de distribuição nos tecidos, os tecidos foram homogeinizados, usando um MagNaLyzer (Roche) para uma concentração de 60 mg/ml em tampão protK (100 mmol/l Tris- HCl pH 8,5, 200 mmol/l NaCl, 5 mmol/l EDTA, 0,2% SDS), contendo 2 mg/ml de proteinase K, seguido por uma incubação de 2 horas (fígado), ou incubação de 4 horas (todos os outros órgãos), em uma estufa para hibridização rotativa a 55°C, e então armazenados a -20oC até o uso. Todos os homogenatos de tecido e curvas de calibração foram diluídos (ajustar ao critério do ensaio) em homogenato de tecido de controle de mdx agrupado diluído 60 vezes (fígado, rim, vários grupos de músculos). Uma sonda molde (template) para cada modelo de AON (5’ gaatagacg-anti-AON-biotina 3', oligonucleotídeo fosfato DNA) e uma sonda de ligação foram usadas (oligonucleotídeo fosfato DNA p-cgtctattc-DIG) no ensaio de hibridação. Os homogenatos foram incubados por 1 h a 37°C com a sonda molde (50nmol/l), e as amostras hibridizadas foram transferidas para placas com 96 poços revestidas com estreptavidina, e incubadas por 30 min a 37°C. Posteriormente, a placa foi lavada quatro vezes, e a ligação marcada com digoxigenina (2 nmol/L) foi adicionada, e incubada durante 30 min à temperatura ambiente. A marcação com DIG foi detectada usando um anti-DIG-POD (1:7,500 - 1:30,000; Roche Diagnostics), que foi visualizado com um substrato de 3,3‘, 5,5‘ -tetrametilbenzidina (Sigma Aldrich, Holanda), e a reação foi interrompida usando uma solução ácida (Sigma Aldrich). A absorção foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placa BioTek Synergy HT (Beun de Ronde, Abcoude, Holanda). As amostras de plasma foram analisadas de acordo com o mesmo protocolo, usando plasma de mdx agrupado 100 vezes diluído.

Ensaio de liberação de citocina no sangue total

[561] Para a detecção da possível estimulação de citocina induzida por AONs selecionados (PS232/PS648 correspondendo a SEQ ID NO: 119/201 e PS534/PS653 correspondendo a SEQ ID NO: 139/192), o sangue total (CPD anticoagulante) a partir de indivíduos voluntários humanos, foi usado. Variando as concentrações de AON (variando de 0 a 50 μg/ml, em uma diluição de aproximadamente 1:0,01 (v/v)) foram adicionadas ao sangue, e as amostras foram incubadas durante 4 horas a 37°C sob atmosfera de 5% de CO2. Após a incubação, as amostras foram centrifugadas a 3200xg durante 15 minutos a 4°C, e os sobrenadantes de plasma foram recolhidos e armazenados a -20°C até a quantificação da citocina. As concentrações de MCP-1, IL-6, TNF-α, e IP-10 foram determinadas por ELISA sanduíche (kits de ELISA MCP-1, IL-6, TNF-α, IP-10 humano (R&D Systems). Os experimentos com o sangue total humano foram repetidos de três a quatro vezes. A Figura 3 é baseada em apenas um experimento, mas é considerada representativa.

Resultados

[562] O efeito sobre a atividade de AON (isto é, a indução da eficiência do salto de éxon) de substituir todas as citosinas por 5-metilcitosinas (m5C) foi testado in vitro em células musculares cultivadas, diferenciadas, saudáveis. Na figura 1a e 1b são mostrados dois exemplos. Ao comparar PS229L e PS524 (=PS229L-M5C) (isto é, sequência não-modificado SEQ ID NO: 91 em comparação com a sequência modificada SEQ ID NO: 92 em que todas as citosinas foram modificadas) em um experimento de transfecção de dose- resposta utilizando 0-100-200-400 nM, PS524 foi claramente mais eficaz do que PS229L a 200 e 400 nM (níveis de salto do éxon 53 1,9 vezes maior) (Figura 1a). Do mesmo modo, ao comparar PS220 e PS399 (=PS220-M5C) (isto é, sequência não- modificado SEQ ID NO: 101 em comparação com a sequência modificada SEQ ID NO: 200 em que todas as citosinas foram modificadas) em um experimento de transfecção de dose- resposta utilizando 0-50-100-200-400-800 nM, PS399 foi claramente mais eficaz do que PS220, especialmente a concentrações baixas (níveis de salto do éxon 45 até 10 vezes mais elevados a 50 nM) (Figura 1b). Estes resultados demonstram que a presença de 5-metilcitosinas tem um efeito positivo sobre a atividade dos AONs. No PS524 (SEQ ID NO: 92) todas as 6 citosinas foram substituídas com 5- metilcitosinas (m5C), que tinha um efeito positivo na atividade de salto do éxon, quando comparado com o PS229L do oligonucleotídeo da contraparte não modificada (SEQ ID NO: 91) (Figura 1a). Para testar se o efeito positivo pode estar correlacionado com o número ou a porcentagem de modificações de bases incorporadas, PS1317, PS1318, e PS1319, com respectivamente 4, 2, e 3 das 6 citosinas substituídas com 5-metilcitosinas (M5C), foram testados e comparados diretamente ao PS524 de células musculares saudáveis, diferenciadas, cultivados in vitro. PS1317, PS1318, e PS1319 foram todos eficazes na indução do salto do éxon 53 (47%, 37%, e 45%, respectivamente) (Figura 1c). Quando comparado aos níveis obtidos com PS524, no entanto (64%), estes resultados sugerem que na verdade, a redução do número de 5-metilcitosinas (M5C) de 6 para 4, 3, 2 ou 5- metilcitosinas, leva a um efeito positivo na redução da atividade do salto de éxon do AON.

[563] Para investigar se as 5-metilcitosinas afetam a bioestabilidade, -distribuição, e/ou -disponibilidade, um camundongos de tipo selvagem (controle) e mdx. O modelo de camundongo mdx para DMD tem uma mutação sem sentido natural no éxon 23, e é, portanto, deficiente em distrofina. A ausência de distrofina nas membranas aumenta a permeabilidade das fibras musculares para moléculas relativamente pequenas como AONs, e na verdade tem sido demonstrada para aumentar a absorção de AON2'-O-metil fosforotioato RNA pelo músculo em até 10 vezes (Heemskerk et al., 2010). Os camundongos foram injetados por via subcutânea com 100 mg/kg de cada um dos AONs contendo 5- metilcitosina (PS524, PS652 correspondente a SEQ ID NO: 92, 185) ou suas contrapartes com as citosinas não modificados (PS229L, PS531, correspondente à SEQ ID NO: 91, 137), três vezes por semana, durante duas semanas. Em diferentes pontos de tempo (dias 1, 7, 14), após a última injeção, os camundongos foram sacrificados, e os diferentes grupos musculares (coração, diafragma, gastrocnêmio, quadríceps e tríceps) e fígado e rim foram isolados para determinar as concentrações de AON nos mesmos (Figura 2A). Como previsto, para todos os compostos as concentrações nos músculos mdx (média de todas as amostras), foi maior do que nos camundongos do controle. A razão dos níveis de AON em mdx para o controle pareceu relativamente maior para os AONs com 5-metilcitosinas. Mais especificamente, nos camundongos mdx, os níveis de PS524 e PS652 foram de 2 a 3 vezes maiores do que os de PS229L e PS531. (Figura 2A). Ao monitorar os níveis de AON no rim e no fígado (órgãos com toxicidade conhecida), as razões entre o tecido muscular e os tecidos de toxicidade se mantinham semelhantes, ou eram ainda favoráveis para PS524. Estes resultados sugerem que os AONs com 5-metilcitosina são absorvidos melhor ou mais estáveis no músculo, do que os AONs com citosinas não modificadas. Na verdade, a meia-vida no músculo foi superior para o PS524 (>20 dias) e PS652 (25 dias), quando comparado com PS229L (7 dias) e PS531 (10 dias). No plasma, os valores de Cmax dos AONs injetados foram semelhante, o que confirma que os camundongos receberam doses iguais (Figura 2B). Notavelmente, os valores de AUC (como indicador de biodisponibilidade) foram de 1,5 a 2,3 vezes maiores para as 5-metilcitosina contendo AONs. Isto foi associado a uma redução da depuração, que apoia os seus níveis mais elevados do tecido muscular. Os resultados deste estudo de farmacocinética demonstram assim que a presença de 5-metilcitosinas tem um efeito positivo sobre a bioestabilidade, -distribuição, e/ou -disponibilidade dos AONs, enquanto as razões de órgãos/toxicidade do músculo foram semelhantes para aqueles com os AONs com citosinas não modificadas.

[564] O perfil de segurança in vitro dos AONs com 5- metilcitosinas (PS648, PS653 correspondentes às SEQ ID NO: 201, 192) foi comparado para aquele dos AONs com citosinas não modificadas (PS232, PS534, correspondentes às SEQ ID NO: 119, 139). Os AONs podem estimular uma resposta imune inata por ativação dos receptores do tipo Toll (incluindo TLR7, TLR8, TLR9), o que resulta no conjunto de respostas imunes coordenadas que inclui a imunidade inata. Várias quimo- e citocinas, tais como IP-10, TNFα, IL-6 e MCP-1 desempenham um papel neste processo, e, por conseguinte, foram monitorizadas no sangue total humano incubado com 0 a 50/ml de cada AON (usando kits de disponíveis comercialmente). Ambos PS232 e PS534 têm citosinas não modificadas, e induziram a liberação de TNF-α (Figura 3A, B), MCP-1 (Figura 3C e D), IP-10 (Figura 3E, F), e de IL-6 (Figura 3G, H), em doses crescentes. Em contraste, ambos PS648 e PS653 (com 5-metilcitosinas) não têm qualquer efeito sobre o TNF-α, IP-10 e IL-6. PS653, PS648 não, parecia induzir uma menor liberação de MCP-1 apenas. Em conclusão, a presença de 5-metilcitosinas melhorou o perfil de segurança destes AONs in vitro.

EXEMPLO 2 Material e Métodos AONs

[565]Todos os oligonucleotídeos (PS43/PS559/PS1106, todas baseados em SEQ ID NO: 31, e correspondentes a SEQ ID NO: 111 (PS43) sequência não modificada, SEQ ID NO: 202 (PS559) em que todas as uracilas foram modificadas, e SEQ ID NO: 203 (PS1106) em que todas as uracilas e todas as citosinas foram modificadas; PS188/PS785/PS1107, todos baseados em SEQ ID NO: 15, e correspondentes à SEQ ID NO: 95 (PS188) sequência não-modificada, SEQ ID NO: 204 (PS785) em que todas as uracilas foram modificadas, e SEQ ID NO: 205 (PS1107) em que todas as uracilas e todas as citosinas foram modificadas; PS235/PS786 todos baseados em SEQ ID NO: 40, e correspondentes à SEQ ID NO: 120 (PS235) sequência não-modificada e SEQ ID NO: 172 (PS786) em que todas as uracilas foram modificadas), e PS49 (SEQ ID NO: 216) e sequência não modificada e PS959 (SEQ ID NO: 214), em que todas as citosinas foram modificadas eram 2'-O-metil- fosforotioato RNA, e sintetizados utilizando um sintetizador OP-10 (GE/ÂKTA OligoPilot) através de protocolos convencionais de fosforamidita, ou obtidos a partir de fornecedores comerciais, em escala 200nmol- 286,1g. Os oligonucleotídeos Prosensa sintetizados foram clivados e desprotegidos em uma sequência de duas etapas (DIEA, seguido por tratamento com NH4OH concentrado), purificados por HPLC e dissolvidos em água, e um excesso de NaCl foi adicionado à troca de íons. Após a evaporação, os compostos foram dissolvidos novamente em água, desalinizados por FPLC ou ultrafiltração, e liofilizados. A espectrometria de massa confirmou a identidade de todos os compostos, e a pureza (determinada por UPLC) foi considerada aceitável para todos os compostos (> 75 a 80%); os compostos obtidos a partir de fontes comerciais foram utilizados como recebidos: PS188 (Girindus, 286,1g de produto obtido, pureza de 93%), PS785, PS786, PS1106, e PS1107 (ChemGenes, escala de síntese de 200nmol, usado como recebido), PS43 (Prosensa, escala de síntese de lμmol, pureza de 90%), PS559 (ChemGenes , escala de síntese de lμmol, usado como recebido), PS235 (Prosensa, escala de síntese de l,92mmol, pureza de 9l%). Para os experimentos de transfecção in vitro aqui descritos, as soluções de trabalho de 50 μm de AONs foram preparadas em 2 0 mM de tampão de fosfato (pH 7,0).

Análise de transfecção e RT-PCR

[566]As células saudáveis musculares humanas diferenciadas de controle (miotubos) foram transfectadas em placas com 6 poços com uma concentração de AON fixa de 200nM, de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP. Para a transfecção, a polietilenimina (ExGen500, Fermentas) foi usada (2 μl por μg AON, em 0,l5M NaCl). Os procedimentos de transfecção acima mencionados foram adaptados do material e dos métodos anteriormente relatados (Aartsma-Rus et al., 2003). Em 24 horas após a transfecção, o RNA foi isolado e analisado por RT-PCR. Resumidamente, para gerar cDNA específico de distrofina, um primer reverso específico para o gene DMD no éxon 53 (PS43/ PS559/PS1106, SEQ ID NO: 111, 202, 203), éxon 46 (PS188/PS785/PS1107 SEQ ID NO: 95, 204, 205) ou éxon 54 (PS235/PS786, SEQ ID NO: 120, 172) foi usado na reação de transcriptase reversa (RT) em 1000 ng de RNA de entrada. A análise de PCR foi, subsequentemente, feita em 3μl de cDNA de distrofina para cada amostra, e inclui um PCR inicial e aninhado utilizando os primers específicos do gene DMD em éxons flanqueadores do éxon 51 (PS43/ PS559/PS1106), éxon 44 (PS188/PS785/PS1107) ou éxon 52 PS235/PS786). O isolamentodo RNA e a análise de RT-PCR foram realizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão não GLP, conforme descrito em [Aartsma-Rus et al., Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14]. Os produtos de RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel (2% de géis de agarose). Os fragmentos de RT-PCR resultantes foram quantificados através da análise DNA Lab-on-a-Chip (Agilent). Os dados foram processados pelo software “Agilent 2100 Bioanalyzer” e Excel 2007. A razão entre o menor produto transcrito (contendo o salto do éxon 51 (PS43/PS559/PS1106), éxon 44 (PS188/PS785/PS1107), ou éxon 52 (PS235/PS786) para a quantidade total de produtos de transcrição foi avaliada (representando as eficiências de salto do éxon 51, 44, ou 52 eficiências em porcentagens), e diretamente comparada com a de células não transfectadas.

Administração in vivo e RT-PCR

[567] Os experimentos com os modelos de camundongos mdx (C57Bl/10ScSn-mdx/J; Charles River Laboratories) foram aprovados pelo LUMC Comitê de Ética de Animal local (número DEC 11145). Dois camundongos mdx por grupo foram anestesiados utilizando isoflurano, e em seguida injetados por via intramuscular em ambos os músculos gastrocnemius, com 20 μg de PS49 (SEQ ID NO: 216) ou PS959 (SEQ ID NO: 214), diluída em solução salina estéril para um volume total de 50 μl por injeção, em dois dias consecutivos. Os animais foram sacrificados uma semana após a última injeção por deslocamento cervical e os músculos foram isolados e congelados rapidamente em tubos magnalyzer greenbead (Roche). Seiscentos μl de TriPure (Roche), foram adicionados aos tubos, e os músculos foram homogeneizados usando a máquina bulletblender, 3 x 1 min velocidade 10. O lisado foi transferido para um tubo limpo, para o qual 120 μl de clorofórmio foram adicionados. As amostras foram vigorosamente agitadas e incubadas em gelo durante 5 minutos, em seguida, centrifugadas durante 15 minutos à velocidade máxima em 4oC. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, e 1 volume de isopropanol foi adicionado. As amostras foram misturadas e incubadas a 4 graus por pelo menos 30 minutos. Em seguida, as amostras foram centrifugadas durante 15 minutos à velocidade máxima a 4oC, lavadas com etanol a 70%, seguido por uma segunda etapa de centrifugação de 10 minutos com velocidade máxima à 4oC. Os precipitados de RNA foram secos ao ar e dissolvidos em água tratada com DEPC. O cDNA foi gerado utilizando 400 ng de RNA total com os primers hexaméricos aleatórios utilizando transcriptase reversa (RT) Transcriptor (Roche Diagnostics), de acordo com as instruções do fabricante. Os PCRs foram realizados por 30 ciclos de 94 graus, durante 30 s, 60 graus durante 30 s, e 72 graus durante 30 s, em uma reação de 50 μl utilizando 1,5 μl de cDNA como molde, utilizando primers específicos para o éxon 22 e o éxon 24 do camundongo. Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose 2% quantificado da Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA, EUA).

Resultados

[568] O efeito sobre a atividade de AON (isto é, eficiência de indução do salto de éxon) em substituir todas as citosinas não modificadas por 5-metilcitosinas, e substituir todas as uracilas não modificadas por 5- metiluracilas (como em PS1106, PS1107, SEQ ID NO: 203, 205), e de apenas substituir todas as uracilas não modificados por 5-metiluracilas (como em PS559, PS785, PS786, SEQ ID NO: 202, 204, 172), foi primeiro testado a uma concentração de AON fixa de 200 nM, in vitro em células musculares cultivadas, diferenciadas e saudáveis (Figura 4A). Os AONs com 5-metiluracilas (PS559, PS785, e PS786) aumentaram as eficiências do salto de éxon de 1,3 a 3 vezes, quando comparados com suas contrapartes com uracilas não modificados. Ao substituir também as citosinas não modificadas por 5-metilcitosinos, os níveis de salto aumentaram ainda mais (PS1106 versus PS559, SEQ ID NO: 203 versus 202) ou semelhante (PS1107 versus PS785, SEQ ID NO: 205 versus 204). O efeito sobre a atividade de AON (isto é, induzir a eficiência do salto de éxon) de substituir todas as uracilas não modificadas (como em PS49, SEQ ID NO: 216) por 5-metiluracilas (como em PS959, SEQ ID NO: 214), em seguida, foi também testado no músculo do modelo do camundongo mdx. PS959 com todos as 5-metiluracilas aumentou as eficiências do salto do éxon 23 em aproximadamente 3 vezes quando comparadas ao PS49 com uracilas não modificadas (n = 4 por AON) (Figura 4B). Esses resultados demonstraram que não apenas as 5-metilcitosinas têm um efeito positivo na atividade de salto do éxon (conforme mostrado na Figura 1), mas também, as 5-metiluracilas, tanto in vitro quanto in vivo. Além disso, o uso combinado dessas 5-metilpirimidinas podem até aumentar ainda mais a atividade.

EXEMPLO 3 Material e Métodos AONs

[569]Todos os oligonucleotídeos (PS43/ PS403, baseado na SEQ ID NO: 31, e correspondente a SED ID NO: 111 (PS43) para não modificados, e SEQ ID NO: 206 (PS403) para a sequência em que todas as adeninas foram modificadas; PS188/PS733, baseado na SEQ ID NO: 15, e correspondente a SEQ ID NO: 95 (PS188) para não modificados, e SEQ ID NO: 207 (PS733) para a sequência em que todas as adeninas foram modificadas; PS235/PS897, baseado na SEQ ID NO: 40, e correspondente a SEQ ID NO: 120 (PS235) para não modificados, e SEQ ID NO: 173 (PS897) para a sequência em que todas as adeninas foram modificadas, foram 2’-O-metil fosforotioato RNA, e sintetizados utilizando um sintetizador OP-10 (GE/ÂKTA Oligopilot), através de protocolos padrão de fosforamidita, ou obtidos a partir de fornecedores comerciais, na escala 200nmol a 151g. Os oligonucleotídeos Prosensa sintetizados foram clivados e desprotegidos em uma sequência de duas etapas (DIEA, seguido por tratamento com NH4OH concentrado), purificados por HPLC e dissolvidos em água, e um excesso de NaCl foi adicionado à troca de íons. Após a evaporação, os compostos foram dissolvidos novamente em água, desalinizados por FPLC ou ultrafiltração, e liofilizados. A espectrometria de massa confirmou a identidade de todos os compostos, e a pureza (determinada por UPLC) foi considerada aceitável para todos os compostos (> 75 a 80%); os compostos obtidos a partir de fontes comerciais foram utilizados como recebidos: S188 (Girindus, 151g obtido, pureza 92%), PS733 (TriLink ou ChemGenes, 200nmol/1mg de escala de síntese, PS43 (Prosensa, 10μmol de escala de síntese, pureza 86%) , PS403 (ChemGenes, lμmol de escala de síntese, utilizado como recebido), PS235 (Prosensa, 1,92mmol de escala de síntese, pureza 91%), PS897 (ChemGenes, 200nmol de escala de síntese, utilizado como recebido). Para as experiências de transfecção in vitro aqui descritas, as soluções de trabalho de 50 μm de AONs foram preparadas em 2 0 mM de tampão de fosfato (pH 7,0). Para os ensaios de ativação do complemento in vitro aqui descritos, 3 mg/ml de soluções estoque PS188 e PS733 foram preparadas em 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0).

Transfecção e análise de RT-PCR

[570] Células musculares humanas saudáveis de controle diferenciadas (miotubos) foram transfectadas em placas com 6 poços, com uma concentração de AON fixa de 200 Nm, de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP. Para a transfecção, polietilenimina (ExGen500, Fermentas) foi usada (2 μl por μg de AON, em 0,15 M de NaCl). Os procedimentos de transfecção acima mencionados foram adaptados do material e dos métodos anteriormente relatados (Aartsma-Rus et al., 2003). Em 24 horas após a transfecção, o RNA foi isolado e analisado por RT-PCR. Resumidamente, para gerar cDNA específico de distrofina, um primer reverso específico para o gene DMD no éxon 53 (PS43/PS403, SEQ ID NO: 111/206), éxon 46 (PS188/PS733, SEQ ID NO: 95/207) ou éxon 54 (PS235/PS897, SEQ ID NO: 120/173) foi usado na reação da transcriptase reversa (RT) em 1000 ng de RNA de entrada. A análise de PCR foi, subsequentemente, feita em 3 μl de cDNA de distrofina para cada amostra, e incluiu um PCR inicial e aninhado, utilizando os primers específicos do gene DMD no flanqueamento de éxons do éxon 51 (PS43/PS403), éxon 44 (PS188/PS733), ou éxon 52 (PS235/PS897). O isolamento do RNA e a análise de RT-PCR foram realizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão não-GLP, conforme descrito [Aartsma-Rus et al., Hum Mol Genet 2003;12(8):907-14]. Os produtos de RT-PCR foram analisados por eletroforese em gel (2% de géis de agarose). Os fragmentos de RT-PCR resultantes foram quantificados através da análise DNA Lab-on-a-Chip (Agilent). Os dados foram processados pelo software “Agilent 2100 Bioanalyzer” e Excel 2007. A razão entre o produto menor transcrito (contendo o salto do éxon 51 (PS43/PS403), éxon 44 (PS188/PS733), ou éxon 52 (PS235/PS897) para a quantidade total de produtos de transcrição foi avaliada (representando as eficiências do salto do éxon 51, 44, ou 52 em porcentagem), e diretamente comparada com a das células não transfectadas.

Ensaio de ativação do complemento

[571] Os oligonucleotídeos anti-senso podem ativar a via do complemento alternativa que contém diversos fatores de divisão tais como C3a e fator Bb (o último é único para a via alternativa). A capacidade dos AONs de possivelmente ativar a via do complemento foi avaliada no plasma de macacos Cynomolgus (LiHe plasma, CIT, France). Concentrações aumentadas (de 0 a 300 g/mL) de PS188 (SEQ ID NO: 95) e PS733 (PS207), em uma diluição de 1:10 (v/v)), foram adicionadas ao plasma, e incubadas a 37°C durante 30 min. A reação foi terminada transferindo as amostras para o gelo e fazendo diluições no diluente gelado. As concentrações de Bb e C3a foram determinadas por ELISA (Quidel, San Diego, CA).

Resultados

[572] O efeito sobre a atividade de AON (isto é, a indução da eficiência do salto de éxon) de substituir todas as adeninas não modificadas com 2,6-diaminopurinas foi testado a uma concentração fixa de AON (200 nM), em células musculares diferenciadas, saudáveis, cultivadas in vitro. Na Figura 5A são mostrados exemplos para três sequências diferentes de AON. Os AONs com 2,6-diaminopurinas (PS403, PS897, e PS733, SEQ ID NO: 206, 207, 173) aumentaram a eficiência do salto de éxon em 2 a 4 vezes, quando comparado com os seus homólogos com adeninas não modificados (em comparação com SEQ ID NO: 111, 95, 120). Parecia haver uma correlação com o número de 2,6- diaminopurinas em cada AON.

[573] O efeito da substituição de todas as adeninas não modificadas (como em PS188, SEQ ID NO: 95) com 2,6- diaminopurinas (como em PS733; SEQ ID NO: 207) na segurança in vitro, isto é, a possível ativação da via do complemento alternativa, foi testado em plasma de macaco. Considerando que PS188 induziu níveis relativamente elevados de ambos os fatores de divisão Bb e C3a, as 2,6-diaminopurinas em PS733 aboliram completamente o efeito sobre a via alternativa, mostrando nenhum aumento em ambos os níveis de Bb ou C3a (Figura 5B). Assim, a presença de 2,6-diaminopurinas pareceu melhorar o perfil de segurança do PS188 in vitro.

[574] Esses resultados demonstraram o efeito positivo das 2,6-diaminopurinas na atividade de salto de éxon e segurança dos AONs.Lista de referênciasvan Ommen, van Deutekom, Aartsma-Rus, Curr Opin Mol Ther. 2008; 10(2):140-9.Yokota, Duddy, Partidge, Acta Myol. 2007; 26(3):179- 84.van Deutekom et al., N Engl J Med. 2007; 357(26):2677- 86.Goemans et al., N Engl J Med. 2011; 364(16):1513-22. Cirak et al., Lancet 2011; 378: 595-605.Heemskerk et al., Mol Ther 2010; 18(6):1210-7.Aartsma-Rus et al., Hum Mol Gen 2003; 12(8):907-14.Yu RZ., Anal Biochem 2002; 304: 19-25.Krieg AM. et al., Nature 1995; 374: 546-549.Diebold S.S. et.al., Eur J Immunol. 2006; Dec;36(12):3256-67.Krieg, A. M., Curr. Opin. Immunol. 2000; 12: 35-43.Wagner, H., Adv. Immunol. 1999; 73: 329-368.Popovic PJ. et al., J of Immunol 2006; 177: 8701-8707.Peacock H et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 9200Arai K et al., Bioorg. Med. Chem. 2011, 21, 6285Ehmsen J. et al., J. Cell Sci. 2002, 115 (Pt14): 28012803.Monaco A.P., et al., Genomics 1988; 2: 90-95.Manzur A.Y. et al., Wiley publishers, 2008. The Cochrane collaboration.Hodgetts S., et al., Neuromuscular Disorders 2006; 16: 591-602.Aartsma-Rus et al., Oligonucleotides 2010, 20(2): 6977Zuker M., et al., Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3406-15.Cartegni L, et al., Nat Rev Genet 2002;3(4):285-98.Cartegni L, et al., Nucleic Acids Res 2003;31(13):3568-71Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000Kumar L, Pharm. Technol. 2008, 3, 128Bruno, K., Advanced Drug Delivery Reviews 2011; 63: 1210.Hari et al., Org. Biomol. Chem. 2012, 10, 9639);Hanessian et al., Angew.Chem. Intl Ed. 2012, 45, 11242

Claims

1. Oligonucleotídeo caracterizado pelo fato de que compreende um monômero de 2’-O-metil RNA e uma cadeia principal de fosforotioato e compreende uma base 5- metiluracila e/ou 5-metilcitosina e/ou 2,6-diaminopurina, em que o referido oligonucleotídeo é representado por um nucleotídeo ou uma sequência de bases compreendendo ou consistindo em uma das SEQ ID NO: 15, 21, 31, 40, 52 e 57.

2. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo compreende uma base 5-metilcitosina e/ou 5-metiluracila.

3. Oligonucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo compreende uma base 2,6-diaminopurina.

4. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo é complementar reverso ao, e/ou se liga a, e/ou alveja, e/ou hibridiza com, pelo menos, uma parte de uma região de éxon e/ou região de não-éxon da distrofina.

5. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo compreende ou consiste em uma sequência que é complementar reversa a, e/ou se liga a, e/ou alveja, e/ou hibridiza com, pelo menos, uma parte dos éxons 44, 45, 51, 52, 53 ou 55 do pré-mRNA da distrofina.

6. Oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido oligonucleotídeo é representado por um nucleotídeo ou uma sequência de bases compreendendo ou consistindo em uma das SEQ ID NO: 92, 172, 173, 185, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 217, 218 ou 219.

7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um excipiente que pode ajudar ainda mais a melhorar o direcionamento e/ou entrega da referida composição e/ou do referido oligonucleotídeo para um tecido, e/ou célula, e/ou em um tecido, e/ou célula.

9. Uso de um oligonucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma composição conforme definida na reivindicação 7 ou 8 caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para prevenção, tratamento e/ou atrasar a Distrofia Muscular de Duchenne ou Distrofia Muscular de Becker a um indivíduo em necessidade do mesmo.