JP6141770B2 - アンチセンス核酸 - Google Patents

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Description

本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５、４５、５０及び４４番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマー及び該オリゴマーを含む医薬組成物に関する。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は出生男子約３，５００人に１人が発症する最も頻度の高い遺伝性進行性筋萎縮症である。乳幼児期には正常のヒトとほとんど変わらない運動機能を示すが、４〜５歳頃から筋力低下がみられる。その後筋力低下は進行し１２歳頃までに歩行不能になり、２０歳代で心不全または呼吸器不全により死に至る重篤な疾患である。現在、ＤＭＤに対する有効な治療法はなく、新たな治療薬の開発が強く求められている。
ＤＭＤはジストロフィン遺伝子の変異が原因であることが知られている。ジストロフィン遺伝子はＸ染色体に存在し、２２０万塩基対のＤＮＡから成る巨大な遺伝子である。ＤＮＡからｍＲＮＡ前駆体に転写され、さらにスプライシングによりイントロンが除かれ７９のエクソンが結合したｍＲＮＡが合成される。このｍＲＮＡから３，６８５のアミノ酸に翻訳され、ジストロフィンタンパク質が生成される。ジストロフィンタンパク質は筋細胞の膜安定性の維持に関与しており、筋細胞を壊れにくくするために必要である。ＤＭＤ患者のジストロフィン遺伝子は変異を有するため、筋細胞において機能を有するジストロフィンタンパク質が殆ど発現されない。そのため、ＤＭＤ患者体内では、筋細胞の構造を維持できなくなり、多量のカルシウムイオンが筋細胞内に流れ込む。その結果、炎症に似た反応が生じ、線維化が進むために筋細胞が再生されにくくなる。
ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）もジストロフィン遺伝子の変異が原因であるが、その症状は筋萎縮による筋力低下を呈するものの一般にＤＭＤと比較して軽く、筋力低下の進行も遅く、多くの場合、成人期に発症する。ＤＭＤとＢＭＤとの臨床症状の違いは、変異によりジストロフィンのｍＲＮＡがジストロフィンタンパク質へと翻訳される際のアミノ酸読み取り枠が破壊されるか、あるいは維持されるかによるものと考えられている（非特許文献１）。つまり、ＤＭＤでは、アミノ酸読み取り枠がずれる変異を有することにより、機能を持つジストロフィンタンパク質がほとんど発現しないが、ＢＭＤでは変異によりエクソンの一部は欠失しているが、アミノ酸読み取り枠は維持されているために不完全ながらも機能を有するジストロフィンタンパク質が産生される。
ＤＭＤの治療法として、エクソンスキッピング法が期待されている。この方法は、スプライシングを改変することでジストロフィンのｍＲＮＡのアミノ酸読み取り枠を修復し、部分的に機能を回復したジストロフィンタンパク質の発現を誘導する方法である（非特許文献２）。エクソンスキッピングの対象となるアミノ酸配列部分は失われることになる。そのためこの治療で発現されるジストロフィンタンパク質は正常のものより短くなるが、アミノ酸読み取り枠が維持されるために筋細胞を安定化する機能が部分的に保持される。従って、エクソンスキッピングにより、ＤＭＤは、より軽症のＢＭＤと同じような症状を呈するようになると期待されている。エクソンスキッピング法は、マウスやイヌによる動物実験を経て、ヒトＤＭＤ患者に対する臨床試験が行われている。
エクソンスキッピングは、５’若しくは３’スプライス部位のいずれか若しくは両方、又はエクソンの内部を標的とするアンチセンス核酸の結合により誘導することができる。エクソンは両方のスプライス部位がスプライソソーム複合体によって認識された場合のみｍＲＮＡに包含される。従って、スプライス部位をアンチセンス核酸でターゲッティングすることにより、エクソンスキッピングを誘導することができる。また、エクソンがスプライシングの機構に認識されるためにはエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）へのＳＲタンパク質の結合が必要であると考えられており、ＥＳＥをターゲッティングすることでもエクソンのスキッピングを誘導することができる。
ジストロフィン遺伝子の変異はＤＭＤ患者によって異なるため、遺伝子変異の場所や種類に応じたアンチセンス核酸が必要になる。これまでに、西オーストラリア大学のＳｔｅｖｅ Ｗｉｌｔｏｎらによって７９個全てのエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作製されており（非特許文献３）、オランダのＡｎｎｅｍｉｅｋｅ Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓらによって３９種類のエクソンに対してエクソンスキッピングを誘導するアンチセンス核酸が作られている（非特許文献４）。
全ＤＭＤ患者の２０％程度は、第５５、４５、５０及び４４番目のエクソン（以下、それぞれ「エクソン５５」、「エクソン４５」、「エクソン５０」及び「エクソン４４」という）をスキッピングすることで治療可能と考えられている。近年では、ジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４をエクソンスキッピングのターゲットとした研究について、複数の研究機関から報告がなされている（特許文献１〜８）。しかしながら、エクソン５５、４５、５０及び４４を患者細胞にて高効率にスキッピングさせる技術は、いまだに確立されていない。
国際公開公報ＷＯ２００６／００００５７ 国際公開公報ＷＯ２００４／０４８５７０ 米国特許公開公報ＵＳ２０１０／０１６８２１２ 国際公開公報ＷＯ２０１０／０４８５８６ 国際公開公報ＷＯ２００４／０８３４４６ 国際公開公報ＷＯ２０１０／０５０８０１ 国際公開公報ＷＯ２００９／１３９６３０ Ｍｏｎａｃｏ Ａ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９８８；２：ｐ．９０−９５ Ｍａｔｓｕｏ Ｍ．，Ｂｒａｉｎ Ｄｅｖ １９９６；１８：ｐ．１６７−１７２ Ｗｉｌｔｏｎ Ｓ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００７：１５：ｐ．１２８８−９６ Ａｎｎｅｍｉｅｋｅ Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １２：Ｓ７１−Ｓ７７ Ｌｉｎｄａ Ｊ．Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．２，ｐ．１０２−１０
上記のような状況において、ジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４のスキッピングを強く誘導するアンチセンスオリゴマー及びそのオリゴマーを含む筋ジストロフィー治療薬が望まれている。
本発明者らは、ジストロフィン遺伝子の構造を詳細に研究した結果、ジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡ前駆体（以下、「ｐｒｅ−ｍＲＮＡ」という）のうちエクソン５５の５’末端から第１〜２１番目、第１１〜３１番目及び第１４〜３４番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン５５のスキッピングを誘導できることを見出した。
また、本発明者らは、ジストロフィン遺伝子ｐｒｅ−ｍＲＮＡのうちエクソン４５の５’末端から第１〜２５番目及び第６〜３０番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン４５のスキッピングを誘導できることを見出した。
さらに、本発明者らは、ジストロフィン遺伝子ｐｒｅ−ｍＲＮＡのうちエクソン５０の５’末端から第１０７〜１２７番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン５０のスキッピングを誘導できることを見出した。
またさらに、本発明者らは、ジストロフィン遺伝子ｐｒｅ−ｍＲＮＡのうちエクソン４４の５’末端から第１１〜３２番目及び第２６〜４７番目周辺のヌクレオチドからなる配列をアンチセンスオリゴマーでターゲッティングすることにより、高効率にエクソン４４のスキッピングを誘導できることを見出した。
本発明者らは、この知見に基づき、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、以下のとおりである。
［１］ ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第３〜１９番目、第３〜２０番目、第３〜２１番目、第３〜２２番目、第３〜２３番目、第９〜２９番目、第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第１０〜２９番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１１〜２９番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１２〜２９番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１３〜２９番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１２〜３４番目、第１２〜３５番目、第１２〜３６番目、第１３〜３４番目、第１３〜３５番目、第１３〜３６番目、第１４〜３２番目、第１４〜３３番目、第１４〜３４番目、第１４〜３５番目、第１４〜３６番目、第１５〜３２番目、第１５〜３３番目、第１５〜３４番目、第１５〜３５番目、第１５〜３６番目、第１６〜３２番目、第１６〜３３番目、第１６〜３４番目、第１６〜３５番目又は第１６〜３６番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
［２］ ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第−３〜１９番目、第−３〜２０番目、第−３〜２１番目、第−３〜２２番目、第−３〜２３番目、第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第−２〜２４番目、第−２〜２５番目、第−２〜２６番目、第−２〜２７番目、第−１〜２４番目、第−１〜２５番目、第−１〜２６番目、第−１〜２７番目、第１〜２４番目、第１〜２５番目、第１〜２６番目、第１〜２７番目、第２〜２４番目、第２〜２５番目、第２〜２６番目、第２〜２７番目、第３〜２３番目、第３〜２４番目、第３〜２５番目、第３〜２６番目、第３〜２７番目、第４〜２８番目、第４〜２９番目、第４〜３０番目、第４〜３１番目、第４〜３２番目、第５〜２８番目、第５〜２９番目、第５〜３０番目、第５〜３１番目、第５〜３２番目、第６〜２８番目、第６〜２９番目、第６〜３０番目、第６〜３１番目、第６〜３２番目、第７〜２８番目、第７〜２９番目、第７〜３０番目、第７〜３１番目、第７〜３２番目、第８〜２８番目、第８〜２９番目、第８〜３０番目、第８〜３１番目又は第８〜３２番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
［３］ ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンの５’末端から第１０５〜１２５番目、第１０５〜１２６番目、第１０５〜１２７番目、第１０５〜１２８番目、第１０５〜１２９番目、第１０６〜１２５番目、第１０６〜１２６番目、第１０６〜１２７番目、第１０６〜１２８番目、第１０６〜１２９番目、第１０７〜１２５番目、第１０７〜１２６番目、第１０７〜１２７番目、第１０７〜１２８番目、第１０７〜１２９番目、第１０８〜１２５番目、第１０８〜１２６番目、第１０８〜１２７番目、第１０８〜１２８番目、第１０８〜１２９番目、第１０９〜１２５番目、第１０９〜１２６番目、第１０９〜１２７番目、第１０９〜１２８番目又は第１０９〜１２９番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
［４］ ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第９〜３４番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１０〜３４番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１１〜３４番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１２〜３４番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１３〜３４番目、第２４〜４５番目、第２４〜４６番目、第２４〜４７番目、第２４〜４８番目、第２４〜４９番目、第２５〜４５番目、第２５〜４６番目、第２５〜４７番目、第２５〜４８番目、第２５〜４９番目、第２６〜４５番目、第２６〜４６番目、第２６〜４７番目、第２６〜４８番目、第２６〜４９番目、第２７〜４５番目、第２７〜４６番目、第２７〜４７番目、第２７〜４８番目、第２７〜４９番目、第２８〜４５番目、第２８〜４６番目、第２８〜４７番目、第２８〜４８番目、第２８〜４９番目、第２９〜４５番目、第２９〜４６番目、第２９〜４７番目、第２９〜４８番目又は第２９〜４９番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
［５］ ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第１〜２１番目、第１１〜３１番目又は第１４〜３４番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、前記［１］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［６］ 配列番号５の第１７０〜１９０番目、第１６０〜１８０番目又は第１５７〜１７７番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列からなる、前記［１］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［７］ ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第−２〜１９番、第１〜２１番目、第１〜２５番目又は第６〜３０番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、前記［２］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［８］ 配列番号６の第１５８〜１７８番目、第１５６〜１７６番目、第１５２〜１７６番目又は第１４７〜１７１番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列からなる、前記［２］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［９］ ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンの５’末端から第１０６〜１２６番又は第１０７〜１２７番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、前記［３］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１０］ 配列番号７の第４〜２４番目又は第３〜２３番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列からなる、前記［３］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１１］ ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第１１〜３２番、第２５〜４５番、第２６〜４６番、第２６〜４７番又は第２７〜４７番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、前記［４］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１２］ 配列番号８の第１１７〜１３８番目、第１０４〜１２４番目、第１０３〜１２３番目、第１０２〜１２３番目又は第１０２〜１２２番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列からなる、前記［４］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１３］ オリゴヌクレオチドである、前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［１４］ 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分及び／又はリン酸結合部分が修飾されている、前記［１３］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１５］ 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドの糖部分が、２’位の−ＯＨ基が、ＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、前記［１４］に記載のアンチセンスオリゴマー。
（上記Ｒは、アルキル又はアリールを示し、上記Ｒ’は、アルキレンを示す。）
［１６］ 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか１つのものである、前記［１４］又は［１５］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１７］ モルホリノオリゴマーである、前記［１］〜［１２］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー。
［１８］ ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、前記［１７］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［１９］ ５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基である、前記［１７］又は［１８］に記載のアンチセンスオリゴマー。
［２０］ 前記［１］〜［１９］のいずれか１つに記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
本発明のアンチセンスオリゴマーにより、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４のスキッピングを高効率に誘導することが可能である。また、本発明の医薬組成物を投与することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの症状を、効果的に軽減することができる。また、本発明のアンチセンスオリゴマーは、患者のエクソン配列のみをターゲットとするため、イントロンをターゲットとするアンチセンスオリゴマーの場合と比べて、ターゲット配列が個体間（個人間）で保存されており、このため、個体差（個人差）に関係なく良好なスキッピング効率が得られることを特徴とする。さらに、本発明のアンチセンスオリゴマーは、その鎖長が２０ｂｐ前後と短いため、従来のＤＭＤ治療を目的としたアンチセンスオリゴマー（２５ｂｐ前後）と比べて、ターゲット配列中にＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）等の個体（個人）間の変異を含む可能性が低く、この点からも個体差（個人差）に関係なく良好なスキッピング効率が得られることを特徴とする。また、一般的に短鎖のアンチセンスオリゴマーは比較的免疫を誘導しにくいため、本発明のアンチセンスオリゴマーはサイトカイン等の誘導による副作用が生じにくいという特徴を有する。
さらに、本発明のアンチセンスオリゴマーは、鎖長が短いため、製造コストが比較的安価である。
ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒトＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５０１７細胞）にヒトＭｙｏＤ遺伝子を導入して筋肉細胞に分化誘導した細胞におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）における２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡオリゴマーによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 ヒト横紋筋肉腫細胞株（ＲＤ細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング効率を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング効率を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン４４のスキッピング結果（ウェスタンブロッティング）を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング結果（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング効率を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング結果（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図である。 エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０５１１２細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。 エクソン８−９重複ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（１１−０６２７細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング結果（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図である。 エクソン８−９重複ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（１１−０６２７細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング効率を示す図である。 エクソン５１−５５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０４３６４細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング結果（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図である。 エクソン５１−５５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞（ＧＭ０４３６４細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５０のスキッピング効率を示す図である。 エクソン５４単独欠損ＤＭＤ患者由来細胞（０４−０３５細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング結果（ＲＴ−ＰＣＲ）を示す図である。 エクソン５４単独欠損ＤＭＤ患者由来細胞（０４−０３５細胞）におけるＰＭＯによるヒトジストロフィン遺伝子エクソン５５のスキッピング効率を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる２０１１年１２月２８日に出願された日本国特許出願（特願２０１１−２８８０４０号）及び２０１２年０２月２９日に出願された日本国特許出願（特願２０１２−０４３０９２号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
また、特に記載のない場合、アミノ酸配列は左端をアミノ末端及び右端をカルボキシル末端とし、塩基配列は左端を５’末端及び右端を３’末端として表わすものとする。
１．アンチセンスオリゴマー
本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第３〜１９番目、第３〜２０番目、第３〜２１番目、第３〜２２番目、第３〜２３番目、第９〜２９番目、第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第１０〜２９番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１１〜２９番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１２〜２９番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１３〜２９番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１２〜３４番目、第１２〜３５番目、第１２〜３６番目、第１３〜３４番目、第１３〜３５番目、第１３〜３６番目、第１４〜３２番目、第１４〜３３番目、第１４〜３４番目、第１４〜３５番目、第１４〜３６番目、第１５〜３２番目、第１５〜３３番目、第１５〜３４番目、第１５〜３５番目、第１５〜３６番目、第１６〜３２番目、第１６〜３３番目、第１６〜３４番目、第１６〜３５番目又は第１６〜３６番目のヌクレオチドからなる配列（以下、「エクソン５５標的配列」ともいう。）のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のエクソン５５スキッピングオリゴマー」という）を提供する。
また、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第−３〜１９番目、第−３〜２０番目、第−３〜２１番目、第−３〜２２番目、第−３〜２３番目、第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第−２〜２４番目、第−２〜２５番目、第−２〜２６番目、第−２〜２７番目、第−１〜２４番目、第−１〜２５番目、第−１〜２６番目、第−１〜２７番目、第１〜２４番目、第１〜２５番目、第１〜２６番目、第１〜２７番目、第２〜２４番目、第２〜２５番目、第２〜２６番目、第２〜２７番目、第３〜２３番目、第３〜２４番目、第３〜２５番目、第３〜２６番目、第３〜２７番目、第４〜２８番目、第４〜２９番目、第４〜３０番目、第４〜３１番目、第４〜３２番目、第５〜２８番目、第５〜２９番目、第５〜３０番目、第５〜３１番目、第５〜３２番目、第６〜２８番目、第６〜２９番目、第６〜３０番目、第６〜３１番目、第６〜３２番目、第７〜２８番目、第７〜２９番目、第７〜３０番目、第７〜３１番目、第７〜３２番目、第８〜２８番目、第８〜２９番目、第８〜３０番目、第８〜３１番目又は第８〜３２番目のヌクレオチドからなる配列（以下、「エクソン４５標的配列」ともいう。）のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のエクソン４５スキッピングオリゴマー」という）を提供する。
さらに、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンの５’末端から第１０５〜１２５番目、第１０５〜１２６番目、第１０５〜１２７番目、第１０５〜１２８番目、第１０５〜１２９番目、第１０６〜１２５番目、第１０６〜１２６番目、第１０６〜１２７番目、第１０６〜１２８番目、第１０６〜１２９番目、第１０７〜１２５番目、第１０７〜１２６番目、第１０７〜１２７番目、第１０７〜１２８番目、第１０７〜１２９番目、第１０８〜１２５番目、第１０８〜１２６番目、第１０８〜１２７番目、第１０８〜１２８番目、第１０８〜１２９番目、第１０９〜１２５番目、第１０９〜１２６番目、第１０９〜１２７番目、第１０９〜１２８番目又は第１０９〜１２９番目のヌクレオチドからなる配列（以下、「エクソン５０標的配列」ともいう。）のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のエクソン５０スキッピングオリゴマー」という）を提供する。
またさらに、本発明は、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第９〜３４番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１０〜３４番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１１〜３４番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１２〜３４番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１３〜３４番目、第２４〜４５番目、第２４〜４６番目、第２４〜４７番目、第２４〜４８番目、第２４〜４９番目、第２５〜４５番目、第２５〜４６番目、第２５〜４７番目、第２５〜４８番目、第２５〜４９番目、第２６〜４５番目、第２６〜４６番目、第２６〜４７番目、第２６〜４８番目、第２６〜４９番目、第２７〜４５番目、第２７〜４６番目、第２７〜４７番目、第２７〜４８番目、第２７〜４９番目、第２８〜４５番目、第２８〜４６番目、第２８〜４７番目、第２８〜４８番目、第２８〜４９番目、第２９〜４５番目、第２９〜４６番目、第２９〜４７番目、第２９〜４８番目又は第２９〜４９番目のヌクレオチドからなる配列（以下、「エクソン４４標的配列」ともいう。）のいずれか１つに相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー（以下、「本発明のエクソン４４スキッピングオリゴマー」という）を提供する。
以下、本発明のエクソン５５、４５、５０及び４４スキッピングオリゴマーを、「本発明のオリゴマー」と総称する場合がある。
［ヒトジストロフィン遺伝子の第５５、４５、５０及び４４番目のエクソン］
本発明において、「遺伝子」には、ゲノム遺伝子以外に、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡも含まれる。好ましくは、遺伝子は、ｍＲＮＡ前駆体、即ち、ｐｒｅ−ｍＲＮＡである。
ヒトゲノムにおいて、ヒトジストロフィン遺伝子は遺伝子座Ｘｐ２１．２に存在する。ヒトジストロフィン遺伝子は、３．０Ｍｂｐのサイズを有しており、既知のヒト遺伝子としては最大の遺伝子である。但し、ヒトジストロフィン遺伝子のコード領域はわずか１４ｋｂに過ぎず、該コード領域は７９個のエクソンとしてジストロフィン遺伝子内に分散している（Ｒｏｂｅｒｔｓ，ＲＧ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６：５３６−５３８（１９９３））。ヒトジストロフィン遺伝子の転写物であるｐｒｅ−ｍＲＮＡは、スプライシングを受けて１４ｋｂの成熟ｍＲＮＡを生成する。ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子の塩基配列は公知である（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４００６）。
ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５５の５’末端から第−２〜１９０番目のヌクレオチドからなる塩基配列を配列番号１に示す。また、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン４５の５’末端から第−３〜１７６番目のヌクレオチドからなる塩基配列を配列番号２に示す。また、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン５０の５’末端から第１〜１０９番目及びイントロン５０の５’末端から第１〜２０番目のヌクレオチドからなる塩基配列を配列番号３に示す。
また、ヒトの野生型ジストロフィン遺伝子のエクソン４４の５’末端から第１〜１４８番目のヌクレオチドからなる塩基配列を配列番号４に示す。
本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０又は４４のスキッピングにより、ＤＭＤ型ジストロフィン遺伝子でコードされるタンパク質を、ＢＭＤ型ジストロフィンタンパク質に改変することを目的として作製されたものである。従って、本発明のオリゴマーのエクソンスキッピングの対象となるジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４には、野生型だけではなく、その各変異型も含まれる。
変異型のヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４は、具体的には、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のポリヌクレオチドである。
（ａ）配列番号１（若しくは配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列）、２（若しくは配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列）、３（若しくは配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列）又は４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１（若しくは配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列）、２（若しくは配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列）、３（若しくは配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列）又は４の塩基配列に対して、９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
本明細書中、「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、例えば、配列番号１（若しくは配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列）、２（若しくは配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列）、３（若しくは配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列）又は４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドの全部又は一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法又はサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えば、”Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｖｏｌ．３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１”及び”Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９８７−１９９７”などに記載されている方法を利用することができる。
本明細書中、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列とワトソン・クリック対を形成する塩基配列に限定されるものではなく、揺らぎ塩基対（Ｗｏｂｂｌｅｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成する塩基配列も含む。ここで、ワトソン・クリック対とは、アデニン−チミン、アデニン−ウラシル及びグアニン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味し、揺らぎ塩基対とは、グアニン−ウラシル、イノシン−ウラシル、イノシン−アデニン及びイノシン−シトシン間に水素結合が形成される塩基対を意味する。また、「相補的な塩基配列」とは、対象となる塩基配列と１００％の相補性を有していなくてもよく、例えば、対象となる塩基配列に対して、１〜３個、１〜２個又は１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
本明細書中、「ストリンジェントな条件」とは、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃又は５×ＳＳＣ、１％ ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃又は０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、６５℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い同一性を有するポリヌクレオチドが効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度等の複数の要素が考えられ、当業者であればこれらの要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばＡｌｋｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを５５℃の条件下で０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む１次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出することができる。あるいは、配列番号１（若しくは配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列）、２（若しくは配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列）、３（若しくは配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列）又は４の塩基配列と相補的な塩基配列の全部又は一部に基づいてプローブを作製する際に、市販の試薬（例えば、ＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）等）を用いて該プローブをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルした場合には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いてハイブリダイゼーションを検出することができる。
上記のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドとしては、相同性検索ソフトウェアであるＢＬＡＳＴにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号１（若しくは配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列）、２（若しくは配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列）、３（若しくは配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列）又は４のポリヌクレオチドからなる配列と９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．１％以上、９９．２％以上、９９．３％以上、９９．４％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。
なお、塩基配列の同一性は、カーリン及びアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７２２６４−２２６８，１９９０；Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３，１９９３）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ，ｅｔ ａｌ：Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３，１９９０）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
エクソン５５の５’末端から第−２〜１９０番目のヌクレオチドの配列に相補的な配列を配列番号５に示す。ここで、エクソン５５の５’末端から第−２〜−１番目のヌクレオチドからなる配列（配列番号１の第１〜２番目のヌクレオチドからなる配列）は、エクソン５４とエクソン５５との間に存在するイントロン５４の３’末端の最下流の２つのヌクレオチドからなる配列を示す。即ち、エクソン５５の塩基配列は、配列番号１の第３〜１９２番目のヌクレオチドからなる配列であり、エクソン５５の塩基配列に相補的な配列は、配列番号５の第１〜１９０番目のヌクレオチドからなる配列である。
ここで、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第３〜１９番目、第３〜２０番目、第３〜２１番目、第３〜２２番目、第３〜２３番目、第９〜２９番目、第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第１０〜２９番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１１〜２９番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１２〜２９番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１３〜２９番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１２〜３４番目、第１２〜３５番目、第１２〜３６番目、第１３〜３４番目、第１３〜３５番目、第１３〜３６番目、第１４〜３２番目、第１４〜３３番目、第１４〜３４番目、第１４〜３５番目、第１４〜３６番目、第１５〜３２番目、第１５〜３３番目、第１５〜３４番目、第１５〜３５番目、第１５〜３６番目、第１６〜３２番目、第１６〜３３番目、第１６〜３４番目、第１６〜３５番目又は第１６〜３６番目のヌクレオチドからなる塩基配列に相補的な配列とは、それぞれ、配列番号５の第１７２〜１９２番目、第１７１〜１９２番目、第１７０〜１９２番目、第１６９〜１９２番目、第１６８〜１９２番目、第１７２〜１９１番目、第１７１〜１９１番目、第１７０〜１９１番目、第１６９〜１９１番目、第１６８〜１９１番目、第１７２〜１９０番目、第１７１〜１９０番目、第１７０〜１９０番目、第１６９〜１９０番目、第１６８〜１９０番目、第１７２〜１８９番目、第１７１〜１８９番目、第１７０〜１８９番目、第１６９〜１８９番目、第１６８〜１８９番目、第１７２〜１８８番目、第１７１〜１８８番目、第１７０〜１８８番目、第１６９〜１８８番目、第１６８〜１８８番目、第１６２〜１８２番目、第１６１〜１８２番目、第１６０〜１８２番目、第１５９〜１８２番目、第１５８〜１８２番目、第１６２〜１８１番目、第１６１〜１８１番目、第１６０〜１８１番目、第１５９〜１８１番目、第１５８〜１８１番目、第１６２〜１８０番目、第１６１〜１８０番目、第１６０〜１８０番目、第１５９〜１８０番目、第１５８〜１８０番目、第１６２〜１７９番目、第１６１〜１７９番目、第１６０〜１７９番目、第１５９〜１７９番目、第１５８〜１７９番目、第１６２〜１７８番目、第１６１〜１７８番目、第１６０〜１７８番目、第１５９〜１７８番目、第１５８〜１７８番目、第１５７〜１７９番目、第１５６〜１７９番目、第１５５〜１７９番目、第１５７〜１７８番目、第１５６〜１７８番目、第１５５〜１７８番目、第１５９〜１７７番目、第１５８〜１７７番目、第１５７〜１７７番目、第１５６〜１７７番目、第１５５〜１７７番目、第１５９〜１７６番目、第１５８〜１７６番目、第１５７〜１７６番目、第１５６〜１７６番目、第１５５〜１７６番目、第１５９〜１７５番目、第１５８〜１７５番目、第１５７〜１７５番目、第１５６〜１７５番目又は第１５５〜１７５番目のヌクレオチドからなる配列と同一である。
エクソン４５の５’末端から第−３〜１７６番目のヌクレオチドの配列に相補的な配列を配列番号６に示す。ここで、エクソン４５の５’末端から第−３〜−１番目のヌクレオチドからなる配列（配列番号２の第１〜３番目のヌクレオチドからなる配列）は、エクソン４４とエクソン４５との間に存在するイントロン４４の３’末端の最下流の３つのヌクレオチドからなる配列を示す。即ち、エクソン４５の塩基配列は、配列番号２の第４〜１７９番目のヌクレオチドからなる配列であり、エクソン４５の塩基配列に相補的な配列は、配列番号６の第１〜１７６番目のヌクレオチドからなる配列である。
ここで、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第−３〜１９番目、第−３〜２０番目、第−３〜２１番目、第−３〜２２番目、第−３〜２３番目、第−２〜１９番目、第−２〜２０番目、第−２〜２１番目、第−２〜２２番目、第−２〜２３番目、第−１〜１９番目、第−１〜２０番目、第−１〜２１番目、第−１〜２２番目、第−１〜２３番目、第１〜１９番目、第１〜２０番目、第１〜２１番目、第１〜２２番目、第１〜２３番目、第２〜１９番目、第２〜２０番目、第２〜２１番目、第２〜２２番目、第２〜２３番目、第−２〜２４番目、第−２〜２５番目、第−２〜２６番目、第−２〜２７番目、第−１〜２４番目、第−１〜２５番目、第−１〜２６番目、第−１〜２７番目、第１〜２４番目、第１〜２５番目、第１〜２６番目、第１〜２７番目、第２〜２４番目、第２〜２５番目、第２〜２６番目、第２〜２７番目、第３〜２３番目、第３〜２４番目、第３〜２５番目、第３〜２６番目、第３〜２７番目、第４〜２８番目、第４〜２９番目、第４〜３０番目、第４〜３１番目、第４〜３２番目、第５〜２８番目、第５〜２９番目、第５〜３０番目、第５〜３１番目、第５〜３２番目、第６〜２８番目、第６〜２９番目、第６〜３０番目、第６〜３１番目、第６〜３２番目、第７〜２８番目、第７〜２９番目、第７〜３０番目、第７〜３１番目、第７〜３２番目、第８〜２８番目、第８〜２９番目、第８〜３０番目、第８〜３１番目又は第８〜３２番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列とは、それぞれ、配列番号６の第１５８〜１７９番目、第１５７〜１７９番目、第１５６〜１７９番目、第１５５〜１７９番目、第１５４〜１７９番目、第１５８〜１７８番目、第１５７〜１７８番目、第１５６〜１７８番目、第１５５〜１７８番目、第１５４〜１７８番目、第１５８〜１７７番目、第１５７〜１７７番目、第１５６〜１７７番目、第１５５〜１７７番目、第１５４〜１７７番目、第１５８〜１７６番目、第１５７〜１７６番目、第１５６〜１７６番目、第１５５〜１７６番目、第１５４〜１７６番目、第１５８〜１７５番目、第１５７〜１７５番目、第１５６〜１７５番目、第１５５〜１７５番目、第１５４〜１７５番目、第１５３〜１７８番目、第１５２〜１７８番目、第１５１〜１７８番目、第１５０〜１７８番目、第１５３〜１７７番目、第１５２〜１７７番目、第１５１〜１７７番目、第１５０〜１７７番目、第１５３〜１７６番目、第１５２〜１７６番目、第１５１〜１７６番目、第１５０〜１７６番目、第１５３〜１７５番目、第１５２〜１７５番目、第１５１〜１７５番目、第１５０〜１７５番目、第１５４〜１７４番目、第１５３〜１７４番目、第１５２〜１７４番目、第１５１〜１７４番目、第１５０〜１７４番目、第１４９〜１７３番目、第１４８〜１７３番目、第１４７〜１７３番目、第１４６〜１７３番目、第１４７〜１７３番目、第１４９〜１７２番目、第１４８〜１７２番目、第１４７〜１７２番目、第１４６〜１７２番目、第１４５〜１７２番目、第１４９〜１７１番目、第１４８〜１７１番目、第１４７〜１７１番目、第１４６〜１７１番目、第１４５〜１７１番目、第１４９〜１７０番目、第１４８〜１７０番目、第１４７〜１７０番目、第１４６〜１７０番目、第１４５〜１７０番目、第１４９〜１６９番目、第１４８〜１６９番目、第１４７〜１６９番目、第１４６〜１６９番目又は第１４５〜１６９番目のヌクレオチドからなる配列と同一である。
エクソン５０の５’末端から第１〜１０９番目のヌクレオチド及びイントロン５０の５’末端から第１〜２０番目のヌクレオチドからなる塩基配列に相補的な配列を配列番号７に示す。ここで、イントロン５０の５’末端から第１〜２０番目のヌクレオチドからなる配列（配列番号３の第１１０〜１２９番目のヌクレオチドからなる配列）は、エクソン５０とエクソン５１との間に存在するイントロン５０の５’末端の最上流の２０個のヌクレオチドからなる配列を示す。即ち、エクソン５０の塩基配列は、配列番号３の第１〜１０９番目のヌクレオチドからなる配列であり、エクソン５０の塩基配列に相補的な配列は、配列番号７の第２１〜１２９番目のヌクレオチドからなる配列である。
ここで、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンの５’末端から第１０５〜１２５番目、第１０５〜１２６番目、第１０５〜１２７番目、第１０５〜１２８番目、第１０５〜１２９番目、第１０６〜１２５番目、第１０６〜１２６番目、第１０６〜１２７番目、第１０６〜１２８番目、第１０６〜１２９番目、第１０７〜１２５番目、第１０７〜１２６番目、第１０７〜１２７番目、第１０７〜１２８番目、第１０７〜１２９番目、第１０８〜１２５番目、第１０８〜１２６番目、第１０８〜１２７番目、第１０８〜１２８番目、第１０８〜１２９番目、第１０９〜１２５番目、第１０９〜１２６番目、第１０９〜１２７番目、第１０９〜１２８番目又は第１０９〜１２９番目のヌクレオチドからなる塩基配列に相補的な配列とは、それぞれ、配列番号７の第５〜２５番目、第４〜２５番目、第３〜２５番目、第２〜２５番目、第１〜２５番目、第５〜２４番目、第４〜２４番目、第３〜２４番目、第２〜２４番目、第１〜２４番目、第５〜２３番目、第４〜２３番目、第３〜２３番目、第２〜２３番目、第１〜２３番目、第５〜２２番目、第４〜２２番目、第３〜２２番目、第２〜２２番目、第１〜２２番目、第５〜２１番目、第４〜２１番目、第３〜２１番目、第２〜２１番目又は第１〜２１番目のヌクレオチドからなる配列と同一である。
エクソン４４の５’末端から第１〜１４８番目のヌクレオチドの配列に相補的な配列を配列番号８に示す。
ここで、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第９〜３０番目、第９〜３１番目、第９〜３２番目、第９〜３３番目、第９〜３４番目、第１０〜３０番目、第１０〜３１番目、第１０〜３２番目、第１０〜３３番目、第１０〜３４番目、第１１〜３０番目、第１１〜３１番目、第１１〜３２番目、第１１〜３３番目、第１１〜３４番目、第１２〜３０番目、第１２〜３１番目、第１２〜３２番目、第１２〜３３番目、第１２〜３４番目、第１３〜３０番目、第１３〜３１番目、第１３〜３２番目、第１３〜３３番目、第１３〜３４番目、第２４〜４５番目、第２４〜４６番目、第２４〜４７番目、第２４〜４８番目、第２４〜４９番目、第２５〜４５番目、第２５〜４６番目、第２５〜４７番目、第２５〜４８番目、第２５〜４９番目、第２６〜４５番目、第２６〜４６番目、第２６〜４７番目、第２６〜４８番目、第２６〜４９番目、第２７〜４５番目、第２７〜４６番目、第２７〜４７番目、第２７〜４８番目、第２７〜４９番目、第２８〜４５番目、第２８〜４６番目、第２８〜４７番目、第２８〜４８番目、第２８〜４９番目、第２９〜４５番目、第２９〜４６番目、第２９〜４７番目、第２９〜４８番目又は第２９〜４９番目のヌクレオチドからなる塩基配列に相補的な配列とは、それぞれ、配列番号８の第１１９〜１４０番目、第１１８〜１４０番目、第１１７〜１４０番目、第１１６〜１４０番目、第１１５〜１４０番目、第１１９〜１３９番目、第１１８〜１３９番目、第１１７〜１３９番目、第１１６〜１３９番目、第１１５〜１３９番目、第１１９〜１３８番目、第１１８〜１３８番目、第１１７〜１３８番目、第１１６〜１３８番目、第１１５〜１３８番目、第１１９〜１３７番目、第１１８〜１３７番目、第１１７〜１３７番目、第１１６〜１３７番目、第１１５〜１３７番目、第１１９〜１３６番目、第１１８〜１３６番目、第１１７〜１３６番目、第１１６〜１３６番目、第１１５〜１３６番目、第１０４〜１２５番目、第１０３〜１２５番目、第１０２〜１２５番目、第１０１〜１２５番目、第１００〜１２５番目、第１０４〜１２４番目、第１０３〜１２４番目、第１０２〜１２４番目、第１０１〜１２４番目、第１００〜１２４番目、第１０４〜１２３番目、第１０３〜１２３番目、第１０２〜１２３番目、第１０１〜１２３番目、第１００〜１２３番目、第１０４〜１２２番目、第１０３〜１２２番目、第１０２〜１２２番目、第１０１〜１２２番目、第１００〜１２２番目、第１０４〜１２１番目、第１０３〜１２１番目、第１０２〜１２１番目、第１０１〜１２１番目、第１００〜１２１番目、第１０４〜１２０番目、第１０３〜１２０番目、第１０２〜１２０番目、第１０１〜１２０番目又は第１００〜１２０番目のヌクレオチドからなる配列と同一である。
エクソン５５、４５、５０及び４４の塩基配列と、配列番号５〜８の対応は、以下の表のようにまとめることができる。
本発明のエクソン５５スキッピングオリゴマーは、好ましくは、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第１〜２１番目、第１１〜３１番目又は第１４〜３４番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号５の第１７０〜１９０番目、第１６０〜１８０番目又は第１５７〜１７７番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列）からなる。
本発明のエクソン４５スキッピングオリゴマーは、好ましくは、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第−２〜１９番、第１〜２１番目、第１〜２５番目又は第６〜３０番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号６の第１５８〜１７８番目、第１５６〜１７６番目、第１５２〜１７６番目又は第１４７〜１７１番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列）からなる。
本発明のエクソン５０スキッピングオリゴマーは、好ましくは、ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンの５’末端から第１０６〜１２６番又は第１０７〜１２７番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号７の第４〜２４番目又は第３〜２３番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列）からなる。
本発明のエクソン４４スキッピングオリゴマーは、好ましくは、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第１１〜３２番、第２５〜４５番、第２６〜４６番、第２６〜４７番又は第２７〜４７番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つに相補的な塩基配列（例えば、配列番号８の第１１７〜１３８番目、第１０４〜１２４番目、第１０３〜１２３番目、第１０２〜１２３番目又は第１０２〜１２２番目のヌクレオチドからなる配列のいずれか１つの塩基配列）からなる。
「ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のエクソン５５に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン５４が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン５３の３’末端に相当する塩基配列の３’側にエクソン５６の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
同様に「ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のエクソン４５に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン４４が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン４３の３’末端に相当する塩基配列の３’側にエクソン４６の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
また、「ヒトジストロフィン遺伝子の第５０番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のエクソン５０に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン５１が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン４９の３’末端に相当する塩基配列の３’側にエクソン５２の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
また同様に、「ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンのスキッピングを可能にする」とは、ヒトジストロフィン遺伝子の転写物（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のエクソン４４に相当する部位に本発明のオリゴマーが結合することにより、該転写物がスプライシングを受けた際に、例えばエクソン４５が欠失したＤＭＤ患者の場合、エクソン４３の３’末端に相当する塩基配列の３’側にエクソン４６の５’末端に相当する塩基配列が連結し、コドンのフレームシフトが起こっていない成熟ｍＲＮＡが形成されることを意味する。
従って、本発明のオリゴマーは、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４のスキッピングを可能にする限り、各ターゲット配列（エクソン５５、４５、５０及び４４）に対して１００％相補的な塩基配列を有していなくてもよい。例えば、本発明のオリゴマーには、ターゲット配列に対して、１〜３個、１〜２個又は１個の非相補的塩基が含まれていてもよい。
ここで、前記「結合」は、本発明のオリゴマーとヒトジストロフィン遺伝子の転写物とを混合した場合に、生理的条件下で両者がハイブリダイズして二本鎖を形成することを意味する。上記「生理的条件下」とは、生体内と類似のｐＨ、塩組成、温度に調節された条件を意味する。例えば、２５〜４０℃、好ましくは３７℃、ｐＨ５〜８、好ましくは、ｐＨ７．４であって、塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭの条件が挙げられる。
ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン５５、４５、５０及び４４のスキッピングが生じたか否かは、ジストロフィン発現細胞（例えば、ヒト横紋筋肉腫細胞）に本発明のオリゴマーを導入し、前記ジストロフィン発現細胞のｔｏｔａｌ ＲＮＡから、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡのエクソン５５、４５、５０及び４４の周辺領域をＲＴ−ＰＣＲ増幅し、該ＰＣＲ増幅産物に対してｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ又はシークエンス解析を行うことにより確認することができる。
スキッピング効率は、ヒトジストロフィン遺伝子のｍＲＮＡを被検細胞から回収し、該ｍＲＮＡのうち、エクソン５５、４５、５０及び４４がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン５５、４５、５０及び４４がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定し、これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って計算することができる。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ １００
本発明のオリゴマーとしては、例えば、１８〜２８塩基の長さを有する、オリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、又はペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ：ＰＮＡ）オリゴマーを挙げることができる。１５〜３０塩基又は２０〜２５塩基の長さが好ましく、モルホリノオリゴマーが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド（以下、「本発明のオリゴヌクレオチド」という）は、ヌクレオチドを構成単位とする本発明のオリゴマーであり、かかるヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドのいずれであってもよい。
修飾ヌクレオチドとは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを構成する核酸塩基、糖部分、及びリン酸結合部分の全部又は一部が修飾されているものをいう。
核酸塩基としては、例えば、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、チミン、ウラシル又はそれらの修飾塩基を挙げることができる。かかる修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、３−メチルウラシル，ジヒドロウラシル、５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）、５−アルキルウラシル（例えば、５−エチルウラシル）、５−ハロウラシル（５−ブロモウラシル）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（６−メチルウラシル）、２−チオウラシル、４−チオウラシル、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、１−メチルアデニン、１−メチルヒポキサンチン、２，２−ジメチルグアニン、３−メチルシトシン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メチルカルボニルメチルウラシル、５−メチルオキシウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、２−チオシトシン、プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
糖部分の修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾及び糖のその他の部分の修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の−ＯＨ基をＯＲ、Ｒ、Ｒ’ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒはアルキル又はアリールを表す。Ｒ’はアルキレンを表す。
糖のその他の部分の修飾としては、例えば、リボース又はデオキシリボースの４’位のＯをＳに置換したもの、糖の２’位と４’位を架橋したもの、例えば、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）又はＥＮＡ（２’−０，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
リン酸結合部分の修飾としては、例えば、ホスホジエステル結合をホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、ボラノフォスフェート結合（Ｅｎｙａ ｅｔ ａｌ：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，１８，９１５４−９１６０）に置換する修飾を挙げることができる（例えば、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び第２００６／０３８６０８号を参照）。
アルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。
シクロアルキルとしては、炭素数５〜１２のシクロアルキルが好ましい。具体的には、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロデシル、シクロドデシルが挙げられる。
ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。
アルコキシとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。
アリールとしては、炭素数６〜１０のアリールが好ましい。具体的には、例えば、フェニル、α−ナフチル、β−ナフチルを挙げることができる。とりわけフェニルが好ましい。当該アリールは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、アルキル、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。
アルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数１〜６のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。
アシルとしては、直鎖状若しくは分枝鎖状のアルカノイル、又はアロイルを挙げることができる。アルカノイルとしては、例えば、ホルミル、アセチル、２−メチルアセチル、２，２−ジメチルアセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、２，２−ジメチルプロピオニル、ヘキサノイル等が挙げられる。アロイルとしては、例えば、ベンゾイル、トルオイル、ナフトイルを挙げることができる。かかるアロイルは置換可能な位置において置換されていてもよく、アルキルで置換されていてもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、リボースの２’位の−ＯＨ基がメトキシで置換され、リン酸結合部分がホスホロチオエート結合である、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
（式中、Ｂａｓｅは、核酸塩基を表す。）
本発明のオリゴヌクレオチドは、各種自動合成装置（例えば、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を用いて容易に合成することが可能であり、あるいは、第三者機関（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社又はＴａｋａｒａ社）等に委託して作製することもできる。
本発明のモルホリノオリゴマーは、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義であり；
Ｗは、以下のいずれかの式で表わされる基を表す。
（式中、Ｘは、−ＣＨ２Ｒ１、−Ｏ−ＣＨ２Ｒ１、−Ｓ−ＣＨ２Ｒ１、−ＮＲ２Ｒ３又はＦを表し；
Ｒ１は、Ｈ、アルキルを表し；
Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、又は、アリールを表し；
Ｙ１は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２又はＮＲ１を表し；
Ｙ２は、Ｏ、Ｓ又はＮＲ１を表し；
Ｚは、Ｏ又はＳを表す。））
モルホリノオリゴマーは、好ましくは、以下の式で表わされる基を構成単位とするオリゴマー（ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（以下、「ＰＭＯ」という））である。
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義である。）
モルホリノオリゴマーは、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号、又は国際公開公報第２００９／０６４４７１号に従って製造することができる。特に、ＰＭＯは、国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の方法に従って製造するか、又は以下に示す方法に従って製造することができる。
［ＰＭＯの製法］
ＰＭＯの１つの態様として、例えば、次の一般式（Ｉ）で表される化合物（以下、ＰＭＯ（Ｉ）という。）を挙げることができる。
［式中、各Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
ｎは、１〜９９の範囲内にある任意の整数であり、好ましくは、１８〜２８の範囲内にある任意の整数である。］
ＰＭＯ（Ｉ）は、公知の方法に従い製造することができるが、例えば、下記工程の操作を実施することにより製造することができる。
下記工程に使用されている化合物及び試薬は、ＰＭＯの製造に一般的に使用されているものであれば特に限定されない。
また、下記のすべての工程は、液相法又は固相法（マニュアル又は市販の固相自動合成機を用いる）で実施することができる。固相法でＰＭＯを製造する場合、操作手順の簡便化及び合成の正確性の点から自動合成機を用いる方法が望ましい。
（１）工程Ａ：
次の一般式（ＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩ）という。）に酸を作用させることによって、次の一般式（ＩＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩＩ）という。）を製造する工程。
［式中、ｎ、Ｒ２、Ｒ３は、前記と同義であり；
各ＢＰは，独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；
Ｔは、トリチル基、モノメトキシトリチル基、又はジメトキシトリチル基を表し；
Ｌは、水素、アシル、又は次の一般式（ＩＶ）で表される基（以下、基（ＩＶ）という。）を表す。］
ＢＰに係る「核酸塩基」としては、Ｂａｓｅと同じ「核酸塩基」を挙げることができる。但し、ＢＰに係る核酸塩基のアミノ基又は水酸基は保護されていてもよい。
かかるアミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル、（ジメチルアミノ）メチレンを挙げることができる。水酸基の保護基としては、例えば、２−シアノエチル、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、置換可能な任意の位置で１〜５個の電子吸引性基で置換されていてもよいフェニル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１−ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシ）ベンジル、４−［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４−（フェニルカルボキシ）ベンジルを挙げることができる（例えば、国際公開公報第２００９／０６４４７１号公報参照）。
「固相担体」としては、核酸の固相反応に使用しうる担体であれば特に制限されないが、例えば、（ｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬（例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、テトラゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、無水酢酸、ルチジン、トリフルオロ酢酸）にほとんど溶解せず、（ｉｉ）モルホリノ核酸誘導体の合成に使用しうる試薬に対して化学的に安定であり、（ｉｉｉ）化学修飾ができ、（ｉｖ）望ましいモルホリノ核酸誘導体の装填ができ、（ｖ）処理中にかかる高圧に耐える十分な強度をもち、（ｖｉ）一定の粒径範囲と分布であるものが望ましい。具体的には、膨潤性ポリスチレン（例えば、アミノメチルポリスチレン樹脂 １％ジベンジルベンゼン架橋（２００〜４００メッシュ）（２．４〜３．０ｍｍｏｌ／ｇ）（東京化成社製）、Ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｒｅｓｉｎ・ＨＣｌ［ジベンジルベンゼン１％，１００〜２００メッシュ］（ペプチド研究所社製））、非膨潤性ポリスチレン（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製））、ＰＥＧ鎖結合型ポリスチレン（例えば、ＮＨ２−ＰＥＧ ｒｅｓｉｎ（渡辺化学社製）、ＴｅｎｔａＧｅｌ ｒｅｓｉｎ）、定孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ；ＣＰＧ）（例えば、ＣＰＧ社製）、オキサリル化−定孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１９，１５２７（１９９１）を参照）、ＴｅｎｔａＧｅｌ支持体−アミノポリエチレングリコール誘導体化支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３４，３３７３（１９９３）を参照）、Ｐｏｒｏｓ−ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーを挙げることができる。
「リンカー」としては、通常核酸やモルホリノ核酸誘導体を連結するために使用される公知のものを用いることができるが、例えば、３−アミノプロピル、スクシニル、２，２’−ジエタノールスルホニル、ロングチェーンアルキルアミノ（ＬＣＡＡ）を挙げることができる。
本工程は、化合物（ＩＩ）に酸を作用させることにより実施することができる。
本工程に使用しうる「酸」としては、例えば、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸又はトリクロロ酢酸を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩ）１モルに対して０．１モル当量〜１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量〜１００モル当量の範囲内である。
また、前記酸と一緒に、有機アミンを使用することができる。有機アミンとしては、特に限定されるものではないが、例えば、トリエチルアミンを挙げることができる。有機アミンの使用量は、例えば、酸１モルに対して、０．０１モル当量〜１０モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは、０．１モル当量〜２モル当量の範囲内である。
本工程において酸と有機アミンとの塩又は混合物を使用する場合には、例えば、トリフルオロ酢酸とトリエチルアミンの塩又は混合物を挙げることができ、より具体的には、トリフルオロ酢酸２当量に対してトリエチルアミン１当量を混合したものを挙げることができる。
本工程に使用しうる酸は、０．１％〜３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
上記反応における反応温度は、例えば、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。
反応時間は、使用する酸の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当である。好ましくは、１分〜５時間の範囲内である。
また、本工程が終了した後、必要に応じて、系中に存在する酸を中和するために塩基を添加することができる。「塩基」としては、特に限定されないが、例えば、ジイソプロピルアミンが挙げられる。塩基は、０．１％（ｖ／ｖ）〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。
本工程に用いる溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。反応温度は、例えば、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分〜５時間の範囲内である。
なお、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ）で表される化合物（以下、化合物（ＩＩａ）という。）は、以下の方法に従って製造することができる。
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
工程１：
次の一般式（Ｖ）で表される化合物にアシル化剤を作用させることによって、次の一般式（ＶＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩ）という。）を製造する工程。
［式中、ＢＰ、Ｔ、リンカーは、前記と同義であり；
Ｒ４は、水酸基、ハロゲン、又は、アミノを表す。］
本工程は、化合物（Ｖ）を出発原料として、公知のリンカーの導入反応により実施することができる。
特に、次の一般式（ＶＩａ）で表される化合物は、化合物（Ｖ）と無水コハク酸とを用いてエステル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義である。］
工程２：
化合物（ＶＩ）に縮合剤等を作用させることによって、固相担体と反応させ、化合物（ＩＩａ）を製造する工程。
［式中、ＢＰ、Ｒ４、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義である。］
本工程は、化合物（ＶＩ）と固相担体とを用いて縮合反応として知られた方法により製造することができる。
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９であって、Ｌが基（ＩＶ）である、次の一般式（ＩＩａ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩａ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔ、リンカー、固相担体は、前記と同義であり；
ｎ’は、１〜９８を表す。］
また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ）で表される化合物は、例えば、国際公開公報第１９９１／００９０３３号に記載の方法により製造することができる。
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義である。］
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９であって、Ｌが水素である、次の一般式（ＩＩｂ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
また、化合物（ＩＩ）において、ｎ＝１であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ）で表される化合物は、化合物（ＩＩｂ）に対してアシル化反応として知られた方法を実施することにより製造することができる。
［式中、ＢＰ、Ｔは、前記と同義であり；
Ｒ５は、アシルを表す。］
化合物（ＩＩ）において、ｎ＝２〜９９であって、Ｌがアシルである、次の一般式（ＩＩｃ２）で表される化合物は、化合物（ＩＩｃ）を出発原料とし、本明細書に記載のＰＭＯの製法にかかる工程Ａ及び工程Ｂを所望の回数繰り返し実施することにより製造することができる。
［式中、ＢＰ、ｎ’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｔは、前記と同義である。］
（２）工程Ｂ：
化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることによって、次の一般式（ＶＩＩ）で表される化合物（以下、化合物（ＶＩＩ）という。）を製造する工程。
［式中、各ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
本工程は、化合物（ＩＩＩ）に塩基存在下にモルホリノモノマー化合物を作用させることにより実施することができる。
モルホリノモノマー化合物としては、例えば、次の一般式（ＶＩＩＩ）で表される化合物を挙げることができる。
［式中、ＢＰ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは前記と同義である。］
本工程に使用しうる「塩基」としては、例えば、ジイソプロピルアミン、トリエチルアミン、又は、Ｎ−エチルモルホリンを挙げることができる。塩基の使用量としては、例えば、化合物（ＩＩＩ）１モルに対して、１モル当量〜１０００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量〜１００モル当量の範囲内である。
本工程に使用しうるモルホリノモノマー化合物および塩基は、０．１％〜３０％の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン、ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル、テロラヒドロフラン、又はこれらの混合物を挙げることができる。
反応温度は、例えば、０℃〜１００℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃〜５０℃の範囲内である。
反応時間は、使用する塩基の種類、反応温度によって異なるが、通常１分〜４８時間の範囲内が適当であり、好ましくは、３０分〜２４時間の範囲内である。
さらに本工程の終了後、必要に応じて、アシル化剤を添加することができる。「アシル化剤」としては、例えば、無水酢酸、酢酸クロライド、フェノキシ酢酸無水物を挙げることができる。アシル化剤は、例えば、０．１％〜３０％の範囲内の濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することもできる。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、トリフルオロエタノールなど）、水又はこれらの混合物を挙げることができる。
また、必要であれば、アシル化剤と一緒に、例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−エチルモルホリン等の塩基を使用することができる。アシル化剤の使用量としては、０．１モル当量〜１００００モル当量の範囲内が好ましく、１モル当量〜１０００モル当量の範囲内がより好ましい。塩基の使用量としては、例えば、アシル化剤１モルに対して、０．１モル当量〜１００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１モル当量〜１０モル当量の範囲内である。
本反応の反応温度は、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。反応時間は、例えば、使用するアシル化剤の種類、反応温度によって異なるが、通常０．１分〜２４時間の範囲内が適当であり、好ましくは、１分から５時間の範囲内である。
（３）工程Ｃ：
工程Ｂにおいて製造される化合物（ＶＩＩ）において、脱保護剤を用いて保護基を脱離し、一般式（ＩＸ）で表される化合物を製造する工程。
［式中、Ｂａｓｅ、ＢＰ、Ｌ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
本工程は、化合物（ＶＩＩ）に脱保護剤を作用させることにより実施することができる。
「脱保護剤」としては、例えば、濃アンモニア水、メチルアミンを挙げることができる。本工程に使用しうる「脱保護剤」は、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリドン、Ｎ−メチルピペリドン又はこれらの混合溶媒で希釈して使用することもできる。なかでも、エタノールが好ましい。脱保護剤の使用量としては、例えば、化合物（ＶＩＩ）１モルに対して、例えば、１モル当量〜１０００００モル当量の範囲内が適当であり、好ましくは１０モル当量〜１０００モル当量の範囲内である。
反応温度は、例えば、１５℃〜７５℃の範囲内が適当であり、好ましくは４０℃〜７０℃の範囲内であり、より好ましくは５０℃〜６０℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＶＩＩ）の種類、反応温度等によって異なるが、１０分〜３０時間の範囲内が適当であり、好ましくは３０分〜２４時間の範囲内であり、より好ましくは５時間〜２０時間の範囲内である。
（４）工程Ｄ：
工程Ｃにおいて製造される化合物（ＩＸ）に酸を作用させることによって、ＰＭＯ（Ｉ）を製造する工程。
［式中、Ｂａｓｅ、ｎ、Ｒ２、Ｒ３、Ｔは、前記と同義である。］
本工程は、化合物（ＩＸ）に酸を加えることによって実施することができる。
本工程において使用しうる「酸」としては、例えば、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、酢酸、リン酸及び塩酸等を挙げることができる。酸の使用量としては、例えば、溶液のｐＨが０．１〜４．０の範囲内になるように使用するのが適当であり、より好ましくは１．０〜３．０の範囲内になるように使用する。溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、アセトニトリル、水、又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。
反応温度は、１０℃〜５０℃の範囲内が好ましく、より好ましくは、２０℃〜４０℃の範囲内であり、さらに好ましくは、２５℃〜３５℃の範囲内である。脱保護反応時間は、化合物（ＩＸ）の種類、反応温度等によって異なるが、０．１分〜５時間の範囲内が適当であり、好ましくは１分〜１時間の範囲内であり、より好ましくは１分〜３０分の範囲内である。
ＰＭＯ（Ｉ）は、本工程で得られた反応混合物から通常の分離精製手段、例えば、抽出、濃縮、中和、濾過、遠心分離、再結晶、Ｃ８からＣ１８の逆相カラムクロマトグラフィー、陽イオン交換カラムクロマトグラフィー、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析、限界ろ過などの手段を単独若しくは組み合わせて用いることにより得ることができ、所望のＰＭＯ（Ｉ）を単離精製することができる（例えば、国際公開公報ＷＯ１９９１／０９０３３を参照）。
逆相クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、溶出溶媒として、例えば２０ｍＭのトリエチルアミン／酢酸緩衝液とアセトニトリルの混合溶液を使用することができる。
また、イオン交換クロマトグラフィーを用いてＰＭＯ（Ｉ）を精製する場合には、例えば、１Ｍの食塩水と１０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の混合溶液を使用することができる。
ペプチド核酸は、下記一般式で表される基を構成単位とする本発明のオリゴマーである。
（式中、Ｂａｓｅは、前記と同義である。）
ペプチド核酸は、例えば、以下の文献に従って製造することができる。
１）Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１４９７（１９９１）
２）Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊａｃｓ．，１１４，１８９５（１９９２）
３）Ｋ．Ｌ．Ｄｕｅｈｏｌｍ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｃ．Ｂｅｈｒｅｎｓ，Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｖｕｌｐｉｕｓ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５９，５７６７（１９９４）
４）Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｂ．Ｇｉｌｄｅａ，Ｋ．Ｈ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ，Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ，Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｊ．Ｃｏｕｌｌ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．，１，１７５（１９９５）
５）Ｔ．Ｋｏｃｈ，Ｈ．Ｆ．Ｈａｎｓｅｎ，Ｐ．Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｌａｒｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．Ｂａｔｚ，Ｋ．Ｏｔｔｅｓｏｎ，Ｈ．Ｏｒｕｍ，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．，４９，８０（１９９７）
また、本発明のオリゴマーは、５’末端が、下記化学式（１）〜（３）のいずれかの基であってもよい。好ましくは（３）−ＯＨである。
以下、上記（１）、（２）及び（３）で示される基を、それぞれ「基（１）」、「基（２）」及び「基（３）」と呼ぶ。
２．医薬組成物
本発明のオリゴマーは、従来技術に係るアンチセンスオリゴマーと比較して、高効率にエクソン５５、４５、５０及び４４のスキッピングを可能にする。従って、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物をＤＭＤ患者に投与することにより、高効率に筋ジストロフィーの症状を緩和することができると予測される。例えば、本発明のオリゴマーを含む医薬組成物を用いる場合、従来技術に係るオリゴマーと比べて少量の投与量でも同程度の治療効果を得られるため、副作用を軽減することができ、かつ経済的である。
そこで、別の実施態様として、本発明のオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物（以下、「本発明の組成物」という）を提供する。
本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの医薬的に許容可能な塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機アミン塩；弗化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、沃化水素酸塩のようなハロゲン化水素酸塩；硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩；酢酸塩、りんご酸塩、フマール酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩などが挙げられる。これらの塩は、公知の方法で製造することができる。あるいは、本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーは、その水和物の形態にあってもよい。
本発明の組成物の投与形態は、医薬的に許容可能な投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができるが、筋組織への送達容易性の観点から、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与、組織内投与、経皮投与等が好ましい。また、本発明の組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤等を挙げることができる。
本発明のオリゴマーを筋ジストロフィー患者に投与する場合、本発明の組成物は、該オリゴマーの筋組織への送達を促進する担体を含むことが好ましい。このような担体は、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、その例として、カチオン性リポソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウイルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リポソームとしては、例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリポソーム（以下、「リポソームＡ」という）、オリゴフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクチン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、リポフェクトアミン（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＴｒａｎｓＩＴ ＴＫＯ（登録商標）（Ｍｉｒｕｓ社製）、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を挙げることができる。それらの中で、リポソームＡが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、ＪｅｔＳＩ（登録商標）（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）、Ｊｅｔ−ＰＥＩ（登録商標）（ポリエチレンイミン、Ｑｂｉｏｇｅｎｅ社製）を挙げることができる。ウイルスエンベロープを利用した担体としては、例えば、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ（登録商標）（ＨＶＪ−Ｅ リポソーム、石原産業社製）を挙げることができる。あるいは、特許２９２４１７９号に記載の医薬デバイス、特許再公表公報第２００６／１２９５９４号及び特許再公表公報第２００８／０９６６９０号に記載のカチオン性担体を用いることもできる。
本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ〜１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内がより好ましい。また、本発明の組成物に含まれる本発明のオリゴマーと担体との重量比（担体／本発明のオリゴマー）は、該オリゴマーの性質及び該担体の種類等によって異なるが、０．１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。
本発明の組成物には、本発明のオリゴマーと上述した担体以外に、任意に医薬的に許容可能な添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬的に許容可能な塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明の組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。
本発明の組成物は、担体の分散液に本発明のオリゴマーを加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、添加剤は、本発明のオリゴマーの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明のオリゴマーを添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬的に許容可能なものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、かかる場合のｐＨ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。
本発明の組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明の組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明の組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明の組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。
本発明の組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
本発明の組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明のオリゴマーの種類、剤形、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明のオリゴマーの量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜１ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
本発明の組成物の別の態様として、本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るベクターと上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明のオリゴヌクレオチドを発現し得るものであってもよい。当該組成物には、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物と同様に、医薬的に許容可能な添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なるが、０．１ｎＭ〜１００μＭの範囲内が適当であり、１ｎＭ〜１０μＭの範囲内が好ましく、１０ｎＭ〜１μＭの範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体／発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、０．１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、１０〜２０の範囲内がより好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明のオリゴマーを含有する本発明の組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明の組成物の場合と同様である。
以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。
［参考例１］
アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸
工程１：４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
アルゴン雰囲気下、Ｎ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミド３．４４ｇと４−ジメチルアミノピリジン（４−ＤＭＡＰ）１．１ｇをジクロロメタン５０ｍＬに懸濁し、無水コハク酸０．９０ｇを加え、室温で３時間撹拌した。反応液にメタノール１０ｍＬを加え、減圧濃縮した。残渣に酢酸エチルと０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液を用いて抽出操作を行った。得られた有機層を０．５Ｍのリン酸二水素カリウム水溶液、水、飽和食塩水の順で洗浄した。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮し、４．０ｇの目的物を得た。
工程２：アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸の製造
４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸４．０ｇをピリジン（脱水）２００ｍＬに溶解し、４−ＤＭＡＰ０．７３ｇ、１−エチル−３‐（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩１１．５ｇを加えた。次いで、アミノポリスチレン樹脂 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔ ２００ ａｍｉｎｏ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｊａｐａｎ社製、１７−５２１４−９７）２５．０ｇ、トリエチルアミン８．５ｍＬを加え、室温で４日間振とうした。反応後、樹脂をろ取した。得られた樹脂をピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥した。得られた樹脂にテトラヒドロフラン（脱水）２００ｍＬ、無水酢酸１５ｍＬ、２，６−ルチジン１５ｍＬを加え、室温で２時間振とうした。樹脂をろ取し、ピリジン、メタノール、ジクロロメタンの順で洗浄し、減圧乾燥し、２６．７ｇの目的物を得た。
当該目的物のローディング量は、公知の方法を用いて、樹脂１ｇ当たりのトリチルのモル量を４０９ｎｍにおけるＵＶ吸光度を測定することにより決定した。樹脂のローディング量は、１２９．２μｍｏｌ／ｇであった。
ＵＶ測定条件
機器：Ｕ−２９１０（日立製作所）
溶媒：メタンスルホン酸
波長：２６５ｎｍ
ε値：４５０００
［参考例２］
アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸
工程１：Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアノシンの製造
グアノシン１００ｇを８０℃で減圧下、２４時間乾燥した。ピリジン（脱水）５００ｍＬ、ジクロロメタン（脱水）５００ｍＬを加え、アルゴン雰囲気下、０℃にてクロロトリメチルシラン４０１ｍＬを滴下し室温で３時間撹拌した。再度氷冷し、フェノキシアセチルクロライド６６．３ｇを滴下し、氷冷下、更に３時間撹拌した。反応液にメタノール５００ｍｌを加え、室温で終夜撹拌後、減圧下溶媒を留去した。残渣にメタノール５００ｍＬを加え、減圧下濃縮することを３回行った。残渣に水４Ｌを加え氷冷下１時間撹拌し、析出物をろ取した。このものを、水、次いで、冷メタノールで洗浄し、乾燥して目的化合物を１５０．２ｇ得た（収率：１０２％）（参考：Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００４），Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．１５，２５５５−２５５７）。
工程２：Ｎ９−｛［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−モルホリン−２−イル］−６−オキソ−６，９−ジヒドロ−１Ｈ−プリン−２−イル｝−２−フェノキシアセタミド ｐ−トルエンスルホン酸塩
工程１で得られた化合物３０ｇをメタノール４８０ｍＬに懸濁し、氷冷下、２Ｎ塩酸１３０ｍＬを加えた。次いで、四ほう酸アンモニウム４水和物５６．８ｇ、過ヨウ素酸ナトリウム１６．２ｇをこの順で加え、室温で３時間撹拌した。反応液を氷冷し、不溶物をろ過して除き、これをメタノール１００ｍＬで洗浄した。ろ液と洗浄液を合わせて氷冷し、２−ピコリンボラン１１．５２ｇを加えて２０分間撹拌後、ｐ−トルエンスルホン酸・１水和物５４．６ｇをゆっくり加えて、４℃で終夜撹拌した。析出物をろ取し、冷メタノール５００ｍＬで洗浄後、乾燥して目的化合物を１７．７ｇ得た（収率：４３．３％）。
１Ｈ ＮＭＲ（δ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：９．９−９．２（２Ｈ，ｂｒ）、８．３５（１Ｈ，ｓ）、７．５５（２Ｈ，ｍ）、７．３５（２Ｈ，ｍ）、７．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ）、７．００（３Ｈ，ｍ）、５．９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．６４，２．４２Ｈｚ）、４．８５（２Ｈ，ｓ）、４．００（１Ｈ，ｍ）、３．９０−３．６０（２Ｈ，ｍ）、３．５０−３．２０（５Ｈ，ｍ）、２．９０（１Ｈ，ｍ）、２．２５（３Ｈ，ｓ）
工程３：Ｎ９−｛（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル｝−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニンの製造
工程２で得られた化合物２．０ｇをジクロロメタン（３０ｍｌ）に懸濁し、氷冷下、トリエチルアミン（１３．９ｇ）、トリチルクロリド（１８．３ｇ）を加えて、室温で１時間撹拌した。反応液を飽和重曹水、次いで水で洗浄後、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮した。残渣に０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）／メタノール（１：４（ｖ／ｖ），４０ｍｌ）を加えて撹拌し、次いで水（４０ｍｌ）を加えて氷冷下１時間撹拌した（懸濁状態）。これをろ取し、冷メタノールで洗浄、乾燥して目的化合物を１．８４ｇ得た（収率：８２．０％）。
工程４：Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）グアニンの製造
工程３で得られた化合物（３８．３ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、イミダゾール（４．６４ｇ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（９．４７ｇ）をこの順で加え、室温で１時間撹拌した。反応液を０．２Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）、次いで、飽和食塩水で洗浄後、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として４４．１ｇを得た。
工程５：Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−トリイソプロピルベンゼンスルホニルグアニンの製造
工程４で得られた化合物（４４．１ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、４−ジメチルアミノピリジン（０．６４ｇ）、トリエチルアミン（２９．２ｍＬ）、トリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（１９．０ｇ）を加えて室温で１時間撹拌した。反応液を１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液で洗浄後、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として６０．５ｇを得た。
工程６： Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−｛（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）メチル｝−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニンの製造
工程５で得られた化合物（６０．５ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、氷冷下、Ｎ−メチルピロリジン（５４．５ｍＬ）を加えて１時間撹拌した。反応液にエチレンシアノヒドリン（３７．２ｇ）、次いで１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１１．９６ｇ）を加え、氷冷下、更に２時間撹拌した。反応液を１Ｍリン酸二水素ナトリウム水溶液、次いで水で洗浄後、有機層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、有機層を減圧濃縮して目的化合物を粗生成物として７２．４ｇを得た。
工程７：Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニンの製造
工程６で得られた化合物（７２．４ｇ）をジクロロメタン（３００ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（２１．１ｇ）を加えて室温で１７時間撹拌した。反応液を冷飽和重曹水に注ぎ、中和後ジクロロメタン層を回収して硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＰＳＱ１００Ｂ（冨士シリシア化学株式会社製、以下同じ。））により精製し、目的化合物を１４．３ｇ得た（工程４からの収率：３９．２％）。
工程８：アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸の製造
参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、Ｎ９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−ヒドロキシメチル−４−トリチルモルホリン−２−イル］−Ｎ２−（フェノキシアセチル）−Ｏ６−（２−シアノエチル）グアニンを使用した。
［参考例３］
アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸
参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−５−メチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオンを使用した。
［参考例４］
アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸
参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミドの代わりに、本工程では、Ｎ−｛９−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］プリン−６−イル｝ベンズアミドを使用した。
［参考例５］
アミノポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸
参考例１と同様の方法で標記化合物を製造した。但し、参考例１の工程１で用いたＮ−｛１−［（２Ｒ，６Ｓ）−６−（ヒドロキシメチル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−４−イル｝ベンズアミトの代わりに、本工程では、２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチル ４−トリチルピペラジン−１−カルボン酸（国際公開公報第２００９／０６４４７１号に記載の化合物）を使用した。
エクソン４５について
以下の実施例１〜８及び比較例１の記載に従い、表５のＰＭＯ Ｎｏ．１〜６及び８〜１０に示す各種ＰＭＯを合成した。合成したＰＭＯを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。なお、ＰＭＯ Ｎｏ．７はジーンツールズ社から購入した。
［実施例１］
ＰＭＯ Ｎｏ．１
アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（４−ベンズアミド−２−オキソピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例１）０．２ｇ（２６μｍｏｌ）をフィルター付きカラムに充填し、核酸合成機（ＡＫＴＡ Ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ １０ ｐｌｕｓ）を使用して、下記合成サイクルを開始した。標記化合物の塩基配列になるよう、各カップリングサイクルにおいて所望のモルホリノモノマー化合物を添加した。
なお、デブロック溶液としては、３％（ｗ／ｖ）トリフルオロ酢酸を含有するジクロロメタン溶液を用いた。中和・洗浄溶液としては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを１０％（ｖ／ｖ）になるように、かつテトラヒドロフランを５％（ｖ／ｖ）になるように、３５％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル含有するジクロロメタン溶液で溶解したものを用いた。カップリング溶液Ａとしては、モルホリノモノマー化合物を０．１０Ｍになるように、テトラヒドロフランで溶解したものを用いた。カップリング溶液Ｂとしては、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを２０％（ｖ／ｖ）になるように、かつテトラヒドロフランを１０％（ｖ／ｖ）になるように、アセトニトリルで溶解したものを用いた。キャッピング溶液としては、アセトニトリルに対して２０％（ｖ／ｖ）の無水酢酸と３０％（ｖ／ｖ）の２，６−ルチジンを溶解したものを使用した。
上記で合成したＰＭＯが担持されたアミノポリスチレン樹脂を反応容器から回収し、２時間以上室温で減圧乾燥した。乾燥したアミノポリスチレン樹脂に担持されたＰＭＯを反応容器に入れ、２８％アンモニア水−エタノール（１／４）５ｍＬを加え、５５℃で１５時間撹拌した。アミノポリスチレン樹脂をろ別し、水−エタノール（１／４）１ｍＬで洗浄した。得られたろ液を減圧濃縮した。得られた残渣を２０ｍＭの酢酸−トリエチルアミン緩衝液（ＴＥＡＡ緩衝液）とアセトニトリルの混合溶媒（４／１）１０ｍＬに溶解し、メンブレンフィルターでろ過した。得られたろ液を逆相ＨＰＬＣにて精製した。使用した条件は、以下の通りである。
各フラクションを分析して、目的物を回収し、減圧濃縮した。濃縮残渣に２Ｍのリン酸水溶液０．５ｍＬを加え、１５分間攪拌した。さらに、２Ｍの水酸化ナトリウム水溶液２ｍＬを加えてアルカリ性とし、メンブレンフィルター（０．４５μｍ）でろ過した。
得られた目的物を含有する水溶液を陰イオン交換樹脂カラムで精製した。使用した条件は下記の通りである。
各フラクションを分析（ＨＰＬＣ）し、目的物を水溶液として得た。得られた水溶液に０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し中和した。次いで、下記条件で逆相ＨＰＬＣにて脱塩した。
目的物を回収し、減圧濃縮した。得られた残渣を水に溶かし、凍結乾燥して、白色綿状固体として１．５ｍｇの目的化合物を得た。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８７７．８
測定値：６８７７．４
［実施例２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８６２．８
測定値：６８６２．５
［実施例３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８６２．８
測定値：６８６２．３
［実施例４］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０２．８
測定値：６９０２．３
［実施例５］
ＰＭＯ．Ｎｏ．５
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０２．８
測定値：６９０２．４
［実施例６］
ＰＭＯ．Ｎｏ．８
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５４７．５
測定値：６５４７．２
［実施例７］
ＰＭＯ．Ｎｏ．９
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５４７．５
測定値：６５４７．２
［実施例８］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１０
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例５）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：７２１４．１
測定値：７２１３．７
［比較例１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．６
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：８１９３．９
測定値：８１９５．３
［試験例１］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
配列番号１９〜３５に記載の２’−Ｏ−メトキシ−ホスホロチオエート体（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）１×１０５個を１２穴プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ）１ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養した。上記のエクソン４５スキッピング用の各種アンチセンスオリゴマー（日本バイオサービス社製）（０．３または１μＭ）とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社製）の複合体を作成し、０．９ｍＬで培地交換したＲＤ細胞に、１００μｌ添加し、終濃度３０または１００ｎＭとした。
添加後、一晩培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ）で２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）２５０μｌを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した。ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ４００ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＰＴＣ−１００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
５０℃、３０分間：逆転写反応
９５℃、１５分間：熱変性
［９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、１分間］ｘ ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
７２℃、１０分間：
ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
上記ＰＣＲの反応産物１μｌをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）を用いて解析した。
エクソン４５がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン４５がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ １００
実験結果
結果を図１、２に示す。本実験により、ヒトジストロフィン遺伝子の第４５番目のエクソンの５’末端から第１〜２５番目又は第６〜３０番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合、第４５番目のエクソンの５’末端から第７〜３１番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合と比較して高い効率でエクソン４５をスキッピングさせることが判明した。
［試験例２］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＲＤ細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株）３．５×１０５個に対して、ＰＭＯ Ｎｏ．１〜５及び８〜１０の本発明のオリゴマー並びにＰＭＯ Ｎｏ．６及び７のアンチセンスオリゴマーを１、３、１０μＭずつＡｍａｘａ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｋｉｔ Ｌを用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）により導入した。プログラムはＴ−０３０を用いた。
導入後、細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（インビトロジェン社製）を含むＥａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地（シグマ社製、以下同じ。）２ｍＬ中、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。細胞をＰＢＳ（ニッスイ社製、以下同じ。）で２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）５００μｌを細胞に添加し、数分間室温に放置して細胞を溶解させ、該溶解物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した。ＩＳＯＧＥＮに添付のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡの濃度はＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ−１０００（エル・エム・エス社製）を用いて測定した。
抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ４００ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。キットに添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはＰＴＣ−１００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
５０℃、３０分間：逆転写反応
９５℃、１５分間：熱変性
［９４℃、３０秒間；６０℃、３０秒間；７２℃、１分間］ｘ ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
７２℃、１０分間：
ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
上記ＰＣＲの反応産物１μｌをＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社製）を用いて解析した。
エクソン４５がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン４５がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ １００
実験結果
結果を図３、図４、図１４及び図１５に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．１、３の本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞において、ＰＭＯ Ｎｏ．６のアンチセンスオリゴマーと同等の効率でエクソン４５をスキッピングさせることが判明した（図３、図４）。また、ＰＭＯ Ｎｏ．１、２、３の本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞において、ＰＭＯ Ｎｏ．７のアンチセンスオリゴマーと比較して高い効率でエクソン４５をスキッピングさせることが判明した（図１４）。さらに、ＰＭＯ Ｎｏ．３は末端構造の異なるＰＭＯ Ｎｏ．１０と比較して高い効率でエクソン４５をスキッピングさせることが判明した（図１５）。
［試験例３］
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＺｓＧｒｅｅｎ１共発現レトロウイルスベクターによりＧＭ０５０１７細胞（ヒトＤＭＤ患者由来線維芽細胞、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）にヒトＭｙｏＤ遺伝子（配列番号３８）を導入した。
４から５日間インキュベートした後に、ＦＡＣＳによりＺｓＧｒｅｅｎ陽性のＭｙｏＤ転換線維芽細胞を回収し、５×１０４個／ｃｍ２になるように１２穴プレートに播種した。増殖培地は１０％ＦＣＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）（シグマ アルドリッチ社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ・Ｆ−１２）（インビトロジェン社）を１ｍＬ使用した。
２４時間後に分化培地（２％ウマ血清（インビトロジェン社）、１％Ｐ／Ｓ及びＩＴＳ Ｌｉｑｕｉｄ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に交換した。２、３日ごとに培地交換を行い１２から１４日間インキュベートし、筋管細胞に分化させた。
その後、分化培地を６μＭのＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）含有分化培地に交換し、終濃度１０μＭになるようにモルホリノオリゴマーを添加した。４８時間インキュベート後に、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）により、細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５０ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
５０℃、３０分間：逆転写反応
９５℃、１５分間：熱変性
［９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間］ｘ ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
７２℃、７分間：ポリメラーゼの熱失活
プライマーはｈＤＭＤ４４Ｆ及びｈＤＭＤ４６Ｒを使用した。
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｎｅＦｌａｓｈ（Ｓｙｎｇｅｎｅ社）によりゲル写真を撮影した。Ｉｍａｇｅ Ｊ（アメリカ国立衛生研究所製）により、エクソン４５がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン４５がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ １００
実験結果
結果を図５に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．３の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０５０１７細胞において、高い効率でエクソン４５をスキッピングさせることが判明した。
エクソン５５について
以下の実施例９〜１９の記載に従い、表１１ ＰＭＯ Ｎｏ．１１〜１４及び１６〜２２に示す各種ＰＭＯを合成した。合成したＰＭＯを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。なお、ＰＭＯ Ｎｏ．１５はジーンツールズ社から購入した。
［実施例９］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１１
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８０７．８
測定値：６８０７．０
［実施例１０］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１２
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８２２．８
測定値：６８２２．５
［実施例１１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１３
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８３７．８
測定値：６８３７．３
［実施例１２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１４
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８６１．８
測定値：６８６１．４
［実施例１３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１６
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８１２．８
測定値：６８１２．７
［実施例１４］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１７
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８５２．８
測定値：６８５２．７
［実施例１５］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１８
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０１．８
測定値：６９０１．５
［実施例１６］
ＰＭＯ．Ｎｏ．１９
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０１．８
測定値：６９０１．７
［実施例１７］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２０
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５２２．５
測定値：６５２２．０
［実施例１８］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２１
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５４６．５
測定値：６５４６．０
［実施例１９］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２２
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例５）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：７２１３．１
測定値：７２１２．５
［試験例４］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
配列番号４９〜６８に記載の２’−Ｏ−メトキシ−ホスホロチオエート体（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
ＲＴ−ＰＣＲを以下のプライマーで実施した他は、エクソン４５（試験例１）と同様の条件・手順で行った。
実験結果
結果を図６、７に示す。本実験により、ヒトジストロフィン遺伝子の第５５番目のエクソンの５’末端から第１〜２１番目又は第１１〜３１番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合、第５５番目のエクソンの５’末端から第１０４〜１２３番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合と比較して高い効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した。
［試験例５］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＲＴ−ＰＣＲを以下のプライマーで実施した他は、エクソン４５（試験例２）と同様の条件・手順で行った。
実験結果
結果を図８、１６及び１７に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．１２、１３、１４（Ｈ５５＿８−２８（ＯＨ）、Ｈ５５＿１１−３１（ＯＨ）及びＨ５５＿１４−３４（ＯＨ））の本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞において、高い効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した（図８）。また、ＰＭＯ Ｎｏ．１４、１６、１７、１８、１９（Ｈ５５＿１４−３４（ＯＨ）、Ｈ５５＿１２−３２（ＯＨ）、Ｈ５５＿１３−３３（ＯＨ）、Ｈ５５＿１５−３５（ＯＨ）及びＨ５５＿１６−３６（ＯＨ））の本発明オリゴマーは、ＲＤ細胞において、ＰＭＯ Ｎｏ．１５（Ｈ５５＿１３９−１５６（ＧＴ））のアンチセンスオリゴマーと比較して著しく高い効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した（図１６）。ＰＭＯ Ｎｏ．１４の本発明オリゴマーと鎖長を１塩基短くしたＰＭＯ Ｎｏ．２１（Ｈ５５＿１５−３４（ＯＨ））は同等の効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した（図１７）。さらに、ＰＭＯ Ｎｏ．１４の本発明オリゴマーは、末端構造の異なるＰＭＯ Ｎｏ．２２（Ｈ５５＿１４−３４（ＴＥＧ））と比較して、同等の効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した（図１７）。
エクソン４４について
以下の実施例２０〜２９の記載に従い、下記表のＰＭＯ Ｎｏ．２３〜２９及び３１〜３３に示す各種ＰＭＯを合成した。合成したＰＭＯを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。なお、ＰＭＯ Ｎｏ．３０はジーンツールズ社から購入した。
［実施例２０］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２３
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９１８．９
測定値：６９１８．３
［実施例２１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２４
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０３．９
測定値：６９０４．２
［実施例２２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２５
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９１２．９
測定値：６９１２．４
［実施例２３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２６
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９０３．９
測定値：６９０４．２
［実施例２４］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２７
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９２７．９
測定値：６９２７．４
［実施例２５］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２８
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９４２．９
測定値：６９４２．３
［実施例２６］
ＰＭＯ．Ｎｏ．２９
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９１７．９
測定値：６９１８．３
［実施例２７］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３１
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５７３．６
測定値：６５７２．４
［実施例２８］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３２
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６５８８．６
測定値：６５８８．３
［実施例２９］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３３
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例５）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：７２５５．２
測定値：７２５４．７
［試験例６］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
配列番号８２〜９５及び配列番号１０９〜１１８に記載の２’−Ｏ−メトキシ−ホスホロチオエート体（２’−ＯＭｅ−Ｓ−ＲＮＡ）のアンチセンスオリゴマーを用いて実験を行った。アッセイに用いた各種アンチセンスオリゴマーは日本バイオサービス社より購入した。各種アンチセンスオリゴマーの配列を以下に示す。
エクソン４５（試験例１）と同様の条件・手順で行った。
実験結果
結果を図９、１０に示す。本実験により、ヒトジストロフィン遺伝子の第４４番目のエクソンの５’末端から第１１〜３２番目又は第２６〜４７番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合、第４４番目のエクソンの５’末端から第６２〜８１番目にアンチセンスオリゴマーを設計した場合と同等の効率でエクソン４４をスキッピングさせることが判明した。
［試験例７］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
エクソン４５（試験例２）と同様の条件・手順で行った。
実験結果
結果を図１１、１２及び１８に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．２４、２６（Ｈ４４＿２５−４５（ＯＨ）、Ｈ４４＿２７−４７（ＯＨ））の本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞において、ＰＭＯ Ｎｏ．３０（Ｈ４４＿１０−３９（ＯＨ））のアンチセンスオリゴマーと同等の効率でエクソン４４をスキッピングさせることが判明した（図１１、１２）。ＰＭＯ Ｎｏ．２６の本発明オリゴマーと鎖長を１塩基短くしたＰＭＯ Ｎｏ．３１（Ｈ４４＿２７−４６（ＯＨ））は同等の効率でエクソン４４をスキッピングさせることが判明した（図１８）。さらに、ＰＭＯ Ｎｏ．２６の本発明オリゴマーは、末端構造の異なるＰＭＯ Ｎｏ．３３（Ｈ４４＿２７−４７（ＴＥＧ））と比較して、同等の効率でエクソン４４をスキッピングさせることが判明した（図１８）。
エクソン５０について
以下の実施例３０〜３９の記載に従い、表１５ＰＭＯ Ｎｏ．３４〜３８及び４１〜４５に示す各種ＰＭＯを合成した。合成したＰＭＯを注射用水（大塚製薬工場社製）で溶解した。なお、ＰＭＯ Ｎｏ．３９，４０はジーンツールズ社から購入した。
［実施例３０］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３４
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８６１．８
測定値：６８６１．８
［実施例３１］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３５
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６８８５．８
測定値：６８８５．９
［実施例３２］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３６
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９２５．９
測定値：６９２５．９
［実施例３３］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３７
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９５０．９
測定値：６９５０．９
［実施例３４］
ＰＭＯ．Ｎｏ．３８
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９９０．９
測定値：６９９１．０
［実施例３５］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４１
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６６３５．６
測定値：６６３５．０
［実施例３６］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４２
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−［［（２Ｓ，６Ｒ）−６−［６−（２−シアノエトキシ）−２−［（２−フェノキシアセチル）アミノ］プリン−９−イル］−４−トリチルモルホリン−２−イル］メトキシ］−４−オキソ−ブタン酸（参考例２）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６６３５．６
測定値：６６３４．９
［実施例３７］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４３
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−（（（２Ｓ，６Ｒ）−６−（５−メチル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロピリミジン−１（２Ｈ）−イル）−４−トリチルモルホリン−２−イル）メトキシ）−４−オキソブタン酸（参考例３）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９６５．９
測定値：６９６５．２
［実施例３８］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４４
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された４−｛［（２Ｓ，６Ｒ）−６−（６−ベンズアミドプリン−９−イル）−４−トリチルモルフォリン−２−イル］メトキシ｝−４−オキソブタン酸（参考例４）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：６９４９．９
測定値：６９４９．２
［実施例３９］
ＰＭＯ．Ｎｏ．４５
実施例１と同様の方法に従って、標記化合物を製造した。但し、出発原料として、アミノポリスチレン樹脂に担持された１，１２−ジオキソ−１−（４−トリチルピペラジン−１−イル）−２，５，８，１１−テトラオキサ−１５−ペンタデカン酸（参考例５）を使用した。
ＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳ 計算値：７３４２．２
測定値：７３４１．６
［試験例８］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
濃度を０．１、０．３、１μＭとして、ＲＴ−ＰＣＲを以下のプライマーで実施した他は、エクソン４５（試験例２）と同様の条件・手順で行った。
実験結果
結果を図１３、１９に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．３８（Ｈ５０＿１０７−１２７（ＯＨ））の本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞において、ＰＭＯ Ｎｏ．３９又は４０（Ｈ５０＿９０−１１４（ＧＴ）、Ｈ５０＿１０３−１２７（ＧＴ））のアンチセンスオリゴマーと比較して高い効率でエクソン５０をスキッピングさせることが判明した。また、ＰＭＯ Ｎｏ．３８は末端構造の異なるＰＭＯ Ｎｏ．４５（Ｈ５０＿１０７−１２７（ＴＥＧ））と比較して高い効率でエクソン５０をスキッピングさせることが判明した（図１９）。
エクソン４４スキッピング検討
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
［試験例９］
ＧＭ０５１１２細胞（エクソン４５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、エクソン４４スキッピング活性を検討した。増殖培地は１０％ＦＣＳ及び１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）（シグマ アルドリッチ社）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）（インビトロジェン社）を使用し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。
細胞はＴ２２５フラスコで培養し、増殖培地３５ｍＬに対して２．５ｍＬのヒト由来ＭｙｏＤ（配列番号３８）発現レトロウイルス（ＺｓＧｒｅｅｎ１共発現）及び終濃度８μｇ／ｍＬでポリブレン（シグマ アルドリッチ社）を添加した。３２℃で２日間培養後、新鮮な増殖培地で培地交換を行い、さらに３７℃で３日間培養した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にてＺｓＧｒｅｅｎ１陽性細胞を選択することでＭｙｏＤ転換線維芽細胞を回収し、コラーゲンコートの２４−ｗｅｌｌプレートに９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。翌日、分化培地（２％ウマ血清（インビトロジェン社）、１％Ｐ／Ｓ及びＩＴＳ Ｌｉｑｕｉｄ Ｍｅｄｉａ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（シグマ社）含有ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）に交換した。２〜３日ごとに培地交換を行いながら培養し、筋管細胞へ分化誘導した。
分化培地に交換後７日目に、終濃度６μＭとなるようにＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）を添加した分化培地に交換し、終濃度が１、３、１０μＭとなるようにＰＭＯ Ｎｏ．２６及び３１を添加した。７日間インキュベート後に、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡ ５０ｎｇに対し、ＱＩＡＧＥＮ ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。添付のプロトコールに従って、反応液を調製した。サーマルサイクラーはｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いた。用いたＲＴ−ＰＣＲのプログラムは、以下の通りである。
５０℃、３０分間：逆転写反応
９５℃、１５分間：熱変性
［９４℃、１分間；６０℃、１分間；７２℃、１分間］ｘ ３５サイクル：ＰＣＲ増幅
７２℃、７分間：最終伸長反応
ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
上記ＲＴ−ＰＣＲ反応の反応産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、イメージアナライザーＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）によりゲル写真を撮影した。付属のソフトにより、エクソン４４がスキップしたバンドのポリヌクレオチド量「Ａ」と、エクソン４４がスキップしなかったバンドのポリヌクレオチド量「Ｂ」を測定した。これら「Ａ」及び「Ｂ」の測定値に基づき、以下の式に従って、スキッピング効率を求めた。
スキッピング効率（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｂ）ｘ １００
実験結果
結果を図２０に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．２６及び３１の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０５１１２細胞において、高い効率でエクソン４４をスキッピングさせることが判明した。
［試験例１０］
試験例９と同様にＧＭ０５１１２細胞を使用してＭｙｏＤ転換線維芽細胞を調製し、筋管細胞へ分化誘導した。分化培地に交換後６日目に終濃度６μＭとなるようにＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）を添加した分化培地に交換し、終濃度１０μＭになるようにＰＭＯ Ｎｏ．２６及び３１を添加した。１４日間インキュベート後に、プロテアーゼインヒビターカクテルＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ（ロッシュ社）を添加した細胞溶解バッファーＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ社）によりスクレーパーで細胞を回収した。超音波破砕機Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ ＵＣＤ−２５０（東湘電機社）により細胞を破砕し、遠心後の上清を回収し、セルライセートとした。セルライセートのタンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて求めた。波長５４４ｎｍの吸光度はプレートリーダーＴｈｅｒｍｏ Ａｐｐｌｉｓｋａｎ Ｔｙｐｅ２００１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ社）を用いて測定した。
セルライセート３μｇをポリアクリルアミドゲルＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ Ｇｅｌ３−８％（インビトロジェン社）を用いて電気泳動した。電気泳動終了後、セミドライブロット法によりＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）へ転写した。転写した膜は０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗浄後、５％ Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を含むＰＢＳＴで冷蔵庫内一晩ブロッキングした。膜をＰＢＳＴで洗浄後、抗ジストロフィン抗体（ＮＣＬ−Ｄｙｓ１、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ社）をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌｌ（ＴＯＹＯＢＯ）で５０倍希釈した溶液中で、室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１７０−６５１６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）をＣａｎ Ｇｅｔ Ｓｉｇｎａｌ２（ＴＯＹＯＢＯ社）で２，５００倍希釈した溶液中で、室温にて１０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄後、ＥＣＬ Ｐｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で処理した。エクソン４４−４５に相当する部分が欠損したジストロフィンの化学発光を、ルミノ・イメージアナライザーＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００ｍｉｎｉ（富士フィルム社）により検出した。
実験結果
ウェスタンブロッティングの結果を図２１に示す。図２１において矢印は発現が確認されたジストロフィンタンパク質のバンドを示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．２６及び３１の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０５１１２細胞において、ジストロフィンタンパク質の発現を誘導することが判明した。
エクソン５０スキッピング検討
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
［試験例１１］
試験例９と同様にＧＭ０５１１２細胞を使用してＭｙｏＤ転換線維芽細胞を調製し、筋管細胞へ分化誘導した。
分化培地に交換後１２日目に、終濃度６μＭとなるようにＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）を添加した分化培地に交換し、終濃度０．１、０．３、１、３、１０μＭになるようにＰＭＯ Ｎｏ．３８を添加した。２日間インキュベート後に、細胞を回収した。試験例９と同様にｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出後、ＲＴ−ＰＣＲを実施し、スキッピング効率を求めた。ただし、ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
実験結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２２に、スキッピング効率を図２３に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．３８の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０５１１２細胞において、高い効率でエクソン５０をスキッピングさせ、ＥＣ５０値は１．３μＭであることが判明した。
［試験例１２］
１１−０６２７細胞（エクソン８−９重複ＤＭＤ患者由来線維芽細胞、国立精神・神経医療研究センター神経・筋疾患研究資源レポジトリー）を使用し、ＰＭＯ Ｎｏ．３８添加時の終濃度を０．１、１、１０μＭとした他は試験例１１と同様の条件・手順でスキッピング試験を行った。
実験結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２６に、スキッピング効率を図２７に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．３８の本発明のオリゴマーは、１１−０６２７細胞において、高い効率でエクソン５０をスキッピングさせることが判明した。
［試験例１３］
ｐＬＶＸ−ＭｙｏＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ１レンチウイルスの作製
ｐＬＶＸ−ｐｕｒｏ（８１２０ｂｐ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のマルチクローニングサイト内ＸｈｏＩ（位置２８１６）から、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子コード領域の３’末端近傍（位置３８９０）まで、１１６４ｂｐを削除して直鎖化したベクターに、ヒトＭｙｏＤ遺伝子、ＩＲＥＳ配列、ＺｓＧｒｅｅｎ１遺伝子の順でコードされた配列（２２７２ｂｐ）を組み込み、レンチウイルス発現ベクターｐＬＶＸ−ＭｙｏＤ−ＺｓＧｒｅｅｎ１（９２１０ｂｐ）を作製した。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ ＨＴＸ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコールに従い、Ｌｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍコラーゲンコートディッシュに播種した。線維芽細胞への感染予定日の３日前に、レンチウイルス発現ベクター、パッケージングベクターをトランスフェクションし、４時間後に培地を交換、以後は培地を交換せず３日間培養した。感染予定日当日に、培養上清をウイルス液として回収した（１０ｃｍディッシュあたり約９ｍＬ）。培養上清をセルストレーナー（４０μｍ）でろ過し、これをさらに５００ｘｇ，１０ｍｉｎで遠心した。この上清をＬｅｎｔｉ−Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のプロトコールに従い濃縮し、最終的に回収直後の１０倍濃度となるように、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に溶解した。この溶液をウイルス液として使用した。
線維芽細胞へのウイルス感染
感染予定日までに、ＧＭ０４３６４細胞（エクソン５１−５５欠損ＤＭＤ患者由来線維芽細胞、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をコラーゲンコート２４ウェルプレートに、３ｘ１０４／ｗｅｌｌの密度で播種した。感染予定日当日に、１ウェルあたり分化培地４００ｕＬ，ウイルス液１００ｕＬ，ポリブレン最終濃度８ｕｇ／ｍＬを添加した。感染翌日、ウイルス含有培地を分化培地５００ｕＬに交換した。以降は２〜３日おきに分化培地を交換し１２日間培養することで、筋管細胞に分化誘導した。
分化培地に交換後１２日目に、終濃度６μＭとなるようにＥｎｄｏ−Ｐｏｒｔｅｒ（ジーンツール社）を添加した分化培地に交換し、終濃度０．１、０．３、１、３、１０μＭになるようにＰＭＯ Ｎｏ．３８を添加した。２日間インキュベート後に、細胞を回収した。試験例１１と同様に、スキッピング効率を求めた。ただし、ＲＴ−ＰＣＲに使用したフォワードプライマーとリバースプライマーの塩基配列は以下の通りである。
実験結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２８に、スキッピング効率を図２９に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．３８の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０４３６４細胞において、高い効率でエクソン５０をスキッピングさせることが判明した。
エクソン５５スキッピング検討
ヒト線維芽細胞を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
［試験例１４］
ＰＭＯ Ｎｏ．１４、２１を使用し、ＲＴ−ＰＣＲを以下のプライマーで実施した他は、試験例１１と同様の条件・手順で行った。
実験結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図２４に、スキッピング効率を図２５に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．１４、２１の本発明のオリゴマーは、ＧＭ０５１１２細胞において、高い効率でエクソン５５をスキッピングさせ、ＥＣ５０値はそれぞれ３．５μＭ、７．５μＭであることが判明した。
［試験例１５］
細胞を０４−０３５細胞（エクソン５４単独欠損ＤＭＤ患者由来細胞、国立精神・神経医療研究センター神経・筋疾患研究資源レポジトリー）を使用し、ＰＭＯ Ｎｏ．１４、２１を終濃度１、３、１０μＭで添加し、ＲＴ−ＰＣＲを以下のプライマーで実施した他は、試験例１３と同様の条件・手順で行った。
実験結果
ＲＴ−ＰＣＲの結果を図３０に、スキッピング効率を図３１に示す。本実験により、ＰＭＯ Ｎｏ．１４、２１の本発明のオリゴマーは、エクソン５４単独欠損ＤＭＤ患者由来細胞において、高い効率でエクソン５５をスキッピングさせることが判明した。
試験例に示す実験結果から、本発明のオリゴマーは、ＲＤ細胞及びＤＭＤ患者由来細胞の両環境において、著しく高い効率で標的エクソン（例えば、エクソン５５等）をスキッピングさせることが示された。
従って、本発明のオリゴマーは、ＤＭＤの治療において、非常に有用である。
配列番号９：合成核酸
配列番号１０：合成核酸
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［配列表］

Claims (10)

  1. ヒトジストロフィン遺伝子の第50番目のエクソンのスキッピングを可能にするアンチセンスオリゴマーであって、ヒトジストロフィン遺伝子の第50番目のエクソンの5’末端から第107〜127番目のヌクレオチドからなる配列に相補的な塩基配列からなる、アンチセンスオリゴマー。
  2. 配列番号7の第3〜23番目のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴマー。
  3. オリゴヌクレオチドである、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー。
  4. 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分及び/又はリン酸結合部分が修飾されている、請求項3に記載のアンチセンスオリゴマー。
  5. 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドの糖部分が、2’位の-OH基が、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、Br及びIからなる群より選択されるいずれかの基で置換されたリボースである、請求項4に記載のアンチセンスオリゴマー。
    （上記Rは、アルキル又はアリールを示し、上記R’は、アルキレンを示す。）
  6. 前記オリゴヌクレオチドを構成する少なくとも1つのヌクレオチドのリン酸結合部分が、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、アルキルホスホネート結合、ホスホロアミデート結合、及びボラノフォスフェート結合からなる群より選択されるいずれか1つのものである、請求項4又は5に記載のアンチセンスオリゴマー。
  7. モルホリノオリゴマーである、請求項1又は2に記載のアンチセンスオリゴマー。
  8. ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである、請求項7に記載のアンチセンスオリゴマー。
  9. 5’末端が、下記化学式（1）〜（3）のいずれかの基である、請求項7又は8に記載のアンチセンスオリゴマー。
  10. 請求項1〜9のいずれか1項に記載のアンチセンスオリゴマー、その医薬的に許容可能な塩又は水和物を有効成分とする、筋ジストロフィー治療用医薬組成物。
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