KR20140108676A - 안티센스 핵산 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제55, 45, 50 및 44번째의 엑손을 고효율로 스키핑시키는 약제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제55, 45, 50 및 44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 올리고머를 제공한다.

Description

안티센스 핵산{Antisense nucleic acid}
본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제55, 45, 50 및 44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머 및 그 올리고머를 포함하는 의약 조성물에 관한 것이다.
뒤시엔느형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy; DMD)은 출생 남자 약 3,500명에 1명이 발증하는 가장 빈도가 높은 유전성 진행성 근위축증이다. 유유아기에는 정상의 인간과 거의 다름없는 운동기능을 나타내지만, 만4~5세경부터 근력 저하가 보인다. 그 후 근력 저하는 진행되어 만12세경까지 보행 불능이 되고, 20대에서 심부전 또는 호흡기 부전에 의해 사망에 이르는 심각한 질환이다. 현재, DMD에 대한 유효한 치료법은 없어, 새로운 치료약의 개발이 강하게 요구되고 있다.
DMD는 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인 것이 알려져 있다. 디스트로핀 유전자는 X염색체에 존재하며, 220만 염기쌍의 DNA로 이루어지는 거대한 유전자이다. DNA로부터 mRNA 전구체로 전사되고, 또한 스플라이싱에 의해 인트론이 제거되어 79의 엑손이 결합한 mRNA가 합성된다. 이 mRNA로부터 3,685의 아미노산으로 번역되어, 디스트로핀 단백질이 생성된다. 디스트로핀 단백질은 근세포의 막 안정성의 유지에 관여하고 있어, 근세포를 파손되기 어렵게 하기 위해 필요하다. DMD 환자의 디스트로핀 유전자는 변이를 갖기 때문에, 근세포에 있어서 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현되지 않는다. 그 때문에, DMD 환자 체내에서는, 근세포의 구조를 유지할 수 없게 되어, 다량의 칼슘 이온이 근세포 내로 흘러들어간다. 그 결과, 염증과 유사한 반응이 생겨, 섬유화가 진행되기 때문에 근세포가 재생되기 어려워진다.
베커형 근이영양증(BMD)도 디스트로핀 유전자의 변이가 원인인데, 그 증상은 근위축에 의한 근력 저하를 나타내지만 일반적으로 DMD와 비교하여 가볍고, 근력 저하의 진행도 느리며, 대부분의 경우, 성인기에 발증한다. DMD와 BMD의 임상증상의 차이는 변이에 의해 디스트로핀의 mRNA가 디스트로핀 단백질로 번역될 때의 아미노산 리딩 프레임이 파괴되는지 또는 유지되는지에 따른 것으로 생각되고 있다(비특허문헌 1). 즉, DMD의 경우는 아미노산 리딩 프레임이 조금 벗어나는 변이를 가짐으로써, 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 거의 발현하지 않는데, BMD의 경우는 변이에 의해 엑손의 일부는 결실되어 있으나, 아미노산 리딩 프레임은 유지되어 있기 때문에 불완전하지만 기능을 갖는 디스트로핀 단백질이 생산된다.
DMD의 치료법으로서, 엑손 스키핑법이 기대되고 있다. 이 방법은 스플라이싱을 개변함으로써 디스트로핀의 mRNA의 아미노산 리딩 프레임을 수복하여, 부분적으로 기능을 회복한 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 방법이다(비특허문헌 2). 엑손 스키핑의 대상이 되는 아미노산 서열 부분은 상실되게 된다. 그 때문에 이 치료에서 발현되는 디스트로핀 단백질은 정상의 것보다 짧아지나, 아미노산 리딩 프레임이 유지되기 때문에 근세포를 안정화하는 기능이 부분적으로 유지된다. 따라서, 엑손 스키핑에 의해, DMD는 보다 경증의 BMD와 동일한 증상을 나타내게 될 것으로 기대되고 있다. 엑손 스키핑법은 마우스나 개에 의한 동물실험을 거쳐, 인간 DMD 환자에 대한 임상시험이 행해지고 있다.
엑손 스키핑은 5' 또는 3' 스플라이스 부위 중 어느 하나 또는 양쪽 또는 엑손의 내부를 표적으로 하는 안티센스 핵산의 결합에 의해 유도할 수 있다. 엑손은 양쪽의 스플라이스 부위가 이어맞추기복합체(spliceosome)에 의해 인식된 경우만 mRNA에 포함된다. 따라서, 스플라이스 부위를 안티센스 핵산으로 타겟팅함으로써, 엑손 스키핑을 유도할 수 있다. 또한 엑손이 스플라이싱의 기구에 인식되기 위해서는 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)로의 SR 단백질의 결합이 필요할 것으로 생각되고 있어, ESE를 타겟팅하는 것으로도 엑손의 스키핑을 유도할 수 있다.
디스트로핀 유전자의 변이는 DMD 환자에 따라 상이하기 때문에, 유전자 변이의 장소나 종류에 따른 안티센스 핵산이 필요해진다. 지금까지, 웨스턴 오스트레일리아 대학의 Steve Wilton 등에 의해 79개 전부의 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있고(비특허문헌 3), 네덜란드의 Annemieke Aartsma-Rus 등에 의해 39종류의 엑손에 대해 엑손 스키핑을 유도하는 안티센스 핵산이 제작되어 있다(비특허문헌 4).
전체 DMD 환자의 20% 정도는 제55, 45, 50 및 44번째의 엑손(이하, 각각 「엑손 55」, 「엑손 45」, 「엑손 50」 및 「엑손 44」라 한다)을 스키핑함으로써 치료 가능한 것으로 생각되고 있다. 최근 들어서는 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44를 엑손 스키핑의 타겟으로 한 연구에 대해서, 복수의 연구기관으로부터 보고가 이루어져 있다(특허문헌 1~8). 그러나 엑손 55, 45, 50 및 44를 환자세포에서 고효율로 스키핑시키는 기술은 아직 확립되어 있지 않다.
국제공개공보 WO 2006/000057 국제공개공보 WO 2004/048570 미국 특허공개공보 US 2010/0168212 국제공개공보 WO 2010/048586 국제공개공보 WO 2004/083446 국제공개공보 WO 2010/050801 국제공개공보 WO 2009/139630
Monaco A. P. et al., Genomics 1988；2：p. 90-95 Matsuo M., Brain Dev 1996；18：p. 167-172 Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007：15：p. 1288-96 Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12：S71-S77 Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol. 20, no.2, p. 102-10
발명의 개시
상기와 같은 상황에 있어서 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44의 스키핑을 강하게 유도하는 안티센스 올리고머 및 그 올리고머를 포함하는 근이영양증(muscular dystrophy) 치료약이 요망되고 있다.
본 발명자들은 디스트로핀 유전자의 구조를 상세히 연구한 결과, 디스트로핀 유전자의 mRNA 전구체(이하, 「pre-mRNA」라 한다) 중 엑손 55의 5' 말단으로부터 제1~21번째, 제11~31번째 및 제14~34번째 주변의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 안티센스 올리고머로 타겟팅함으로써 고효율로 엑손 55의 스키핑을 유도할 수 있는 것을 발견하였다.
또한 본 발명자들은 디스트로핀 유전자 pre-mRNA 중 엑손 45의 5' 말단으로부터 제1~25번째 및 제6~30번째 주변의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 안티센스 올리고머로 타겟팅함으로써 고효율로 엑손 45의 스키핑을 유도할 수 있는 것을 발견하였다.
추가로 본 발명자들은 디스트로핀 유전자 pre-mRNA 중 엑손 50의 5' 말단으로부터 제107~127번째 주변의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 안티센스 올리고머로 타겟팅함으로써 고효율로 엑손 50의 스키핑을 유도할 수 있는 것을 발견하였다.
또한 추가로 본 발명자들은 디스트로핀 유전자 pre-mRNA 중 엑손 44의 5' 말단으로부터 제11~32번째 및 제26~47번째 주변의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 안티센스 올리고머로 타겟팅함으로써 고효율로 엑손 44의 스키핑을 유도할 수 있는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 이 지견(知見)을 토대로 본 발명을 완성시켰다.
즉 본 발명은 아래와 같다.
[1] 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제3~19번째, 제3~20번째, 제3~21번째, 제3~22번째, 제3~23번째, 제9~29번째, 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제10~29번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제11~29번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제12~29번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제13~29번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제12~34번째, 제12~35번째, 제12~36번째, 제13~34번째, 제13~35번째, 제13~36번째, 제14~32번째, 제14~33번째, 제14~34번째, 제14~35번째, 제14~36번째, 제15~32번째, 제15~33번째, 제15~34번째, 제15~35번째, 제15~36번째, 제16~32번째, 제16~33번째, 제16~34번째, 제16~35번째 또는 제16~36번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
[2] 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-3~19번째, 제-3~20번째, 제-3~21번째, 제-3~22번째, 제-3~23번째, 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제-2~24번째, 제-2~25번째, 제-2~26번째, 제-2~27번째, 제-1~24번째, 제-1~25번째, 제-1~26번째, 제-1~27번째, 제1~24번째, 제1~25번째, 제1~26번째, 제1~27번째, 제2~24번째, 제2~25번째, 제2~26번째, 제2~27번째, 제3~23번째, 제3~24번째, 제3~25번째, 제3~26번째, 제3~27번째, 제4~28번째, 제4~29번째, 제4~30번째, 제4~31번째, 제4~32번째, 제5~28번째, 제5~29번째, 제5~30번째, 제5~31번째, 제5~32번째, 제6~28번째, 제6~29번째, 제6~30번째, 제6~31번째, 제6~32번째, 제7~28번째, 제7~29번째, 제7~30번째, 제7~31번째, 제7~32번째, 제8~28번째, 제8~29번째, 제8~30번째, 제8~31번째 또는 제8~32번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
[3] 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제105~125번째, 제105~126번째, 제105~127번째, 제105~128번째, 제105~129번째, 제106~125번째, 제106~126번째, 제106~127번째, 제106~128번째, 제106~129번째, 제107~125번째, 제107~126번째, 제107~127번째, 제107~128번째, 제107~129번째, 제108~125번째, 제108~126번째, 제108~127번째, 제108~128번째, 제108~129번째, 제109~125번째, 제109~126번째, 제109~127번째, 제109~128번째 또는 제109~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
[4] 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제9~34번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제10~34번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제11~34번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제12~34번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제13~34번째, 제24~45번째, 제24~46번째, 제24~47번째, 제24~48번째, 제24~49번째, 제25~45번째, 제25~46번째, 제25~47번째, 제25~48번째, 제25~49번째, 제26~45번째, 제26~46번째, 제26~47번째, 제26~48번째, 제26~49번째, 제27~45번째, 제27~46번째, 제27~47번째, 제27~48번째, 제27~49번째, 제28~45번째, 제28~46번째, 제28~47번째, 제28~48번째, 제28~49번째, 제29~45번째, 제29~46번째, 제29~47번째, 제29~48번째 또는 제29~49번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
[5] 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제1~21번째, 제11~31번째 또는 제14~34번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]에 기재된 안티센스 올리고머.
[6] 서열번호 5의 제170~190번째, 제160~180번째 또는 제157~177번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [1]에 기재된 안티센스 올리고머.
[7] 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번, 제1~21번째, 제1~25번째 또는 제6~30번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 상기 [2]에 기재된 안티센스 올리고머.
[8] 서열번호 6의 제158~178번째, 제156~176번째, 제152~176번째 또는 제147~171번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [2]에 기재된 안티센스 올리고머.
[9] 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제106~126번 또는 제107~127번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 상기 [3]에 기재된 안티센스 올리고머.
[10] 서열번호 7의 제4~24번째 또는 제3~23번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [3]에 기재된 안티센스 올리고머.
[11] 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제11~32번, 제25~45번, 제26~46번, 제26~47번 또는 제27~47번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는, 상기 [4]에 기재된 안티센스 올리고머.
[12] 서열번호 8의 제117~138번째, 제104~124번째, 제103~123번째, 제102~123번째 또는 제102~122번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는, 상기 [4]에 기재된 안티센스 올리고머.
[13] 올리고뉴클레오티드인, 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 안티센스 올리고머.
[14] 상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분 및/또는 인산 결합부분이 수식되어 있는, 상기 [13]에 기재된 안티센스 올리고머.
[15] 상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분이 2' 위치의 -OH기가 OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기로 치환된 리보오스인, 상기 [14]에 기재된 안티센스 올리고머.
(상기 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, 상기 R'는 알킬렌을 나타낸다.)
[16] 상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 인산 결합부분이 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 및 보라노포스페이트(boranophosphate) 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인, 상기 [14] 또는 [15]에 기재된 안티센스 올리고머.
[17] 모르폴리노 올리고머인, 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 기재된 안티센스 올리고머.
[18] 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인, 상기 [17]에 기재된 안티센스 올리고머.
[19] 5' 말단이 하기 화학식 1~3 중 어느 하나의 기인, 상기 [17] 또는 [18]에 기재된 안티센스 올리고머.
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[20] 상기 [1] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 안티센스 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는, 근이영양증 치료용 의약 조성물.
본 발명의 안티센스 올리고머에 의해 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44의 스키핑을 고효율로 유도하는 것이 가능하다. 또한 본 발명의 의약 조성물을 투여함으로써 뒤시엔느형 근이영양증의 증상을 효과적으로 경감할 수 있다. 또한 본 발명의 안티센스 올리고머는 환자의 엑손 서열만을 타겟으로 하기 때문에, 인트론을 타겟으로 하는 안티센스 올리고머의 경우와 비교해 타겟 서열이 개체 간(개인 간)에서 보존되어 있고, 이 때문에 개체차(개인차)에 관계없이 양호한 스키핑 효율이 얻어지는 것을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 안티센스 올리고머는 그의 사슬 길이가 20 bp 전후로 짧기 때문에, 종래의 DMD 치료를 목적으로 한 안티센스 올리고머(25 bp 전후)와 비교해서 타겟 서열 중에 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 등의 개체(개인) 간의 변이를 포함할 가능성이 낮고, 이 점으로부터도 개체차(개인차)에 관계없이 양호한 스키핑 효율이 얻어지는 것을 특징으로 한다. 또한 일반적으로 단쇄(短鎖)의 안티센스 올리고머는 비교적 면역을 유도하기 어렵기 때문에, 본 발명의 안티센스 올리고머는 사이토카인 등의 유도에 의한 부작용이 발생하기 어렵다고 하는 특징을 갖는다.
또한 본 발명의 안티센스 올리고머는 사슬 길이가 짧기 때문에 제조 비용이 비교적 저렴하다.
도 1은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 2는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 4는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05017세포)에 인간 MyoD 유전자를 도입하여 근육세포로 분화 유도한 세포에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 6은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 7은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 8은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 9는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 10은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 2'-OMe-S-RNA 올리고머에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 11은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 12는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 13은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 14는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 15는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 45의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 16은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 17은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 18은 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 19는 인간 횡문근육종 세포주(RD세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 20은 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 21은 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 44의 스키핑 결과(웨스턴 블로팅)를 나타내는 도면이다.
도 22는 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 결과(RT-PCR)를 나타내는 도면이다.
도 23은 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 24는 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 결과(RT-PCR)를 나타내는 도면이다.
도 25는 엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM05112세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 26은 엑손 8-9 중복 DMD 환자 유래 섬유아세포(11-0627세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 결과(RT-PCR)를 나타내는 도면이다.
도 27은 엑손 8-9 중복 DMD 환자 유래 섬유아세포(11-0627세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 28은 엑손 51-55 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM04364세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 결과(RT-PCR)를 나타내는 도면이다.
도 29는 엑손 51-55 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포(GM04364세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 50의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
도 30은 엑손 54 단독 결손 DMD 환자 유래 세포(04-035세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 결과(RT-PCR)를 나타내는 도면이다.
도 31은 엑손 54 단독 결손 DMD 환자 유래 세포(04-035세포)에 있어서의 PMO에 의한 인간 디스트로핀 유전자 엑손 55의 스키핑 효율을 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 다음의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태로만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은 그 요지를 벗어나지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다.
또한 본 명세서에 있어서 인용한 모든 문헌 및 공개공보, 특허공보, 기타 특허문헌은 참조로써 본 명세서에 포함하는 것으로 한다. 또한 본 명세서는 본원 우선권주장의 기초가 되는 2011년 12월 28일에 출원된 일본국 특허출원(특원2011-288040호) 및 2012년 02월 29일에 출원된 일본국 특허출원(특원2012-043092호)의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 다음의 실시형태는 본 발명을 설명하기 위한 예시로, 본 발명을 이 실시형태로만 한정하는 취지는 아니다. 본 발명은 그 요지를 벗어나지 않는 한 다양한 형태로 실시할 수 있다.
또한 특별히 기재가 없는 경우, 아미노산 서열은 좌단을 아미노 말단 및 우단을 카르복실 말단으로 하고, 염기서열은 좌단을 5' 말단 및 우단을 3' 말단으로 하여 나타내는 것으로 한다.
1. 안티센스 올리고머
본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제3~19번째, 제3~20번째, 제3~21번째, 제3~22번째, 제3~23번째, 제9~29번째, 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제10~29번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제11~29번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제12~29번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제13~29번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제12~34번째, 제12~35번째, 제12~36번째, 제13~34번째, 제13~35번째, 제13~36번째, 제14~32번째, 제14~33번째, 제14~34번째, 제14~35번째, 제14~36번째, 제15~32번째, 제15~33번째, 제15~34번째, 제15~35번째, 제15~36번째, 제16~32번째, 제16~33번째, 제16~34번째, 제16~35번째 또는 제16~36번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(이하, 「엑손 55 표적 서열」이라고도 한다.) 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 엑손 55 스키핑 올리고머」라 한다)를 제공한다.
또한 본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-3~19번째, 제-3~20번째, 제-3~21번째, 제-3~22번째, 제-3~23번째, 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제-2~24번째, 제-2~25번째, 제-2~26번째, 제-2~27번째, 제-1~24번째, 제-1~25번째, 제-1~26번째, 제-1~27번째, 제1~24번째, 제1~25번째, 제1~26번째, 제1~27번째, 제2~24번째, 제2~25번째, 제2~26번째, 제2~27번째, 제3~23번째, 제3~24번째, 제3~25번째, 제3~26번째, 제3~27번째, 제4~28번째, 제4~29번째, 제4~30번째, 제4~31번째, 제4~32번째, 제5~28번째, 제5~29번째, 제5~30번째, 제5~31번째, 제5~32번째, 제6~28번째, 제6~29번째, 제6~30번째, 제6~31번째, 제6~32번째, 제7~28번째, 제7~29번째, 제7~30번째, 제7~31번째, 제7~32번째, 제8~28번째, 제8~29번째, 제8~30번째, 제8~31번째 또는 제8~32번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(이하, 「엑손 45 표적 서열」이라고도 한다.) 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 엑손 45 스키핑 올리고머」라 한다)를 제공한다.
또한 본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제105~125번째, 제105~126번째, 제105~127번째, 제105~128번째, 제105~129번째, 제106~125번째, 제106~126번째, 제106~127번째, 제106~128번째, 제106~129번째, 제107~125번째, 제107~126번째, 제107~127번째, 제107~128번째, 제107~129번째, 제108~125번째, 제108~126번째, 제108~127번째, 제108~128번째, 제108~129번째, 제109~125번째, 제109~126번째, 제109~127번째, 제109~128번째 또는 제109~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(이하, 「엑손 50 표적 서열」이라고도 한다.) 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 엑손 50 스키핑 올리고머」라 한다)를 제공한다.
또한 본 발명은 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제9~34번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제10~34번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제11~34번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제12~34번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제13~34번째, 제24~45번째, 제24~46번째, 제24~47번째, 제24~48번째, 제24~49번째, 제25~45번째, 제25~46번째, 제25~47번째, 제25~48번째, 제25~49번째, 제26~45번째, 제26~46번째, 제26~47번째, 제26~48번째, 제26~49번째, 제27~45번째, 제27~46번째, 제27~47번째, 제27~48번째, 제27~49번째, 제28~45번째, 제28~46번째, 제28~47번째, 제28~48번째, 제28~49번째, 제29~45번째, 제29~46번째, 제29~47번째, 제29~48번째 또는 제29~49번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(이하, 「엑손 44 표적 서열」이라고도 한다.) 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머(이하, 「본 발명의 엑손 44 스키핑 올리고머」라 한다)를 제공한다.
이하, 본 발명의 엑손 55, 45, 50 및 44 스키핑 올리고머를 「본 발명의 올리고머」라 총칭하는 경우가 있다.
[인간 디스트로핀 유전자의 제55, 45, 50 및 44번째의 엑손]
본 발명에 있어서 「유전자」에는 게놈 유전자 이외에 cDNA, mRNA 전구체 및 mRNA도 포함된다. 바람직하게는 유전자는 mRNA 전구체, 즉 pre-mRNA이다.
인간 게놈에 있어서 인간 디스트로핀 유전자는 유전자좌 Xp21.2에 존재한다. 인간 디스트로핀 유전자는 3.0 Mbp의 사이즈를 가지고 있어, 기지의 인간 유전자로서는 최대의 유전자이다. 단, 인간 디스트로핀 유전자의 코드영역은 불과 14 kb에 불과하여 그 코드영역은 79개의 엑손으로서 디스트로핀 유전자 내에 분산되어 있다(Roberts, RG., et al., Genomics, 16：536-538(1993)). 인간 디스트로핀 유전자의 전사물인 pre-mRNA는 스플라이싱을 받아 14 kb의 성숙 mRNA를 생성한다. 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 염기서열은 공지이다(GenBank Accession No.NM_004006).
인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 55의 5' 말단으로부터 제-2~190번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열을 서열번호 1에 나타낸다. 또한 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 45의 5' 말단으로부터 제-3~176번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열을 서열번호 2에 나타낸다. 또한 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 50의 5' 말단으로부터 제1~109번째 및 인트론 50의 5' 말단으로부터 제1~20번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열을 서열번호 3에 나타낸다.
또한 인간의 야생형 디스트로핀 유전자의 엑손 44의 5' 말단으로부터 제1~148번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열을 서열번호 4에 나타낸다.
본 발명의 올리고머는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 또는 44의 스키핑에 의해 DMD형 디스트로핀 유전자로 코드되는 단백질을 BMD형 디스트로핀 단백질로 개변하는 것을 목적으로 제작된 것이다. 따라서 본 발명의 올리고머의 엑손 스키핑의 대상이 되는 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44에는 야생형뿐 아니라 그의 각 변이형도 포함된다.
변이형의 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44는 구체적으로는 아래의 (a) 또는 (b)에 기재된 폴리뉴클레오티드이다.
(a) 서열번호 1(또는 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 2(또는 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 3(또는 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열) 또는 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드；
(b) 서열번호 1(또는 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 2(또는 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 3(또는 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열) 또는 4의 염기서열에 대해 90% 이상의 동일성을 갖는 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
본 명세서 중, 「폴리뉴클레오티드」란 DNA 또는 RNA를 의미한다.
본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드」란 예를 들면 서열번호 1(또는 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 2(또는 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 3(또는 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열) 또는 4의 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부를 프로브로 하여 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 하이브리다제이션의 방법으로서는 예를 들면 "Sambrook & Russell, Molecular Cloning：A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001" 및 "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997" 등에 기재되어 있는 방법을 이용할 수 있다.
본 명세서 중, 「상보적인 염기서열」이란 대상이 되는 염기서열과 왓슨·크릭쌍(Watson-Crick pairing)을 형성하는 염기서열에 한정되지 않고, 동요염기쌍(Wobble base pair)을 형성하는 염기서열도 포함한다. 여기서, 왓슨·크릭쌍이란 아데닌-티민, 아데닌-우라실 및 구아닌-시토신 간에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미하고, 동요염기쌍이란 구아닌-우라실, 이노신-우라실, 이노신-아데닌 및 이노신-시토신 간에 수소결합이 형성되는 염기쌍을 의미한다. 또한 「상보적인 염기서열」이란 대상이 되는 염기서열과 100%의 상보성을 가지고 있지 않아도 되고, 예를 들면 대상이 되는 염기서열에 대해 1~3개, 1~2개 또는 1개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 된다.
본 명세서 중, 「스트린젠트한 조건」이란 저스트린젠트한 조건, 중스트린젠트한 조건 및 고스트린젠트한 조건 중 어느 것이어도 된다. 「저스트린젠트한 조건」은 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 32℃의 조건이다. 또한 「중스트린젠트한 조건」은 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 42℃ 또는 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드, 42℃의 조건이다. 「고스트린젠트한 조건」은 예를 들면 5×SSC, 5×덴하르트용액, 0.5% SDS, 50% 포름아미드, 50℃ 또는 0.2×SSC, 0.1% SDS, 65℃의 조건이다. 이들 조건에 있어서, 온도를 올릴수록 높은 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드가 효율적으로 얻어지는 것을 기대할 수 있다. 단 하이브리다이제이션의 스트린젠시에 영향을 미치는 요소로서는 온도, 프로브 농도, 프로브의 길이, 이온 강도, 시간, 염농도 등의 복수의 요소를 생각할 수 있고, 당업자라면 이들 요소를 적절히 선택함으로써 동일한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.
또한 하이브리다이제이션에 시판의 키트를 사용하는 경우는, 예를 들면 Alkphos Direct Labelling and Detection System(GE Healthcare)을 사용할 수 있다. 이 경우는 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 표지된 프로브와의 인큐베이션을 하룻밤 행한 후, 멤브레인을 55℃의 조건하에서 0.1%(w/v) SDS를 포함하는 1차 세정 버퍼로 세정 후, 하이브리다이즈한 폴리뉴클레오티드를 검출할 수 있다. 또는 서열번호 1(또는 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 2(또는 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 3(또는 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열) 또는 4의 염기서열과 상보적인 염기서열의 전부 또는 일부를 토대로 프로브를 제작할 때, 시판의 시약(예를 들면 PCR 라벨링 믹스(로슈·다이어그노스틱스사) 등)을 사용하여 그 프로브를 디곡시게닌(DIG) 라벨한 경우에는 DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이어그노스틱스사)를 사용하여 하이브리다이제이션을 검출할 수 있다.
상기 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드 이외의 폴리뉴클레오티드로서는 상동성 검색 소프트웨어인 BLAST에 의해 디폴트의 파라미터를 사용하여 계산했을 때에, 서열번호 1(또는 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 2(또는 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열), 3(또는 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열) 또는 4의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 서열과 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상 또는 99.9% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
또한 염기서열의 동일성은 칼린 및 알츄얼에 의한 알고리즘 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990；Proc Natl Acad Sci USA 90：5873, 1993)를 사용하여 결정할 수 있다. BLAST의 알고리즘을 토대로 한 BLASTN이나 BLASTX로 불리는 프로그램이 개발되어 있다(Altschul SF, et al：J Mol Biol 215：403, 1990). BLASTN을 사용하여 염기서열을 헤석하는 경우는, 파라미터는 예를 들면 score=100, wordlength=12로 한다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우는 각 프로그램의 디폴트 파라미터를 사용한다.
엑손 55의 5' 말단으로부터 제-2~190번째의 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 서열번호 5에 나타낸다. 여기서 엑손 55의 5' 말단으로부터 제-2~-1번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(서열번호 1의 제1~2번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열)은 엑손 54와 엑손 55 사이에 존재하는 인트론 54의 3' 말단 최하류의 2개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 나타낸다. 즉 엑손 55의 염기서열은 서열번호 1의 제3~192번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이고, 엑손 55의 염기서열에 상보적인 서열은 서열번호 5의 제1~190번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이다.
여기서 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제3~19번째, 제3~20번째, 제3~21번째, 제3~22번째, 제3~23번째, 제9~29번째, 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제10~29번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제11~29번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제12~29번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제13~29번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제12~34번째, 제12~35번째, 제12~36번째, 제13~34번째, 제13~35번째, 제13~36번째, 제14~32번째, 제14~33번째, 제14~34번째, 제14~35번째, 제14~36번째, 제15~32번째, 제15~33번째, 제15~34번째, 제15~35번째, 제15~36번째, 제16~32번째, 제16~33번째, 제16~34번째, 제16~35번째 또는 제16~36번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열에 상보적인 서열이란, 각각 서열번호 5의 제172~192번째, 제171~192번째, 제170~192번째, 제169~192번째, 제168~192번째, 제172~191번째, 제171~191번째, 제170~191번째, 제169~191번째, 제168~191번째, 제172~190번째, 제171~190번째, 제170~190번째, 제169~190번째, 제168~190번째, 제172~189번째, 제171~189번째, 제170~189번째, 제169~189번째, 제168~189번째, 제172~188번째, 제171~188번째, 제170~188번째, 제169~188번째, 제168~188번째, 제162~182번째, 제161~182번째, 제160~182번째, 제159~182번째, 제158~182번째, 제162~181번째, 제161~181번째, 제160~181번째, 제159~181번째, 제158~181번째, 제162~180번째, 제161~180번째, 제160~180번째, 제159~180번째, 제158~180번째, 제162~179번째, 제161~179번째, 제160~179번째, 제159~179번째, 제158~179번째, 제162~178번째, 제161~178번째, 제160~178번째, 제159~178번째, 제158~178번째, 제157~179번째, 제156~179번째, 제155~179번째, 제157~178번째, 제156~178번째, 제155~178번째, 제159~177번째, 제158~177번째, 제157~177번째, 제156~177번째, 제155~177번째, 제159~176번째, 제158~176번째, 제157~176번째, 제156~176번째, 제155~176번째, 제159~175번째, 제158~175번째, 제157~175번째, 제156~175번째 또는 제155~175번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열과 동일하다.
엑손 45의 5' 말단으로부터 제-3~176번째의 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 서열번호 6에 나타낸다. 여기서 엑손 45의 5' 말단으로부터 제-3~-1번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(서열번호 2의 제1~3번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열)은 엑손 44와 엑손 45 사이에 존재하는 인트론 44의 3' 말단 최하류의 3개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 나타낸다. 즉 엑손 45의 염기서열은 서열번호 2의 제4~179번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이고, 엑손 45의 염기서열에 상보적인 서열은 서열번호 6의 제1~176번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이다.
여기서 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-3~19번째, 제-3~20번째, 제-3~21번째, 제-3~22번째, 제-3~23번째, 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제-2~24번째, 제-2~25번째, 제-2~26번째, 제-2~27번째, 제-1~24번째, 제-1~25번째, 제-1~26번째, 제-1~27번째, 제1~24번째, 제1~25번째, 제1~26번째, 제1~27번째, 제2~24번째, 제2~25번째, 제2~26번째, 제2~27번째, 제3~23번째, 제3~24번째, 제3~25번째, 제3~26번째, 제3~27번째, 제4~28번째, 제4~29번째, 제4~30번째, 제4~31번째, 제4~32번째, 제5~28번째, 제5~29번째, 제5~30번째, 제5~31번째, 제5~32번째, 제6~28번째, 제6~29번째, 제6~30번째, 제6~31번째, 제6~32번째, 제7~28번째, 제7~29번째, 제7~30번째, 제7~31번째, 제7~32번째, 제8~28번째, 제8~29번째, 제8~30번째, 제8~31번째 또는 제8~32번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열이란, 각각 서열번호 6의 제158~179번째, 제157~179번째, 제156~179번째, 제155~179번째, 제154~179번째, 제158~178번째, 제157~178번째, 제156~178번째, 제155~178번째, 제154~178번째, 제158~177번째, 제157~177번째, 제156~177번째, 제155~177번째, 제154~177번째, 제158~176번째, 제157~176번째, 제156~176번째, 제155~176번째, 제154~176번째, 제158~175번째, 제157~175번째, 제156~175번째, 제155~175번째, 제154~175번째, 제153~178번째, 제152~178번째, 제151~178번째, 제150~178번째, 제153~177번째, 제152~177번째, 제151~177번째, 제150~177번째, 제153~176번째, 제152~176번째, 제151~176번째, 제150~176번째, 제153~175번째, 제152~175번째, 제151~175번째, 제150~175번째, 제154~174번째, 제153~174번째, 제152~174번째, 제151~174번째, 제150~174번째, 제149~173번째, 제148~173번째, 제147~173번째, 제146~173번째, 제147~173번째, 제149~172번째, 제148~172번째, 제147~172번째, 제146~172번째, 제145~172번째, 제149~171번째, 제148~171번째, 제147~171번째, 제146~171번째, 제145~171번째, 제149~170번째, 제148~170번째, 제147~170번째, 제146~170번째, 제145~170번째, 제149~169번째, 제148~169번째, 제147~169번째, 제146~169번째 또는 제145~169번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열과 동일하다.
엑손 50의 5' 말단으로부터 제1~109번째의 뉴클레오티드 및 인트론 50의 5' 말단으로부터 제1~20번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열에 상보적인 서열을 서열번호 7에 나타낸다. 여기서 인트론 50의 5' 말단으로부터 제1~20번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열(서열번호 3의 제110~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열)은 엑손 50과 엑손 51 사이에 존재하는 인트론 50의 5' 말단 최하류의 20개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열을 나타낸다. 즉 엑손 50의 염기서열은 서열번호 3의 제1~109번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이고, 엑손 50의 염기서열에 상보적인 서열은 서열번호 7의 제21~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열이다.
여기서 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제105~125번째, 제105~126번째, 제105~127번째, 제105~128번째, 제105~129번째, 제106~125번째, 제106~126번째, 제106~127번째, 제106~128번째, 제106~129번째, 제107~125번째, 제107~126번째, 제107~127번째, 제107~128번째, 제107~129번째, 제108~125번째, 제108~126번째, 제108~127번째, 제108~128번째, 제108~129번째, 제109~125번째, 제109~126번째, 제109~127번째, 제109~128번째 또는 제109~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열에 상보적인 서열이란, 각각 서열번호 7의 제5~25번째, 제4~25번째, 제3~25번째, 제2~25번째, 제1~25번째, 제5~24번째, 제4~24번째, 제3~24번째, 제2~24번째, 제1~24번째, 제5~23번째, 제4~23번째, 제3~23번째, 제2~23번째, 제1~23번째, 제5~22번째, 제4~22번째, 제3~22번째, 제2~22번째, 제1~22번째, 제5~21번째, 제4~21번째, 제3~21번째, 제2~21번째 또는 제1~21번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열과 동일하다.
엑손 44의 5' 말단으로부터 제1~148번째의 뉴클레오티드의 서열에 상보적인 서열을 서열번호 8에 나타낸다.
여기서 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제9~34번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제10~34번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제11~34번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제12~34번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제13~34번째, 제24~45번째, 제24~46번째, 제24~47번째, 제24~48번째, 제24~49번째, 제25~45번째, 제25~46번째, 제25~47번째, 제25~48번째, 제25~49번째, 제26~45번째, 제26~46번째, 제26~47번째, 제26~48번째, 제26~49번째, 제27~45번째, 제27~46번째, 제27~47번째, 제27~48번째, 제27~49번째, 제28~45번째, 제28~46번째, 제28~47번째, 제28~48번째, 제28~49번째, 제29~45번째, 제29~46번째, 제29~47번째, 제29~48번째 또는 제29~49번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 염기서열에 상보적인 서열이란, 각각 서열번호 8의 제119~140번째, 제118~140번째, 제117~140번째, 제116~140번째, 제115~140번째, 제119~139번째, 제118~139번째, 제117~139번째, 제116~139번째, 제115~139번째, 제119~138번째, 제118~138번째, 제117~138번째, 제116~138번째, 제115~138번째, 제119~137번째, 제118~137번째, 제117~137번째, 제116~137번째, 제115~137번째, 제119~136번째, 제118~136번째, 제117~136번째, 제116~136번째, 제115~136번째, 제104~125번째, 제103~125번째, 제102~125번째, 제101~125번째, 제100~125번째, 제104~124번째, 제103~124번째, 제102~124번째, 제101~124번째, 제100~124번째, 제104~123번째, 제103~123번째, 제102~123번째, 제101~123번째, 제100~123번째, 제104~122번째, 제103~122번째, 제102~122번째, 제101~122번째, 제100~122번째, 제104~121번째, 제103~121번째, 제102~121번째, 제101~121번째, 제100~121번째, 제104~120번째, 제103~120번째, 제102~120번째, 제101~120번째 또는 제100~120번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열과 동일하다.
엑손 55, 45, 50 및 44의 염기서열과 서열번호 5~8의 대응은 아래의 표와 같이 정리할 수 있다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012

본 발명의 엑손 55 스키핑 올리고머는 바람직하게는 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제1~21번째, 제11~31번째 또는 제14~34번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면 서열번호 5의 제170~190번째, 제160~180번째 또는 제157~177번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열)로 이루어진다.
본 발명의 엑손 45 스키핑 올리고머는 바람직하게는 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번째, 제1~21번째, 제1~25번째 또는 제6~30번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면 서열번호 6의 제158~178번째, 제156~176번째, 제152~176번째 또는 제147~171번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열)로 이루어진다.
본 발명의 엑손 50 스키핑 올리고머는 바람직하게는 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제106~126번째 또는 제107~127번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면 서열번호 7의 제4~24번째 또는 제3~23번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열)로 이루어진다.
본 발명의 엑손 44 스키핑 올리고머는 바람직하게는 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제11~32번째, 제25~45번째, 제26~46번째, 제26~47번째 또는 제27~47번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열(예를 들면 서열번호 8의 제117~138번째, 제104~124번째, 제103~123번째, 제102~123번째 또는 제102~122번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열)로 이루어진다.
「인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는」이란, 인간 디스트로핀 유전자의 전사물(예를 들면 pre-mRNA)의 엑손 55에 상당하는 부위에 본 발명의 올리고머가 결합함으로써 그 전사물이 스플라이싱을 받았을 때, 예를 들면 엑손 54가 결실된 DMD 환자의 경우, 엑손 53의 3' 말단에 상당하는 염기서열의 3' 측에 엑손 56의 5' 말단에 상당하는 염기서열이 연결되어, 코돈의 프레임 시프트가 일어나지 않은 성숙 mRNA가 형성되는 것을 의미한다.
동일하게 「인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는」이란, 인간 디스트로핀 유전자의 전사물(예를 들면 pre-mRNA)의 엑손 45에 상당하는 부위에 본 발명의 올리고머가 결합함으로써 그 전사물이 스플라이싱을 받았을 때, 예를 들면 엑손 44가 결실된 DMD 환자의 경우, 엑손 43의 3' 말단에 상당하는 염기서열의 3' 측에 엑손 46의 5' 말단에 상당하는 염기서열이 연결되어, 코돈의 프레임 시프트가 일어나지 않은 성숙 mRNA가 형성되는 것을 의미한다.
또한 「인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는」이란, 인간 디스트로핀 유전자의 전사물(예를 들면 pre-mRNA)의 엑손 50에 상당하는 부위에 본 발명의 올리고머가 결합함으로써 그 전사물이 스플라이싱을 받았을 때, 예를 들면 엑손 51이 결실된 DMD 환자의 경우, 엑손 49의 3' 말단에 상당하는 염기서열의 3' 측에 엑손 52의 5' 말단에 상당하는 염기서열이 연결되어, 코돈의 프레임 시프트가 일어나지 않은 성숙 mRNA가 형성되는 것을 의미한다.
또한 동일하게 「인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는」이란, 인간 디스트로핀 유전자의 전사물(예를 들면 pre-mRNA)의 엑손 44에 상당하는 부위에 본 발명의 올리고머가 결합함으로써 그 전사물이 스플라이싱을 받았을 때, 예를 들면 엑손 45가 결실된 DMD 환자의 경우, 엑손 43의 3' 말단에 상당하는 염기서열의 3' 측에 엑손 46의 5' 말단에 상당하는 염기서열이 연결되어, 코돈의 프레임 시프트가 일어나지 않은 성숙 mRNA가 형성되는 것을 의미한다.
따라서 본 발명의 올리고머는 인간 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44의 스키핑을 가능하게 하는 한, 각 타겟 서열(엑손 55, 45, 50 및 44)에 대해 100% 상보적인 염기서열을 가지고 있지 않아도 된다. 예를 들면 본 발명의 올리고머에는 타겟 서열에 대해 1~3개, 1~2개 또는 1개의 비상보적 염기가 포함되어 있어도 된다.
여기서 상기 「결합」은 본 발명의 올리고머와 인간 디스트로핀 유전자의 전사물을 혼합한 경우에 생리적 조건하에서 양자가 하이브리다이즈하여 이중가닥을 형성하는 것을 의미한다. 상기 「생리적 조건하」란 생체 내와 유사한 pH, 염 조성, 온도로 조절된 조건을 의미한다. 예를 들면 25~40℃, 바람직하게는 37℃, pH 5~8, 바람직하게는 pH 7.4이며, 염화나트륨 농도가 150 mM인 조건을 들 수 있다.
인간 디스트로핀 유전자의 엑손 55, 45, 50 및 44의 스키핑의 발생 여부는 디스트로핀 발현세포(예를 들면 인간 횡문근육종 세포)에 본 발명의 올리고머를 도입하고, 상기 디스트로핀 발현세포의 total RNA로부터 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA의 엑손 55, 45, 50 및 44의 주변영역을 RT-PCR 증폭하고, 그 PCT 증폭산물에 대해 nested PCR 또는 시퀀스 해석을 행함으로써 확인할 수 있다.
스키핑 효율은 인간 디스트로핀 유전자의 mRNA를 피검세포로부터 회수하여, 그 mRNA 중 엑손 55, 45, 50 및 44가 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 55, 45, 50 및 44가 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하고, 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로 아래의 식에 따라 계산할 수 있다.
Figure pct00013

본 발명의 올리고머로서는 예를 들면 18~28 염기의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 올리고머 또는 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid：PNA) 올리고머를 들 수 있다. 15~30 염기 또는 20~25 염기의 길이가 바람직하고, 모르폴리노 올리고머가 바람직하다.
상기 올리고뉴클레오티드(이하, 「본 발명의 올리고뉴클레오티드」라 한다)는 뉴클레오티드를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머로, 이러한 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식 뉴클레오티드 중 어느 것이어도 된다.
수식 뉴클레오티드란 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 구성하는 핵산 염기, 당부분 및 인산 결합부분의 전부 또는 일부가 수식되어 있는 것을 말한다.
핵산 염기로서는 예를 들면 아데닌, 구아닌, 히포크산틴, 시토신, 티민, 우라실 또는 그들의 수식 염기를 들 수 있다. 이러한 수식 염기로서는 예를 들면 슈도우라실, 3-메틸우라실, 디히드로우라실, 5-알킬시토신(예를 들면 5-메틸시토신), 5-알킬우라실(예를 들면 5-에틸우라실), 5-할로우라실(5-브로모우라실), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘(6-메틸우라실), 2-티오우라실, 4-티오우라실, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 1-메틸아데닌, 1-메틸히포크산틴, 2,2-디메틸구아닌, 3-메틸시토신, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메틸카르보닐메틸우라실, 5-메틸옥시우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시초산, 2-티오시토신, 퓨린, 2,6-디아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이소구아닌, 인돌, 이미다졸, 크산틴 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
당부분의 수식으로서는 예를 들면 리보오스의 2' 위치의 수식 및 당의 기타 부분의 수식을 들 수 있다. 리보오스의 2' 위치의 수식으로서는 예를 들면 리보오스의 2' 위치의 -OH기를 OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br, I로 치환하는 수식을 들 수 있다. 여기서 R은 알킬 또는 아릴을 나타낸다. R'는 알킬렌을 나타낸다.
당의 기타 부분의 수식으로서는 예를 들면 리보오스 또는 데옥시리보오스의 4' 위치의 O를 S로 치환한 것, 당의 2' 위치와 4' 위치를 가교한 것, 예를 들면 LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 ENA(2'-O,4'-C-Ethylene-bridged Nucleic Acids) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
인산 결합부분의 수식으로서는 예를 들면 포스포디에스테르 결합을 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합, 보라노포스페이트 결합(Enya et al：Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154-9160)으로 치환하는 수식을 들 수 있다(예를 들면 특허 재공표공보 제2006/129594호 및 제2006/038608호를 참조).
알킬로서는 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알킬이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, n-헥실, 이소헥실을 들 수 있다. 당해 알킬은 치환되어 있어도 되고, 이러한 치환기로서는 예를 들면 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1~3개 치환되어 있어도 된다.
시클로알킬로서는 탄소수 5~12의 시클로알킬이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로데실, 시클로도데실을 들 수 있다.
할로겐으로서는 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다.
알콕시로서는 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알콕시, 예를 들면 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, sec-부톡시, tert-부톡시, n-펜틸옥시, 이소펜틸옥시, n-헥실옥시, 이소헥실옥시 등을 들 수 있다. 특히, 탄소수 1~3의 알콕시가 바람직하다.
아릴로서는 탄소수 6~10의 아릴이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면 페닐, α-나프틸, β-나프틸을 들 수 있다. 특히 페닐이 바람직하다. 당해 아릴은 치환되어 있어도 되고, 이러한 치환기로서는 예를 들면 알킬, 할로겐, 알콕시, 시아노, 니트로를 들 수 있으며, 이들이 1~3개 치환되어 있어도 된다.
알킬렌으로서는 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1~6의 알킬렌이 바람직하다. 구체적으로는 예를 들면 메틸렌, 에틸렌, 트리메틸렌, 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 2-(에틸)트리메틸렌, 1-(메틸)테트라메틸렌을 들 수 있다.
아실로서는 직쇄상 또는 분지쇄상의 알카노일 또는 알로일을 들 수 있다. 알카노일로서는 예를 들면 포르밀, 아세틸, 2-메틸아세틸, 2,2-디메틸아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 펜타노일, 2,2-디메틸프로피오닐, 헥사노일 등을 들 수 있다. 알로일로서는 예를 들면 벤조일, 톨루오일, 나프토일을 들 수 있다. 이러한 알로일은 치환 가능한 위치에서 치환되어 있어도 되고, 알킬로 치환되어 있어도 된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 리보오스의 2' 위치의 -OH기가 메톡시로 치환되고, 인산 결합부분이 포스포로티오에이트 결합인, 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.
Figure pct00014
(식 중, Base는 핵산 염기를 나타낸다.)
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 각종 자동 합성장치(예를 들면 AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare))를 사용하여 용이하게 합성하는 것이 가능하고, 또는 제3자 기관(예를 들면 Promega사 또는 Takara사) 등에 위탁하여 제작하는 것도 가능하다.
본 발명의 모르폴리노 올리고머는 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.
Figure pct00015
(식 중, Base는 상기와 동일한 정의이고；
W는 다음 중 어느 하나의 식으로 표시되는 기를 나타낸다.
Figure pct00016
(식 중, X는 -CH2R1, -O-CH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 또는 F를 나타내고；
R1은 H, 알킬을 나타내며；
R2 및 R3는 동일 또는 상이하여 H, 알킬, 시클로알킬 또는 아릴을 나타내고；
Y1은 O, S, CH2 또는 NR1을 나타내며；
Y2는 O, S 또는 NR1을 나타내고；
Z는 O 또는 S를 나타낸다.))
모르폴리노 올리고머는 바람직하게는 아래의 식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 올리고머(포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(이하, 「PMO」라 한다))이다.
Figure pct00017
(식 중, Base, R2, R3는 상기와 동일한 정의이다.)
모르폴리노 올리고머는 예를 들면 국제공개공보 제1991/009033호 또는 국제공개공보 제2009/064471호에 따라 제조할 수 있다. 특히 PMO는 국제공개공보 제2009/064471호에 기재된 방법에 따라 제조하거나, 또는 아래에 나타내는 방법에 따라 제조할 수 있다.
[ PMO 의 제법]
PMO의 하나의 태양으로서, 예를 들면 다음의 화학식 I으로 표시되는 화합물(이하, PMO(I)이라 한다)를 들 수 있다.
Figure pct00018
[식 중, 각 Base, R2, R3는 상기와 동일한 정의이고；
n은 1~99의 범위 내에 있는 임의의 정수이며, 바람직하게는 18~28의 범위 내에 있는 임의의 정수이다.]
PMO(I)은 공지의 방법에 따라 제조할 수 있는데, 예를 들면 하기 공정의 조작을 실시함으로써 제조할 수 있다.
하기 공정에 사용되고 있는 화합물 및 시약은 PMO의 제조에 일반적으로 사용되고 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
또한 하기의 모든 공정은 액상법 또는 고상법(매뉴얼 또는 시판의 고상 자동합성기를 사용한다)으로 실시할 수 있다. 고상법으로 PMO를 제조하는 경우, 조작 순서의 간편화 및 합성의 정확성 관점에서 자동합성기를 사용하는 방법이 바람직하다.
(1) 공정 A：
다음의 화학식 II로 표시되는 화합물(이하, 화합물(II)라 한다.)에 산을 작용시킴으로써 다음의 화학식 III로 표시되는 화합물(이하, 화합물(III)라 한다.)을 제조하는 공정.
Figure pct00019
[식 중, n, R2, R3는 상기와 동일한 정의이고；
각 BP는 독립적으로 보호되어 있어도 되는 핵산 염기를 나타내며；
T는 트리틸기, 모노메톡시트리틸기 또는 디메톡시트리틸기를 나타내고；
L은 수소, 아실 또는 다음의 화학식 IV로 표시되는 기(이하, 기(IV)라 한다.)를 나타낸다.]
Figure pct00020
BP에 관계되는 「핵산 염기」로서는 Base와 동일한 「핵산 염기」를 들 수 있다. 단, BP에 관계되는 핵산 염기의 아미노기 또는 수산기는 보호되어 있어도 된다.
이러한 아미노기의 보호기로서는 핵산의 보호기로서 사용되는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 구체적으로는 예를 들면 벤조일, 4-메톡시벤조일, 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 이소부티릴, 페닐아세틸, 페녹시아세틸, 4-tert-부틸페녹시아세틸, 4-이소프로필페녹시아세틸, (디메틸아미노)메틸렌을 들 수 있다. 수산기의 보호기로서는 예를 들면 2-시아노에틸, 4-니트로페네틸, 페닐설포닐에틸, 메틸설포닐에틸, 트리메틸실릴에틸, 치환 가능한 임의의 위치에서 1~5개의 전자 흡인성기로 치환되어 있어도 되는 페닐, 디페닐카르바모일, 디메틸카르바모일, 디에틸카르바모일, 메틸페닐카르바모일, 1-피롤리디닐카르바모일, 모르폴리노카르바모일, 4-(tert-부틸카르복시)벤질, 4-[(디메틸아미노)카르복시]벤질, 4-(페닐카르복시)벤질을 들 수 있다(예를 들면 국제공개공보 제2009/064471호 공보 참조).
「고상 담체」로서는 핵산의 고상반응에 사용 가능한 담체라면 특별히 제한되지 않는데, 예를 들면 (i) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용 가능한 시약(예를 들면 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라졸, N-메틸이미다졸, 피리딘, 무수 초산, 루티딘, 트리플루오로초산)에 거의 용해되지 않고, (ii) 모르폴리노 핵산 유도체의 합성에 사용 가능한 시약에 대해 화학적으로 안정하며, (iii) 화학 수식 가능하고, (iv) 바람직한 모르폴리노 핵산 유도체의 장전이 가능하며, (v) 처리 중에 가해지는 고압에 견디는 충분한 강도를 갖고, (vi) 일정 입경 범위와 분포인 것이 바람직하다. 구체적으로는, 팽윤성 폴리스티렌(예를 들면 아미노메틸폴리스티렌 수지 1% 디벤질벤젠 가교(200~400 메시)(2.4~3.0 mmol/g)(도쿄 화성사 제조), Aminomethylated Polystyrene Resin·HCl[디벤질벤젠 1%, 100~200 메시](펩티드 연구소사 제조)), 비팽윤성 폴리스티렌(예를 들면 Primer Support(GE Healthcare사 제조)), PEG 사슬 결합형 폴리스티렌(예를 들면 NH2-PEG resin(와타나베 화학사 제조), TentaGel resin), 정공 유리(controlled pore glass；CPG)(예를 들면 CPG사 제조), 옥살릴화-정공 유리(예를 들면 Alul 등, Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527(1991)을 참조), TentaGel 지지체-아미노폴리에틸렌글리콜 유도체화 지지체(예를 들면 Wright 등, Tetrahedron Letters, Vol.34, 3373(1993)을 참조), Poros-폴리스티렌/디비닐벤젠의 코폴리머를 들 수 있다.
「링커」로서는 통상 핵산이나 모르폴리노 핵산 유도체를 연결하기 위해 사용되는 공지의 것을 사용할 수 있는데, 예를 들면 3-아미노프로필, 숙시닐, 2,2'-디에탄올설포닐, 장쇄 알킬 아미노(LCAA)를 들 수 있다.
본 공정은 화합물(II)에 산을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
본 공정에 사용 가능한 「산」으로서는 예를 들면 트리플루오로초산, 디클로로초산 또는 트리클로로초산을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는 예를 들면 화합물(II) 1몰에 대해 0.1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1몰 당량~100몰 당량의 범위 내이다.
또한 상기 산과 함께 유기 아민을 사용할 수 있다. 유기 아민으로서는 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 트리에틸아민을 들 수 있다. 유기 아민의 사용량은 예를 들면 산 1몰에 대해 0.01몰 당량~10몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 0.1몰 당량~2몰 당량의 범위 내이다.
본 공정에 있어서 산과 유기 아민의 염 또는 혼합물을 사용하는 경우에는 예를 들면 트리플루오로초산과 트리에틸아민의 염 또는 혼합물을 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 트리플루오로초산 2 당량에 대해 트리에틸아민 1 당량을 혼합한 것을 들 수 있다.
본 공정에 사용 가능한 산은 0.1%~30% 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석해서 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
상기 반응에 있어서의 반응온도는 예를 들면 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다.
반응시간은 사용하는 산의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하다. 바람직하게는 1분~5시간의 범위 내이다.
또한 본 공정이 종료된 후, 필요에 따라 계(系) 중에 존재하는 산을 중화하기 위해 염기를 첨가할 수 있다. 「염기」로서는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 디이소프로필아민을 들 수 있다. 염기는 0.1%(v/v)~30%(v/v) 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다.
본 공정에 사용하는 용매로서는 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 반응온도는 예를 들면 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다.
반응시간은 사용하는 염기의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~5시간의 범위 내이다.
또한 화합물(II)에 있어서, n=1이고, L이 기(IV)인, 다음의 화학식 IIa로 표시되는 화합물(이하, 화합물(IIa)라 한다)은, 아래의 방법에 따라 제조할 수 있다.
Figure pct00021
[식 중, BP, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이다.]
공정 1：
다음의 화학식 V로 표시되는 화합물에 아실화제를 작용시킴으로써 다음의 화학식 VI로 표시되는 화합물(이하, 화합물(VI)라 한다.)을 제조하는 공정.
Figure pct00022
[식 중, BP, T, 링커는 상기와 동일한 정의이고；
R4는 수산기, 할로겐 또는 아미노를 나타낸다.]
본 공정은 화합물(V)를 출발원료로 하여, 공지의 링커의 도입 반응에 의해 실시할 수 있다.
특히, 다음의 화학식 VIa로 표시되는 화합물은, 화합물(V)와 무수 숙신산을 사용하여 에스테르화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00023
[식 중, BP, T는 상기와 동일한 정의이다.]
공정 2：
화합물(VI)에 축합제 등을 작용시킴으로써 고상 담체와 반응시켜, 화합물(IIa)를 제조하는 공정.
Figure pct00024
[식 중, BP, R4, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이다.]
본 공정은 화합물(VI)와 고상 담체를 사용하여 축합 반응으로서 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다.
화합물(II)에 있어서, n=2~99이고, L이 기(IV)인, 다음의 화학식 IIa2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIa)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복하여 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00025
[식 중, BP, R2, R3, T, 링커, 고상 담체는 상기와 동일한 정의이고；
n'는 1~98을 나타낸다.]
또한 화합물(II)에 있어서, n=1이고, L이 수소인, 다음의 화학식 IIb로 표시되는 화합물은 예를 들면 국제공개공보 제1991/009033호에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다.
Figure pct00026
[식 중, BP, T는 상기와 동일한 정의이다.]
화합물(II)에 있어서, n=2~99이고, L이 수소인, 다음의 화학식 IIb2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIb)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복해서 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00027
[식 중, BP, n', R2, R3, T는 상기와 동일한 정의이다.]
또한 화합물(II)에 있어서 n=1이고, L이 아실인, 다음의 화학식 IIc로 표시되는 화합물은, 화합물(IIb)에 대해 아실화 반응으로서 알려진 방법을 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00028
[식 중, BP, T는 상기와 동일한 정의이고；
R5는 아실을 나타낸다.]
화합물(II)에 있어서 n=2~99이고, L이 아실인, 다음의 화학식 IIc2로 표시되는 화합물은, 화합물(IIc)를 출발 원료로 하여, 본 명세서에 기재된 PMO의 제법에 관계되는 공정 A 및 공정 B를 목적하는 횟수 반복해서 실시함으로써 제조할 수 있다.
Figure pct00029
[식 중, BP, n', R2, R3, R5, T는 상기와 동일한 정의이다.]
(2) 공정 B：
화합물(III)에 염기 존재하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써, 다음의 화학식 VII으로 표시되는 화합물(이하, 화합물(VII)이라 한다.)을 제조하는 공정.
Figure pct00030
[식 중, 각 BP, L, n, R2, R3, T는 상기와 동일한 정의이다.]
본 공정은 화합물(III)에 염기 존재하에 모르폴리노 모노머 화합물을 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
모르폴리노 모노머 화합물로서는 예를 들면 다음의 화학식 VIII으로 표시되는 화합물을 들 수 있다.
Figure pct00031
[식 중, BP, R2, R3, T는 상기와 동일한 정의이다.]
본 공정에 사용 가능한 「염기」로서는 예를 들면 디이소프로필아민, 트리에틸아민 또는 N-에틸모르폴린을 들 수 있다. 염기의 사용량으로서는 예를 들면 화합물(III) 1몰에 대해 1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 10몰 당량~100몰 당량의 범위 내이다.
본 공정에 사용 가능한 모르폴리노 모노머 화합물 및 염기는 0.1%~30%의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈, DMF, 디클로로메탄, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
반응온도는 예를 들면 0℃~100℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10℃~50℃의 범위 내이다.
반응시간은 사용하는 염기의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 1분~48시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 30분~24시간의 범위 내이다.
또한 본 공정의 종료 후, 필요에 따라 아실화제를 첨가할 수 있다. 「아실화제」로서는 예를 들면 무수 초산, 초산 클로라이드, 페녹시초산 무수물을 들 수 있다. 아실화제는 예를 들면 0.1%~30% 범위 내의 농도가 되도록 적당한 용매로 희석하여 사용하는 것도 가능하다. 용매로서는 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 디클로로메탄, 아세토니트릴, 알코올류(에탄올, 이소프로판올, 트리플루오로에탄올 등), 물 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
또한 필요하다면 아실화제와 함께 예를 들면 피리딘, 루티딘, 콜리딘, 트리에틸아민, 디이소프로필에틸아민, N-에틸모르폴린 등의 염기를 사용할 수 있다. 아실화제의 사용량으로서는 0.1몰 당량~10000몰 당량의 범위 내가 바람직하고, 1몰 당량~1000몰 당량의 범위 내가 보다 바람직하다. 염기의 사용량으로서는 예를 들면 아실화제 1몰에 대해 0.1몰 당량~100몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1몰 당량~10몰 당량의 범위 내이다.
본 반응의 반응온도는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하며, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이고, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다. 반응시간은 예를 들면 사용하는 아실화제의 종류, 반응온도에 따라 상이하나, 통상 0.1분~24시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~5시간의 범위 내이다.
(3) 공정 C：
공정 B에 있어서 제조되는 화합물(VII)에 있어서 탈보호제를 사용하여 보호기를 탈리해서, 화학식 IX로 표시되는 화합물을 제조하는 공정.
Figure pct00032
[식 중, Base, BP, L, n, R2, R3, T는 상기와 동일한 정의이다.]
본 공정은 화합물(VII)에 탈보호제를 작용시킴으로써 실시할 수 있다.
「탈보호제」로서는 예를 들면 농암모니아수, 메틸아민을 들 수 있다. 본 공정에 사용 가능한 「탈보호제」는 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, DMF, N,N-디메틸이미다졸리돈, N-메틸피페리돈 또는 이들의 혼합용매로 희석해서 사용하는 것도 가능하다. 그 중에서도 에탄올이 바람직하다. 탈보호제의 사용량으로서는 화합물(VII) 1몰에 대해 예를 들면 1몰 당량~100000몰 당량의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 10몰 당량~1000몰 당량의 범위 내이다.
반응온도는 예를 들면 15℃~75℃의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 40℃~70℃의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 50℃~60℃의 범위 내이다. 탈보호 반응시간은 화합물(VII)의 종류, 반응온도 등에 따라 상이하나, 10분~30시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 30분~24시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 5시간~20시간의 범위 내이다.
(4) 공정 D：
공정 C에 있어서 제조되는 화합물(IX)에 산을 작용시킴으로써 PMO(I)을 제조하는 공정.
Figure pct00033
[식 중, Base, n, R2, R3, T는 상기와 동일한 정의이다.]
본 공정은 화합물(IX)에 산을 첨가함으로써 실시할 수 있다.
본 공정에 있어서 사용 가능한 「산」으로서는 예를 들면 트리클로로초산, 디클로로초산, 초산, 인산 및 염산 등을 들 수 있다. 산의 사용량으로서는 예를 들면 용액의 pH가 0.1~4.0의 범위 내가 되도록 사용하는 것이 적당하고, 보다 바람직하게는 1.0~3.0의 범위 내가 되도록 사용한다. 용매로서는 반응에 관여하지 않는다면 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 아세토니트릴, 물 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
반응온도는 10℃~50℃의 범위 내가 바람직하고, 보다 바람직하게는 20℃~40℃의 범위 내이며, 더욱 바람직하게는 25℃~35℃의 범위 내이다. 탈보호 반응시간은 화합물(IX)의 종류, 반응온도 등에 따라 상이하나, 0.1분~5시간의 범위 내가 적당하고, 바람직하게는 1분~1시간의 범위 내이며, 보다 바람직하게는 1분~30분의 범위 내이다.
PMO(I)은 본 공정에서 얻어진 반응 혼합물로부터 통상의 분리정제수단, 예를 들면 추출, 농축, 중화, 여과, 원심분리, 재결정, C8~C18의 역상 칼럼크로마토그래피, 양이온 교환 칼럼크로마토그래피, 음이온 교환 칼럼크로마토그래피, 겔 여과 칼럼크로마토그래피, 고속 액체크로마토그래피, 투석, 한계 여과 등의 수단을 단독 또는 조합해서 사용함으로써 얻을 수 있어, 목적하는 PMO(I)을 단리 정제할 수 있다(예를 들면 국제공개공보 WO1991/09033을 참조).
역상 크로마토그래피를 사용하여 PMO(I)을 정제하는 경우에는, 용출 용매로서, 예를 들면 20 mM의 트리에틸아민/초산 완충액과 아세토니트릴의 혼합용액을 사용할 수 있다.
또한 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 PMO(I)을 정제하는 경우에는 예를 들면 1 M의 식염수와 10 mM의 수산화나트륨 수용액의 혼합용액을 사용할 수 있다.
펩티드 핵산은 하기 화학식으로 표시되는 기를 구성 단위로 하는 본 발명의 올리고머이다.
Figure pct00034
(식 중, Base는 상기와 동일한 정의이다.)
펩티드 핵산은 예를 들면 아래의 문헌에 따라 제조할 수 있다.
1) P. E. Nielsen M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497(1991)
2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895(1992)
3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767(1994)
4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175(1995)
5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80(1997)
또한 본 발명의 올리고머는 5' 말단이 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 기여도 된다. 바람직하게는 (3)-OH이다.
Figure pct00035
이하, 상기 (1), (2) 및 (3)으로 나타내어지는 기를 각각 「기(1)」, 「기(2)」 및 「기(3)」이라 부른다.
2. 의약 조성물
본 발명의 올리고머는 종래 기술에 관계되는 안티센스 올리고머와 비교하여 고효율로 엑손 55, 45, 50 및 44의 스키핑을 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 올리고머를 포함하는 의약 조성물을 DMD 환자에게 투여함으로써 고효율로 근이영양증의 증상을 완화할 수 있는 것으로 예측된다. 예를 들면 본 발명의 올리고머를 포함하는 의약 조성물을 사용하는 경우, 종래 기술에 관계되는 올리고머에 비해 소량의 투여량으로도 동일 정도의 치료효과를 얻을 수 있기 때문에, 부작용을 경감할 수 있고 또한 경제적이다.
이에 다른 실시태양으로서 본 발명의 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는, 근이영양증 치료용 의약 조성물(이하, 「본 발명의 조성물」이라 한다)을 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머의 의약적으로 허용 가능한 염의 예로서는 나트륨염, 칼륨염, 리튬염과 같은 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염과 같은 알칼리토류금속염；알루미늄염, 철염, 아연염, 구리염, 니켈염, 코발트염 등의 금속염；암모늄염；t-옥틸아민염, 디벤질아민염, 모르폴린염, 글루코사민염, 페닐글리신알킬에스테르염, 에틸렌디아민염, N-메틸글루카민염, 구아니딘염, 디에틸아민염, 트리에틸아민염, 디시클로헥실아민염, N,N'-디벤질에틸렌디아민염, 클로로프로카인염, 프로카인염, 디에탄올아민염, N-벤질-페네틸아민염, 피페라진염, 테트라메틸암모늄염, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄염과 같은 유기 아민염；플루오르화 수소산염, 염산염, 브롬화 수소산염, 요오드화 수소산염과 같은 할로겐화 수소산염；질산염, 과염소산염, 황산염, 인산염 등의 무기산염；메탄설폰산염, 트리플루오로메탄설폰산염, 에탄설폰산염과 같은 저급 알칸설폰산염；벤젠설폰산염, p-톨루엔설폰산염과 같은 아릴설폰산염；초산염, 말산염, 푸마르산염, 숙신산염, 구연산염, 타르타르산염, 옥살산염, 말레산염 등의 유기산염；글리신염, 리신염, 아르기닌염, 오르니틴염, 글루타민산염, 아스파라긴산염과 같은 아미노산염 등을 들 수 있다. 이들 염은 공지의 방법으로 제조할 수 있다. 또는 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머는 그의 수화물의 형태에 있어도 된다.
본 발명의 조성물의 투여형태는 의약적으로 허용 가능한 투여형태라면 특별히 제한되지 않고, 치료방법에 따라 선택할 수 있으나, 근조직으로의 송달 용이성의 관점에서 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 조직내 투여, 경피 투여 등이 바람직하고, 또한 본 발명의 조성물이 취할 수 있는 제형으로서는 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 각종 주사제, 경구제, 점적제, 흡입제, 연고제, 로션제 등을 들 수 있다.
본 발명의 올리고머를 근이영양증 환자에게 투여하는 경우, 본 발명의 조성물은 그 올리고머의 근조직으로의 송달을 촉진하는 담체를 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 담체는 의약적으로 허용 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 그 예로서, 양이온성 리포솜, 양이온성 폴리머 등의 양이온성 담체 또는 바이러스 엔벨로프를 이용한 담체를 들 수 있다. 양이온성 리포솜으로서는 예를 들면 2-O-(2-디에틸아미노에틸)카르바모일-1,3-O-디올레오일글리세롤과 인지질을 필수 구성성분으로서 형성되는 리포솜(이하, 「리포솜 A」라 한다), 올리고펙트아민(등록상표)(Invitrogen사 제조), 리포펙틴(등록상표)(Invitrogen사 제조), 리포펙트아민(등록상표)(Invitrogen사 제조), Lipofectamine 2000(등록상표)(Invitrogen사 제조), DMRIE-C(등록상표)(Invitrogen사 제조), GeneSilencer(등록상표)(Gene Therapy Systems사 제조), TransMessenger(등록상표)(QIAGEN사 제조), TransIT TKO(등록상표)(Mirus사 제조), Nucleofector II(Lonza)를 들 수 있다. 그들 중에서 리포솜 A가 바람직하다. 양이온성 폴리머로서는 예를 들면 JetSI(등록상표)(Qbiogene사 제조), Jet-PEI(등록상표)(폴리에틸렌이민, Qbiogene사 제조)를 들 수 있다. 바이러스 엔벨로프를 이용한 담체로서는 예를 들면 GenomeOne(등록상표)(HVJ-E 리포솜, 이시하라 산업사 제조)을 들 수 있다. 또는 일본국 특허 제2924179호에 기재된 의약 디바이스, 일본국 특허 재공표 공보 제2006/129594호 및 일본국 특허 재공표 공보 제2008/096690호에 기재된 양이온성 담체를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머의 농도는 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1 nM~100 μM의 범위 내가 적당하고, 1 nM~10 μM의 범위 내가 바람직하며, 10 nM~1 μM의 범위 내가 보다 바람직하다. 또한 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 올리고머와 담체의 중량비(담체/본 발명의 올리고머)는 그 올리고머의 성질 및 그 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1~100의 범위 내가 적당하고, 1~50의 범위 내가 바람직하며, 10~20의 범위 내가 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물에는 본 발명의 올리고머와 전술한 담체 이외에 임의로 의약적으로 허용 가능한 첨가제를 배합할 수 있다. 이러한 첨가제로서 예를 들면 유화 보조제(예를 들면 탄소수 6~22의 지방산이나 그의 의약적으로 허용 가능한 염, 알부민, 덱스트란), 안정화제(예를 들면 콜레스테롤, 포스파티딘산), 등장화제(예를 들면 염화나트륨, 글루코오스, 말토오스, 락토오스, 수크로오스, 트레할로오스), pH 조정제(예를 들면 염산, 황산, 인산, 초산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민)를 들 수 있다. 이들을 1종 또는 2종 이상 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물 중의 당해 첨가제의 함유량은 90 중량% 이하가 적당하고, 70 중량% 이하가 바람직하며, 50 중량% 이하가 보다 바람직하다.
본 발명의 조성물은 담체의 분산액에 본 발명의 올리고머를 첨가하고, 적당히 교반함으로써 조제할 수 있다. 또한 첨가제는 본 발명의 올리고머의 첨가 전에도 첨가 후에도 적당한 공정에서 첨가할 수 있다. 본 발명의 올리고머를 첨가시킬 때 사용할 수 있는 수성 용매로서는 의약적으로 허용 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 주사용수, 주사용 증류수, 생리식염수 등의 전해질액, 포도당액, 말토오스액 등의 당액을 들 수 있다. 또한 이러한 경우의 pH 및 온도 등의 조건은 당업자가 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물은 예를 들면 액제나 그의 동결건조제제로 할 수 있다. 당해 동결건조제제는 통상의 방법으로, 액제의 형태를 가지고 있는 본 발명의 조성물을 동결건조처리함으로써 조제할 수 있다. 예를 들면 액제의 형태를 가지고 있는 본 발명의 조성물을 적당한 멸균을 행한 후 소정량을 바이알병에 분주하고, 약 -40~-20℃의 조건에서 예비 동결을 2시간 정도 행하여, 약 0~10℃에서 감압하에 1차 건조를 행하고, 이어서 약 15~25℃에서 감압하에 2차 건조하여 동결건조할 수 있다. 그리고 일반적으로는 바이알 내부를 질소가스로 치환하고, 타전(打栓)하여 본 발명의 조성물의 동결건조제제를 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물의 동결건조제제는 일반적으로는 임의의 적당한 용액(재용해액)의 첨가에 의해 재용해해서 사용할 수 있다. 이러한 재용해액으로서는 주사용수, 생리식염수, 기타 일반 수액을 들 수 있다. 이 재용해액의 액량은 용도 등에 따라 상이하여 특별히 제한되지 않으나, 동결건조 전의 액량의 0.5~2배량 또는 500 mL 이하가 적당하다.
본 발명의 조성물을 투여할 때의 용량으로서는 함유되는 본 발명의 올리고머의 종류, 제형, 연령이나 체중 등의 환자의 상태, 투여 경로, 질환의 성질과 정도를 고려하여 조제하는 것이 바람직하나, 성인에 대해 본 발명의 올리고머의 양으로서 1일당 0.1 ㎎~10 g/인간의 범위 내가, 바람직하게는 1 ㎎~1 g/인간의 범위 내가 일반적이다. 이 수치는 표적으로 하는 질환의 종류, 투여 형태, 표적 분자에 따라서도 상이한 경우가 있다. 따라서, 경우에 따라서는 이 이하여도 충분하고, 또한 반대로 이 이상의 용량을 필요로 하는 때도 있다. 또한 1일 1회 내지 수회의 투여 또는 1일 내지 수일 간의 간격으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 다른 태양으로서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 벡터와 전술한 담체를 포함하는 의약 조성물을 들 수 있다. 이러한 발현 벡터는 복수의 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 발현 가능한 것이어도 된다. 당해 조성물에는 본 발명의 올리고머를 함유하는 본 발명의 조성물과 마찬가지로 의약적으로 허용 가능한 첨가제를 첨가할 수 있다. 당해 조성물 중에 포함되는 발현 벡터의 농도는 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1 nM~100 μM의 범위 내가 적당하고, 1 nM~10 μM의 범위 내가 바람직하며, 10 nM~1 μM의 범위 내가 보다 바람직하다. 당해 조성물 중에 포함되는 발현 벡터와 담체의 중량비(담체/발현 벡터)는 발현 벡터의 성질, 담체의 종류 등에 따라 상이하나, 0.1~100의 범위 내가 적당하고, 1~50의 범위 내가 바람직하며, 10~20의 범위 내가 보다 바람직하다. 또한 당해 조성물 중에 포함되는 담체의 함유량은 본 발명의 올리고머를 함유하는 본 발명의 조성물의 경우와 동일하고, 그 조제방법 등에 관해서도 본 발명의 조성물의 경우와 동일하다.
실시예
아래에 실시예 및 시험예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하나, 본 발명은 실시예에 나타내어지는 범위에 한정되는 것은 아니다.
[참고예 1]
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4- 벤즈아미드 -2- 옥소피리미딘 -1-일)-4- 트리틸모르폴린 -2-일] 메톡시 }-4- 옥소부탄산
공정 1：4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산의 제조
아르곤 분위기하, N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 3.44 g과 4-디메틸아미노피리딘(4-DMAP) 1.1 g을 디클로로메탄 50 mL에 현탁하고, 무수 숙신산 0.90 g을 첨가하여, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 10 mL를 첨가하고, 감압 농축하였다. 잔사에 초산에틸과 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액을 사용하여 추출 조작을 행하였다. 얻어진 유기층을 0.5 M의 인산이수소칼륨 수용액, 물, 포화식염수의 순으로 세정하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조하고, 감압 농축하여, 4.0 g의 목적물을 얻었다.
공정 2：아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산의 제조
4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산 4.0 g을 피리딘(탈수) 200 mL에 용해하고, 4-DMAP 0.73 g, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염 11.5 g을 첨가하였다. 이어서 아미노폴리스티렌 수지 Primer support 200 amino(GE Healthcare Japan사 제조, 17-5214-97) 25.0 g, 트리에틸아민 8.5 mL를 첨가하고, 실온에서 4일간 진탕하였다. 반응 후, 수지를 여과하여 모았다. 얻어진 수지를 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하였다. 얻어진 수지에 테트라히드로푸란(탈수) 200 mL, 무수 초산 15 mL, 2,6-루티딘 15 mL를 첨가하고, 실온에서 2시간 진탕하였다. 수지를 여과하여 모아 피리딘, 메탄올, 디클로로메탄의 순으로 세정하고, 감압 건조하여 26.7 g의 목적물을 얻었다.
당해 목적물의 로딩량은 공지의 방법을 사용하여 수지 1 g당 트리틸의 몰량을 409 ㎚에 있어서의 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 수지의 로딩량은 129.2 μmol/g이었다.
UV 측정조건
기기：U-2910(히타치 제작소)
용매：메탄설폰산
파장：265 ㎚
ε값：45000
[참고예 2]
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2- 시아노에톡시 )-2-[(2-페 녹시아 세틸)아미노]퓨린-9-일]-4- 트리틸모르폴린 -2-일] 메톡시 ]-4-옥소-부탄산
공정 1：N2-(페녹시아세틸)구아노신의 제조
구아노신 100 g을 80℃에서 감압하 24시간 건조하였다. 피리딘(탈수) 500 mL, 디클로로메탄(탈수) 500 mL를 첨가하고, 아르곤 분위기하, 0℃에서 클로로트리메틸실란 401 mL를 적하하고 실온에서 3시간 교반하였다. 재차 빙랭하고, 페녹시아세틸 클로라이드 66.3 g을 적하하여, 빙랭하 추가로 3시간 교반하였다. 반응액에 메탄올 500 mL를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반 후, 감압하 용매를 증류 제거하였다. 잔사에 메탄올 500 mL를 첨가하고, 감압하 농축하는 것을 3회 행하였다. 잔사에 물 4 L를 첨가하여 빙랭하 1시간 교반하고, 석출물을 여과하여 모았다. 이것을 물, 이어서 냉메탄올로 세정하고, 건조하여 목적 화합물을 150.2 g 얻었다(수율：102%)(참고：Org. Lett. (2004), Vol. 6, No.15, 2555-2557).
공정 2：N9-{[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-모르폴린-2-일]-6-옥소-6,9-디히드로-1H-퓨린-2-일}-2-페녹시아세트아미드 p-톨루엔설폰산염
공정 1에서 얻어진 화합물 30 g을 메탄올 480 mL에 현탁하고, 빙랭하 2 N 염산 130 mL를 첨가하였다. 이어서 4붕산암모늄 4수화물 56.8 g, 과요오드산나트륨16.2 g을 이 순으로 첨가하고, 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액을 빙랭하고, 불용물을 여과하여 제거해서, 이것을 메탄올 100 mL로 세정하였다. 여액과 세정액을 합하여 빙랭하고, 2-피콜린보란 11.52 g을 첨가하여 20분간 교반 후, p-톨루엔설폰산·1수화물 54.6 g을 천천히 첨가하여, 4℃에서 밤새 교반하였다. 석출물을 여과하여 모으고, 냉메탄올 500 mL로 세정 후, 건조하여 목적 화합물을 17.7 g 얻었다(수율：43.3%).
Figure pct00036

공정 3：N9-{(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일}-N2-(페녹시아세틸)구아닌의 제조
공정 2에서 얻어진 화합물 2.0 g을 디클로로메탄(30 ㎖)에 현탁하고, 빙랭하 트리에틸아민(13.9 g), 트리틸 클로라이드(18.3 g)를 첨가하여, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 포화중조수, 이어서 물로 세정 후, 유기층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조하고, 유기층을 감압 농축하였다. 잔사에 0.2 M 구연산나트륨 완충액(pH 3)/메탄올(1：4(v/v), 40 ㎖)을 첨가하여 교반하고, 이어서 물(40 ㎖)을 첨가하여 빙랭하 1시간 교반하였다(현탁상태). 이것을 여과하여 모아 냉메탄올로 세정하고, 건조하여 목적 화합물을 1.84 g 얻었다(수율：82.0%).
공정 4：N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)구아닌의 제조
공정 3에서 얻어진 화합물(38.3 g)을 디클로로메탄(300 mL)에 용해하고, 빙랭하 이미다졸(4.64 g), t-부틸디메틸실릴 클로라이드(9.47 g)를 이 순으로 첨가하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 0.2 M 구연산나트륨 완충액(pH 3), 이어서 포화식염수로 세정 후, 유기층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조하고, 유기층을 감압 농축하여 목적 화합물을 조생성물(粗生成物)로서 44.1 g을 얻었다.
공정 5：N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-트리이소프로필벤젠설포닐구아닌의 제조
공정 4에서 얻어진 화합물(44.1 g)을 디클로로메탄(300 mL)에 용해하고, 빙랭하 4-디메틸아미노피리딘(0.64 g), 트리에틸아민(29.2 mL), 트리이소프로필벤젠설포닐 클로라이드(19.0 g)를 첨가하여 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 1 M 인산이수소나트륨 수용액으로 세정 후, 유기층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조하고, 유기층을 감압 농축하여 목적 화합물을 조생성물로서 60.5 g을 얻었다.
공정 6： N9-[(2R,6S)-6-{(tert-부틸디메틸실릴옥시)메틸}-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌의 제조
공정 5에서 얻어진 화합물(60.5 g)을 디클로로메탄(300 mL)에 용해하고, 빙랭하 N-메틸피롤리딘(54.5 mL)을 첨가하여 1시간 교반하였다. 반응액에 에틸렌시아노히드린(37.2 g), 이어서 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔(11.96 g)을 첨가하여 빙랭하 추가로 2시간 교반하였다. 반응액을 1 M 인산이수소나트륨 수용액, 이어서 물로 세정 후, 유기층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조하고, 유기층을 감압 농축하여 목적 화합물을 조생성물로서 72.4 g을 얻었다.
공정 7：N9-[(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌의 제조
공정 6에서 얻어진 화합물(72.4 g)을 디클로로메탄(300 mL)에 용해하고, 트리에틸아민트리히드로 플루오라이드(21.1 g)를 첨가하여 실온에서 17시간 교반하였다. 반응액을 냉포화중조수에 붓고, 중화 후 디클로로메탄층을 회수하여 황산마그네슘으로 건조하고, 감압 농축하였다. 잔사를 실리카겔 칼럼크로마토그래피(PSQ100B(후지 실리시아 화학 주식회사 제조, 이하 동일.))에 의해 정제하여, 목적 화합물을 14.3 g 얻었다(공정 4로부터의 수율：39.2%).
공정 8：아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산의 제조
참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는 N9-[(2R,6S)-6-히드록시메틸-4-트리틸모르폴린-2-일]-N2-(페녹시아세틸)-O6-(2-시아노에틸)구아닌을 사용하였다.
[참고예 3]
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(5- 메틸 -2,4- 디옥소 -3,4-디히드로피리미딘-1-일)-4- 트리틸모르폴린 -2-일] 메톡시 }-4- 옥소부탄산
참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는 1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-5-메틸피리미딘-2,4(1H,3H)-디온을 사용하였다.
[참고예 4]
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6- 벤즈아미드퓨린 -9-일)-4- 트리틸모르폴린 -2-일] 메톡시 }-4- 옥소부탄산
참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는 N-{9-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]퓨린-6-일}벤즈아미드를 사용하였다.
[참고예 5]
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 1,12- 디옥소 -1-(4- 트리틸피페라진 -1-일)-2,5,8,11- 테트라옥사 -15- 펜타데칸산
참고예 1과 동일한 방법으로 표기 화합물을 제조하였다. 단, 참고예 1의 공정 1에서 사용한 N-{1-[(2R,6S)-6-(히드록시메틸)-4-트리틸모르폴린-2-일]-2-옥소-1,2-디히드로피리미딘-4-일}벤즈아미드 대신에, 본 공정에서는 2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에틸 4-트리틸피페라진-1-카르복실산(국제공개공보 제2009/064471호에 기재된 화합물)을 사용하였다.
엑손 45에 대해서
아래의 실시예 1~8 및 비교예 1의 기재에 따라, 표 5의 PMO No.1~6 및 8~10에 나타내는 각종 PMO를 합성하였다. 합성한 PMO를 주사용수(오츠카 제약 공장사 제조)로 용해하였다. 또한 PMO No.7은 진 툴즈사로부터 구입하였다.
Figure pct00037
[실시예 1]
PMO No.1
아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(4-벤즈아미드-2-옥소피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 1) 0.2 g(26 μmol)을 필터 부착 칼럼에 충전하고, 핵산 합성기(AKTA Oligopilot 10 plus)를 사용하여, 하기 합성 사이클을 개시하였다. 표기 화합물의 염기서열이 되도록 각 커플링 사이클에 있어서 목적하는 모르폴리노 모노머 화합물을 첨가하였다.
Figure pct00038
또한 디블로킹 용액으로서는 3%(w/v) 트리플루오로초산을 함유하는 디클로로메탄 용액을 사용하였다. 중화·세정 용액으로서는 N,N-디이소프로필에틸아민을 10%(v/v)가 되도록, 또한 테트라히드로푸란을 5%(v/v)가 되도록, 35%(v/v)의 아세토니트릴 함유하는 디클로로메탄 용액으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 A로서는 모르폴리노 모노머 화합물을 0.10 M이 되도록 테트라히드로푸란으로 용해한 것을 사용하였다. 커플링 용액 B로서는 N,N-디이소프로필에틸아민을 20%(v/v)가 되도록, 또한 테트라히드로푸란을 10%(v/v)가 되도록, 아세토니트릴로 용해한 것을 사용하였다. 캡핑 용액으로서는 아세토니트릴에 대해 20%(v/v)의 무수 초산과 30%(v/v)의 2,6-루티딘을 용해한 것을 사용하였다.
상기에서 합성한 PMO가 담지된 아미노폴리스티렌 수지를 반응 용기로부터 회수하여 2시간 이상 실온에서 감압 건조하였다. 건조한 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 PMO를 반응 용기에 넣고, 28% 암모니아수-에탄올(1/4) 5 mL를 첨가하여, 55℃에서 15시간 교반하였다. 아미노폴리스티렌 수지를 여과 분별하고, 물-에탄올(1/4) 1 mL로 세정하였다. 얻어진 여액을 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 20 mM의 초산-트리에틸아민 완충액(TEAA 완충액)과 아세토니트릴의 혼합용매(4/1) 10 mL에 용해하고, 멤브레인 필터로 여과하였다. 얻어진 여액을 역상 HPLC로 정제하였다. 사용한 조건은 아래와 같다.
Figure pct00039
각 프랙션을 분석하여 목적물을 회수하고 감압 농축하였다. 농축 잔사에 2 M의 인산 수용액 0.5 mL를 첨가하고, 15분간 교반하였다. 추가로 2 M의 수산화나트륨 수용액 2 mL를 첨가하여 알칼리성으로 하고, 멤브레인 필터(0.45 ㎛)로 여과하였다.
얻어진 목적물을 함유하는 수용액을 음이온 교환 수지 칼럼으로 정제하였다. 사용한 조건은 하기와 같다.
Figure pct00040
각 프랙션을 분석(HPLC)하여 목적물을 수용액으로서 얻었다. 얻어진 수용액에 0.1 M의 인산 완충액(pH 6.0)을 첨가하여 중화하였다. 이어서 하기 조건으로 역상 HPLC로 탈염하였다.
Figure pct00041
목적물을 회수하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 물에 녹이고 동결건조하여, 백색 면상(綿狀) 고체로서 1.5 ㎎의 목적 화합물을 얻었다.
ESI-TOF-MS 계산값：6877.8
측정값：6877.4
[실시예 2]
PMO . No.3
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6862.8
측정값：6862.5
[실시예 3]
PMO . No.2
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6862.8
측정값：6862.3
[실시예 4]
PMO . No.4
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6902.8
측정값：6902.3
[실시예 5]
PMO. No.5
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6902.8
측정값：6902.4
[실시예 6]
PMO . No.8
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6547.5
측정값：6547.2
[실시예 7]
PMO . No.9
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6547.5
측정값：6547.2
[실시예 8]
PMO . No.10
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산(참고예 5)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：7214.1
측정값：7213.7
[비교예 1]
PMO . No.6
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：8193.9
측정값：8195.3
[시험예 1]
In vitro 어세이
서열번호 19~35에 기재된 2'-O-메톡시-포스포로티오에이트체(2'-OMe-S-RNA)의 안티센스 올리고머를 사용하여 실험을 행하였다. 어세이에 사용한 각종 안티센스 올리고머는 일본 바이오서비스사로부터 구입하였다. 각종 안티센스 올리고머의 서열을 아래에 나타낸다.
Figure pct00042
RD세포(인간 횡문근육종 세포주) 1×105개를 12웰 플레이트에 파종하고, 10% 소 태아 혈청(FCS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 Eagle's minimal essential medium(EMEM)배지(시그마사 제조, 이하 동일) 1 mL 중, 37℃, 5% CO2 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 상기 엑손 45 스키핑용의 각종 안티센스 올리고머(일본 바이오서비스사 제조)(0.3 또는 1 μM)와 Lipofectamine 2000(인비트로젠사 제조)의 복합체를 제작하여, 0.9 mL로 배지 교환한 RD세포에 100 ㎕ 첨가하고, 종농도 30 또는 100 nM로 하였다.
첨가 후 하룻밤 배양하였다. 세포를 PBS(닛스이사 제조, 이하 동일)로 2회 세정한 후, ISOGEN(닛폰 진사 제조) 250 ㎕를 세포에 첨가하고, 수 분간 실온에 방치하여 세포를 용해시켜, 그 용해물을 Eppendorf 튜브에 회수하였다. ISOGEN에 첨부된 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000(엘·엠·에스사 제조)을 사용해서 측정하였다.
추출한 total RNA 400 ng에 대해 QIAGEN OneStep RT-PCR Kit를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 PTC-100(MJ Research사 제조)을 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은 아래와 같다.
50℃, 30분간：역전사반응
95℃, 15분간：열변성
[94℃, 30초간；60℃, 30초간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭
72℃, 10분간：
RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 아래와 같다.
Figure pct00043

상기 PCR의 반응산물 1 ㎕를 Bioanalyzer(아질렌트사 제조)를 사용해서 해석하였다.
엑손 45가 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 45가 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로 아래의 식에 따라서 스키핑 효율을 구하였다.
Figure pct00044

실험결과
결과를 도 1, 2에 나타낸다. 본 실험에 의해 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제1~25번째 또는 제6~30번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우, 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제7~31번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우와 비교하여 높은 효율로 엑손 45를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
[시험예 2]
In vitro 어세이
RD세포(인간 횡문근육종 세포주) 3.5×105개에 대해 PMO No.1~5 및 8~10의 본 발명의 올리고머 및 PMO No.6 및 7의 안티센스 올리고머를 1, 3, 10 μM씩 Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L을 사용하여 Nucleofector II(Lonza)에 의해 도입하였다. 프로그램은 T-030을 사용하였다.
도입 후, 세포를 10% 소 태아 혈청(FCS)(인비트로젠사 제조)을 포함하는 Eagle's minimal essential medium(EMEM)배지(시그마사 제조, 이하 동일.) 2 mL 중, 37℃, 5% CO2 조건하에서 3일간 배양하였다. 세포를 PBS(닛스이사 제조, 이하 동일.)로 2회 세정한 후, ISOGEN(닛폰 진사 제조) 500 ㎕를 세포에 첨가하고, 수 분간 실온에 방치하여 세포를 용해시켜, 그 용해물을 Eppendorf 튜브에 회수하였다. ISOGEN에 첨부된 프로토콜에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA의 농도는 NanoDrop ND-1000(엘·엠·에스사 제조)을 사용해서 측정하였다.
추출한 total RNA 400 ng에 대해 QIAGEN OneStep RT-PCR Kit(퀴아겐사 제조)를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 키트에 첨부된 프로토콜에 따라 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 PTC-100(MJ Research사 제조)을 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은 아래와 같다.
50℃, 30분간：역전사반응
95℃, 15분간：열변성
[94℃, 30초간；60℃, 30초간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭
72℃, 10분간：
RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Figure pct00045

상기 PCR의 반응산물 1 ㎕를 Bioanalyzer(아질렌트사 제조)를 사용해서 해석하였다.
엑손 45가 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 45가 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로 아래의 식에 따라서 스키핑 효율을 구하였다.
Figure pct00046

실험결과
결과를 도 3, 도 4, 도 14 및 도 15에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.1, 3의 본 발명의 올리고머는 RD세포에 있어서, PMO No.6의 안티센스 올리고머와 동등한 효율로 엑손 45를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 3, 도 4), 또한 PMO No.1, 2, 3의 본 발명의 올리고머는 RD세포에 있어서, PMO No.7의 안티센스 올리고머와 비교하여 높은 효율로 엑손 45를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 14). 추가로 PMO No.3는 말단 구조가 상이한 PMO No.10과 비교하여 높은 효율로 엑손 45를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 15).
[시험예 3]
인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이
ZsGreen1 공발현 레트로바이러스 벡터에 의해 GM05017세포(인간 DMD 환자 유래 섬유아세포, Coriell Institute for Medical Research)에 인간 MyoD 유전자(서열번호 38)를 도입하였다.
4~5일간 인큐베이트한 후에, FACS에 의해 ZsGreen 양성의 MyoD 전환 섬유아세포를 회수하고, 5×104개/㎠가 되도록 12웰 플레이트에 파종하였다. 증식배지는 10% FCS 및 1% Penicillin/Streptomycin(P/S)(시그마 알드리치사)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM·F-12)(인비트로젠사)를 1 mL 사용하였다.
24시간 후에 분화배지(2% 말 혈청(인비트로젠사), 1% P/S 및 ITS Liquid Media Supplement(시그마사) 함유 DMEM/F-12)로 교환하였다. 2, 3일마다 배지 교환을 행하여 12~14일간 인큐베이트하고, 근관(myotube)세포로 분화시켰다.
그 후 분화배지를 6 μM의 Endo-Porter(진 툴사) 함유 분화배지로 교환하고, 종농도 10 μM이 되도록 모르폴리노 올리고머를 첨가하였다. 48시간 인큐베이트 후에, TRIzol(인비트로젠사 제조)에 의해, 세포로부터 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 50 ng에 대해 QIAGEN OneStep RT-PCR Kit를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 첨부된 프로토콜에 따라 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 iCycler(Bio-Rad사 제조)를 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은 아래와 같다.
50℃, 30분간：역전사반응
95℃, 15분간：열변성
[94℃, 1분간；60℃, 1분간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭
72℃, 7분간：폴리머라아제의 열 불활성화
프라이머는 hDMD44F 및 hDMD46R을 사용하였다.
Figure pct00047

상기 RT-PCR 반응의 반응산물을 2% 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, GeneFlash(Syngene사)에 의해 겔 사진을 촬영하였다. Image J(아메리카 국립위생연구소 제조)에 의해, 엑손 45가 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 45가 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로 아래의 식에 따라서 스키핑 효율을 구하였다.
Figure pct00048

실험결과
결과를 도 5에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.3의 본 발명의 올리고머는 GM05017세포에 있어서 높은 효율로 엑손 45를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
엑손 55에 대해서
아래의 실시예 9~19의 기재에 따라 표 11 PMO No.11~14 및 16~22에 나타내는 각종 PMO를 합성하였다. 합성한 PMO를 주사용수(오츠카 제약 공장사 제조)로 용해하였다. 또한 PMO No.15는 진 툴즈사로부터 구입하였다.
Figure pct00049
[실시예 9]
PMO . No.11
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6807.8
측정값：6807.0
[실시예 10]
PMO . No.12
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6822.8
측정값：6822.5
[실시예 11]
PMO . No.13
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6837.8
측정값：6837.3
[실시예 12]
PMO . No.14
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6861.8
측정값：6861.4
[실시예 13]
PMO . No.16
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6812.8
측정값：6812.7
[실시예 14]
PMO . No.17
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6852.8
측정값：6852.7
[실시예 15]
PMO. No.18
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6901.8
측정값：6901.5
[실시예 16]
PMO. No.19
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6901.8
측정값：6901.7
[실시예 17]
PMO . No.20
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6522.5
측정값：6522.0
[실시예 18]
PMO . No.21
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6546.5
측정값：6546.0
[실시예 19]
PMO . No.22
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산(참고예 5)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：7213.1
측정값：7212.5
[시험예 4]
In vitro 어세이
서열번호 49~68에 기재된 2'-O-메톡시-포스포로티오에이트체(2'-OMe-S-RNA)의 안티센스 올리고머를 사용하여 실험을 행하였다. 어세이에 사용한 각종 안티센스 올리고머는 일본 바이오서비스사로부터 구입하였다. 각종 안티센스 올리고머의 서열을 아래에 나타낸다.
Figure pct00050
RT-PCR을 아래의 프라이머로 실시한 것 외에는 엑손 45(시험예 1)와 동일한 조건·순서로 행하였다.
Figure pct00051

실험결과
결과를 도 6, 7에 나타낸다. 본 실험에 의해 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제1~21번째 또는 제11~31번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우, 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제104~123번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우와 비교하여 높은 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
[시험예 5]
In vitro 어세이
RT-PCR을 아래의 프라이머로 실시한 것 외에는 엑손 45(시험예 2)와 동일한 조건·순서로 행하였다.
Figure pct00052

실험결과
결과를 도 8, 16 및 17에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.12, 13, 14(H55_8-28(OH), H55_11-31(OH) 및 H55_14-34(OH))의 본 발명의 올리고머는 RD세포에 있어서 높은 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 8). 또한 PMO No.14, 16, 17, 18, 19(H55_14-34(OH), H55_12-32(OH), H55_13-33(OH), H55_15-35(OH) 및 H55_16-36(OH))의 본 발명 올리고머는 RD세포에 있어서, PMO No.15(H55_139-156(GT))의 안티센스 올리고머와 비교하여 현저하게 높은 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 16). PMO No.14의 본 발명 올리고머와 사슬 길이를 1 염기 짧게 한 PMO No.21(H55_15-34(OH))은 동등한 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 17). 또한 PMO No.14의 본 발명 올리고머는 말단 구조가 상이한 PMO No.22(H55_14-34(TEG))와 비교하여 동등한 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 17).
엑손 44에 대해서
아래의 실시예 20~29의 기재에 따라 하기 표의 PMO No.23~29 및 31~33에 나타내는 각종 PMO를 합성하였다. 합성한 PMO를 주사용수(오츠카 제약 공장사 제조)로 용해하였다. 또한 PMO No.30은 진 툴즈사로부터 구입하였다.
Figure pct00053
[실시예 20]
PMO . No.23
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6918.9
측정값：6918.3
[실시예 21]
PMO . No.24
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6903.9
측정값：6904.2
[실시예 22]
PMO . No.25
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6912.9
측정값：6912.4
[실시예 23]
PMO . No.26
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6903.9
측정값：6904.2
[실시예 24]
PMO . No.27
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6927.9
측정값：6927.4
[실시예 25]
PMO . No.28
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6942.9
측정값：6942.3
[실시예 26]
PMO . No.29
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6917.9
측정값：6918.3
[실시예 27]
PMO . No.31
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6573.6
측정값：6572.4
[실시예 28]
PMO . No.32
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6588.6
측정값：6588.3
[실시예 29]
PMO . No.33
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산(참고예 5)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：7255.2
측정값：7254.7
[시험예 6]
In vitro 어세이
서열번호 82~95 및 서열번호 109~118에 기재된 2'-O-메톡시-포스포로티오에이트체(2'-OMe-S-RNA)의 안티센스 올리고머를 사용하여 실험을 행하였다. 어세이에 사용한 각종 안티센스 올리고머는 일본 바이오서비스사로부터 구입하였다. 각종 안티센스 올리고머의 서열을 아래에 나타낸다.
Figure pct00054
엑손 45(시험예 1)와 동일한 조건·순서로 행하였다.
실험결과
결과를 도 9, 10에 나타낸다. 본 실험에 의해 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제11~32번째 또는 제26~47번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우, 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제62~81번째에 안티센스 올리고머를 설계한 경우와 동등한 효율로 엑손 44를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
[시험예 7]
In vitro 어세이
엑손 45(시험예 2)와 동일한 조건·순서로 행하였다.
실험결과
결과를 도 11, 12 및 18에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.24, 26(H44_25-45(OH), H44_27-47(OH))의 본 발명의 올리고머는 RD세포에 있어서, PMO No.30(H44_10-39(OH))의 안티센스 올리고머와 동등한 효율로 엑손 44를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 11, 12). PMO No.26의 본 발명 올리고머와 사슬 길이를 1 염기 짧게 한 PMO No.31(H44_27-46(OH))은 동등한 효율로 엑손 44를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 18). 또한 PMO No.26의 본 발명 올리고머는 말단 구조가 상이한 PMO No.33(H44_27-47(TEG))과 비교하여 동등한 효율로 엑손 44를 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 18).
엑손 50에 대해서
아래의 실시예 30~39의 기재에 따라 표 15 PMO No.34~38 및 41~45에 나타내는 각종 PMO를 합성하였다. 합성한 PMO를 주사용수(오츠카 제약 공장사 제조)로 용해하였다. 또한 PMO No.39, 40은 진 툴즈사로부터 구입하였다.
Figure pct00055
[실시예 30]
PMO . No.34
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6861.8
측정값：6861.8
[실시예 31]
PMO . No.35
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6885.8
측정값：6885.9
[실시예 32]
PMO . No.36
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6925.9
측정값：6925.9
[실시예 33]
PMO . No.37
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6950.9
측정값：6950.9
[실시예 34]
PMO . No.38
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6990.9
측정값：6991.0
[실시예 35]
PMO . No.41
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6635.6
측정값：6635.0
[실시예 36]
PMO . No.42
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-시아노에톡시)-2-[(2-페녹시아세틸)아미노]퓨린-9-일]-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시]-4-옥소-부탄산(참고예 2)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6635.6
측정값：6634.9
[실시예 37]
PMO . No.43
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-(((2S,6R)-6-(5-메틸-2,4-디옥소-3,4-디히드로피리미딘-1(2H)-일)-4-트리틸모르폴린-2-일)메톡시)-4-옥소부탄산(참고예 3)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6965.9
측정값：6965.2
[실시예 38]
PMO . No.44
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 4-{[(2S,6R)-6-(6-벤즈아미드퓨린-9-일)-4-트리틸모르폴린-2-일]메톡시}-4-옥소부탄산(참고예 4)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：6949.9
측정값：6949.2
[실시예 39]
PMO . No.45
실시예 1과 동일한 방법에 따라 표기 화합물을 제조하였다. 단, 출발 원료로서 아미노폴리스티렌 수지에 담지된 1,12-디옥소-1-(4-트리틸피페라진-1-일)-2,5,8,11-테트라옥사-15-펜타데칸산(참고예 5)을 사용하였다.
ESI-TOF-MS 계산값：7342.2
측정값：7341.6
[시험예 8]
In vitro 어세이
농도를 0.1, 0.3, 1 μM로 하여, RT-PCR을 아래의 프라이머로 실시한 것 외에는 엑손 45(시험예 2)와 동일한 조건·순서로 행하였다.
Figure pct00056

실험결과
결과를 도 13, 19에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.38(H50_107-127(OH))의 본 발명의 올리고머는 RD세포에 있어서, PMO No.39 또는 40(H50_90-114(GT), H50_103-127(GT))의 안티센스 올리고머와 비교하여 높은 효율로 엑손 50을 스키핑시키는 것이 판명되었다. 또한 PMO No.38은 말단 구조가 상이한 PMO No.45(H50_107-127(TEG))와 비교하여 높은 효율로 엑손 50을 스키핑시키는 것이 판명되었다(도 19).
엑손 44 스키핑 검토
인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이
[시험예 9]
GM05112세포(엑손 45 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포, Coriell Institute for Medical Research)를 사용하여, 엑손 44 스키핑 활성을 검토하였다. 증식배지는 10% FCS 및 1% Penicillin/Streptomycin(P/S)(시그마 알드리치사)을 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)(인비트로젠사)를 사용하여 5% CO2 존재하, 37℃에서 배양하였다.
세포는 T225 플라스크에서 배양하고, 증식배지 35 mL에 대해 2.5 mL의 인간 유래 MyoD(서열번호 38) 발현 레트로바이러스(ZsGreen1 공발현) 및 종농도 8 ㎍/mL로 폴리브렌(시그마 알드리치사)을 첨가하였다. 32℃에서 2일간 배양 후, 신선한 증식배지로 배지 교환을 행하고, 추가로 37℃에서 3일간 배양하였다. BD FACSAria Cell Sorter(BD Bioscience사)로 ZsGreen1 양성 세포를 선택함으로써 MyoD 전환 섬유아세포를 회수하고, 콜라겐 코트의 24-well 플레이트에 9×104 cells/well로 파종하였다. 다음날 분화배지(2% 말 혈청(인비트로젠사), 1% P/S 및 ITS Liquid Media Supplement(시그마사) 함유 DMEM/F-12)로 교환하였다. 2~3일마다 배지 교환을 행하면서 배양하여 근관세포로 분화 유도하였다.
분화배지로 교환 후 7일째에 종농도 6 μM이 되도록 Endo-Porter(진 툴사)를 첨가한 분화배지로 교환하고, 종농도가 1, 3, 10 μM이 되도록 PMO No.26 및 31을 첨가하였다. 7일간 인큐베이트 후에 세포를 회수하고, RNeasy Mini Kit(퀴아겐사)를 사용하여 total RNA를 추출하였다. 추출한 total RNA 50 ng에 대해 QIAGEN OneStep RT-PCR Kit를 사용하여 RT-PCR을 행하였다. 첨부된 프로토콜에 따라 반응액을 조제하였다. 서멀 사이클러는 iCycler(Bio-Rad사)를 사용하였다. 사용한 RT-PCR의 프로그램은 다음과 같다.
50℃, 30분간：역전사반응
95℃, 15분간：열변성
[94℃, 1분간；60℃, 1분간；72℃, 1분간]×35사이클：PCR 증폭
72℃, 7분간：최종 신장반응
RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Figure pct00057

상기 RT-PCR 반응의 반응산물을 2% 아가로스겔 전기영동으로 분리하고, 이미지 애널라이저 ImageQuant LAS 4000 Mini(후지필름사)에 의해 겔 사진을 촬영하였다. 부속 소프트웨어에 의해 엑손 44가 스킵한 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「A」와, 엑손 44가 스킵하지 않은 밴드의 폴리뉴클레오티드량 「B」를 측정하였다. 이들 「A」 및 「B」의 측정값을 토대로 아래의 식에 따라서 스키핑 효율을 구하였다.
Figure pct00058

실험결과
결과를 도 20에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.26 및 31의 본 발명의 올리고머는 GM05112세포에 있어서 높은 효율로 엑손 44를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
[시험예 10]
시험예 9와 동일하게 GM05112세포를 사용하여 MyoD 전환 섬유아세포를 조제하고 근관세포로 분화 유도하였다. 분화배지로 교환 후 6일째에 종농도 6 μM이 되도록 Endo-Porter(진 툴사)를 첨가한 분화배지로 교환하고, 종농도 10 μM이 되도록 PMO No.26 및 31을 첨가하였다. 14일간 인큐베이트 후에 프로테아제 인히비터 칵테일 Complete Mini(로슈사)를 첨가한 세포 용해 버퍼 RIPA buffer(Pierce사)에 의해 스크레이퍼로 세포를 회수하였다. 초음파 파쇄기 Bioruptor UCD-250(도쇼 전기사)에 의해 세포를 파쇄하고, 원심분리 후의 상청을 회수하여, 세포 용해물(cell lysate)로 하였다. 세포 용해물의 단백질 농도는 Pierce BCA protein assay kit(Pierce사)를 사용해서 구하였다. 파장 544 ㎚의 흡광도는 플레이트 리더 Thermo Appliskan Type2001(Thermo Electron사)을 사용해서 측정하였다.
세포 용해물 3 ㎍을 폴리아크릴아미드 겔 NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel 3-8%(인비트로젠사)를 사용해서 전기영동하였다. 전기영동 종료 후, 세미드라이 블로트법에 의해 ImmobiloN-P membrane(Millipore사)으로 전사하였다. 전사한 막은 0.1% Tween20을 포함하는 PBS(PBST)로 세정 후, 5% Amersham ECL Prime Blocking agent(GE Healthcare사)를 포함하는 PBST로 냉장고 내 하룻밤 블로킹하였다. 막을 PBST로 세정 후, 항디스트로핀 항체(NCL-Dys1, Novocastra사)를 Can Get Signall(TOYOBO)로 50배 희석한 용액 중에서 실온에서 1시간 인큐베이트하였다. PBST로 세정 후, 퍼옥시다아제 표지 염소 항마우스 IgG 항체(170-6516, Bio-Rad사)를 Can Get Signal2(TOYOBO사)로 2,500배 희석한 용액 중에서 실온에서 10분간 인큐베이트하였다. PBST로 세정 후, ECL Plus Western Blotting Detection System(GE Healthcare사)으로 처리하였다. 엑손 44-45에 상당하는 부분이 결손된 디스트로핀의 화학발광을 루미노·이미지 애널라이저 ImageQuant LAS 4000 Mini(후지필름사)에 의해 검출하였다.
실험결과
웨스턴 블로팅의 결과를 도 21에 나타낸다. 도 21에 있어서 화살표는 발현이 확인된 디스트로핀 단백질의 밴드를 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.26 및 31의 본 발명의 올리고머는 GM05112세포에 있어서, 디스트로핀 단백질의 발현을 유도하는 것이 판명되었다.
엑손 50 스키핑 검토
인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이
[시험예 11]
시험예 9와 동일하게 GM05112세포를 사용하여 MyoD 전환 섬유아세포를 조제하고 근관세포로 분화 유도하였다.
분화배지로 교환 후 12일째에 종농도 6 μM이 되도록 Endo-Porter(진 툴사)를 첨가한 분화배지로 교환하고, 종농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10 μM이 되도록 PMO No.38을 첨가하였다. 2일간 인큐베이트 후에 세포를 회수하였다. 시험예 9와 동일하게 total RNA를 추출 후, RT-PCR을 실시하여 스키핑 효율을 구하였다. 단 RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Figure pct00059

실험결과
RT-PCR의 결과를 도 22에, 스키핑 효율을 도 23에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.38의 본 발명의 올리고머는 GM05112세포에 있어서 높은 효율로 엑손 50을 스키핑시키고, EC50값은 1.3 μM인 것이 판명되었다.
[시험예 12]
11-0627세포(엑손 8-9 중복 DMD 환자 유래 섬유아세포, 고꾸리쯔 세이신·신께이 이료겡뀨센따 신경·근질환 연구자원 레포지토리)를 사용하여 PMO No.38 첨가시의 종농도를 0.1, 1, 10 μM으로 한 것 외에는 시험예 11과 동일한 조건·순서로 스키핑 시험을 행하였다.
실험결과
RT-PCR의 결과를 도 26에, 스키핑 효율을 도 27에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.38의 본 발명의 올리고머는 11-0627세포에 있어서 높은 효율로 엑손 50을 스키핑시키는 것이 판명되었다.
[시험예 13]
pLVX - MyoD - ZsGreen1 렌티바이러스의 제작
pLVX-puro(8120 bp, Clontech사)의 멀티클로닝사이트 내 XhoI(위치 2816)로부터 Puromycin 내성 유전자코드 영역의 3' 말단 근방(위치 3890)까지 1164 bp를 삭제하여 직쇄화한 벡터에 인간 MyoD 유전자, IRES서열, ZsGreen1 유전자의 순으로 코드된 서열(2272 bp)을 삽입하여, 렌티바이러스 발현 벡터 pLVX-MyoD-ZsGreen1(9210 bp)을 제작하였다. Lenti-X HTX Packaging System(Clontech사)의 프로토콜에 따라, Lenti-X293T세포를 10 ㎝ 콜라겐 코트 디쉬에 파종하였다. 섬유아세포로의 감염 예정일 3일 전에 렌티바이러스 발현 벡터, 패키징 벡터를 트랜스펙션하고, 4시간 후에 배지를 교환, 이후는 배지를 교환하지 않고 3일간 배양하였다. 감염 예정일 당일에 배양상청을 바이러스액으로서 회수하였다(10 ㎝ 디쉬당 약 9 mL). 배양상청을 셀 스트레이너(40 ㎛)로 여과하고, 이것을 추가로 500×g, 10 min에서 원심분리하였다. 이 상청을 Lenti-X Concentrator(Clontech사)의 프로토콜에 따라 농축하고, 최종적으로 회수 직후의 10배 농도가 되도록 DMEM/F12 배지에 용해하였다. 이 용액을 바이러스액으로서 사용하였다.
섬유아세포로의 바이러스 감염
감염 예정일까지 GM04364세포(엑손 51-55 결손 DMD 환자 유래 섬유아세포, Coriell Institute for Medical Research)를 콜라겐 코트 24 웰 플레이트에, 3×104/well의 밀도로 파종하였다. 감염 예정일 당일에 1웰당 분화배지 400 uL, 바이러스액 100 uL, 폴리브렌 최종농도 8 ug/mL를 첨가하였다. 감염 다음날 바이러스 함유 배지를 분화배지 500 uL로 교환하였다. 이후는 2~3일 간격으로 분화배지를 교환하여 12일간 배양함으로써 근관세포로 분화 유도하였다.
분화배지로 교환 후 12일째에 종농도 6 μM이 되도록 Endo-Porter(진 툴사)를 첨가한 분화배지로 교환하고, 종농도 0.1, 0.3, 1, 3, 10 μM이 되도록 PMO No.38을 첨가하였다. 2일간 인큐베이트 후에 세포를 회수하였다. 시험예 11과 동일하게 스키핑 효율을 구하였다. 단 RT-PCR에 사용한 포워드 프라이머와 리버스 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
Figure pct00060

실험결과
RT-PCR의 결과를 도 28에, 스키핑 효율을 도 29에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.38의 본 발명의 올리고머는 GM04364세포에 있어서 높은 효율로 엑손 50을 스키핑시키는 것이 판명되었다.
엑손 55 스키핑 검토
인간 섬유아세포를 사용한 In vitro 어세이
[시험예 14]
PMO No.14, 21을 사용하여 RT-PCR을 아래의 프라이머로 실시한 것 외에는 시험예 11과 동일한 조건·순서로 행하였다.
Figure pct00061

실험결과
RT-PCR의 결과를 도 24에, 스키핑 효율을 도 25에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.14, 21의 본 발명의 올리고머는 GM05112세포에 있어서 높은 효율로 엑손 55를 스키핑시키고, EC50값은 각각 3.5 μM, 7.5 μM인 것이 판명되었다.
[시험예 15]
세포를 04-035세포(엑손 54 단독 결손 DMD 환자 유래 세포, 고꾸리쯔 세이신·신께이 이료겡뀨센따 신경·근질환 연구자원 레포지토리)를 사용하여 PMO No.14, 21을 종농도 1, 3, 10 μM로 첨가하고, RT-PCR을 다음의 프라이머로 실시한 것 외에는 시험예 13과 동일한 조건·순서로 행하였다.
Figure pct00062

실험결과
RT-PCR의 결과를 도 30에, 스키핑 효율을 도 31에 나타낸다. 본 실험에 의해 PMO No.14, 21의 본 발명의 올리고머는 엑손 54 단독 결손 DMD 환자 유래 세포에 있어서 높은 효율로 엑손 55를 스키핑시키는 것이 판명되었다.
시험예에 나타내는 실험결과로부터, 본 발명의 올리고머는 RD세포 및 DMD 환자 유래 세포의 두 환경에 있어서, 현저하게 높은 효율로 표적 엑손(예를 들면 엑손 55 등)을 스키핑시키는 것이 나타내어졌다.
따라서 본 발명의 올리고머는 DMD의 치료에 있어서 매우 유용하다.
서열표 자유텍스트
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서열표
SEQUENCE LISTING <110> NIPPON SHINYAKU CO., LTD. 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Synthetic Nucleic Acid <400> 66 uuucaucagc ucuuuuacuc c 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 67 uugccauugu uucaucagcu 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 68 uccuguagga cauuggcagu 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 69 catggaagga gggtccctat 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 70 ctgccggctt aattcatcat 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 71 ataatgaaaa cgccgccatt t 21 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 72 tcataatgaa aacgccgcca t 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 73 atcataatga aaacgccgcc a 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 74 tatcataatg aaaacgccgc c 21 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 75 atatcataat gaaaacgccg c 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 76 tatatcataa tgaaaacgcc g 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 77 ttatatcata atgaaaacgc c 21 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 78 tgaaaacgcc gccatttctc aacagatctg 30 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 79 atcataatga aaacgccgcc 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 80 tatcataatg aaaacgccgc 20 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 81 tatcataatg aaaacgccgc c 21 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 82 cucaacagau cugucaaauc gc 22 <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 83 gccgccauuu cucaacagau cu 22 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 84 uaaugaaaac gccgccauuu cu 22 <210> 85 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 85 uaucauaaug aaaacgccgc ca 22 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 86 cuuuauauca uaaugaaaac gc 22 <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 87 gauuaaauau cuuuauauca ua 22 <210> 88 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 88 guuagccacu gauuaaauau cu 22 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 89 uucagcuucu guuagccacu ga 22 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 90 ugagaaacug uucagcuucu gu 22 <210> 91 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 91 ugugucuuuc ugagaaacug uu 22 <210> 92 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 92 guucccaauu cucaggaauu ug 22 <210> 93 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 93 uauuuagcau guucccaauu cu 22 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 94 auaccauuug uauuuagcau gu 22 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 95 ucagcuucug uuagccacug 20 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 96 tccagtatac ttacaggctc c 21 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 97 atccagtata cttacaggct c 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 98 gatccagtat acttacaggc t 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 99 ggatccagta tacttacagg c 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 100 gggatccagt atacttacag g 21 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 101 cttacaggct ccaatagtgg tcagt 25 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 102 gggatccagt atacttacag gctcc 25 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 103 aacaaccgga tgtggaagag 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 104 ttggagatgg cagtttcctt 20 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 105 cauuucucaa cagaucuguc aa 22 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 106 aaaacgccgc cauuucucaa ca 22 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 107 aauaucuuua uaucauaaug aa 22 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 108 cuucuguuag ccacugauua aa 22 <210> 109 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 109 aacuguucag cuucuguuag cc 22 <210> 110 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 110 cuuucugaga aacuguucag cu 22 <210> 111 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 111 gaauuugugu cuuucugaga aa 22 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 112 cucaggaauu ugugucuuuc ug 22 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 113 caauucucag gaauuugugu cu 22 <210> 114 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 114 agcauguucc caauucucag ga 22 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 115 gagtcttcta ggagcctt 18 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 116 gtttcttcca aagcagcctc 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 117 agtttcttcc aaagcagcct 20 <210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 118 agtttcttcc aaagcagcct c 21 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 119 ggatccagta tacttacagg 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 120 gggatccagt atacttacag 20 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 121 tgggatccag tatacttaca g 21 <210> 122 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Nucleic Acid <400> 122 atgggatcca gtatacttac a 21

Claims (20)

  1. 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제14~34번째, 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제3~19번째, 제3~20번째, 제3~21번째, 제3~22번째, 제3~23번째, 제9~29번째, 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제10~29번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제11~29번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제12~29번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제13~29번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제12~34번째, 제12~35번째, 제12~36번째, 제13~34번째, 제13~35번째, 제13~36번째, 제14~32번째, 제14~33번째, 제14~35번째, 제14~36번째, 제15~32번째, 제15~33번째, 제15~34번째, 제15~35번째, 제15~36번째, 제16~32번째, 제16~33번째, 제16~34번째, 제16~35번째 또는 제16~36번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  2. 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-3~19번째, 제-3~20번째, 제-3~21번째, 제-3~22번째, 제-3~23번째, 제-2~19번째, 제-2~20번째, 제-2~21번째, 제-2~22번째, 제-2~23번째, 제-1~19번째, 제-1~20번째, 제-1~21번째, 제-1~22번째, 제-1~23번째, 제1~19번째, 제1~20번째, 제1~21번째, 제1~22번째, 제1~23번째, 제2~19번째, 제2~20번째, 제2~21번째, 제2~22번째, 제2~23번째, 제-2~24번째, 제-2~25번째, 제-2~26번째, 제-2~27번째, 제-1~24번째, 제-1~25번째, 제-1~26번째, 제-1~27번째, 제1~24번째, 제1~25번째, 제1~26번째, 제1~27번째, 제2~24번째, 제2~25번째, 제2~26번째, 제2~27번째, 제3~23번째, 제3~24번째, 제3~25번째, 제3~26번째, 제3~27번째, 제4~28번째, 제4~29번째, 제4~30번째, 제4~31번째, 제4~32번째, 제5~28번째, 제5~29번째, 제5~30번째, 제5~31번째, 제5~32번째, 제6~28번째, 제6~29번째, 제6~30번째, 제6~31번째, 제6~32번째, 제7~28번째, 제7~29번째, 제7~30번째, 제7~31번째, 제7~32번째, 제8~28번째, 제8~29번째, 제8~30번째, 제8~31번째 또는 제8~32번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  3. 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제105~125번째, 제105~126번째, 제105~127번째, 제105~128번째, 제105~129번째, 제106~125번째, 제106~126번째, 제106~127번째, 제106~128번째, 제106~129번째, 제107~125번째, 제107~126번째, 제107~127번째, 제107~128번째, 제107~129번째, 제108~125번째, 제108~126번째, 제108~127번째, 제108~128번째, 제108~129번째, 제109~125번째, 제109~126번째, 제109~127번째, 제109~128번째 또는 제109~129번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  4. 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 스키핑을 가능하게 하는 안티센스 올리고머로서, 인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제9~30번째, 제9~31번째, 제9~32번째, 제9~33번째, 제9~34번째, 제10~30번째, 제10~31번째, 제10~32번째, 제10~33번째, 제10~34번째, 제11~30번째, 제11~31번째, 제11~32번째, 제11~33번째, 제11~34번째, 제12~30번째, 제12~31번째, 제12~32번째, 제12~33번째, 제12~34번째, 제13~30번째, 제13~31번째, 제13~32번째, 제13~33번째, 제13~34번째, 제24~45번째, 제24~46번째, 제24~47번째, 제24~48번째, 제24~49번째, 제25~45번째, 제25~46번째, 제25~47번째, 제25~48번째, 제25~49번째, 제26~45번째, 제26~46번째, 제26~47번째, 제26~48번째, 제26~49번째, 제27~45번째, 제27~46번째, 제27~47번째, 제27~48번째, 제27~49번째, 제28~45번째, 제28~46번째, 제28~47번째, 제28~48번째, 제28~49번째, 제29~45번째, 제29~46번째, 제29~47번째, 제29~48번째 또는 제29~49번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  5. 제1항에 있어서,
    인간 디스트로핀 유전자의 제55번째 엑손의 5' 말단으로부터 제1~21번째, 제11~31번째 또는 제14~34번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  6. 제1항에 있어서,
    서열번호 5의 제170~190번째, 제160~180번째 또는 제157~177번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  7. 제2항에 있어서,
    인간 디스트로핀 유전자의 제45번째 엑손의 5' 말단으로부터 제-2~19번, 제1~21번째, 제1~25번째 또는 제6~30번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  8. 제2항에 있어서,
    서열번호 6의 제158~178번째, 제156~176번째, 제152~176번째 또는 제147~171번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  9. 제3항에 있어서,
    인간 디스트로핀 유전자의 제50번째 엑손의 5' 말단으로부터 제106~126번 또는 제107~127번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  10. 제3항에 있어서,
    서열번호 7의 제4~24번째 또는 제3~23번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  11. 제4항에 있어서,
    인간 디스트로핀 유전자의 제44번째 엑손의 5' 말단으로부터 제11~32번, 제25~45번, 제26~46번, 제26~47번 또는 제27~47번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열에 상보적인 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  12. 제4항에 있어서,
    서열번호 8의 제117~138번째, 제104~124번째, 제103~123번째, 제102~123번째 또는 제102~122번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 안티센스 올리고머.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드인 안티센스 올리고머.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분 및/또는 인산 결합부분이 수식되어 있는 안티센스 올리고머.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 당부분이 2' 위치의 -OH기가 OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3, CN, F, Cl, Br 및 I로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 기로 치환된 리보오스인 안티센스 올리고머.
    (상기 R은 알킬 또는 아릴을 나타내고, 상기 R'는 알킬렌을 나타낸다.)
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드를 구성하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 인산 결합부분이 포스포로티오에이트 결합, 포스포로디티오에이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로아미데이트 결합 및 보라노포스페이트 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 것인 안티센스 올리고머.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고머.
  18. 제17항에 있어서,
    포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머인 안티센스 올리고머.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    5' 말단이 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나의 기인 안티센스 올리고머.
    Figure pct00063
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 기재된 안티센스 올리고머, 그의 의약적으로 허용 가능한 염 또는 수화물을 유효성분으로 하는 근이영양증(muscular dystrophy) 치료용 의약 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180043244A (ko) * 2015-09-15 2018-04-27 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1766010T3 (da) 2004-06-28 2011-06-06 Univ Western Australia Antisense-oligonukleotider til induktion af exon-skipping og fremgangsmåder til anvendelse deraf
ES2852549T3 (es) 2005-02-09 2021-09-13 Sarepta Therapeutics Inc Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
HUE028662T2 (en) 2007-10-26 2016-12-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Preparations and methods for controlling muscle disorders
EP2119783A1 (en) 2008-05-14 2009-11-18 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in Duchenne Muscular Dystrophy and associated means
TR201902952T4 (tr) 2008-10-24 2019-03-21 Sarepta Therapeutics Inc Dmd için ekson atlama bileşimleri.
KR102366851B1 (ko) 2009-11-12 2022-02-23 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
IN2014DN06220A (ko) * 2011-12-28 2015-10-23 Nippon Shinyaku Co Ltd
CA2862628C (en) 2012-01-27 2021-08-24 Prosensa Technologies B.V. Rna modulating oligonucleotides with improved characteristics for the treatment of duchenne and becker muscular dystrophy
WO2014153220A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping compositions for treating muscular dystrophy
US20140329762A1 (en) 2013-03-15 2014-11-06 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions for treating muscular dystrophy
RU2702424C2 (ru) * 2014-03-12 2019-10-08 Ниппон Синяку Ко., Лтд. Антисмысловые нуклеиновые кислоты
WO2015178277A1 (ja) * 2014-05-19 2015-11-26 神戸天然物化学株式会社 ＣＤ４４遺伝子のバリアントエクソンのスキッピングを誘導し、正常型ＣＤ４４ｍＲＮＡの発現を増加させる核酸医薬
TWI721461B (zh) 2014-06-17 2021-03-11 日商日本新藥股份有限公司 反義核酸
EP3208277A4 (en) * 2014-10-14 2018-06-13 Ajinomoto Co., Inc. Morpholino oligonucleotide manufacturing method
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
EP3359668A4 (en) 2015-10-09 2019-06-05 Sarepta Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING DUCHENNE MUSCLE DYSTROPHY AND ASSOCIATED ILLNESSES THEREOF
WO2017062862A2 (en) 2015-10-09 2017-04-13 Wave Life Sciences Ltd. Oligonucleotide compositions and methods thereof
DK3464306T3 (da) * 2016-05-24 2024-05-21 Sarepta Therapeutics Inc Fremgangsmåder til fremstilling af phosphorodiamidat-morpholino-oligomerer
CN109563114B (zh) * 2016-05-24 2022-08-12 萨勒普塔医疗公司 用于制备寡聚物的方法
CA3025575A1 (en) * 2016-06-30 2018-01-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomers for muscular dystrophy
US20190364862A1 (en) * 2016-12-08 2019-12-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Dmd reporter models containing humanized duchenne muscular dystrophy mutations
KR102639633B1 (ko) * 2016-12-19 2024-02-26 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드 근육 이상증에 대한 엑손 스킵핑 올리고머 결합체
NZ755416A (en) 2016-12-19 2023-05-26 Sarepta Therapeutics Inc Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
IL267246B2 (en) 2016-12-19 2023-03-01 Sarepta Therapeutics Inc Exon-skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
EA201991450A1 (ru) 2017-09-22 2019-12-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Конъюгаты олигомеров для пропуска экзона при мышечной дистрофии
WO2019067981A1 (en) 2017-09-28 2019-04-04 Sarepta Therapeutics, Inc. POLYTHERAPIES FOR TREATING MUSCLE DYSTROPHY
US10758629B2 (en) 2018-05-29 2020-09-01 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
CA3108289A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
SG11202100934PA (en) 2018-08-02 2021-02-25 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
EP3894558A1 (en) * 2018-12-13 2021-10-20 Sarepta Therapeutics, Inc. Exon skipping oligomer conjugates for muscular dystrophy
US20220144902A1 (en) 2018-12-25 2022-05-12 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for inducing muscular cells using cells in spot urine
IL293997A (en) 2019-12-19 2022-08-01 Nippon Shinyaku Co Ltd Antistrand nucleic acids that allow exon skipping
CN114901823A (zh) 2019-12-26 2022-08-12 日本新药株式会社 诱导外显子50的跳读的反义核酸
WO2022232478A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Sarepta Therapeutics, Inc. Treatment methods for muscular dystrophy
JPWO2022239863A1 (ko) 2021-05-13 2022-11-17
TW202307208A (zh) 2021-06-23 2023-02-16 日商日本新藥股份有限公司 反義寡聚物之組合
AU2022306542A1 (en) 2021-07-08 2024-01-18 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Precipitation suppressing agent
TW202308664A (zh) 2021-07-08 2023-03-01 日商日本新藥股份有限公司 腎毒性減輕劑
WO2023282345A1 (ja) 2021-07-08 2023-01-12 日本新薬株式会社 腎毒性軽減剤
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
KR20240032945A (ko) * 2021-07-09 2024-03-12 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
WO2023026994A1 (ja) 2021-08-21 2023-03-02 武田薬品工業株式会社 ヒトトランスフェリンレセプター結合ペプチド－薬物コンジュゲート
WO2023168427A1 (en) 2022-03-03 2023-09-07 Yale University Compositions and methods for delivering therapeutic polynucleotides for exon skipping
WO2023171820A1 (ja) * 2022-03-11 2023-09-14 日本新薬株式会社 キャリアペプチドが連結された核酸
WO2023178230A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Sarepta Therapeutics, Inc. Phosphorodiamidate morpholino oligomer conjugates

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004048570A1 (ja) 2002-11-25 2004-06-10 Nonprofit Organization Translational Research Organization Of Duchenne Muscular Dystrophy ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
WO2004083446A2 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
WO2006000057A1 (en) 2004-06-28 2006-01-05 SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, doing business as GLAXOSMITHKLINE Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2009139630A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in duchenne muscular dystrophy and associated means
WO2010048586A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Avi Biopharma, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
WO2010050801A1 (en) 2008-10-27 2010-05-06 Prosensa Technologies B.V. Methods and means for efficient skipping of exon 45 in duchenne muscular dystrophy pre-mrna
US20100168212A1 (en) 2008-09-11 2010-07-01 Royal Holloway, University Of London Oligomers
WO2010123369A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0962463B1 (en) 1989-12-20 2002-07-10 Antivirals Inc. Uncharged morpholino-based polymers having phosphorus-containing chiral intersubunit linkages
JP2924179B2 (ja) 1993-02-19 1999-07-26 日本新薬株式会社 グリセロール誘導体，デバイス及び医薬組成物
DE69435108D1 (de) * 1993-07-13 2008-08-14 Centelion Defekte adenovirus-vektoren und deren verwendung in der gentherapie
US6727355B2 (en) * 2000-08-25 2004-04-27 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy
EP1191097A1 (en) * 2000-09-21 2002-03-27 Leids Universitair Medisch Centrum Induction of exon skipping in eukaryotic cells
JPWO2006038608A1 (ja) 2004-10-05 2008-05-15 日本新薬株式会社 オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物
JP2008538500A (ja) * 2005-04-22 2008-10-30 アカデミス ツィーケンホイス ライデン ＳＲタンパク質の結合に対する干渉とＲＮＡ二次構造に対する干渉による、ｍＲＮＡ前駆体におけるエクソン認識の調節
EP1886688A4 (en) 2005-05-30 2013-01-09 Nippon Shinyaku Co Ltd METHOD FOR PRODUCING PREPARATION OF A NUCLEIC ACID-CONTAINING COMPLEX
US8067571B2 (en) * 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
EP1857548A1 (en) * 2006-05-19 2007-11-21 Academisch Ziekenhuis Leiden Means and method for inducing exon-skipping
JP5347510B2 (ja) 2007-02-05 2013-11-20 日本新薬株式会社 ポリエチレングリコール誘導体
HUE028662T2 (en) 2007-10-26 2016-12-28 Academisch Ziekenhuis Leiden Preparations and methods for controlling muscle disorders
CN101861318A (zh) 2007-11-15 2010-10-13 Avi生物制药公司 合成吗啉代低聚物的方法
US20120270930A1 (en) * 2009-10-29 2012-10-25 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Methods and compositions for dysferlin exon-skipping
KR102366851B1 (ko) * 2009-11-12 2022-02-23 더 유니버시티 오브 웨스턴 오스트레일리아 안티센스 분자 및 이를 이용한 질환 치료방법
NZ603606A (en) 2010-05-28 2015-06-26 Sarepta Therapeutics Inc Oligonucleotide analogues having modified intersubunit linkages and/or terminal groups
JP5593949B2 (ja) 2010-08-17 2014-09-24 横河電機株式会社 プログラマブルロジックコントローラ
IN2014DN06220A (ko) * 2011-12-28 2015-10-23 Nippon Shinyaku Co Ltd

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004048570A1 (ja) 2002-11-25 2004-06-10 Nonprofit Organization Translational Research Organization Of Duchenne Muscular Dystrophy ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングを修飾するＥＮＡ核酸医薬
WO2004083446A2 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Academisch Ziekenhuis Leiden Modulation of exon recognition in pre-mrna by interfering with the secondary rna structure
WO2006000057A1 (en) 2004-06-28 2006-01-05 SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION, doing business as GLAXOSMITHKLINE Antisense oligonucleotides for inducing exon skipping and methods of use thereof
WO2009139630A2 (en) 2008-05-14 2009-11-19 Prosensa Technologies B.V. Method for efficient exon (44) skipping in duchenne muscular dystrophy and associated means
US20100168212A1 (en) 2008-09-11 2010-07-01 Royal Holloway, University Of London Oligomers
WO2010048586A1 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Avi Biopharma, Inc. Multiple exon skipping compositions for dmd
KR20110082576A (ko) * 2008-10-24 2011-07-19 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 Ｄｍｄ를 위한 다중 엑손 스키핑 조성물
WO2010050801A1 (en) 2008-10-27 2010-05-06 Prosensa Technologies B.V. Methods and means for efficient skipping of exon 45 in duchenne muscular dystrophy pre-mrna
WO2010123369A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Prosensa Technologies B.V. Oligonucleotide comprising an inosine for treating dmd

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Annemieke Aartsma-Rus et al., (2002) Neuromuscular Disorders 12：S71-S77
Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol. 20, no.2, p. 102-10
Matsuo M., Brain Dev 1996；18：p. 167-172
Monaco A. P. et al., Genomics 1988；2：p. 90-95
Wilton S. D., et al., Molecular Therapy 2007：15：p. 1288-96

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180043244A (ko) * 2015-09-15 2018-04-27 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산
KR20190040098A (ko) * 2015-09-15 2019-04-16 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 안티센스 핵산
US10851373B2 (en) 2015-09-15 2020-12-01 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids
US11981894B2 (en) 2015-09-15 2024-05-14 Nippon Shinyaku Co., Ltd. Antisense nucleic acids

Also Published As

Publication number Publication date
JP6141770B2 (ja) 2017-06-07
AU2012360702B2 (en) 2018-06-28
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