ES2852549T3 - Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular - Google Patents

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Abstract

Una composición antisentido de un compuesto oligonucleotídico resistente a nucleasa (i) compuesto por subunidades morfolino y enlaces entre subunidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno morfolino de una subunidad a un carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, (ii) que contiene entre 18-40 subunidades, (iii) que tiene una secuencia de bases que es complementaria de al menos 12 bases contiguas de un sitio de corte y empalme en el transcrito de miostatina humana preprocesado que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 13, (iv) en el que el compuesto oligonucleotídico incluye una secuencia de bases como se establece en SEQ ID NO: 3, (v) en el que el oligonucleótido es eficaz para formar en condiciones rigurosas de hibridación un heterodúplex con una región sensible a la expresión de un transcrito de ARN de miostatina humana preprocesado definido en su forma procesada por SEQ ID NO: 6, teniendo el heterodúplex una Tm sustancialmente superior a 37 °C, y (vi) en el que el compuesto oligonucleotídico bloquea la producción de una transcripción de miostatina procesada de longitud completa a partir de una transcripción de miostatina preprocesada.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular
Campo de la invención
Esta invención se refiere a compuestos y usos de los mismos para tratar afecciones patológicas de desgaste muscular y, adicionalmente, para influir en el desarrollo del tejido muscular en sujetos mamíferos.
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Antecedentes de la invención
La miostatina, o factor 8 de crecimiento/diferenciación (GDF-8), pertenece a la superfamilia del factor 6 de crecimiento transformante (TGF-B) (McPherron, Lawler et al. 1997).
Se ha clonado el gen de miostatina humana (González-Cadavid, Taylor et al. 1998) y se ha informado que la miostatina se expresa en gran medida en el músculo esquelético humano y desempeña una función esencial en la regulación negativa del crecimiento y desarrollo del músculo esquelético (González -Cadavid, Taylor et al. 1998).
Los ratones recombiantes proporcionaron la primera evidencia de que la miostatina cumple una función clave en la regulación negativa del desarrollo muscular (McPherron, Lawler et al. 1997). Los ratones sin miostatina eran normales excepto que eran significativamente más grandes que los ratones de tipo silvestre y tenían un aumento grande y generalizado de la masa del músculo esquelético. Adicionalmente, también se determinó que dos razas de ganado, con la característica hereditaria de aumento de la masa muscular, tienen mutaciones en la secuencia de codificación de la miostatina (McPherron and Lee 1997). Adicionalmente, las concentraciones séricas e intramusculares de miostatina aumentan en hombres infectados por VIH con desgaste muscular en comparación con hombres sanos (González-Cadavid, Taylor et al. 1998). Estos datos apoyan la función de la miostatina como regulador negativo del crecimiento del músculo esquelético en hombres adultos y como contribuyente al desgaste muscular en hombres infectados por el VIH.
Hasta ahora, se han propuesto métodos para tratar afecciones de desgaste muscular y/o mejorar la masa muscular en mamíferos al manipular los niveles de miostatina. Por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nos. 6,103,466 y 6,617,440, y las solicitudes de patente estadounidenses publicadas de Estados Unidos 2004/242528 A1 y 20030074680 A1 divulgan métodos para inhibir niveles de miostatina expresada al administrar a un sujeto humano o animal, un compuesto antisentido contra la transcripción de miostatina. Hasta la fecha, no hay evidencia de que dichos enfoques hayan tenido éxito o tendrían éxito según lo divulgado, o cómo se seleccionarían y monitorizarían los sujetos durante el tratamiento. Por tanto, subsiste la necesidad de una composición para uso en un método de tratamiento para tratar eficazmente el desgaste muscular como resultado de una afección tal como parálisis o estado de enfermedad tal como, por ejemplo, envejecimiento, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, esclerosis múltiple y cáncer. También subsiste la necesidad de un agente antisentido que se pueda acumular eficazmente en las células musculares diana, por ejemplo, con la administración oral, e inhibir la expresión de miostatina en las células musculares.
También se han propuesto métodos para mejorar la masa muscular en animales productores carne, mediante la administración de agentes antisentido anti-miostatina. Sin embargo, hasta la fecha, dichos enfoques no han demostrado ser prácticos debido a la mala absorción de los agentes y/o la incapacidad para administrar los agentes por vía oral. Por tanto, sería deseable proporcionar un agente que pudiera suministrarse por vía oral, por ejemplo, en la alimentación animal, para mejorar la masa muscular en los animales productores de carne.
Resumen de la invención
La invención incluye, en un aspecto, una composición antisentido para uso en el aumento de la masa del músculo esquelético en un sujeto humano. La composición antisentido incluye un compuesto de oligonucleótido resistente a nucleasa (i) que se compone de subunidades de morfolino y enlaces intersubunitarios que contienen fósforo que une un nitrógeno morfolino de una subunidad a un carbono exocíclico de 5' de una subunidad adyacente; (ii) que contiene entre 18-40 subunidades; y (iii) que tiene una secuencia base que es complementaria a al menos 12 bases contiguas de un sitio de corte y empalme en el transcripción de miostatina humana preprocesado que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 13, (iv) en el que el compuesto de oligonucléotidos incluye una secuencia de bases como se establece en la SEQ ID NO: 3, (v) en el que el oligonucleótido es eficaz para formar bajo condiciones rigurosas de hibridación un heterodúplex a una región sensible a la expresión de la transcripción de ARN de miostatina humana preprocesada, definida, en su forma procesada, por la SEQ ID NO: 6, el heterodúplex tiene una Tm sustancialmente superior a 37 °C, y (vi) en el que el compuesto de oligonucleótidos bloquea la producción de una transcripción de miostatina procesada de longitud completa a partir de una transcripción de miostatina preprocesada.
Las subunidades de morfolino en el compuesto pueden unirse mediante enlaces entre subunidades, de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000004_0001
donde Yi = 0, Z = 0, Pj es una fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, a una base en un polinudeótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi o -NR2, en el que cada R es independientemente H o alquilo.
El compuesto antisentido de la composición se puede conjugar con un polipéptido rico en arginina eficaz para promover la captación del compuesto en las células musculares diana. Un péptido rico en arginina ejemplar tiene una de las secuencias identificadas como las SEQ ID NO: 7-9. El péptido rico en arginina se puede acoplar covalentemente en su terminal C al extremo 5' del compuesto antisentido.
En otro aspecto, la invención incluye la composición para utilizar en un método para tratar la pérdida de masa de músculo esquelético en un sujeto humano. Las etapas del método implican (a) medir los niveles de miostatina en sangre o tejido en el sujeto, (b) administrar al sujeto, una cantidad inhibidora de la expresión de miostatina de la composición antisentido descrita anteriormente, (c) mediante esta administración, formando dentro de las células musculares diana en el sujeto, una estructura heterodúplex de pares de bases compuesta de transcripción de ARN de miostatina humana y el compuesto antisentido y que tiene una Tm de disociación de al menos 45 °C, inhibiendo de esta manera la expresión de miostatina en dichas células, (d) en un tiempo seleccionado después de la administración del compuesto antisentido, medir un nivel de miostatina en sangre o tejido en el sujeto, y (e) repetir la administración, utilizando los niveles de miostatina medidos en (d) para ajustar la dosis o programa de dosificación de la cantidad de antisentido compuesto administrado, si es necesario, para reducir los niveles medidos de miostatina sobre los medidos inicialmente y mantener dichos niveles de miostatina medidos en la etapa (d) dentro de un rango determinado para individuos sanos normales.
En una realización general, el valor de miostatina medido en la etapa (a) está por encima de un umbral seleccionado para personas sanas normales. Las etapas de administración y medición se llevan a cabo preferiblemente durante un período seleccionado de al menos 2 semanas. La administración puede ser por ruta oral.
También forma parte del uso de la composición un método para medir los niveles de expresión de miostatina en un sujeto mamífero, al (a) administrar al sujeto, una cantidad inhibidora de la expresión de miostatina del compuesto antisentido sustancialmente no cargado del tipo descrito anteriormente, (b) dentro de aproximadamente 8-72 horas después de la administración, analizar una muestra de fluido corporal obtenida del sujeto para detectar la presencia de un heterodúplex conformado por el compuesto antisentido y una región complementaria de dicha transcripción de ARN de miostatina, para determinar la concentración de la transcripción en dicha muestra.
También se divulga una composición alimenticia para un animal productor de carne, compuesta de una sustancia alimenticia, y mezclada con ella, un compuesto antisentido sustancialmente no cargado del tipo descrito anteriormente.
Estos y otros objetos y características de la invención serán más evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada junto con las figuras y ejemplos acompañantes.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 muestra varias subunidades de tipo morfolino preferidas que tienen grupos de enlace de 5 átomos (A), seis átomos (B) y siete átomos (C-D) adecuados para formar polímeros; y
Las FIGS. 2A-D muestran el segmento de subunidades repetidas de oligonucleótidos morfolino ejemplares que tienen enlaces que contienen fósforo, designados A a D, construidos utilizando las subunidades A-D, respectivamente, de la FIG. 1.
Descripción detallada de la invención
I. Definiciones
Los términos siguientes, como se utilizan en este documento, tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario.
Los términos “oligonucleótidos antisentido”, “oligómero antisentido” y “compuesto antisentido” se utilizan indistintamente y se refieren a un compuesto que tiene una secuencia de bases de nucleótidos y una cadena principal de subunidad a subunidad que permite que el oligómero antisentido se hibride con una secuencia diana en ARN por emparejamiento de bases Watson-Crick, para formar un heterodúplex ARN: oligómero dentro de la secuencia diana. El oligonucleótido antisentido incluye una secuencia de bases heterocíclicas de purina y pirimidina, soportadas por una cadena principal, que son eficaces para formar enlaces de hidrógeno con las bases contiguas correspondientes en una secuencia de ácidos nucleicos diana. La cadena principal está compuesta por fracciones de cadena principal de subunidades que soportan las bases heterocíclicas de purina y pirimidina en posiciones que permiten dicho enlace de hidrógeno. Estas fracciones de la cadena principal son fracciones cíclicas de 5 a 7 átomos de longitud, ligadas entre sí por enlaces que contienen fósforo de uno a tres átomos de longitud.
Un oligonucleótido “morfolino” se refiere a una molécula polimérica que tiene una cadena principal que soporta bases capaces de unirse por enlaces de hidrógeno a polinucleótidos típicos, en los que el polímero carece de una fracción de cadena principal de azúcar pentosa, y más específicamente una cadena principal de ribosa ligada por enlaces fosfodiéster que es típico de nucleótidos y nucleósidos, pero en su lugar contiene un anillo de nitrógeno con acoplamiento a través del anillo de nitrógeno. Un oligonucleótido “morfolino” preferido está compuesto por estructuras de subunidades morfolino de la forma mostrada en la Fig. 1A-1D, donde (i) las estructuras se ligan por enlaces que contienen fósforo, de uno a tres átomos de longitud, que unen el nitrógeno morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, y (ii) Pi y Pj son fracciones de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaces para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido. Las estructuras ejemplares de oligonucleótidos antisentido para uso en la invención incluyen los tipos de subunidades morfolino mostradas en las Figs. 1A-1D, con los enlaces sin carga que contienen fósforo mostrados en las Figs. 2A-2D.
Como se utiliza en este documento, un oligonucleótido u oligómero antisentido “se hibrida específicamente” con un polinucleótido diana si el oligómero se hibrida con la diana bajo condiciones fisiológicas, con un punto de fusión térmico (Tm) sustancialmente superior a 37 °C, preferiblemente al menos 45 °C, y normalmente 50 °C-80 °C o más. Dicha hibridación corresponde preferiblemente a condiciones de hibridación rigurosas, seleccionadas para que sean aproximadamente 10 °C y preferiblemente aproximadamente 50 °C más bajas que la Tm para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. A una fuerza iónica y un pH dados, la Tm es la temperatura a la que el 50 % de una secuencia diana se hibrida con un polinucleótido complementario.
Los polinucleótidos se describen como “complementarios” entre sí cuando se produce la hibridación en una configuración antiparalela entre dos polinucleótidos de cadena sencilla. Un polinucleótido de cadena doble puede ser “complementario” de otro polinucleótido, si se puede producir la hibridación entre una de las cadenas del primer polinucleótido y el segundo. La complementariedad (el grado en que un polinucleótido es complementario con otro) es cuantificable en términos de la proporción de bases en cadenas opuestas que se espera que formen enlaces de hidrógeno entre sí, de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases generalmente aceptadas. Un compuesto antisentido puede ser complementario a una región diana de una transcripción diana incluso si las secuencias de dos bases no son 100 % complementarias, siempre que la estructura heterodúplex formada entre el compuesto y la transcripción tenga la estabilidad Tm deseada.
Como se utiliza en el presente documento, el término “análogo” con referencia a un oligómero significa una sustancia que posee propiedades tanto estructurales como químicas similares a las del oligómero de referencia.
Como se utiliza en el presente documento, una primera secuencia es una “secuencia antisentido” o “secuencia diana” con respecto a una segunda secuencia o “secuencia diana” si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia se une específicamente a, o se hibrida específicamente con, la segunda secuencia de polinucleótidos bajo condiciones fisiológicas.
Como se utiliza en este documento, “cantidad eficaz” en relación con un oligómero antisentido se refiere a la cantidad de oligómero antisentido administrada a un sujeto, ya sea como una dosis única o como parte de una serie de dosis que son eficaces para inhibir la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos diana.
Como se utiliza en este documento, una “región sensible a la expresión” de una transcripción de ARNm procesada o preprocesada se refiere a (i) una región que incluye o adyacente al sitio de inicio AUG de una transcripción procesada, donde la formación de un heterodúplex de transcripción antisentido es eficaz para inhibir la traducción de la transcripción o (ii) una región que incluye o adyacente a una unión de sitio de corte y empalme donante o aceptor en una transcripción preprocesada, donde la formación de un heterodúplex de transcripción antisentido es eficaz para inhibir la formación de una transcripción procesada de longitud completa, ya sea porque o se han eliminado más exones que normalmente se incluirían en la transcripción o porque la transcripción se ha truncado en el sitio de corte y empalme diana.
Un agente es “absorbido activamente por las células de mamífero” cuando el agente puede entrar en la célula mediante un mecanismo distinto de la difusión pasiva a través de la membrana celular. El agente puede transportarse, por ejemplo, mediante “transporte activo”, que se refiere al transporte de agentes a través de la membrana de una célula de mamífero mediante, por ejemplo, un mecanismo de transporte dependiente de ATP, o mediante “transporte facilitado”, que se refiere al transporte de agentes antisentido a través de la membrana celular mediante un mecanismo de transporte que requiere la unión del agente a una proteína de transporte, que luego facilita el paso del agente unido a través de la membrana. Tanto para el transporte activo como para el facilitado, el compuesto de oligonucléotidos tiene una cadena principal sustancialmente no cargada, como se define a continuación. Además, el análogo se puede conjugar, por ejemplo, en su extremo 5' o 3', con un péptido rico en arginina, por ejemplo, la proteína TAT del VIH o poliarginina, para facilitar el transporte en la célula anfitriona diana, como se describe a continuación.
Como se utiliza en este documento, el término “oligómero antisentido de miostatina” se refiere a un oligómero antisentido de morfolino ligado a fósforo resistente a nucleasa que tiene alta afinidad para (es decir, que “se hibrida específicamente con”) una secuencia de ácidos nucleicos de miostatina humana complementaria o casi complementaria.
Como se utiliza en el presente documento, “tratamiento” de un individuo o una célula es cualquier tipo de intervención utilizada en un intento de alterar el curso natural del individuo o célula. El tratamiento incluye, pero no se limita a, la administración de, por ejemplo, una composición farmacéutica, y se puede realizar de forma profiláctica o después del inicio de un evento patológico o contacto con un agente etiológico.
II. Composición antisentido para utilizar en la práctica de la invención
Compuesto antisentido. Los compuestos antisentido de acuerdo con la presente invención son compuestos antisentido sustancialmente no cargados (i) que se componen de subunidades morfolino y enlaces de intersubunidad que contienen fósforo que unen un nitrógeno morfolino de una subunidad a un carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente; (ii) que son capaces de captación mediante células musculares diana en el sujeto; (iii) que contienen entre 10 y 40 bases de nucleótidos; (iv) que tienen una secuencia de bases eficaz para hibridar con una región sensible a la expresión de la transcripción de ARN de miostatina humana procesada o preprocesada, identificada, en su forma procesada, por la SEQ ID NO: 6; para formar un complejo heterodúplex que tiene una Tm sustancialmente superior a 37 °C, preferiblemente al menos 45 °C, y (vi) resistencia a nucleasa.
Además, el compuesto antisentido puede tener la capacidad de transporte activo o facilitado según se evidencia mediante (i) la unión competitiva con un oligómero antisentido de fosforotioato y/o (ii) la capacidad de transportar un indicador detectable a las células diana.
Los oligómeros antisentido candidatos se pueden evaluar, de acuerdo con métodos bien conocidos, para toxicidad celular aguda y crónica, tal como el efecto sobre la síntesis de proteínas y ADN según se mide mediante la incorporación de 3H-leucina y 3H-timidina, respectivamente. Además, varios oligonucleótidos de control, por ejemplo, oligonucleótidos de control tales como secuencias antisentido con sentido, sin sentido y mezcladas, o secuencias que contienen bases emparejadas de forma incorrecta, para confirmar la especificidad de la unión de oligómeros antisentido candidatos. El resultado de dichas pruebas es importante para discernir los efectos específicos de la inhibición antisentido de la expresión génica de la supresión indiscriminada. De acuerdo con lo anterior, las secuencias se pueden modificar según sea necesario para limitar la unión no específica de oligómeros antisentido a secuencias de ácido nucleico no diana.
Formación de heterodúplex. La eficacia de un compuesto antisentido dado para formar un heterodúplex con el ARNm diana se puede determinar mediante métodos de cribado conocidos en la técnica. Por ejemplo, el oligómero se incuba en un cultivo celular que contiene un ARNm expresado preferentemente en linfocitos activados, y el efecto sobre el ARNm diana se evalúa al monitorizar la presencia o ausencia de (1) formación de heterodúplex con la secuencia diana y secuencias no diana utilizando procedimientos conocido por aquellos expertos en la técnica, (2) la cantidad de ARNm diana expresada por linfocitos activados, según se determina mediante técnicas estándar como RT-PCR o electrotransferencia Northern, (3) la cantidad de proteína transcrita a partir del ARNm diana, según se determina mediante técnicas estándar tales como ELISA o electrotransferencia Western. (Véase, por ejemplo, (Pari, Field et al. 1995; Anderson, Fox et al. 1996).
Captación en células. Una segunda prueba mide el transporte celular, al examinar la capacidad del compuesto de prueba para transportar un indicador marcado, por ejemplo, un indicador de fluorescencia, al interior de células, por ejemplo, miocitos cultivados. Las células se incuban en presencia de compuesto de prueba marcado, agregado a una concentración final entre aproximadamente 10-300 nM. Después de incubación durante 30-120 minutos, las células se examinan, por ejemplo, mediante microscopía o análisis FACS, en busca de marcado intracelular. La presencia de un marcador intracelular significativo es una prueba de que el compuesto de prueba se transporta mediante transporte activo o facilitado.
En una realización de la invención, la captación en las células se mejora mediante la administración del compuesto antisentido en combinación con un péptido rico en arginina ligado al extremo 5' o 3' del oligómero antisentido. El péptido tiene normalmente de 8 a 16 aminoácidos y consiste en una mezcla de arginina y otros aminoácidos que incluyen fenilalanina y cisteína, como se discute más adelante.
Resistencia a la ARNasa. Se han propuesto dos mecanismos generales para explicar la inhibición de la expresión por oligonucleótidos antisentido (Agrawal, Mayrand et al. 1990; Bonham, Brown et al. 1995; Boudvillain, Guerin et al.
1997). En el primero, un heterodúplex formado entre el oligonucleótido y el ARN viral actúa como sustrato para la ARNasaH, lo que conduce a la escisión del ARN. Los oligonucleótidos que pertenecen, o que se propone que pertenezcan, a esta clase incluyen fosforotioatos, fosfotriésteres y fosfodiésteres (oligonucleótidos “naturales” no modificados). Dichos compuestos exponen el ARN en una estructura de oligómero: dúplex de ARN a la hidrólisis por RNasaH y, por lo tanto, a la pérdida de función.
No se ha observado que una segunda clase de análogos de oligonucleótidos, denominados “bloqueadores estéricos” o, alternativamente, “RNasaH inactivo” o “RNasaH resistente”, actúen como sustrato para RNasaH y actúen al bloquear estéricamente el transporte nucleocitoplasmático del ARN diana, corte y empalme, traducción o replicación. Esta clase incluye metilfosfonatos (Toulme, Tinevez et al. 1996), oligonucleótidos morfolino, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ciertos oligonucleótidos modificados con 2-O-alilo o 2'-O-alquilo (Bonham, Brown et al.
1995), y Fosforamidatos n3'->P' (Ding, Grayaznov et al. 1996; Gee, Robbins et al. 1998).
Se puede ensayar un oligómero de prueba para su resistencia a RNasaH al formar un dúplex de ARN: oligómero con el compuesto de prueba, luego incubar el dúplex con RNasaH bajo condiciones de ensayo estándar, como se describe (Stein, Foster et al. 1997). Después de la exposición a RNasaH, se puede monitorizar la presencia o ausencia de dúplex intacto mediante electroforesis en gel o espectrometría de masas.
Captación in vivo. De acuerdo con otro aspecto de la divulgación, se proporciona una prueba rápida y sencilla para confirmar que un tipo de oligómero antisentido dado proporciona las características requeridas indicadas anteriormente, a saber, Tm alta, capacidad para ser absorbida activamente por las células huésped y resistencia sustancial a RNasaH. Este método se basa en el descubrimiento de que un compuesto antisentido diseñado apropiadamente formará un heterodúplex estable con la porción complementaria del ARN diana cuando se administra a un sujeto mamífero, y el heterodúplex aparece posteriormente en la orina (u otro fluido corporal). Los detalles de este método también se dan en la patente de EE.UU. No. 6,365,351 de copropiedad para “Método no invasivo para detectar ARN diana”.
Brevemente, un oligómero morfolino de prueba que tiene una estructura principal que contiene fósforo no cargado a evaluar, y que tiene una secuencia de bases dirigida contra una secuencia de ARN de miostatina conocida (no necesariamente una región sensible a la expresión del transcrito de ARN), se inyecta en un sujeto mamífero.
Varias horas (típicamente 8-72) después de la administración, se analiza en la orina la presencia del heterodúplex de ARN antisentido. Si se detecta heterodúplex, la estructura principal es adecuada para su uso en los oligómeros antisentido de la presente invención.
El oligómero de prueba puede marcarse, por ejemplo, mediante una etiqueta fluorescente o radiactiva, para facilitar los análisis posteriores, si es apropiado para el sujeto mamífero. El ensayo puede estar en cualquier formato de fase sólida o fluido adecuado. Generalmente, un ensayo en fase sólida implica en primer lugar unir el analito heterodúplex a un soporte en fase sólida, por ejemplo, partículas o un polímero o sustrato de tira de prueba, y detectar la presencia/cantidad de heterodúplex unido. En un ensayo en fase fluida, la muestra de analito normalmente se pretrata para eliminar los componentes de la muestra que interfieren. Si el oligómero está marcado, la presencia del heterodúplex se confirma detectando los marcadores de etiqueta. Para los compuestos no marcados, el heterodúplex puede detectarse mediante inmunoensayo si está en formato de fase sólida o mediante espectroscopía de masas u otros métodos conocidos si está en formato de solución o suspensión.
Características estructurales. Como se detalló anteriormente, el oligómero antisentido tiene una secuencia de bases dirigida a una porción objetivo de un gen celular, preferiblemente la región en o adyacente al codón de inicio o un transcrito procesado o una región en o adyacente a una unión del sitio de empalme del ARNm de miostatina o transcripto preprocesado. Además, el oligómero puede inhibir eficazmente la expresión del gen diana cuando se administra a una célula huésped, por ejemplo, en un mamífero. Este requisito se cumple cuando el compuesto oligomérico (a) tiene la capacidad de ser absorbido por las células musculares y (b) una vez absorbido, forma un dúplex con el ARN diana con una Tm superior a aproximadamente 45 °C, preferiblemente superior a 50 °C.
La capacidad de ser absorbido selectivamente por células inmunes activadas requiere, en parte, que la cadena principal del oligómero esté sustancialmente sin carga. La capacidad del oligómero para formar un dúplex estable con el ARN diana dependerá de la estructura principal del oligómero, la longitud y el grado de complementariedad del oligómero antisentido con respecto a la diana, la relación de coincidencias de base G: C a A: T, y las posiciones de cualquier base no emparejada. La capacidad del oligómero antisentido para resistir las nucleasas celulares promueve la supervivencia y la administración final del agente al citoplasma celular.
Los oligonucleótidos antisentido de 15-20 bases son generalmente lo suficientemente largos como para tener una secuencia complementaria en el genoma de mamífero. Además, los compuestos antisentido que tienen una longitud de al menos 12, normalmente al menos 15 nucleótidos de longitud, hibridan bien con su ARNm diana. Debido a su hidrofobicidad, los oligonucleótidos antisentido tienden a interactuar bien con las membranas de fosfolípidos, y se ha sugerido que después de la interacción con la membrana plasmática celular, los oligonucleótidos se transportan activamente a las células vivas (Loke, Stein et al. 1989; Yakubov, Deeva et al. al.1989; Anderson, Xiong et al.1999). Se ha demostrado que los oligonucleótidos de morfolino, particularmente los oligonucleótidos de morfolino unidos a fosforamidato o fosforodiamidato, tienen altas afinidades de unión por ácidos nucleicos complementarios o casi complementarios. Los oligómeros morfolino también exhiben poca o ninguna actividad antisentido no específica, proporcionan buena solubilidad en agua, son inmunes a las nucleasas y están diseñados para tener bajos costes de producción (Summerton y Weller 1997).
Los oligonucleótidos morfolino (incluidos los oligómeros antisentido) se detallan, por ejemplo, en las patentes estadounidenses de copropiedad No. 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185, 444, 5,521,063 y 5,506,337.
Como se señaló anteriormente, los oligómeros antisentido para usar en la práctica de la invención están compuestos de subunidades morfolino de la forma mostrada en las patentes citadas anteriormente, donde (i) los grupos morfolino están unidos entre sí por enlaces que contienen fósforo no cargado, uno a tres átomos de largo, uniendo el nitrógeno morfolino de una subunidad al carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, y (ii) la base unida al grupo morfolino es una fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, por base específica enlace de hidrógeno, a una base en un polinucleótido. La fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina es típicamente adenina, citosina, guanina, uracilo o timina. La preparación de tales oligómeros se describe en detalle en la Patente de Estados Unidos No. 5,185,444 (Summerton et al., 1993. Como se muestra en esta referencia, se pueden usar varios tipos de enlaces no iónicos para construir una estructura principal morfolino. Las estructuras de subunidades ejemplares para los oligonucleótidos antisentido de la invención incluyen los tipos de subunidades de morfolino mostrados en las Figs. 1A-D, cada una unida por un enlace de subunidad que contiene fósforo, sin carga, como se muestra en las Figs. 2A-2D, respectivamente. En estas figuras, la fracción X pendiente del fósforo puede ser cualquiera de los siguientes: flúor; un alquilo o alquilo sustituido; un alcoxi o alcoxi sustituido; un tioalcoxi o tioalcoxi sustituido; o un nitrógeno no sustituido, monosustituido o disustituido, incluidas las estructuras cíclicas. Alquilo, alcoxi y tioalcoxi incluyen preferiblemente de 1 a 6 átomos de carbono y más preferiblemente de 1 a 4 átomos de carbono. El nitrógeno monosustituido o disustituido se refiere preferiblemente a la sustitución de alquilo inferior, y las estructuras cíclicas son preferiblemente heterociclos de nitrógeno de 5 a 7 miembros que contienen opcionalmente 1-2 heteroátomos adicionales seleccionados entre oxígeno, nitrógeno y azufre. Z es azufre u oxígeno y preferiblemente es oxígeno.
La Fig. 1A muestra un enlace que contiene fósforo que forma la estructura principal de cinco átomos de unidades repetidas que se muestra en la Fig. 2A, donde los anillos de morfolino están unidos por un enlace fosfoamida de 1 átomo. La subunidad B en la Fig. 1B está diseñada para estructuras principales de unidades repetidas de 6 átomos, como se muestra en la Fig. 2B. En la Fig. 1B, el átomo Y que une el carbono morfolino 5' con el grupo fósforo puede ser azufre, nitrógeno, carbono o, preferiblemente, oxígeno. La fracción X colgante del fósforo puede ser cualquiera de los siguientes: flúor; un alquilo o alquilo sustituido; un alcoxi o alcoxi sustituido; un tioalcoxi o tioalcoxi sustituido; o un nitrógeno no sustituido, monosustituido o disustituido, incluidas las estructuras cíclicas. Z es azufre u oxígeno y preferiblemente es oxígeno. Los oligonucleótidos de morfolino particularmente preferidos incluyen aquellos compuestos por estructuras de subunidades de morfolino de la forma mostrada en la Fig. 2B, donde X es una amina o alquilamina de la forma X = NR2, donde R es independientemente H o CH3, es decir, donde X = NH2, X = NHCH3 o X = N (CH3)2, Y = O y Z = O.
Las subunidades C-D en las Figs. 1C-D están diseñadas para estructuras principales de longitud unitaria de 7 átomos como se muestra para las estructuras en las Figs. 2C y D. En la Estructura C, la fracción X es como en la Estructura B, y la fracción Y puede ser metileno, azufre o preferiblemente oxígeno. En la Estructura D, las fracciones X e Y son como en la Estructura B. En todas las subunidades representadas en las Figs. 1 y 2, cada Pi y Pj es una fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante enlace de hidrógeno específico de base, a una base en un polinucleótido, y se selecciona preferiblemente de adenina, citosina, guanina y uracilo.
Como se indicó anteriormente, el oligómero sustancialmente no cargado puede incluir ventajosamente un número limitado de enlaces cargados, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 por cada 5 enlaces no cargados. En el caso de los oligómeros morfolino, tal enlace cargado puede ser un enlace como se representa en cualquiera de las Figs.
2A-D, preferiblemente Fig. 2B, donde X es óxido (-O-) o sulfuro (-S-).
Se prefiere especialmente un oligómero morfolino sustancialmente no cargado tal como el ilustrado por el oligómero morfolino fosforodiamidato (PMO) mostrado en la Fig. 3G. Se apreciará que una estructura principal sustancialmente sin carga puede incluir uno o más, por ejemplo, hasta un 10-20 % de enlaces intersubunitarios cargados, típicamente enlaces de fósforo cargados negativamente.
Dianas antisentido preferidas. En el método y la composición de la invención, el oligómero antisentido está diseñado para hibridar con una región sensible a la expresión de la secuencia de ácido nucleico de miostatina, en condiciones fisiológicas con una Tm sustancialmente mayor de 37 °C., Por ejemplo, al menos 50 °C. y preferiblemente 60 °C. hasta 80 °C. El compuesto antisentido está diseñado para tener una alta afinidad de unión al ácido nucleico y puede ser 100 % complementario a la secuencia diana de miostatina o puede incluir emparejamientos incorrectos, por ejemplo, para acomodar variantes alélicas, siempre que el heterodúplex formado entre el oligómero y la diana de miostatina La secuencia es suficientemente estable para resistir la acción de las nucleasas celulares y otros modos de degradación durante su tránsito de la célula al fluido corporal. Los emparejamientos incorrectos, si están presentes, son menos desestabilizadores hacia las regiones finales del dúplex híbrido que en el medio. El número de emparejamientos incorrectos permitidos dependerá de la longitud del oligómero, el porcentaje de par de bases G: C en el dúplex y la posición del o de los emparejamientos incorrectos en el dúplex, de acuerdo con principios bien entendidos de estabilidad de dúplex.
Aunque tal oligómero antisentido no es necesariamente 100 % complementario a la secuencia diana de miostatina, es eficaz para unirse de forma estable y específica a la secuencia diana de manera que se modula la expresión de miostatina. La longitud apropiada del oligómero para permitir una unión estable y eficaz combinada con una buena especificidad es de aproximadamente 8 a 40 unidades de base de nucleótidos, y preferiblemente de aproximadamente 12 a 25 nucleótidos. También se contemplan las bases de oligómeros que permiten el emparejamiento de bases degeneradas con las bases diana, asumiendo que se mantiene la especificidad del par de bases con la diana.
En un enfoque preferido, la diana para la modulación de la expresión génica usando los métodos antisentido de la presente invención comprende una secuencia que abarca o es adyacente al codón de inicio de la traducción del ARNm para la miostatina. En un enfoque alternativo preferido, se dirige una región aceptora o donante de empalme de ARNm de miostatina preprocesado. Se entenderá que pueden dirigirse otras regiones del ARNm de miostatina, que incluyen una o más de un sitio iniciador o promotor, un sitio de unión de intrón o exón, una región 3' sin traducir y una región 5' sin traducir. Se entenderá además que tanto el ARN empalmado como el no empalmado pueden servir como molde para el diseño de oligómeros antisentido para su uso en los métodos de la invención (véase, por ejemplo, Hudziak, Summerton et al. 2000). La Tabla 1 a continuación enumera regiones diana ejemplares en el gen de la miostatina humana (SEQ ID NO: 10-14). El objetivo del sitio de inicio de la traducción (MSTN-AUG) cubre una región de -28 a 24 en relación con el residuo A del codón de inicio ATG (mostrado en negrita). La región de nucleótidos (región Nct.) Es relativa a una secuencia de cromosomas artificiales bacterianos humanos (número de acceso de GenBank AC073120) que contiene el gen de la miostatina. Para las dianas donante de empalme (SD) y aceptor de empalme (SA), el sitio de empalme se indica dentro de la secuencia con “/”. Las regiones diana específicas para los oligómeros antisentido enumerados en la Tabla 2 están contenidas dentro de las secuencias diana mostradas en la Tabla 1 y son ejemplares. Se prevé completamente que los oligómeros antisentido alternativos que se dirigen a diferentes secuencias dentro de las mostradas en la Tabla 1 funcionarían para disminuir eficazmente la expresión del gen de la miostatina.
Tabla 1. Regiones objetivo de la miostatina humana
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En la Tabla 2, a continuación, se proporcionan ejemplos de oligómeros antisentido para miostatina y sus dianas. El complemento del codón de inicio de traducción de miostatina se indica en negrita.
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Por ejemplo, el oligómero antisentido es un PMO que contiene las secuencias presentadas como SEQ ID NO: 1-5. La eficacia de una molécula de oligómero antisentido dada para formar un heterodúplex con el ARN diana puede determinarse mediante métodos de cribado conocidos en la técnica. Por ejemplo, el oligómero se incuba en un cultivo celular que expresa miostatina y el efecto sobre el ARN diana se evalúa controlando la presencia o ausencia de (1) formación de heterodúplex con la secuencia diana y secuencias no diana usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, (2) la cantidad de ARNm de miostatina, según se determina mediante técnicas estándar como RT-PCR o inmunotransferencia Northern, o (3) la cantidad de proteína de miostatina, según se determina mediante técnicas estándar como ELISA o inmunotransferencia (por ejemplo, inmunotransferencia Western).
III. Composiciones para su uso en el tratamiento del desgaste muscular
La invención proporciona composiciones para su uso en el tratamiento de la desgaste muscular con un oligonucleótido antisentido dirigido contra una secuencia de ácido nucleico que codifica miostatina, y se basa en el descubrimiento de un compuesto antisentido morfolino unido a fósforo, estable, sustancialmente no cargado, caracterizado por una alta Tm, capaz de transporte activo o facilitado a las células, y capaz de unirse con alta afinidad a una secuencia de ácido nucleico de miostatina complementaria o casi complementaria, puede administrarse a un sujeto o paciente humano e inhibir la expresión de miostatina por las células musculares dando como resultado un aumento de crecimiento muscular.
La administración in vivo de un oligómero antisentido de miostatina a un sujeto usando los métodos descritos en este documento puede dar como resultado una masa muscular mejorada para el paciente, con el grado de mejora dependiente de la dosis y la frecuencia de la administración del oligómero antisentido de miostatina y el estado general del sujeto.
En las aplicaciones preferidas de las composiciones para su uso, el sujeto es un paciente humano al que se le ha diagnosticado una masa muscular degenerada o reducida secundaria a una indicación primaria o un estado de enfermedad como cáncer, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) o distrofia muscular. El paciente también puede ser uno que no tiene una enfermedad de desgaste muscular, pero necesita mantener o aumentar la masa y el tono muscular para compensar la pérdida normal de masa muscular a medida que envejece, o la pérdida de masa muscular debido a un período prolongado de inactividad.
Como primer paso, se analizan los niveles de miostatina del paciente, típicamente usando un ensayo estándar para medir los niveles de miostatina en suero. Véanse, por ejemplo, Yarasheski, et al., Schulte et al., Y Kirk, et al. para métodos y reactivos para medir niveles séricos inmunorreactivos de miostatina. Si los niveles medidos están por encima de un nivel de umbral seleccionado para individuos promedio normales, y típicamente más del 10-20 % por encima del umbral seleccionado, o si el paciente presenta de otra manera un desgaste muscular obvio, el paciente es un candidato para el uso de la composición de la invención. Los valores de umbral normales se pueden determinar para individuos sanos normales dentro de un cierto sexo y/o grupo de edad, por ejemplo, hombres en el grupo de edad de 20 a 35 años, pero más típicamente, se prefieren los valores para pacientes normales en la misma categoría que los pacientes de prueba, excepto para pacientes muy ancianos, por ejemplo, mayores de 70 años. Alternativamente, los niveles de transcripción de miostatina pueden determinarse usando el método de detección de heterodúplex descrito a continuación.
En otra realización, la composición se aplica a pacientes que probablemente sean candidatos a la pérdida de músculo, por ejemplo, aquellos que están sujetos a períodos prolongados de inactividad, incluso aunque los niveles medidos de miostatina pueden estar dentro de un rango normal.
Regímenes de tratamiento
Después de identificar al paciente como candidato de tratamiento, se administra al paciente una cantidad del compuesto antisentido eficaz para elevar los niveles de miostatina medidos durante un período de respuesta adecuado, por ejemplo, 1-3 días después de la administración del compuesto antisentido.
De acuerdo con la invención, la administración eficaz de un oligómero antisentido a un sujeto humano puede incluir, entre otras, varias rutas sistémicas, incluidas las rutas oral y parenteral, por ejemplo, intravenosa (IV), subcutánea, intraperitoneal (IP) e intramuscular; así como por inhalación y administración transdérmica. Se aprecia que también se contempla cualquier método eficaz para administrar un oligómero antisentido de miostatina en el torrente sanguíneo de un sujeto. El suministro transdérmico de oligómeros antisentido se puede lograr mediante el uso de un vehículo farmacéuticamente aceptable adaptado para, por ejemplo, la administración tópica. Un ejemplo de liberación de oligómeros morfolino se describe en la solicitud de patente PCT WO 97/40854.
En una realización preferida, el oligómero es un oligómero morfolino fosforodiamidato (PMO), contenido en un portador farmacéuticamente aceptable y administrado por vía oral. En un aspecto adicional de esta realización, se administra un oligonucleótido antisentido de morfolino miostatina a intervalos regulares durante un período de tiempo corto, por ejemplo, diariamente durante dos semanas o menos. Sin embargo, en algunos casos, el oligómero antisentido se administra de forma intermitente durante un período de tiempo más largo.
Normalmente, se administran una o más dosis de oligómero antisentido, generalmente a intervalos regulares durante un período de aproximadamente una a dos semanas. Las dosis preferidas para la administración oral son desde aproximadamente 1 mg de oligómero/paciente hasta aproximadamente 100 mg de oligómero/paciente (basado en un peso adulto de 70 kg). En algunos casos, pueden ser necesarias dosis de más de 100 mg de oligómero por paciente. Para la administración intravenosa, las dosis preferidas son de aproximadamente 0,5 mg de oligómero/paciente a aproximadamente 10 mg de oligómero/paciente (basado en un peso adulto de 70 kg). El compuesto antisentido se administra generalmente en una cantidad suficiente para dar como resultado una concentración máxima en sangre de al menos 200-400 nM de oligómero antisentido. Se pueden administrar cantidades mayores o menores de oligonucleótido según se requiera y las dosis de mantenimiento pueden ser menores.
A intervalos regulares durante el tratamiento, por ejemplo, 1-3 días después de la administración del compuesto antisentido, se monitoriza al paciente para detectar cambios en los niveles de miostatina, por ejemplo, proteína inmunorreactiva de miostatina en suero. La dosis de compuesto antisentido administrada al paciente debe ser tal que reduzca el nivel de miostatina medido por encima del nivel medido inicialmente. Normalmente, se desea una disminución en el nivel de miostatina medido de al menos un 10-20 % sobre los niveles iniciales. Si los niveles medidos iniciales estaban por encima de un umbral seleccionado para individuos sanos normales, la dosis de compuesto antisentido se ajusta preferiblemente para llevar el nivel de miostatina dentro de este rango normal, y el tratamiento continúa, según sea necesario para mantener los niveles de miostatina dentro de este rango. El diagnóstico y la monitorización del desgaste muscular en general implican la monitorización de la pérdida de peso debido al aumento de la degradación del músculo esquelético (Wallace y Schwartz 2002). Estos métodos pueden ser cualitativos o cuantitativos.
En algunos casos, el régimen de tratamiento incluirá una intervención adicional como radioterapia, inmunoterapia y/o quimioterapia adicional. Dicho tratamiento puede tener lugar antes, durante o después de la administración del agente quimioterapéutico y del oligómero antisentido de miostatina.
Listado de secuencias
Figure imgf000011_0001
continuación
Figure imgf000012_0001
SEQ ID NO: 6
>gi | 4028595 | AF104922.1 | AF104922 Homo sapiens miostatina (GDFS) ARNm, cds completo
AGATTCACTGGTGTGGCAAGTTGTCTCTCAGACTGTACATGCATTAAAATTTTGCTTGGCATTACTCAAA AG CAAAAGAAAAGT AAAAGGAAG AAACAAGAAC AAGAAAAAAGAT TATAT TGATT TTAAAAT CATG CAAA AACTGCAACTCTGTGTTTATATTTACCTGTTTATGCTGATTGTTGCTGGTCCAGTGGATCTAAATGAGAA CAGTGAGCAAAAAGAAAATGTGGAAAAAGAGGGGCTGTGTAATGCATGTACTTGGAGACAAAACACTAAA TCTTCAAGAATAGAAGCCATTAAGATACAAATCCTCAGTAAACTTCGTCTGGAAACAGCTCCTAACATCA GCAAAGATGTTATAAGACAACTTTTACCCAAAGCTCCTCCACTCCGGGAACTGATTGATCAGTATGATGT CCAGAGGGATGACAGCAGCGATGGCTCTTTGGAAGATGACGATTATCACGCTACAACGGAAACAATCATT ACCATGCCTACAGAGTCTGATTTTCTAATGCAAGTGGATGGAAAACCCAAATGTTGCTTCTTTAAATTTA G CT CTAAAATACAATACAATAAAGT AGTAAAGGCCCAACT ATGGATATATTTGAGAC CCGT CGAGACT C C TACAACAGTGTTTGTGCAAATCCTGAGACTCATCAAACCTATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGGAATC CGATCTCTGAAACTTGACATGAACCCAGGCACTGGTATTTGGCAGAGCATTGATGTGAAGACAGTGTTGC AAAATTGGCTCAAACAACCTGAATCCAACTTAGGCATTGAAATAAAAGCTTTAGATGAGAATGGTCATGA TCTTGCTGTAACCTTCCCAGGACCAGGAGAAGATGGGCTGAATCCGTTTTTAGAGGTCAAGGTAACAGAC ACACCAAAAAGATCCAGAAGGGATTTTGGTCTTGACTGTGATGAGCACTCAACAGAATCACGATGCTGTC GTTACCCTCTAACTGTGGATTTTGAAGCTTTTGGATGGGATTGGATTATCGCTCCTAAAAGATATAAGGC CAATTACTGCTCTGGAGAGTGTGAATTTGTATTTTTACAAAAATATCCTCATACTCATCTGGTACACCAA GCAAACCCCAGAGGTTCAGCAGGCCCTTGCTGTACTCCCACAAAGATGTCTCCAATTAATATGCTATATT T TAATGG CAAAGAACAAAT AAT AT ATGGG AAAAT T C CAG CGATGGT AGT AGACCG CTGTGGGTGCT CATG AGATTTATATTAAGCGTTCATAACTTCCTAAAACATGGAAGGTTTTCCCCTCAACAATTTTGAAGCTGTG AAATTAAGTACCACAGGCTATAGGCCTAGAGTATGCTACAGTCACTTAAGCATAAGCTACAGTATGTAAA CTAAAAGGGGGAATATATGCAATGGTTGGCATTTAACCATCCAAACAAATCATACAAGAAAGTTTTATGA TTTCCAGAGTTTTTGAGCTAGAAGGAGATCAAATTACATTTATGTTCCTATATATTACAACATCGGCGAG GAAATGAAAGCGATTCTCCTTGAGTTCTGATGAATTAAAGGAGTATGCTTTAAAGTCTATTTCTTTAAAG

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición antisentido de un compuesto oligonucleotídico resistente a nucleasa (i) compuesto por subunidades morfolino y enlaces entre subunidades que contienen fósforo que unen un nitrógeno morfolino de una subunidad a un carbono exocíclico 5' de una subunidad adyacente, (ii) que contiene entre 18-40 subunidades, (iii) que tiene una secuencia de bases que es complementaria de al menos 12 bases contiguas de un sitio de corte y empalme en el transcrito de miostatina humana preprocesado que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 13, (iv) en el que el compuesto oligonucleotídico incluye una secuencia de bases como se establece en SEQ ID NO: 3, (v) en el que el oligonucleótido es eficaz para formar en condiciones rigurosas de hibridación un heterodúplex con una región sensible a la expresión de un transcrito de ARN de miostatina humana preprocesado definido en su forma procesada por SEQ ID NO: 6, teniendo el heterodúplex una Tm sustancialmente superior a 37 °C, y (vi) en el que el compuesto oligonucleotídico bloquea la producción de una transcripción de miostatina procesada de longitud completa a partir de una transcripción de miostatina preprocesada.
2. La composición de la reivindicación 1, en la que el heterodúplex formado por el compuesto oligonucleotídico tiene una disociación Tm de al menos 45 °C.
3. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que las subunidades morfolino están unidas por enlaces intersubunitarios, de acuerdo con la estructura:
Figure imgf000017_0001
en la que Y1 = O, Z = O, Pj es una fracción de emparejamiento de bases de purina o pirimidina eficaz para unirse, mediante enlaces de hidrógeno específicos de base, a una base en un polinucleótido, y X es alquilo, alcoxi, tioalcoxi o -NR2, en el que cada R es independientemente H o alquilo.
4. La composición de la reivindicación 3, en la que X es -NR2, en la que cada R es metilo.
5. La composición de la reivindicación 1, en la que el compuesto oligonucleotídico se conjuga con un péptido rico en arginina eficaz para promover la captación del compuesto en las células musculares diana.
6. La composición de la reivindicación 5, en la que el péptido rico en arginina tiene una de las secuencias identificadas como SEQ ID NO: 7-9.
7. La composición de la reivindicación 6, en la que el péptido rico en arginina tiene una secuencia de SEQ ID NO: 9.
8. La composición de la reivindicación 5, en la que el péptido rico en arginina está acoplado covalentemente en su terminal C al extremo del compuesto oligonucleotídico.
9. La composición de la reivindicación 8, en la que el péptido rico en arginina está acoplado covalentemente en su terminal C-al extremo 5' del compuesto oligonucleotídico.
10. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de la deficiencia de masa de músculo esquelético en un sujeto humano, en la que la composición se administra al sujeto en una cantidad inhibidora que expresa miostatina.
11. La composición para su uso de la reivindicación 10, en la que el sujeto a tratar tiene un nivel de miostatina por encima de un umbral seleccionado para individuos sanos normales.
12. La composición para uso de la reivindicación 11, en la que, en un tiempo seleccionado después de la administración, se va a medir un nivel de miostatina en sangre o tejido.
13. La composición para uso de la reivindicación 12, en la que la administración debe repetirse para reducir los niveles medidos de miostatina y mantener los niveles de miostatina en el sujeto dentro de un rango determinado para individuos sanos normales.
14. La composición para su uso de la reivindicación 13, en la que la administración y medición deben llevarse a cabo durante un período seleccionado de al menos 2 semanas.
15. La composición para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 10-14, en la que la administración se lleva a cabo mediante administración oral.
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