JP2002535015A - 標的ｒｎａを検出するための非侵襲性方法 - Google Patents
標的ｒｎａを検出するための非侵襲性方法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、特定のｍＲＮＡ配列を、非荷電のリン含有骨格連結を有するモルホリノアンチセンス化合物の経口投与によってインビボで標的化するための方法を提供する。１以上の選択された標的配列を含むＲＮＡのインビボでの存在の非侵襲性検出方法および非侵襲性定量方法もまた開示される。この方法は、３７℃よりも実質的に高いＴｍを有して、ワトソン−クリック対合によって標的ＲＮＡ領域へとハイブリダイズするヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーを被験体に投与する工程を含む。このオリゴマーは、標的ＲＮＡと細胞内で複合体形成し得、そして細胞内部位から、ヌクレアーゼ耐性へテロ二重鎖として遊離され、これは次いで体液サンプル（例えば、尿）中で測定され得る。
Description
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、非荷電のリン含有骨格結合を有するヌクレアーゼ耐性モルホリノア
ンチセンス化合物の経口投与による、被験体におけるインビボでのｍＲＮＡの効
果的な標的化のための方法に関する。本発明はさらに、被験体における１つ以上
の標的ＲＮＡを含む塩基特異的な細胞内結合事象の検出のための方法およびキッ
トに関し、ここで標的ＲＮＡおよびアンチセンスオリゴマーを含むヘテロ二重鎖
は、被験体から採取された体液サンプル中で検出される。
ンチセンス化合物の経口投与による、被験体におけるインビボでのｍＲＮＡの効
果的な標的化のための方法に関する。本発明はさらに、被験体における１つ以上
の標的ＲＮＡを含む塩基特異的な細胞内結合事象の検出のための方法およびキッ
トに関し、ここで標的ＲＮＡおよびアンチセンスオリゴマーを含むヘテロ二重鎖
は、被験体から採取された体液サンプル中で検出される。
【０００２】 （発明の背景） 多くの疾患および他の医学的状態は、所望でないＤＮＡまたはＲＮＡの存在に
よって特徴付けられ、このＤＮＡまたはＲＮＡは、特定の例では一本鎖であり、
そして他の例では二本鎖である。これらの疾患および状態は、アンチセンス治療
の原理を用いて処置され得、このアンチセンス治療は、相補性または別の特異的
な結合手段を通して、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列を標的化する工程
を包含する。
よって特徴付けられ、このＤＮＡまたはＲＮＡは、特定の例では一本鎖であり、
そして他の例では二本鎖である。これらの疾患および状態は、アンチセンス治療
の原理を用いて処置され得、このアンチセンス治療は、相補性または別の特異的
な結合手段を通して、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡの標的配列を標的化する工程
を包含する。
【０００３】 治療的適用において、経口投与のために処方されたアンチセンスオリゴマーは
、制限された成功をもたらし、この制限された成功は、一般に、インビボで存在
する遍在性のヌクレアーゼの効果、および細胞に入る能力を制限する分子の全体
の電荷に起因する。
、制限された成功をもたらし、この制限された成功は、一般に、インビボで存在
する遍在性のヌクレアーゼの効果、および細胞に入る能力を制限する分子の全体
の電荷に起因する。
【０００４】 疾患の診断および処置のためのこのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの
経口送達の増強に関する多数の引用文献が、文献中に見出され得る。
経口送達の増強に関する多数の引用文献が、文献中に見出され得る。
【０００５】 種々の疾患状態の診断およびモニタリングは、その状態と関連するペプチド、
タンパク質、抗体、または核酸の分析によって達成される。
タンパク質、抗体、または核酸の分析によって達成される。
【０００６】 個体の遺伝的分析は、通常２つの型の情報に焦点を当てる：第１の情報は、種
々の遺伝的疾患（例えば、嚢胞性線維症、ハンティングトン病、および遺伝子の
変異に関連することが知られている特定の癌（例えば、乳癌））に関連する変異
の分析である。第２の情報は、特定の条件下（例えば、薬物処置に対する応答、
種々の疾患もしくは状態における、または異なる組織間での遺伝子発現のレベル
の差異）での遺伝子の発現の相対レベルの分析を含む。
々の遺伝的疾患（例えば、嚢胞性線維症、ハンティングトン病、および遺伝子の
変異に関連することが知られている特定の癌（例えば、乳癌））に関連する変異
の分析である。第２の情報は、特定の条件下（例えば、薬物処置に対する応答、
種々の疾患もしくは状態における、または異なる組織間での遺伝子発現のレベル
の差異）での遺伝子の発現の相対レベルの分析を含む。
【０００７】 現在、この型の遺伝的分析は、代表的には、個体から血液サンプルの組織を得
、そして特定の変異の存在もしくは非存在について、または遺伝子発現の上昇レ
ベルもしくは減少レベルについて、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを
分析することによって、エキソビボで行われる。変異または発現レベルの変化を
検出するための診断デバイス（例えば、遺伝子チップ）は、現在利用可能であり
、そして開発中の新しい可能性を伴う。
、そして特定の変異の存在もしくは非存在について、または遺伝子発現の上昇レ
ベルもしくは減少レベルについて、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡを
分析することによって、エキソビボで行われる。変異または発現レベルの変化を
検出するための診断デバイス（例えば、遺伝子チップ）は、現在利用可能であり
、そして開発中の新しい可能性を伴う。
【０００８】 同様の方法は、個体における遺伝子発現に対する治療化合物の効果をモニタリ
ングするために使用され得る。すなわち、化合物の投与後、組織生検または血液
サンプルが、処置された患者から得られて、１つ以上の標的化された遺伝子の発
現に対する化合物の効果が決定され得る。
ングするために使用され得る。すなわち、化合物の投与後、組織生検または血液
サンプルが、処置された患者から得られて、１つ以上の標的化された遺伝子の発
現に対する化合物の効果が決定され得る。
【０００９】 これらのインビボ方法による、変異および遺伝子発現のレベルの分析は、遺伝
子の組み立ておよび個体における薬物応答についての重要な情報を産生する能力
を有するが、この方法は、しばしば非実用的であり、高価であり、そして／また
は所望の情報を提供することができない。例えば、遺伝子発現をモニタリングす
るために個体の組織を生検にすることは、一般的に実用的ではない。なぜなら、
組織サンプルを得ることの困難さおよび患者へのリスクのため、ならびに分析の
ために組織サンプルを用意することの高価さのための両方だからである。
子の組み立ておよび個体における薬物応答についての重要な情報を産生する能力
を有するが、この方法は、しばしば非実用的であり、高価であり、そして／また
は所望の情報を提供することができない。例えば、遺伝子発現をモニタリングす
るために個体の組織を生検にすることは、一般的に実用的ではない。なぜなら、
組織サンプルを得ることの困難さおよび患者へのリスクのため、ならびに分析の
ために組織サンプルを用意することの高価さのための両方だからである。
【００１０】 従って、個体からの組織または細胞サンプルを得ることも、そのような細胞も
しくは組織から得られた核酸サンプルを単離することおよびそれを測定すること
も必要としない方法によって、遺伝子の変異を標的とし得ることおよび遺伝子発
現のレベルまたは治療剤に応答した遺伝子発現をモニタリングし得ることは、非
常に望ましくあり得る。
しくは組織から得られた核酸サンプルを単離することおよびそれを測定すること
も必要としない方法によって、遺伝子の変異を標的とし得ることおよび遺伝子発
現のレベルまたは治療剤に応答した遺伝子発現をモニタリングし得ることは、非
常に望ましくあり得る。
【００１１】 （発明の要旨） 本発明は、ｍＲＮＡ標的によってコードされる遺伝子産物の調節された発現を
生じる様式で、非荷電のリン含有骨格結合を有するヌクレアーゼ耐性モルホリノ
アンチセンス化合物の経口投与によって、被験体においてインビボでｍＲＮＡを
効果的に標的化するための方法を提供することによって、先行技術における欠陥
に取り組む。
生じる様式で、非荷電のリン含有骨格結合を有するヌクレアーゼ耐性モルホリノ
アンチセンス化合物の経口投与によって、被験体においてインビボでｍＲＮＡを
効果的に標的化するための方法を提供することによって、先行技術における欠陥
に取り組む。
【００１２】 １つの局面において、上記アンチセンス化合物は、好ましくは約８〜４０塩基
、より好ましくは１２〜２５塩基の長さを有する。
、より好ましくは１２〜２５塩基の長さを有する。
【００１３】 別の局面において、上記アンチセンス化合物は、好ましくは、図２ＡＡ〜２Ｅ
Ｅに示される構造からなる群より選択されるサブユニット間結合を有し、そして
特に、図２Ｂ−Ｂにおいて表されるホスホロジアミデート結合によって例示され
、ここで、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。
Ｅに示される構造からなる群より選択されるサブユニット間結合を有し、そして
特に、図２Ｂ−Ｂにおいて表されるホスホロジアミデート結合によって例示され
、ここで、Ｘ＝ＮＨ2、Ｙ＝Ｏ、およびＺ＝Ｏである。
【００１４】 さらなる局面において、モルホリノアンチセンス化合物は、標的化塩基配列を
含み、この配列は、選択された標的遺伝子の翻訳開始コドンにわたる領域に相補
的である。
含み、この配列は、選択された標的遺伝子の翻訳開始コドンにわたる領域に相補
的である。
【００１５】 本発明の経口投与されるアンチセンスオリゴマーについての好ましい標的遺伝
子は、増殖障害（例えば、癌）と関連する遺伝子である。代表的な配列は、配列
番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２によって同定される配列である。
子は、増殖障害（例えば、癌）と関連する遺伝子である。代表的な配列は、配列
番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）２によって同定される配列である。
【００１６】 関連する局面において、本発明は、以下の工程を実行することによって、被験
体における標的ＲＮＡを含む、塩基特異的細胞内結合事象の出現を検出する方法
を提供する：（ａ）モルホリノアンチセンス化合物を３７℃より実質的に高いＴ
ｍで標的ＲＮＡの領域にハイブリダイズするのに有効な量で被験体に投与する工
程であって、ここで、このアンチセンス化合物は、選択された遺伝子の開始コド
ンにわたる領域に相補的である標的化塩基配列、および非荷電のリン含有サブユ
ニット間結合を含む、工程；（ｂ）オリゴヌクレオチド投与後の選択された時間
に被験体から体液のサンプルを採取する工程；および（ｃ）サンプル中でアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ領域から構成されるヌクレアーゼ耐
性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程。
体における標的ＲＮＡを含む、塩基特異的細胞内結合事象の出現を検出する方法
を提供する：（ａ）モルホリノアンチセンス化合物を３７℃より実質的に高いＴ
ｍで標的ＲＮＡの領域にハイブリダイズするのに有効な量で被験体に投与する工
程であって、ここで、このアンチセンス化合物は、選択された遺伝子の開始コド
ンにわたる領域に相補的である標的化塩基配列、および非荷電のリン含有サブユ
ニット間結合を含む、工程；（ｂ）オリゴヌクレオチド投与後の選択された時間
に被験体から体液のサンプルを採取する工程；および（ｃ）サンプル中でアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ領域から構成されるヌクレアーゼ耐
性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程。
【００１７】 この方法の実施において、アンチセンスオリゴマーは約８〜４０塩基の長さを
有し、そして経口投与後に有効であることが好ましい。
有し、そして経口投与後に有効であることが好ましい。
【００１８】 本発明の方法は、体液（例えば、尿、唾液、血漿、または血液、好ましくは尿
）中でのアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出を提供する。
）中でのアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出を提供する。
【００１９】 １つの局面において、ヘテロ二重鎖の検出は、そのヘテロ二重鎖に対して特異
的な抗体とサンプルとを反応させること、および抗体−ヘテロ二重鎖結合体の存
在を検出することによって達成される。
的な抗体とサンプルとを反応させること、および抗体−ヘテロ二重鎖結合体の存
在を検出することによって達成される。
【００２０】 他の場合において、本発明の方法は、レポーター分子を含むアンチセンスオリ
ゴマーを提供し、その結果、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検
出は、ヘテロ二重鎖に付随するレポーター分子の存在を検出することによって達
成される。
ゴマーを提供し、その結果、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検
出は、ヘテロ二重鎖に付随するレポーター分子の存在を検出することによって達
成される。
【００２１】 本発明はさらに、被験体の生物学的状態を評価するための診断方法を提供する
。ここで、生物学的状態は、標的遺伝子の発現と関連し、そしてこの方法は、標
的遺伝子の発現と関連するＲＮＡにおける変化を検出するために使用される。
。ここで、生物学的状態は、標的遺伝子の発現と関連し、そしてこの方法は、標
的遺伝子の発現と関連するＲＮＡにおける変化を検出するために使用される。
【００２２】 １つの好ましい適用において、この方法は、被験体における治療剤に応答した
標的遺伝子の発現の変化を検出するために使用され得る。ここで、標的ＲＮＡは
、選択された遺伝子（例えば、既知の疾患状態と関連する遺伝子）の発現によっ
て産生されるｍＲＮＡである。
標的遺伝子の発現の変化を検出するために使用され得る。ここで、標的ＲＮＡは
、選択された遺伝子（例えば、既知の疾患状態と関連する遺伝子）の発現によっ
て産生されるｍＲＮＡである。
【００２３】 本発明は、治療的適用および／または診断的適用のためにヌクレアーゼ耐性ア
ンチセンスオリゴマーの単回または複数回の投与に適用可能である。
ンチセンスオリゴマーの単回または複数回の投与に適用可能である。
【００２４】 本発明はまた、被験体中の標的ＲＮＡを含む、塩基特異的細胞内結合事象の出
現を検出するためのキットを提供する。このキットは、３７℃よりも実質的に高
いＴｍで標的にハイブリダイズする、標的ＲＮＡと相補的なヌクレアーゼ耐性ア
ンチセンスオリゴマー、およびそのアンチセンスオリゴマーと標的ＲＮＡとの間
に形成されたヘテロ二重鎖を検出するための手段を含む。
現を検出するためのキットを提供する。このキットは、３７℃よりも実質的に高
いＴｍで標的にハイブリダイズする、標的ＲＮＡと相補的なヌクレアーゼ耐性ア
ンチセンスオリゴマー、およびそのアンチセンスオリゴマーと標的ＲＮＡとの間
に形成されたヘテロ二重鎖を検出するための手段を含む。
【００２５】 これらおよび他の本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明が添付の図面
とともに読まれる場合に、より完全にに明らかとなる。
とともに読まれる場合に、より完全にに明らかとなる。
【００２６】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 本明細書中で使用される場合、以下の用語は、そうでないと指示されない限り
は以下の意味を有する。
は以下の意味を有する。
【００２７】 本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「アンチ
センスオリゴヌクレオチド」と交換可能に使用され、そして、この骨格は、アン
チセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対合によってＲＮＡ中の標的配列
にハイブリダイズして、標的配列中にＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成す
ることを可能にする、ヌクレオチド塩基およびサブユニット−サブユニット骨格
の配列を有するオリゴマーをいう。このオリゴマーは、標的配列に対する正確な
配列相補性を有してもよいし、近い相補性を有してもよい。これらのアンチセン
スオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得る
か、または遺伝子の転写を阻害し得る。ここで、そのオリゴヌクレオチドは、二
本鎖結合因子である。
センスオリゴヌクレオチド」と交換可能に使用され、そして、この骨格は、アン
チセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対合によってＲＮＡ中の標的配列
にハイブリダイズして、標的配列中にＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成す
ることを可能にする、ヌクレオチド塩基およびサブユニット−サブユニット骨格
の配列を有するオリゴマーをいう。このオリゴマーは、標的配列に対する正確な
配列相補性を有してもよいし、近い相補性を有してもよい。これらのアンチセン
スオリゴマーは、標的配列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得る
か、または遺伝子の転写を阻害し得る。ここで、そのオリゴヌクレオチドは、二
本鎖結合因子である。
【００２８】 本明細書中で使用される場合、用語「アンチセンスオリゴマー組成物」とは、
本発明のＲＮＡ検出方法における使用のための１つ以上のアンチセンスオリゴマ
ーを含む組成物をいう。いくつかの場合において、このような「アンチセンスオ
リゴマー組成物」は、複数のアンチセンスオリゴマーを含む。
本発明のＲＮＡ検出方法における使用のための１つ以上のアンチセンスオリゴマ
ーを含む組成物をいう。いくつかの場合において、このような「アンチセンスオ
リゴマー組成物」は、複数のアンチセンスオリゴマーを含む。
【００２９】 本明細書中で使用される場合、用語「化合物」「因子」「オリゴマー」および
「オリゴヌクレオチド」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し
て交換可能に使用され得る。この用語は、ヌクレオチド塩基およびサブユニット
−サブユニット骨格の配列であって、この骨格が、アンチセンスオリゴマーがワ
トソン−クリック塩基対合によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、
標的配列とのＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするもの
をいう。このオリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性を有してもよい
し、近い相補性を有してもよい。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的配
列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得るか、または遺伝子の転写
を阻害し得、二本鎖または一本鎖の配列に結合し得、そしてそれがハイブリダイ
ズする配列に「指向される」といわれ得る。
「オリゴヌクレオチド」とは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに関し
て交換可能に使用され得る。この用語は、ヌクレオチド塩基およびサブユニット
−サブユニット骨格の配列であって、この骨格が、アンチセンスオリゴマーがワ
トソン−クリック塩基対合によってＲＮＡ中の標的配列にハイブリダイズして、
標的配列とのＲＮＡ：オリゴマーヘテロ二重鎖を形成することを可能にするもの
をいう。このオリゴマーは、標的配列に対する正確な配列相補性を有してもよい
し、近い相補性を有してもよい。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的配
列を含むｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害し得るか、または遺伝子の転写
を阻害し得、二本鎖または一本鎖の配列に結合し得、そしてそれがハイブリダイ
ズする配列に「指向される」といわれ得る。
【００３０】 本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドについての代表
的な構造には、図１Ａ〜Ｅに示されるモルホリノサブユニット型が含まれる。ポ
リマーは１より多くの結合型を含み得ることが理解される。
的な構造には、図１Ａ〜Ｅに示されるモルホリノサブユニット型が含まれる。ポ
リマーは１より多くの結合型を含み得ることが理解される。
【００３１】 図１におけるサブユニットＡは、１原子リン含有結合を含み、この結合は、図
２にＡ−Ａで示される５原子繰り返し単位骨格を形成する。ここで、モルホリノ
環は、１原子ホスホンアミド結合によって結合される。
２にＡ−Ａで示される５原子繰り返し単位骨格を形成する。ここで、モルホリノ
環は、１原子ホスホンアミド結合によって結合される。
【００３２】 図１におけるサブユニットＢは、図２にＢ−Ｂで示されるような６原子繰り返
し単位骨格について設計される。構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリン基
に結合する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リ
ンから張り出したＸ部分は、以下のいずれかであり得る：フッ素；アルキルまた
は置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換
アルコキシ；あるいは、置換されていない窒素、一置換された窒素、または二置
換された窒素（環状構造を含む）。
し単位骨格について設計される。構造Ｂにおいて、５’モルホリノ炭素をリン基
に結合する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素、または好ましくは酸素であり得る。リ
ンから張り出したＸ部分は、以下のいずれかであり得る：フッ素；アルキルまた
は置換アルキル；アルコキシまたは置換アルコキシ；チオアルコキシまたは置換
アルコキシ；あるいは、置換されていない窒素、一置換された窒素、または二置
換された窒素（環状構造を含む）。
【００３３】 図１におけるサブユニットＣ〜Ｅは、図２にＣ−Ｃ〜Ｅ−Ｅで示されるような
７原子単位長骨格について設計される。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構造Ｂにお
いての通りであり、そしてＹ部分はメチレン、硫黄、または好ましくは酸素であ
り得る。構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂにおいての通りである
。構造Ｅにおいて、Ｘは構造Ｂにおいての通りであり、そしてＹは、Ｏ、Ｓ、ま
たはＮＲである。図１Ａ〜Ｅにおいて示されるすべてのサブユニットにおいて、
ＺはＯまたはＳであり、そしてＰiまたはＰjはアデニン、シトシン、グアニン、
またはウラシルである。
７原子単位長骨格について設計される。構造Ｃにおいて、Ｘ部分は、構造Ｂにお
いての通りであり、そしてＹ部分はメチレン、硫黄、または好ましくは酸素であ
り得る。構造Ｄにおいて、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂにおいての通りである
。構造Ｅにおいて、Ｘは構造Ｂにおいての通りであり、そしてＹは、Ｏ、Ｓ、ま
たはＮＲである。図１Ａ〜Ｅにおいて示されるすべてのサブユニットにおいて、
ＺはＯまたはＳであり、そしてＰiまたはＰjはアデニン、シトシン、グアニン、
またはウラシルである。
【００３４】 本明細書中で使用される場合、「モルホリノオリゴマー」とは、代表的なポリ
ヌクレオチドに水素結合可能な塩基を支持する骨格を有するポリマー性分子であ
って、ここでこのポリマーが、ペントース糖骨格部分、そしてより具体的には、
ヌクレオチドおよびヌクレオシドに典型的なホスホジエステル結合によって結合
されるリボース骨格を欠くが、その代わりに環の窒素を通してカップリングを有
する環の窒素を含む分子をいう。好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは
、図２Ｂにおいて示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され、こ
こで（ｉ）この構造は、隣接するサブユニットの５’環外炭素に１つのサブユニ
ットのモルホリノ窒素を結合する、１〜３原子長のリン含有結合によって一緒に
結合され、そして（ｉｉ）ＰiおよびＰjは、塩基特異的水素結合によって、ポリ
ヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部
分である。
ヌクレオチドに水素結合可能な塩基を支持する骨格を有するポリマー性分子であ
って、ここでこのポリマーが、ペントース糖骨格部分、そしてより具体的には、
ヌクレオチドおよびヌクレオシドに典型的なホスホジエステル結合によって結合
されるリボース骨格を欠くが、その代わりに環の窒素を通してカップリングを有
する環の窒素を含む分子をいう。好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは
、図２Ｂにおいて示される形態のモルホリノサブユニット構造から構成され、こ
こで（ｉ）この構造は、隣接するサブユニットの５’環外炭素に１つのサブユニ
ットのモルホリノ窒素を結合する、１〜３原子長のリン含有結合によって一緒に
結合され、そして（ｉｉ）ＰiおよびＰjは、塩基特異的水素結合によって、ポリ
ヌクレオチド中の塩基に結合するのに有効なプリンまたはピリミジン塩基対合部
分である。
【００３５】 本明細書中で使用される場合、用語「ＰＭＯ」とは、以下でさらに説明するよ
うに、ホスホジアミデートモルホリノオリゴマーであって、ここで、このオリゴ
マーが、約８〜４０塩基長、好ましくは１２〜２５塩基長のポリヌクレオチドで
あるものをいう。本発明のこの好ましい局面は、図２Ｂに図示され、これは、ホ
スホロジアミデート結合によって結合される２つのこのようなサブユニットを示
す。
うに、ホスホジアミデートモルホリノオリゴマーであって、ここで、このオリゴ
マーが、約８〜４０塩基長、好ましくは１２〜２５塩基長のポリヌクレオチドで
あるものをいう。本発明のこの好ましい局面は、図２Ｂに図示され、これは、ホ
スホロジアミデート結合によって結合される２つのこのようなサブユニットを示
す。
【００３６】 本発明のこの好ましい局面は、図２Ｂにおいて図示され、これは、ホスホロジ
アミデート結合によって結合される２つのこのようなサブユニットを示す。モル
ホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有
に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，
１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同
第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，
３３７号に詳述され、これらのすべては本明細書中に参考として明確に援用され
る。
アミデート結合によって結合される２つのこのようなサブユニットを示す。モル
ホリノオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴマーを含む）は、例えば、共有
に係る米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，
１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同
第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、および同第５，５０６，
３３７号に詳述され、これらのすべては本明細書中に参考として明確に援用され
る。
【００３７】 本明細書中で使用される場合、「ヌクレアーゼ耐性」オリゴマー性分子（オリ
ゴマー）は、その骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に感受性でな
い分子である。代表的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、オリゴヌ
クレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエートおよびホスフェート−アミン
ＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）（この両方が荷電した骨格を有する）、ならびにメチルホ
スホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド（
これらのすべては非荷電の骨格を有さない）である。
ゴマー）は、その骨格がホスホジエステル結合のヌクレアーゼ切断に感受性でな
い分子である。代表的なヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴマーは、オリゴヌ
クレオチドアナログ、例えば、ホスホロチオエートおよびホスフェート−アミン
ＤＮＡ（ｐｎＤＮＡ）（この両方が荷電した骨格を有する）、ならびにメチルホ
スホネート、モルホリノ、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチド（
これらのすべては非荷電の骨格を有さない）である。
【００３８】 本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴ
マーは、そのオリゴマーが生理学的な条件下で、３７℃より実質的に高い、好ま
しくは少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃以上のＴｍで、標的
にハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイ
ズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、所定のイオン強
度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔ［ｍ］）よりも約１０℃、そ
して好ましくは約５℃低いように選択されるストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］は、
標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である
。
マーは、そのオリゴマーが生理学的な条件下で、３７℃より実質的に高い、好ま
しくは少なくとも５０℃、そして代表的には６０℃〜８０℃以上のＴｍで、標的
にハイブリダイズする場合に、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイ
ズする」。このようなハイブリダイゼーションは、好ましくは、所定のイオン強
度およびｐＨでの特定の配列についての熱融点（Ｔ［ｍ］）よりも約１０℃、そ
して好ましくは約５℃低いように選択されるストリンジェントなハイブリダイゼ
ーション条件に対応する。所定のイオン強度およびｐＨにおいて、Ｔ［ｍ］は、
標的配列の５０％が相補的なポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である
。
【００３９】 ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが２つの一本鎖ポリヌクレオチ
ド間で逆平行の配置で起こる場合に、互いに「相補的である」と記載される。二
本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの
一方の鎖と第２のポリヌクレオチドとの間で起こり得る場合に、別のポリヌクレ
オチドと「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌ
クレオチドに相補的である度合い）は、一般的に受け入れられている塩基対合の
規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される、反対側の鎖に関し
て塩基の割合によって定量可能である。
ド間で逆平行の配置で起こる場合に、互いに「相補的である」と記載される。二
本鎖ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが第１のポリヌクレオチドの
一方の鎖と第２のポリヌクレオチドとの間で起こり得る場合に、別のポリヌクレ
オチドと「相補的」であり得る。相補性（１つのポリヌクレオチドが別のポリヌ
クレオチドに相補的である度合い）は、一般的に受け入れられている塩基対合の
規則に従って、互いに水素結合を形成することが予想される、反対側の鎖に関し
て塩基の割合によって定量可能である。
【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語「癌特異的抗原」とは、癌細胞によって発
現されるが、正常細胞によっても非癌細胞によっても発現されない抗原をいう。
現されるが、正常細胞によっても非癌細胞によっても発現されない抗原をいう。
【００４１】 本明細書中で使用される場合、用語「癌関連抗原」とは、本明細書中でｃ−ｍ
ｙｃによって例示される、癌細胞によって発現されるが、正常細胞または非癌細
胞によってもまた発現され得る抗原をいう。
ｙｃによって例示される、癌細胞によって発現されるが、正常細胞または非癌細
胞によってもまた発現され得る抗原をいう。
【００４２】 本明細書中で使用される場合、用語「ｃ−ｍｙｃアンチセンスオリゴマー」と
は、相補的なまたはほぼ相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列に高い親和性を有する（す
なわち、「特異的にハイブリダイズする」）ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリ
ゴマーをいう。
は、相補的なまたはほぼ相補的なｃ−ｍｙｃ核酸配列に高い親和性を有する（す
なわち、「特異的にハイブリダイズする」）ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリ
ゴマーをいう。
【００４３】 本明細書中で使用される場合、配列が第１の配列であるポリヌクレオチドが、
配列が第２の配列であるポリヌクレオチドに特異的に結合する場合に、第１の配
列は、第２の配列に関して「アンチセンス配列」である。
配列が第２の配列であるポリヌクレオチドに特異的に結合する場合に、第１の配
列は、第２の配列に関して「アンチセンス配列」である。
【００４４】 本明細書中で使用される場合、「標的ＲＮＡを含む塩基特異的な細胞内結合事
象」とは、細胞内での標的ＲＮＡ配列とのオリゴマーの特異的結合をいう。この
ような結合の塩基特異性は、配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチ
ドは、配列において相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る
。
象」とは、細胞内での標的ＲＮＡ配列とのオリゴマーの特異的結合をいう。この
ような結合の塩基特異性は、配列特異的である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチ
ドは、配列において相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る
。
【００４５】 本明細書中で使用する場合、「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、その相
補的標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重
鎖であって、遍在性の細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによるイン
ビボ分解に耐性である、ヘテロ二重鎖をいう。
補的標的に対するアンチセンスオリゴマーの結合によって形成されるヘテロ二重
鎖であって、遍在性の細胞内ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼによるイン
ビボ分解に耐性である、ヘテロ二重鎖をいう。
【００４６】 本明細書中で使用される場合、ｍＲＮＡまたは他の核酸配列に関して、用語「
標的」とは、造血幹細胞において優先的に発現されるｍＲＮＡまたは他の核酸配
列をいう。優先的に発現されるとは、標的ｍＲＮＡが、より分化した細胞におい
て同じ遺伝子が発現されるよりも高い程度に造血幹細胞において発現される遺伝
子に由来すること、または発現が造血幹細胞に特異的であり、そしてより分化し
た細胞においては検出可能でないことを意味する。
標的」とは、造血幹細胞において優先的に発現されるｍＲＮＡまたは他の核酸配
列をいう。優先的に発現されるとは、標的ｍＲＮＡが、より分化した細胞におい
て同じ遺伝子が発現されるよりも高い程度に造血幹細胞において発現される遺伝
子に由来すること、または発現が造血幹細胞に特異的であり、そしてより分化し
た細胞においては検出可能でないことを意味する。
【００４７】 本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドに関して、用語「発現を調
節する」とは、所定のタンパク質の発現またはＲＮＡの翻訳を妨害することによ
って、所定のタンパク質の発現を増強するかまたは減少するかのいずれかのアン
チセンスオリゴマーの能力をいう。タンパク質発現を増強する場合、アンチセン
スオリゴマーは、サプレッサー遺伝子（例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子）の発
現をブロックし得る。タンパク質発現を減少する場合、アンチセンスオリゴマー
は、所定の遺伝子の発現を直接ブロックし得るか、またはその遺伝子から転写さ
れたＲＮＡの分解の加速に寄与し得る。
節する」とは、所定のタンパク質の発現またはＲＮＡの翻訳を妨害することによ
って、所定のタンパク質の発現を増強するかまたは減少するかのいずれかのアン
チセンスオリゴマーの能力をいう。タンパク質発現を増強する場合、アンチセン
スオリゴマーは、サプレッサー遺伝子（例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子）の発
現をブロックし得る。タンパク質発現を減少する場合、アンチセンスオリゴマー
は、所定の遺伝子の発現を直接ブロックし得るか、またはその遺伝子から転写さ
れたＲＮＡの分解の加速に寄与し得る。
【００４８】 本明細書中で使用される場合、アンチセンスオリゴマーに関して「有効量」と
は、単回用量または一連の用量の一部のいずれかとして哺乳動物被験体に投与さ
れるアンチセンスオリゴマーの量であって、選択された標的配列のすべてまたは
一部に特異的にハイブリダイズして標的ＲＮＡとアンチセンスオリゴマーとの間
にヘテロ二重鎖を形成し、このヘテロ二重鎖が引き続いて被験体の体液中で検出
され得る量をいう。
は、単回用量または一連の用量の一部のいずれかとして哺乳動物被験体に投与さ
れるアンチセンスオリゴマーの量であって、選択された標的配列のすべてまたは
一部に特異的にハイブリダイズして標的ＲＮＡとアンチセンスオリゴマーとの間
にヘテロ二重鎖を形成し、このヘテロ二重鎖が引き続いて被験体の体液中で検出
され得る量をいう。
【００４９】 本明細書中で使用される場合、個体または細胞の「処置」とは、個体または細
胞の自然の経過を変更する試みにおけるあらゆる型の介入である。処置には、例
えば、薬学的組成物の投与が含まれるがこれに限定されず、そして予防的に、ま
た病原性事象の開始後に、もしくは病因因子との接触後に行われ得る。
胞の自然の経過を変更する試みにおけるあらゆる型の介入である。処置には、例
えば、薬学的組成物の投与が含まれるがこれに限定されず、そして予防的に、ま
た病原性事象の開始後に、もしくは病因因子との接触後に行われ得る。
【００５０】 本明細書中で使用される場合、用語「体液」は、被験体から得られた種々の型
のサンプルを含み、これには、尿、唾液、血漿、血液、髄液、および生物学的起
源の他の液体サンプルを含み、そしてそこに懸濁している細胞もしくは細胞フラ
グメントを含み得るか、または液体培地およびその溶質を含むことを言及しない
。
のサンプルを含み、これには、尿、唾液、血漿、血液、髄液、および生物学的起
源の他の液体サンプルを含み、そしてそこに懸濁している細胞もしくは細胞フラ
グメントを含み得るか、または液体培地およびその溶質を含むことを言及しない
。
【００５１】 用語「相対量」とは、試験測定とコントロール測定との間で比較がなされる場
合に使用される。反応において複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール
標本と反応する量と比較した、試験試料と反応する量である。コントロール標本
は、同じアッセイにおいて別々に実行され得るか、または同じサンプルの一部（
例えば、組織切片中の悪性領域を取り囲む正常組織）であり得る。
合に使用される。反応において複合体を形成する試薬の相対量は、コントロール
標本と反応する量と比較した、試験試料と反応する量である。コントロール標本
は、同じアッセイにおいて別々に実行され得るか、または同じサンプルの一部（
例えば、組織切片中の悪性領域を取り囲む正常組織）であり得る。
【００５２】 本明細書中で使用される場合、用語「増殖性障害」とは、異常な細胞増殖によ
って特徴付けられる状態をいい、そして形態学および／または遺伝子型の両方が
周りを取り囲む組織と異なる、悪性細胞ならびに非悪性細胞の集団に適用され得
る。
って特徴付けられる状態をいい、そして形態学および／または遺伝子型の両方が
周りを取り囲む組織と異なる、悪性細胞ならびに非悪性細胞の集団に適用され得
る。
【００５３】 本明細書中で使用される場合、用語「腫瘍」および「癌」とは、増殖の制御の
喪失を示し、そして異常に大きな細胞クローンを形成する細胞をいう。腫瘍細胞
または癌細胞は、一般的に、接触阻害を喪失しており、そして侵襲的であり得か
つ／または転移する能力を有し得る。
喪失を示し、そして異常に大きな細胞クローンを形成する細胞をいう。腫瘍細胞
または癌細胞は、一般的に、接触阻害を喪失しており、そして侵襲的であり得か
つ／または転移する能力を有し得る。
【００５４】 本明細書中で使用される場合、癌患者に関して、用語「改善された治療結果」
とは、癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または減少の総数、あるいは癌細胞ま
たは全腫瘍量の減少をいう。
とは、癌細胞または固形腫瘍の増殖の遅延または減少の総数、あるいは癌細胞ま
たは全腫瘍量の減少をいう。
【００５５】 （ＩＩ．本発明の方法） 本発明の方法は、相補的かまたはほぼ相補的な標的ＲＮＡに対して高い親和性
で結合するのに有効なクラスのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの有
効な経口投与のための手段を提供する。
で結合するのに有効なクラスのモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドの有
効な経口投与のための手段を提供する。
【００５６】 本発明はさらに、標的ＲＮＡを含む塩基特異的な細胞内結合事象の出現を検出
する方法を提供する。本発明は、相補的かまたはほぼ相補的な標的ＲＮＡ配列に
対して高い親和性で結合し得る、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスモルホリノオリ
ゴマー、またはより一般的には、ヌクレアーゼ耐性モルホリノオリゴマーが個体
に投与され得、そして引き続いて体液サンプル（例えば、尿）中で、アンチセン
スオリゴマーおよび標的ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の形態で検出さ
れ得るという発見に基づく。
する方法を提供する。本発明は、相補的かまたはほぼ相補的な標的ＲＮＡ配列に
対して高い親和性で結合し得る、ヌクレアーゼ耐性アンチセンスモルホリノオリ
ゴマー、またはより一般的には、ヌクレアーゼ耐性モルホリノオリゴマーが個体
に投与され得、そして引き続いて体液サンプル（例えば、尿）中で、アンチセン
スオリゴマーおよび標的ＲＮＡのヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の形態で検出さ
れ得るという発見に基づく。
【００５７】 この発見の根底にある機構は本願発明の一部ではないが、この発見は、経口投
与されたアンチセンスオリゴマーが、（ｉ）体内の細胞に移動しそしてその細胞
に侵入し得、（ｉｉ）標的ＲＮＡの相補的かまたはほぼ相補的な標的領域に対し
て、ワトソン−クリック塩基対合することによって高い親和性で結合して、その
ＲＮＡの標的領域とのヘテロ二重鎖を形成し得、そして（ｉｉｉ）その発現をブ
ロックし得ること、を示唆する。
与されたアンチセンスオリゴマーが、（ｉ）体内の細胞に移動しそしてその細胞
に侵入し得、（ｉｉ）標的ＲＮＡの相補的かまたはほぼ相補的な標的領域に対し
て、ワトソン−クリック塩基対合することによって高い親和性で結合して、その
ＲＮＡの標的領域とのヘテロ二重鎖を形成し得、そして（ｉｉｉ）その発現をブ
ロックし得ること、を示唆する。
【００５８】 本発明の検出方法において、この発見は、一旦投与されれば、このアンチセン
スオリゴマーは、（ｉ）体内の細胞に移動しかつそれに侵入し得、（ｉｉ）標的
ＲＮＡの相補的かまたはほぼ相補的な標的領域に対してワトソン−クリック塩基
対合することによって高い親和性で結合して、そのＲＮＡの標的領域とのヘテロ
二重鎖を形成し得、（ｉｉｉ）そのＲＮＡのヘテロ二重鎖領域をヌクレアーゼ分
解から保護し得、（ｉｖ）ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の形態で、細胞から血
流に放出され、そして（ｖ）体液（例えば、血液、尿、唾液など）中での検出の
ために十分な量で血流中で残存し得ることを示唆する。
スオリゴマーは、（ｉ）体内の細胞に移動しかつそれに侵入し得、（ｉｉ）標的
ＲＮＡの相補的かまたはほぼ相補的な標的領域に対してワトソン−クリック塩基
対合することによって高い親和性で結合して、そのＲＮＡの標的領域とのヘテロ
二重鎖を形成し得、（ｉｉｉ）そのＲＮＡのヘテロ二重鎖領域をヌクレアーゼ分
解から保護し得、（ｉｖ）ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の形態で、細胞から血
流に放出され、そして（ｖ）体液（例えば、血液、尿、唾液など）中での検出の
ために十分な量で血流中で残存し得ることを示唆する。
【００５９】 （Ａ．アンチセンスオリゴマー化合物および組成物：経口送達されるモルホリ
ノアンチセンスオリゴヌクレオチドについての標的） 本発明の方法における使用のための好ましい標的には、（１）発生的におよび
／または組織によって調節されるＲＮＡ；（２）種々の疾患状態において（特に
増殖障害において）アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされ
るＲＮＡ；（３）環境刺激に応答してアップレギュレートされるかまたはダウン
レギュレートされるＲＮＡ；および（４）治療処方計画によって変更されるか、
またはその発現がこのような処方計画によって変更されるＲＮＡが含まれる。
ノアンチセンスオリゴヌクレオチドについての標的） 本発明の方法における使用のための好ましい標的には、（１）発生的におよび
／または組織によって調節されるＲＮＡ；（２）種々の疾患状態において（特に
増殖障害において）アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされ
るＲＮＡ；（３）環境刺激に応答してアップレギュレートされるかまたはダウン
レギュレートされるＲＮＡ；および（４）治療処方計画によって変更されるか、
またはその発現がこのような処方計画によって変更されるＲＮＡが含まれる。
【００６０】 特定の遺伝的疾患は、正常な組織において存在しない遺伝子の存在によって特
徴付けられる。他の疾患状態は、ＲＮＡの発現の変化または正常な細胞では発現
しないＲＮＡ翻訳産物（すなわち、ペプチドまたはタンパク質）によって特徴付
けられる。いくつかの疾患状態は、特定の遺伝子または遺伝子の部分の非存在、
あるいは遺伝子産物またはタンパク質の発現の非存在または変化によって特徴付
けられる。
徴付けられる。他の疾患状態は、ＲＮＡの発現の変化または正常な細胞では発現
しないＲＮＡ翻訳産物（すなわち、ペプチドまたはタンパク質）によって特徴付
けられる。いくつかの疾患状態は、特定の遺伝子または遺伝子の部分の非存在、
あるいは遺伝子産物またはタンパク質の発現の非存在または変化によって特徴付
けられる。
【００６１】 本発明の方法は、疾患の状態（特に、遺伝疾患）と相関する遺伝子の発現を調
節および／またはモニタリングするために使用され得る。例えば、特定の疾患状
態と関連するアンチセンスオリゴマーの定期的な投与、および被験体の尿におけ
るアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖のモニタリングは、特定の疾患
状態と関連する、当業者に公知の遺伝子の発現を検出するために使用され得る。
従って、本発明の方法は、このような疾患状態における初期の介入のための手段
、治療用オリゴヌクレオチドを投与するため、および特定の疾患状態に関連する
ＲＮＡの存在をモニタリングするための方法を提供する。代表的な疾患状態とし
ては、嚢胞性線維症、癌（例えば、乳癌）、ハンティングトン病、および他の公
知の遺伝病が挙げられる。
節および／またはモニタリングするために使用され得る。例えば、特定の疾患状
態と関連するアンチセンスオリゴマーの定期的な投与、および被験体の尿におけ
るアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖のモニタリングは、特定の疾患
状態と関連する、当業者に公知の遺伝子の発現を検出するために使用され得る。
従って、本発明の方法は、このような疾患状態における初期の介入のための手段
、治療用オリゴヌクレオチドを投与するため、および特定の疾患状態に関連する
ＲＮＡの存在をモニタリングするための方法を提供する。代表的な疾患状態とし
ては、嚢胞性線維症、癌（例えば、乳癌）、ハンティングトン病、および他の公
知の遺伝病が挙げられる。
【００６２】 本発明の方法は、複数のアンチセンスオリゴマーを投与することによって複数
の医学的状態のいずれかについてスクリーニングする際にさらなる有用性を見出
し、この複数のアンチセンスオリゴマーは、特定の疾患状態または医学的状態に
それ自体特異的である、異なる発現したＲＮＡについて各々特異的である。
の医学的状態のいずれかについてスクリーニングする際にさらなる有用性を見出
し、この複数のアンチセンスオリゴマーは、特定の疾患状態または医学的状態に
それ自体特異的である、異なる発現したＲＮＡについて各々特異的である。
【００６３】 異なる癌細胞において、一緒にまたは独立して、２つの型の変化した遺伝子発
現が起こることが観察された［Ｂｉｓｈｏｐ、Ｃｅｌｌ（１９９１）６４：２３
５−２４８；米国特許第５，７７６，６８３号］。第１の型において、劣性の腫
瘍サプレッサー遺伝子（これは明らかに悪性の増殖を妨害するように作用する）
の発現の減少が存在する。第２の型において、優性遺伝子（例えば、癌遺伝子）
（これは、悪性増殖を促進するように作用するか、または悪性のために重要ない
くつかの他の表現型を提供するように作用する）の発現の増加が存在する。遺伝
子のいずれかの型の発現の変化は、潜在的な診断の指標であり、これは、被験体
へのアンチセンスオリゴマー（これは、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子または
癌遺伝子に特異的である）の投与、続いて被験体の体液におけるアンチセンスオ
リゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出によってモニタリングされ得る。
現が起こることが観察された［Ｂｉｓｈｏｐ、Ｃｅｌｌ（１９９１）６４：２３
５−２４８；米国特許第５，７７６，６８３号］。第１の型において、劣性の腫
瘍サプレッサー遺伝子（これは明らかに悪性の増殖を妨害するように作用する）
の発現の減少が存在する。第２の型において、優性遺伝子（例えば、癌遺伝子）
（これは、悪性増殖を促進するように作用するか、または悪性のために重要ない
くつかの他の表現型を提供するように作用する）の発現の増加が存在する。遺伝
子のいずれかの型の発現の変化は、潜在的な診断の指標であり、これは、被験体
へのアンチセンスオリゴマー（これは、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子または
癌遺伝子に特異的である）の投与、続いて被験体の体液におけるアンチセンスオ
リゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の検出によってモニタリングされ得る。
【００６４】 癌において観察される細胞機能の変化は、広範な供給源から生じる。いくつか
の場合において、その変化は細胞の因子によって誘発され、他の状況においては
その変化は悪性の形質転換をもたらす。例えば、正常な遺伝子における変異は、
細胞の悪性の形質転換を生じ得る（例えば、原癌遺伝子ｒａｓが点変異によって
形質転換されて癌遺伝子になる場合）。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗
原は、広範な機能を示す別の癌遺伝子発現産物である［Ｆａｎｎｉｎｇ，Ｅ．お
よびＫｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒ．，Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：５
５−８５（１９９３）］；米国特許第５，８４３，７３７号］。体細胞における
原癌遺伝子の変異は、ヒトの癌の誘導において重要であるとますます認識されて
いる。このような変異によって形成される癌遺伝子のいくつかの例としては、ｎ
ｅｕ、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２、ｆｅｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｍｓ、Ｈａ−
ｒａｓ、およびＫｉ−ｒａｓが挙げられる。原癌遺伝子を癌遺伝子に転換する変
異は、しばしば点変異である［米国特許第５，８４３，６８４号を参照のこと］
。このような変異した遺伝子の発現によって形成されるＲＮＡは、本発明の方法
における使用のためのアンチセンスオリゴマーの設計のためのテンプレートとし
て働き得る。
の場合において、その変化は細胞の因子によって誘発され、他の状況においては
その変化は悪性の形質転換をもたらす。例えば、正常な遺伝子における変異は、
細胞の悪性の形質転換を生じ得る（例えば、原癌遺伝子ｒａｓが点変異によって
形質転換されて癌遺伝子になる場合）。シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗
原は、広範な機能を示す別の癌遺伝子発現産物である［Ｆａｎｎｉｎｇ，Ｅ．お
よびＫｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒ．，Ａｎｎｕｌ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：５
５−８５（１９９３）］；米国特許第５，８４３，７３７号］。体細胞における
原癌遺伝子の変異は、ヒトの癌の誘導において重要であるとますます認識されて
いる。このような変異によって形成される癌遺伝子のいくつかの例としては、ｎ
ｅｕ、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２、ｆｅｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｍｙｂ、ｆｍｓ、Ｈａ−
ｒａｓ、およびＫｉ−ｒａｓが挙げられる。原癌遺伝子を癌遺伝子に転換する変
異は、しばしば点変異である［米国特許第５，８４３，６８４号を参照のこと］
。このような変異した遺伝子の発現によって形成されるＲＮＡは、本発明の方法
における使用のためのアンチセンスオリゴマーの設計のためのテンプレートとし
て働き得る。
【００６５】 本発明の方法を使用するＲＮＡ発現の評価のための他の標的としては、広範な
種々の化学療法薬物に対して耐性である癌細胞と相関付けられているＲＮＡに対
して特異的なアンチセンスオリゴマーが挙げられる。代表的な標的としては、Ｐ
−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、および肺耐性タンパク質
（ＬＲＰ）が挙げられる［例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．ら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９：８０７−８１３（１９９７）を参照のこと］。
種々の化学療法薬物に対して耐性である癌細胞と相関付けられているＲＮＡに対
して特異的なアンチセンスオリゴマーが挙げられる。代表的な標的としては、Ｐ
−糖タンパク質、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）、および肺耐性タンパク質
（ＬＲＰ）が挙げられる［例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｕ．ら、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９：８０７−８１３（１９９７）を参照のこと］。
【００６６】 １つの局面において、本発明の経口送達方法は、治療処方計画の一部として、
被験体（例えば、癌患者）に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達する
ために使用され得る。このような処置についての代表的な標的として、配列番号
２として提示される配列によって例示される、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンス
であるモルホリノオリゴマーアンチセンスが挙げられる。
被験体（例えば、癌患者）に対してアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達する
ために使用され得る。このような処置についての代表的な標的として、配列番号
２として提示される配列によって例示される、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンス
であるモルホリノオリゴマーアンチセンスが挙げられる。
【００６７】 多数の癌遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、ならびに癌および他の疾患状態と
関連することが当該分野で公知の他のＲＮＡについての配列は、公的なデータベ
ースにおいて容易に利用可能であり、そしてそれらの処置および検出のためのア
ンチセンスオリゴマーを設計するために使用され得る。
関連することが当該分野で公知の他のＲＮＡについての配列は、公的なデータベ
ースにおいて容易に利用可能であり、そしてそれらの処置および検出のためのア
ンチセンスオリゴマーを設計するために使用され得る。
【００６８】 腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ｐ５３遺伝子、網膜芽細胞腫遺伝子、およ
びウィルムス腫瘍遺伝子）もまた、悪性形質転換と関連する。その表現型は劣性
である。なぜなら、両方の対立遺伝子が変異した場合、腫瘍サプレッサー遺伝子
の非存在が、腫瘍発生の増強を生じるからである。これらの遺伝子の正常な発現
は、代表的には、抑制されていない細胞増殖を妨害するが、それらの変異は、細
胞増殖を抑制されていないままにして、それによって細胞の悪性形質転換を生じ
る。顕著な注目が、細胞調節におけるその複雑な役割ゆえに、このファミリーの
メンバーのすべて（特に、ｐ５３）に焦点を合わしている［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６２：１９５８−１９６１（１９９３）；米国特許第５，８４３，６８４号］。
この遺伝子における変異は、広範なヒト腫瘍（膀胱、脳、胸部、子宮頸部、結腸
、食道、喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、および甲状腺の腫瘍
を含む）に関連付けられている。従って、ｐ５３は、本明細書中に記載するよう
に、モルホリノアンチセンスオリゴマーの経口送達によって、標的化され得る。
びウィルムス腫瘍遺伝子）もまた、悪性形質転換と関連する。その表現型は劣性
である。なぜなら、両方の対立遺伝子が変異した場合、腫瘍サプレッサー遺伝子
の非存在が、腫瘍発生の増強を生じるからである。これらの遺伝子の正常な発現
は、代表的には、抑制されていない細胞増殖を妨害するが、それらの変異は、細
胞増殖を抑制されていないままにして、それによって細胞の悪性形質転換を生じ
る。顕著な注目が、細胞調節におけるその複雑な役割ゆえに、このファミリーの
メンバーのすべて（特に、ｐ５３）に焦点を合わしている［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
６２：１９５８−１９６１（１９９３）；米国特許第５，８４３，６８４号］。
この遺伝子における変異は、広範なヒト腫瘍（膀胱、脳、胸部、子宮頸部、結腸
、食道、喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、および甲状腺の腫瘍
を含む）に関連付けられている。従って、ｐ５３は、本明細書中に記載するよう
に、モルホリノアンチセンスオリゴマーの経口送達によって、標的化され得る。
【００６９】 ＤＮＡ修復系のメンバーはまた、劇的に細胞に効果（特に細胞の悪性形質転換
）をもたらし得る分子である。例えば、ミスマッチ修復系がヒトにおいて存在す
ることが最近発見された［Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：１０２７−
１０３８（１９９３）；Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：１２１５−
１２２５（１９９３）；およびＰａｒｓｏｎｓ，Ｒ．、Ｃｅｌｌ ７５：１２２
７−１２３６（１９９３）］。この系のメンバーは、ヒトのミスマッチ修復遺伝
子ｈＭＳＨ２を含む。これらの遺伝子における変異は、遺伝性の非ポリープ症結
腸癌（ＨＮＰＣＣ）を含む種々の癌と関連付けられている［Ａａｌｔｏｎｅｎ，
Ｌ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：８１２−８１６（１９９３）］。従って、
本発明の方法は、このような修復系をモニタリングする際に有用性を見出す。
）をもたらし得る分子である。例えば、ミスマッチ修復系がヒトにおいて存在す
ることが最近発見された［Ｆｉｓｈｅｌ，Ｒ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：１０２７−
１０３８（１９９３）；Ｌｅａｃｈ，Ｆ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ７５：１２１５−
１２２５（１９９３）；およびＰａｒｓｏｎｓ，Ｒ．、Ｃｅｌｌ ７５：１２２
７−１２３６（１９９３）］。この系のメンバーは、ヒトのミスマッチ修復遺伝
子ｈＭＳＨ２を含む。これらの遺伝子における変異は、遺伝性の非ポリープ症結
腸癌（ＨＮＰＣＣ）を含む種々の癌と関連付けられている［Ａａｌｔｏｎｅｎ，
Ｌ．Ａ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：８１２−８１６（１９９３）］。従って、
本発明の方法は、このような修復系をモニタリングする際に有用性を見出す。
【００７０】 さらに、本発明の方法は、サプレッサー遺伝子の発現を回復させるか、または
優性遺伝子（例えば、癌遺伝子）の発現を減少させることを求める処置ストラテ
ジーをモニタリングするために有用である。好ましい疾患標的としては、癌（特
に、膀胱、脳、胸部、子宮頸部、結腸、食道、喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前
立腺、皮膚、胃、および甲状腺の癌を含む）が挙げられる。。
優性遺伝子（例えば、癌遺伝子）の発現を減少させることを求める処置ストラテ
ジーをモニタリングするために有用である。好ましい疾患標的としては、癌（特
に、膀胱、脳、胸部、子宮頸部、結腸、食道、喉頭、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前
立腺、皮膚、胃、および甲状腺の癌を含む）が挙げられる。。
【００７１】 本発明の方法が使用され得る代表的な疾患状態は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ
）を有する患者における寛解の質の評価である。現在使用される標準的な方法は
、骨髄由来の分裂中期の細胞遺伝学的な分析、癌遺伝子配列の近位またはこれら
の遺伝子の破壊のいずれかを検出するための染色体の蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析、癌遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ）転写物の存在ま
たは非存在を決定するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
分析、およびＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の存在または非存在を決定するための細
胞溶解物のウェスタンブロット分析である。これらの技術の各々は、特定の利点
および落とし穴を有し、そして通常、生検または血液の収集物を必要とする。従
って、これらの技術は、一般的に研究室に限られ、そしてＣＭＬ患者における寛
解の質をモニタリングするための手段についての必要性が存在する［Ｃｒｏｓｓ
，Ｎ．Ｃ．Ｐ．、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２：
３８９−４０３（１９９７）］。
）を有する患者における寛解の質の評価である。現在使用される標準的な方法は
、骨髄由来の分裂中期の細胞遺伝学的な分析、癌遺伝子配列の近位またはこれら
の遺伝子の破壊のいずれかを検出するための染色体の蛍光インサイチュハイブリ
ダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析、癌遺伝子（ＢＣＲ−ＡＢＬ）転写物の存在ま
たは非存在を決定するための逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
分析、およびＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質の存在または非存在を決定するための細
胞溶解物のウェスタンブロット分析である。これらの技術の各々は、特定の利点
および落とし穴を有し、そして通常、生検または血液の収集物を必要とする。従
って、これらの技術は、一般的に研究室に限られ、そしてＣＭＬ患者における寛
解の質をモニタリングするための手段についての必要性が存在する［Ｃｒｏｓｓ
，Ｎ．Ｃ．Ｐ．、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２：
３８９−４０３（１９９７）］。
【００７２】 本発明の方法は、ＲＮＡ発現を評価するための、従って疾患状態（例えば、Ｃ
ＭＬ）の処置および／またはモニタリングのための非侵襲的な手順を提供する。
ＭＬ）の処置および／またはモニタリングのための非侵襲的な手順を提供する。
【００７３】 発現されたＲＮＡを検出するための効率的かつ有効な手段を提供することによ
って、本発明は、遺伝子それ自体の検出のための方法を超える利点を提供する。
なぜなら、遺伝子は、癌（または他の疾患状態）において複製されることなく過
剰発現され得るか、または複製されて静止状態にとどまり得るからである。
って、本発明は、遺伝子それ自体の検出のための方法を超える利点を提供する。
なぜなら、遺伝子は、癌（または他の疾患状態）において複製されることなく過
剰発現され得るか、または複製されて静止状態にとどまり得るからである。
【００７４】 さらに、本発明は、遺伝子の発現の変化を検出またはモニタリングするための
手段を提供し、この遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子または癌遺伝子それ自体
ではないが、疾患状態（例えば、癌）の結果として発現される。このような遺伝
子の発現の評価は、それにも関わらず、その状態に診断的および／または予後的
であり得る。例えば、上皮増殖因子レセプターは、乳癌腫瘍の４５％で過剰発現
され［Ｋｌｉｊｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．１３：３−１７（１９９２
）］、そしてＩＧＦ−１レセプターは、乳癌腫瘍の５０〜９３％において過剰発
現される［Ｂｅｒｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１０３６〜１０３９（
１９９２）］。
手段を提供し、この遺伝子は、腫瘍サプレッサー遺伝子または癌遺伝子それ自体
ではないが、疾患状態（例えば、癌）の結果として発現される。このような遺伝
子の発現の評価は、それにも関わらず、その状態に診断的および／または予後的
であり得る。例えば、上皮増殖因子レセプターは、乳癌腫瘍の４５％で過剰発現
され［Ｋｌｉｊｎら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖ．１３：３−１７（１９９２
）］、そしてＩＧＦ−１レセプターは、乳癌腫瘍の５０〜９３％において過剰発
現される［Ｂｅｒｎｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１０３６〜１０３９（
１９９２）］。
【００７５】 増殖因子の変化した発現は、疾患状態を生じ得るか、または疾患状態の原因で
あり得ることが実証されている。例えば、神経成長因子および線維芽細胞増殖因
子は、アルツハイマー病の動物モデルにおいてニューロン細胞の生存に影響を与
えることが示されており、そしてこのような増殖因子をコードする核酸の投与を
包含する治療は、研究中である［例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参
照のこと］。
あり得ることが実証されている。例えば、神経成長因子および線維芽細胞増殖因
子は、アルツハイマー病の動物モデルにおいてニューロン細胞の生存に影響を与
えることが示されており、そしてこのような増殖因子をコードする核酸の投与を
包含する治療は、研究中である［例えば、米国特許第５，５８０，８５９号を参
照のこと］。
【００７６】 本発明の方法は、それ自体遺伝子発現を調節する因子（例えば、特定の遺伝子
の発現によって生成されるｍＲＮＡのレベルに影響を与えるタンパク質または他
の分子）、および／またはその発現が種々の疾患状態においてアップレギュレー
トされるかもしくはダウンレギュレートされる因子の発現を評価するために使用
され得る。これらの因子には、とりわけ、ホルモン、サイトカイン、細胞内メッ
センジャー、転写因子、発癌物質が含まれる。
の発現によって生成されるｍＲＮＡのレベルに影響を与えるタンパク質または他
の分子）、および／またはその発現が種々の疾患状態においてアップレギュレー
トされるかもしくはダウンレギュレートされる因子の発現を評価するために使用
され得る。これらの因子には、とりわけ、ホルモン、サイトカイン、細胞内メッ
センジャー、転写因子、発癌物質が含まれる。
【００７７】 ｂｃｌ−２タンパク質の発現のダウンレギュレーションに対するアンチセンス
オリゴヌクレオチドの効果（これは、小細胞の肺癌と相関付けられている）は、
進行中の臨床試験の対象である［例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ Ｎａｔ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９：１０２７−１０３６（１９９７）を参照の
こと］。本発明の方法は、アンチセンスオリゴマーの定期的な投与およびこのよ
うな研究に参加する患者の尿中のアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖
のモニタリングによって、このような試験（例えば、遺伝子治療試験）をモニタ
リングするために使用され得る［例えば、米国特許第５，８４３，６８４号を参
照のこと］。
オリゴヌクレオチドの効果（これは、小細胞の肺癌と相関付けられている）は、
進行中の臨床試験の対象である［例えば、Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．ら、Ｊ Ｎａｔ
ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８９：１０２７−１０３６（１９９７）を参照の
こと］。本発明の方法は、アンチセンスオリゴマーの定期的な投与およびこのよ
うな研究に参加する患者の尿中のアンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖
のモニタリングによって、このような試験（例えば、遺伝子治療試験）をモニタ
リングするために使用され得る［例えば、米国特許第５，８４３，６８４号を参
照のこと］。
【００７８】 本発明の方法はまた、ＲＮＡスプライシング事象を診断およびモニタリングす
るために使用され得る。スプライシングプロセスは、プレ−ｍＲＮＡからのイン
トロン（介在性の、一次転写物または「プレ−ｍＲＮＡ」中の、ＲＮＡに転写さ
れたＤＮＡの非コード領域）の除去、および引き続くエキソンの結合を包含する
。異常なスプライシングは、プレ−ｍＲＮＡ中に変異が存在する場合に起こり得
る（例えば、米国特許第５，６２７，２７４号を参照のこと）。アンチセンス治
療は、このような異常なスプライシングを修正するために使用されてきた。従っ
て、本発明の方法もまた、このような治療の効果をモニタリングするために使用
され得る。
るために使用され得る。スプライシングプロセスは、プレ−ｍＲＮＡからのイン
トロン（介在性の、一次転写物または「プレ−ｍＲＮＡ」中の、ＲＮＡに転写さ
れたＤＮＡの非コード領域）の除去、および引き続くエキソンの結合を包含する
。異常なスプライシングは、プレ−ｍＲＮＡ中に変異が存在する場合に起こり得
る（例えば、米国特許第５，６２７，２７４号を参照のこと）。アンチセンス治
療は、このような異常なスプライシングを修正するために使用されてきた。従っ
て、本発明の方法もまた、このような治療の効果をモニタリングするために使用
され得る。
【００７９】 本発明の方法はさらに、多数の微生物のいずれかによる被験体の感染およびこ
のような感染に対する治療的介入の効果をモニタリングする際にさらなる有用性
を見出す。より具体的には、本発明の方法を使用してこのような感染と関連する
ＲＮＡの発現を評価することによって、特定のウイルス、細菌、または真菌での
感染が診断され得、そして治療がモニタリングされ得る。多数の感染性の微生物
と関連する特徴的な核酸配列は、公的なデータベースをにおいて利用可能であり
、そして本発明の方法における使用のために特異的なアンチセンスオリゴマーの
設計のための基礎として働き得る。
のような感染に対する治療的介入の効果をモニタリングする際にさらなる有用性
を見出す。より具体的には、本発明の方法を使用してこのような感染と関連する
ＲＮＡの発現を評価することによって、特定のウイルス、細菌、または真菌での
感染が診断され得、そして治療がモニタリングされ得る。多数の感染性の微生物
と関連する特徴的な核酸配列は、公的なデータベースをにおいて利用可能であり
、そして本発明の方法における使用のために特異的なアンチセンスオリゴマーの
設計のための基礎として働き得る。
【００８０】 例えば、代表的なウイルス感染（例えば、ＣＭＶのような潜伏性ウイルスの発
現によって引き起こされる感染）は、免疫蛍光アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、および／または固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して感染
した組織または血液の分析によってモニタリングされる。本発明は、感染に関連
するウイルスＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴマーを被験体に投与すること
、および被験体の尿中にそのオリゴマーを含むヘテロ二重鎖の引き続く分析によ
って、非侵襲的な手順で活性な感染を慣用的にモニタリングするための方法の利
点を提供する。
現によって引き起こされる感染）は、免疫蛍光アッセイ、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）、および／または固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して感染
した組織または血液の分析によってモニタリングされる。本発明は、感染に関連
するウイルスＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴマーを被験体に投与すること
、および被験体の尿中にそのオリゴマーを含むヘテロ二重鎖の引き続く分析によ
って、非侵襲的な手順で活性な感染を慣用的にモニタリングするための方法の利
点を提供する。
【００８１】 （Ｂ．モルホリノアンチセンスの利点） モルホリノサブユニットは、ヌクレオシドまたはヌクレオチドサブユニットと
は以下の点で異なる：（ｉ）モルホリノサブユニットは、ペントース糖骨格を欠
き、そしてより具体的には、リボース骨格部分を欠くこと、（ｉｉ）モルホリノ
に基づくサブユニット基における骨格部分は、環の窒素を含むこと、および（ｉ
ｉｉ）モルホリノサブユニットポリマーにおいてサブユニットに対する骨格カッ
プリングは、環の窒素を通してであること。
は以下の点で異なる：（ｉ）モルホリノサブユニットは、ペントース糖骨格を欠
き、そしてより具体的には、リボース骨格部分を欠くこと、（ｉｉ）モルホリノ
に基づくサブユニット基における骨格部分は、環の窒素を含むこと、および（ｉ
ｉｉ）モルホリノサブユニットポリマーにおいてサブユニットに対する骨格カッ
プリングは、環の窒素を通してであること。
【００８２】 モルホリノに基づくサブユニットの重要な化学的特性は、安定な、非荷電の骨
格連結によってポリマー型で連結される能力、およびそのように形成されたポリ
マーの、相補性塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）と、高い親和性でハイブリダ
イズする能力である。
格連結によってポリマー型で連結される能力、およびそのように形成されたポリ
マーの、相補性塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）と、高い親和性でハイブリダ
イズする能力である。
【００８３】 モルホリノオリゴヌクレオチドは、サブユニット間連結の型によって他の型の
オリゴヌクレオチドと区別され、そして以下の方法において異なる。
オリゴヌクレオチドと区別され、そして以下の方法において異なる。
【００８４】 ホスホジエステル結合によって連結された天然のポリヌクレオチドは、２つの
相補鎖のＴm（融解温度）によって測定されるように、相補鎖ＤＮＡおよびＲＮ
Ａについて比較的高い結合親和性を有する。生理学的条件下では、代表的な２０
マーのＤＮＡ鎖は、相補鎖ＤＮＡと対合した場合に約７２℃のＴmを有し、そし
て相補鎖ＲＮＡと対合した場合に約７７℃のＴmを有する。このような二重鎖の
両方の鎖は、荷電した骨格を有する。
相補鎖のＴm（融解温度）によって測定されるように、相補鎖ＤＮＡおよびＲＮ
Ａについて比較的高い結合親和性を有する。生理学的条件下では、代表的な２０
マーのＤＮＡ鎖は、相補鎖ＤＮＡと対合した場合に約７２℃のＴmを有し、そし
て相補鎖ＲＮＡと対合した場合に約７７℃のＴmを有する。このような二重鎖の
両方の鎖は、荷電した骨格を有する。
【００８５】 荷電したホスホジエステル結合が荷電した他の結合（例えば、ホスホロチオエ
ートまたはホスホロジチオエート）によって置換されているポリヌクレオチドは
、天然のポリヌクレオチドに対する結合親和性の有意な損失を示し、そして同じ
数の核酸塩基を含む、非荷電のオリゴヌクレオチドよりも、細胞の取り込みのた
めにより高い濃度を必要とする。
ートまたはホスホロジチオエート）によって置換されているポリヌクレオチドは
、天然のポリヌクレオチドに対する結合親和性の有意な損失を示し、そして同じ
数の核酸塩基を含む、非荷電のオリゴヌクレオチドよりも、細胞の取り込みのた
めにより高い濃度を必要とする。
【００８６】 荷電したホスホジエステル結合が、非荷電の結合（例えば、メチルホスホネー
ト、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、およびカルバメート）によって
置換されているポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ポリヌクレオチドと
比較した場合に、すべてＤＮＡまたはＲＮＡとの結合親和性の有意な減少を示す
。
ト、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、およびカルバメート）によって
置換されているポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合ポリヌクレオチドと
比較した場合に、すべてＤＮＡまたはＲＮＡとの結合親和性の有意な減少を示す
。
【００８７】 従って、最適な、非荷電の結合によって連結されているモルホリノに基づくサ
ブユニットで構築されるオリゴヌクレオチドは、相補鎖ＲＮＡまたは相補鎖ＤＮ
Ａと対合する場合に高い結合親和性のために好ましい。
ブユニットで構築されるオリゴヌクレオチドは、相補鎖ＲＮＡまたは相補鎖ＤＮ
Ａと対合する場合に高い結合親和性のために好ましい。
【００８８】 （Ｃ．例示的なｃ−ｍｙｃアンチセンス化合物） ｃ−ｍｙｃは、細胞の増殖および分化を調節する原癌遺伝子であり、血管再造
形のプロセスに関与して、アポトーシスにおいて役割を果たすことに加えて、平
滑筋細胞の増殖および細胞外マトリクス合成を調節する。ｃ-ｍｙｃの異常発現
は、ヒトの癌において頻繁に観察される。ｃ-ｍｙｃの異常発現、構成的発現ま
たは過剰発現は、ヒトの多数の癌（肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、
肺癌などを含む）と関連付けられている。
形のプロセスに関与して、アポトーシスにおいて役割を果たすことに加えて、平
滑筋細胞の増殖および細胞外マトリクス合成を調節する。ｃ-ｍｙｃの異常発現
は、ヒトの癌において頻繁に観察される。ｃ-ｍｙｃの異常発現、構成的発現ま
たは過剰発現は、ヒトの多数の癌（肺癌、結腸直腸癌、乳癌、膀胱癌、白血病、
肺癌などを含む）と関連付けられている。
【００８９】 ｍｙｃ原癌遺伝子は、他の遺伝子（この例としては、ＥＣＡ３９、ｐ５３、オ
ルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、α−プロチモシン（ａｌｐｈａ−ｐｒ
ｏｔｈｙｍｏｓｉｎ）およびＣｄｃ２５Ａが挙げられる）の発現を直接調節する
転写因子として記載されている（Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｆ，Ｔ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ １７（２）：１６５−７１，１９９８）。
ルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、α−プロチモシン（ａｌｐｈａ−ｐｒ
ｏｔｈｙｍｏｓｉｎ）およびＣｄｃ２５Ａが挙げられる）の発現を直接調節する
転写因子として記載されている（Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｆ，Ｔ．ら，Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ １７（２）：１６５−７１，１９９８）。
【００９０】 いくつかの原癌遺伝子ｍＲＮＡのインビトロ翻訳は、ホスホジエステルアンチ
センスオリゴヌクレオチドおよび／またはホスホロチオエートアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドによって好首尾にブロックされることが示されている（ｃ−ｍｙ
ｃ：ＭｃＭａｎａｗａｙら，Ｌａｎｃｅｔ ３３５：８０８，１９９０；Ｗａｔ
ｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３９９６，１９９１；ｂｃｌ−２：Ｒ
ｅｅｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：６５６５，１９９０；ｍｙｂ：Ｃａｌ
ａｂｒｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２３
５１，１９９１；ｂｃｒ−ａｂ：Ｓｚｃｚｙｌｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３
：５６２ １９９１）。
センスオリゴヌクレオチドおよび／またはホスホロチオエートアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドによって好首尾にブロックされることが示されている（ｃ−ｍｙ
ｃ：ＭｃＭａｎａｗａｙら，Ｌａｎｃｅｔ ３３５：８０８，１９９０；Ｗａｔ
ｓｏｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：３９９６，１９９１；ｂｃｌ−２：Ｒ
ｅｅｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：６５６５，１９９０；ｍｙｂ：Ｃａｌ
ａｂｒｅｔｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２３
５１，１９９１；ｂｃｒ−ａｂ：Ｓｚｃｚｙｌｉｋら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３
：５６２ １９９１）。
【００９１】 本発明に従って、（ｉ）選択された遺伝子の翻訳開始コドンにわたる領域に相
補的である標的化塩基配列を含む８〜４０ヌクレオチドを有し、そして（ｉｉ）
非荷電のリン含有サブユニット間結合を有する、経口投与されたモルホリノアン
チセンス化合物が、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に、生理学的条件下で３
７℃よりも実質的に高いＴｍでハイブリダイズすることが見出された。本発明に
支持されて行われたインビトロ研究および動物モデル研究は、このようなアンチ
センス化合物が、（ｉ）経口投与後に効率的に取り込まれること；（ｉｉ）細胞
内で作用して標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害すること；および（ｉｉｉ）このような
阻害において、他の型のアンチセンス化合物（例えば、ホスホロチオエートアン
チセンス化合物）よりも有意に効率的であることを示す。
補的である標的化塩基配列を含む８〜４０ヌクレオチドを有し、そして（ｉｉ）
非荷電のリン含有サブユニット間結合を有する、経口投与されたモルホリノアン
チセンス化合物が、標的ｍＲＮＡ内に含まれる標的配列に、生理学的条件下で３
７℃よりも実質的に高いＴｍでハイブリダイズすることが見出された。本発明に
支持されて行われたインビトロ研究および動物モデル研究は、このようなアンチ
センス化合物が、（ｉ）経口投与後に効率的に取り込まれること；（ｉｉ）細胞
内で作用して標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害すること；および（ｉｉｉ）このような
阻害において、他の型のアンチセンス化合物（例えば、ホスホロチオエートアン
チセンス化合物）よりも有意に効率的であることを示す。
【００９２】 モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合の特徴は、上記に引用した米国
特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０
４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２
１，０６３号および同第５，５０６，３３７号（これらの全ては、本明細書中に
参考として援用される）に詳述される。本発明のアンチセンスオリゴマー（化合
物）は、上記に引用した特許において示した形態のモルホリノサブユニットから
構成され、ここで、（ｉ）モルホリノ基は、１つのサブユニットのモルホリノ窒
素を、隣接したサブユニットの５’の環外の炭素へと連結する非荷電の（１〜３
原子長の）リン含有結合によって一緒に連結され、そして（ｉｉ）モルホリノ基
に結合した塩基は、ポリヌクレオチドにおける塩基へと、塩基特異的水素結合に
よって結合するのに有効なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分で
ある。プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分は代表的に、アデニン
、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。このようなオリゴマーの
調製は、米国特許第５，１８５，４４４号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌ
ｅｒ，１９９３）（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に
詳細に記載される。この参考文献に示されるように、いくつかの型の非イオン性
結合を用いて、モルホリノ骨格を構築し得る。
特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０
４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，５２
１，０６３号および同第５，５０６，３３７号（これらの全ては、本明細書中に
参考として援用される）に詳述される。本発明のアンチセンスオリゴマー（化合
物）は、上記に引用した特許において示した形態のモルホリノサブユニットから
構成され、ここで、（ｉ）モルホリノ基は、１つのサブユニットのモルホリノ窒
素を、隣接したサブユニットの５’の環外の炭素へと連結する非荷電の（１〜３
原子長の）リン含有結合によって一緒に連結され、そして（ｉｉ）モルホリノ基
に結合した塩基は、ポリヌクレオチドにおける塩基へと、塩基特異的水素結合に
よって結合するのに有効なプリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分で
ある。プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分は代表的に、アデニン
、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。このようなオリゴマーの
調製は、米国特許第５，１８５，４４４号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌ
ｅｒ，１９９３）（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に
詳細に記載される。この参考文献に示されるように、いくつかの型の非イオン性
結合を用いて、モルホリノ骨格を構築し得る。
【００９３】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例示的な骨格構造としては、図１
Ａ〜図１Ｅに示すβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチ
ドが１より多くの結合型を含み得ることが認識される。
Ａ〜図１Ｅに示すβ−モルホリノサブユニット型が挙げられる。ポリヌクレオチ
ドが１より多くの結合型を含み得ることが認識される。
【００９４】 図１におけるサブユニットＡは、図２においてＡ−Ａにて示した５原子繰り返
し単位骨格を形成する１原子リン含有結合を含み、ここでモルホリノ環は、１原
子ホスホアミド結合によって連結される。
し単位骨格を形成する１原子リン含有結合を含み、ここでモルホリノ環は、１原
子ホスホアミド結合によって連結される。
【００９５】 図１におけるサブユニットＢは、図２においてＢ−Ｂにて示すような、６原子
繰り返し単位骨格について設計される。構造Ｂでは、５’モルホリノ炭素をリン
基へと連結する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素または好ましくは酸素であり得る。
リンから張り出しているＸ部分は、以下のうちのいずれかであり得る：フッ素；
アルキルもしくは置換アルキル；アルコキシもしくは置換アルコキシ；チオアル
コキシもしくは置換チオアルコキシ；または非置換、一置換、もしくは二置換の
窒素（環状構造を含む）。
繰り返し単位骨格について設計される。構造Ｂでは、５’モルホリノ炭素をリン
基へと連結する原子Ｙは、硫黄、窒素、炭素または好ましくは酸素であり得る。
リンから張り出しているＸ部分は、以下のうちのいずれかであり得る：フッ素；
アルキルもしくは置換アルキル；アルコキシもしくは置換アルコキシ；チオアル
コキシもしくは置換チオアルコキシ；または非置換、一置換、もしくは二置換の
窒素（環状構造を含む）。
【００９６】 図１におけるサブユニットＣからＥは、図２におけるＣ−ＣからＥ−Ｅまでに
ついて示すような７原子単位長の骨格について設計される。構造Ｃでは、Ｘ部分
は、構造Ｂにおいての通りであり、そして部分Ｙは、メチレン、硫黄または好ま
しくは酸素であり得る。構造Ｄでは、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂにおいての
通りである。構造Ｅでは、Ｘは、構造Ｂにおいての通りであり、そしてＹは、Ｏ
、ＳまたはＮＲである。図１Ａ〜図１Ｅにおいて示す全てのサブユニットでは、
ＺはＯまたはＳであり、そしてＰiまたはＰjは、アデニン、シトシン、グアニン
またはウラシルである。
ついて示すような７原子単位長の骨格について設計される。構造Ｃでは、Ｘ部分
は、構造Ｂにおいての通りであり、そして部分Ｙは、メチレン、硫黄または好ま
しくは酸素であり得る。構造Ｄでは、Ｘ部分およびＹ部分は、構造Ｂにおいての
通りである。構造Ｅでは、Ｘは、構造Ｂにおいての通りであり、そしてＹは、Ｏ
、ＳまたはＮＲである。図１Ａ〜図１Ｅにおいて示す全てのサブユニットでは、
ＺはＯまたはＳであり、そしてＰiまたはＰjは、アデニン、シトシン、グアニン
またはウラシルである。
【００９７】 好ましい「モルホリノ」オリゴヌクレオチドは、図２Ｂ−Ｂに示す形態のモル
ホリノサブニット構造から構成され、ここで（ｉ）その構造は、１つのサブユニ
ットのモルホリノ窒素を、隣接したサブユニットの５’環外炭素へと連結する、
（１〜３原子長の）ホスホロジアミデート含有結合によって一緒に連結され、（
ｉｉ）ＰiおよびＰjは、ポリヌクレオチド中の塩基へと、塩基特異的水素結合に
よって結合するのに有効な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分
であり、そしてＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏである。
ホリノサブニット構造から構成され、ここで（ｉ）その構造は、１つのサブユニ
ットのモルホリノ窒素を、隣接したサブユニットの５’環外炭素へと連結する、
（１〜３原子長の）ホスホロジアミデート含有結合によって一緒に連結され、（
ｉｉ）ＰiおよびＰjは、ポリヌクレオチド中の塩基へと、塩基特異的水素結合に
よって結合するのに有効な、プリン塩基対合部分またはピリミジン塩基対合部分
であり、そしてＸ＝ＮＨ2、Ｙ＝ＯおよびＺ＝Ｏである。
【００９８】 上記で示したように、オリゴヌクレオチド化合物は、標的ｍＲＮＡの開始コド
ンに及ぶ配列を有し、このことは、この化合物が、ＡＵＧ ｍＲＮＡ翻訳開始部
位ならびに隣接する５’塩基および３’塩基を含む標的ＲＮＡの一領域に相補的
な配列を含むことを意味する。この化合物が指向されるｍＲＮＡの領域は、本明
細書中で標的配列とも呼ばれる。このｍＲＮＡは、プロセシング前ｍＲＮＡまた
はプロセシング後ｍＲＮＡであり得る。
ンに及ぶ配列を有し、このことは、この化合物が、ＡＵＧ ｍＲＮＡ翻訳開始部
位ならびに隣接する５’塩基および３’塩基を含む標的ＲＮＡの一領域に相補的
な配列を含むことを意味する。この化合物が指向されるｍＲＮＡの領域は、本明
細書中で標的配列とも呼ばれる。このｍＲＮＡは、プロセシング前ｍＲＮＡまた
はプロセシング後ｍＲＮＡであり得る。
【００９９】 この化合物は、標的ｍＲＮＡに、生理的条件下で、３７℃よりも実質的に高い
Ｔｍ（例えば、少なくとも５０℃および好ましくは６０℃〜８０℃）でハイブリ
ダイズするように設計される。この化合物は、標的配列に対して必ずしも１００
％相補的ではないが、標的配列の発現が調節されるように、標的配列に安定かつ
特異的に結合するために有効である。良好な特異性での安定で有効な結合を可能
にするために適切なオリゴマーの長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位、そ
して好ましくは約１２〜２５塩基単位である。存在する場合、ミスマッチは、真
ん中においてよりも、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かってより不安定化さ
れない。標的との塩基対合特異性が維持されるとすれば、標的塩基との縮重塩基
対合を可能にするオリゴマー塩基もまた意図される。好ましくは、この化合物は
、ＡＵＧ部位に相補的な内部の３塩基コドン、ならびにこの開始部位に対して５
’および３’側の１以上の塩基を含む。ｃ−ｍｙｃ開始部位配列に及ぶ１つの例
示的な化合物は、配列番号２として表され、そして塩基配列：５’−ＡＣＧ Ｔ
ＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’を有する。ｃ−ｍｙｃ開始
部位に及ぶことに加えて、この化合物は、約３０ｍｇ／ｍｌよりも高い、水性媒
体中での溶解度を有する。
Ｔｍ（例えば、少なくとも５０℃および好ましくは６０℃〜８０℃）でハイブリ
ダイズするように設計される。この化合物は、標的配列に対して必ずしも１００
％相補的ではないが、標的配列の発現が調節されるように、標的配列に安定かつ
特異的に結合するために有効である。良好な特異性での安定で有効な結合を可能
にするために適切なオリゴマーの長さは、約８〜４０ヌクレオチド塩基単位、そ
して好ましくは約１２〜２５塩基単位である。存在する場合、ミスマッチは、真
ん中においてよりも、ハイブリッド二重鎖の末端領域に向かってより不安定化さ
れない。標的との塩基対合特異性が維持されるとすれば、標的塩基との縮重塩基
対合を可能にするオリゴマー塩基もまた意図される。好ましくは、この化合物は
、ＡＵＧ部位に相補的な内部の３塩基コドン、ならびにこの開始部位に対して５
’および３’側の１以上の塩基を含む。ｃ−ｍｙｃ開始部位配列に及ぶ１つの例
示的な化合物は、配列番号２として表され、そして塩基配列：５’−ＡＣＧ Ｔ
ＴＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＧＣ−３’を有する。ｃ−ｍｙｃ開始
部位に及ぶことに加えて、この化合物は、約３０ｍｇ／ｍｌよりも高い、水性媒
体中での溶解度を有する。
【０１００】 このアンチセンス化合物の溶解度およびこの化合物が、溶液中での保存の際に
沈殿に抵抗する能力は、オリゴマーを可溶化部分（例えば、親水性オリゴマー）
または荷電種を用いて誘導体化することによってさらに増強され得る。
沈殿に抵抗する能力は、オリゴマーを可溶化部分（例えば、親水性オリゴマー）
または荷電種を用いて誘導体化することによってさらに増強され得る。
【０１０１】 標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖を形成する際の所定のアンチセンス配列の有効性
は、当該分野で公知のスクリーニング方法によって決定され得る。例えば、この
オリゴマーは、この標的ＲＮＡを発現する細胞培養物とともにインキュベートさ
れ、そしてヘテロ二重鎖の存在または非存在が、以下に示す技術のような技術に
よって、またはＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングのような標準的技
術によって決定される、コードされるタンパク質の存在もしくは非存在をモニタ
リングすることによって、決定される［例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３９（５
）：１１５７−１１６１（１９９５）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０（９
）：２００４−２０１１（１９９６）を参照のこと］。非標的配列に対するオリ
ゴマー分子の非特異的結合が制限されることは一般に望ましい。
は、当該分野で公知のスクリーニング方法によって決定され得る。例えば、この
オリゴマーは、この標的ＲＮＡを発現する細胞培養物とともにインキュベートさ
れ、そしてヘテロ二重鎖の存在または非存在が、以下に示す技術のような技術に
よって、またはＥＬＩＳＡもしくはウェスタンブロッティングのような標準的技
術によって決定される、コードされるタンパク質の存在もしくは非存在をモニタ
リングすることによって、決定される［例えば、Ｐａｒｉ，Ｇ．Ｓ．ら，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３９（５
）：１１５７−１１６１（１９９５）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら，Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ４０（９
）：２００４−２０１１（１９９６）を参照のこと］。非標的配列に対するオリ
ゴマー分子の非特異的結合が制限されることは一般に望ましい。
【０１０２】 本発明を実施する際に用いられるアンチセンスオリゴマーは、以下の特性を有
さねばならない：（Ａ）ヌクレアーゼ耐性、（Ｂ）高い親和性で、すなわち、３
７℃より実質的に高いＴｍにて、標的ＲＮＡの相補配列とハイブリダイズする能
力、および（Ｃ）標的ＲＮＡとヌクレアーゼ耐性オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重
鎖を形成する能力。
さねばならない：（Ａ）ヌクレアーゼ耐性、（Ｂ）高い親和性で、すなわち、３
７℃より実質的に高いＴｍにて、標的ＲＮＡの相補配列とハイブリダイズする能
力、および（Ｃ）標的ＲＮＡとヌクレアーゼ耐性オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重
鎖を形成する能力。
【０１０３】 二重鎖ＤＮＡは、アンチセンス分子によって標的化され得るが、この遺伝子の
関連する領域から転写されたｍＲＮＡは、より一般的に標的化される。このよう
なｍＲＮＡは、コード配列に加えて、イニシエーター部位またはプロモーター部
位、イントロン／エキソン連結部位、３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域を
含み、これらの領域もまた標的化され得る。
関連する領域から転写されたｍＲＮＡは、より一般的に標的化される。このよう
なｍＲＮＡは、コード配列に加えて、イニシエーター部位またはプロモーター部
位、イントロン／エキソン連結部位、３’非翻訳領域、および５’非翻訳領域を
含み、これらの領域もまた標的化され得る。
【０１０４】 候補アンチセンスオリゴマーはまた、周知の方法に従って、急性細胞毒性およ
び慢性細胞毒性（例えば、それぞれ、3Ｈ−ロイシンおよび3Ｈ−チミジンの取り
込みによって測定した、タンパク質合成およびＤＮＡ合成に対する効果）につい
て評価される。
び慢性細胞毒性（例えば、それぞれ、3Ｈ−ロイシンおよび3Ｈ−チミジンの取り
込みによって測定した、タンパク質合成およびＤＮＡ合成に対する効果）につい
て評価される。
【０１０５】 非標的配列に対するオリゴマー分子の非特異的結合が制限されることが一般に
望ましい。このようなオリゴマーのいくつかの非配列特異的相互作用は、治療効
果を示し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９６）が、このような相互作用
はしばしば、所望でない副作用を生じる。非特異的結合について試験するために
、コントロール配列（例えば、センス配列または非センス配列）またはミスマッ
チ塩基を含む配列は、予備スクリーニング試験に（インビトロにて）含まれ得る
。過剰な標的化されたタンパク質またはｍＲＮＡはまた、細胞培養物に添加され
て、このアンチセンスオリゴマーの効果が逆転されるかが観察される［Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（７）：１９８１−１９９
３（１９９５）］。
望ましい。このようなオリゴマーのいくつかの非配列特異的相互作用は、治療効
果を示し得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９６）が、このような相互作用
はしばしば、所望でない副作用を生じる。非特異的結合について試験するために
、コントロール配列（例えば、センス配列または非センス配列）またはミスマッ
チ塩基を含む配列は、予備スクリーニング試験に（インビトロにて）含まれ得る
。過剰な標的化されたタンパク質またはｍＲＮＡはまた、細胞培養物に添加され
て、このアンチセンスオリゴマーの効果が逆転されるかが観察される［Ｂｅｎｎ
ｅｔｔ，Ｍ．Ｒ．ら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９２（７）：１９８１−１９９
３（１９９５）］。
【０１０６】 さらなる配列は、１以上の所望の標的配列を計画して、当業者によって慣用的
に用いられる方法に従って実施されるスクリーニングを用いて、当業者によって
調製され得る。
に用いられる方法に従って実施されるスクリーニングを用いて、当業者によって
調製され得る。
【０１０７】 メッセンジャーＲＮＡ配列の標的化が好ましいが、二重鎖ＤＮＡは、二重鎖Ｄ
ＮＡにおける主溝部位に対する配列特異的結合について設計された非イオン性プ
ローブを用いることにより、標的化され得る。このようなプローブ型は、米国特
許第５，１６６，３１５号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９２
）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載され、そしてまた一般
に、本明細書中で、標的遺伝子の発現をブロックする能力を言及して、アンチセ
ンスオリゴマーと言及される。
ＮＡにおける主溝部位に対する配列特異的結合について設計された非イオン性プ
ローブを用いることにより、標的化され得る。このようなプローブ型は、米国特
許第５，１６６，３１５号（ＳｕｍｍｅｒｔｏｎおよびＷｅｌｌｅｒ，１９９２
）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載され、そしてまた一般
に、本明細書中で、標的遺伝子の発現をブロックする能力を言及して、アンチセ
ンスオリゴマーと言及される。
【０１０８】 モルホリノオリゴマーは、安定な非荷電の骨格連結によってポリマー形態で連
結され得、そして相補的な塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）と高い親和性でハ
イブリダイズし得る。各モルホリノサブユニットの環窒素を通してのサブユニッ
トカップリングに関するこの組み合わせは、天然のポリヌクレオチドにも、種々
の荷電連結もしくは非荷電連結を含むポリヌクレオチドにも、天然に存在するヌ
クレオチドの「１以上の」アナログを含むポリヌクレオチドにも見出されない。
結され得、そして相補的な塩基標的核酸（標的ＲＮＡを含む）と高い親和性でハ
イブリダイズし得る。各モルホリノサブユニットの環窒素を通してのサブユニッ
トカップリングに関するこの組み合わせは、天然のポリヌクレオチドにも、種々
の荷電連結もしくは非荷電連結を含むポリヌクレオチドにも、天然に存在するヌ
クレオチドの「１以上の」アナログを含むポリヌクレオチドにも見出されない。
【０１０９】 本発明によれば、アンチセンスオリゴマーは、標的ＲＮＡに含まれる選択され
た標的配列の領域に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。従って、
公知の配列を有する任意の遺伝子の発現産物が、当該分野で公知である合成につ
いて慣用技術を用いたアンチセンスオリゴマーの形成のためのテンプレートとし
て用いられ得ることが認識される。このようなアンチセンスオリゴは、本発明の
方法に取り込まれ得、そして標的遺伝子の発現についてスクリーニングするため
に用いられ得る。従って、スプライシングされたＲＮＡおよびスプライシングさ
れていないＲＮＡの両方が、本発明の方法において用いられ得るアンチセンスオ
リゴマーの設計のためのテンプレートとして役立ち得る。
た標的配列の領域に特異的にハイブリダイズするように設計され得る。従って、
公知の配列を有する任意の遺伝子の発現産物が、当該分野で公知である合成につ
いて慣用技術を用いたアンチセンスオリゴマーの形成のためのテンプレートとし
て用いられ得ることが認識される。このようなアンチセンスオリゴは、本発明の
方法に取り込まれ得、そして標的遺伝子の発現についてスクリーニングするため
に用いられ得る。従って、スプライシングされたＲＮＡおよびスプライシングさ
れていないＲＮＡの両方が、本発明の方法において用いられ得るアンチセンスオ
リゴマーの設計のためのテンプレートとして役立ち得る。
【０１１０】 ２つ以上のＲＮＡ配列（例えば、２以上の生物学的サンプルにおいて発現され
るＲＮＡ）の間の相違は、このような相違（例えば、１つの組織において優先的
に発現し、そして別の組織において優先的に発現しない特定の遺伝子における変
異）を反映するアンチセンスオリゴマーの合成の基礎として役立ち得る。このよ
うな優先的発現は、定量的または定性的であり得る。
るＲＮＡ）の間の相違は、このような相違（例えば、１つの組織において優先的
に発現し、そして別の組織において優先的に発現しない特定の遺伝子における変
異）を反映するアンチセンスオリゴマーの合成の基礎として役立ち得る。このよ
うな優先的発現は、定量的または定性的であり得る。
【０１１１】 上記の種々の結合を有するアンチセンスオリゴマーは、公知の方法に従って調
製され得る。例えば、広範に使用されるホスホロチオエート連結オリゴヌクレオ
チドアナログは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．またはＰｈ
ａｒｍａｃｉａから入手可能な商業的ＤＮＡシンセサイザーにおいて、標準的な
ホスホルアミダイト化学またはβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用い
て調製され得る。リン結合は、標準的なヨウ素試薬の代わりに３Ｈ−１，２−ベ
ンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドを用いて酸化することによって
ホスホロチオエートへと変換される（例えば、Ａｇｒａｗａｌ，Ｓｍｉｔｈ，Ｉ
ｙｅｒを参照のこと）。
製され得る。例えば、広範に使用されるホスホロチオエート連結オリゴヌクレオ
チドアナログは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．またはＰｈ
ａｒｍａｃｉａから入手可能な商業的ＤＮＡシンセサイザーにおいて、標準的な
ホスホルアミダイト化学またはβ−シアノエチルホスホルアミダイト化学を用い
て調製され得る。リン結合は、標準的なヨウ素試薬の代わりに３Ｈ−１，２−ベ
ンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシドを用いて酸化することによって
ホスホロチオエートへと変換される（例えば、Ａｇｒａｗａｌ，Ｓｍｉｔｈ，Ｉ
ｙｅｒを参照のこと）。
【０１１２】 （ＩＩＩ．発明を実施するための形態） （Ａ．アンチセンスオリゴマーの投与） １つの好ましい実施形態では、本発明は、薬学的に受容可能なキャリア中に含
まれる非荷電のリン含有骨格結合を有するモルホリノアンチセンス化合物の効率
的な経口送達を提供し、この送達は、３７℃よりも実質的に高いＴｍでのワトソ
ン−クリック塩基対合によるｍＲＮＡ標的へのオリゴマーのハイブリダイゼーシ
ョンをもたらす。
まれる非荷電のリン含有骨格結合を有するモルホリノアンチセンス化合物の効率
的な経口送達を提供し、この送達は、３７℃よりも実質的に高いＴｍでのワトソ
ン−クリック塩基対合によるｍＲＮＡ標的へのオリゴマーのハイブリダイゼーシ
ョンをもたらす。
【０１１３】 別の好ましい実施形態では、本発明は、標的ＲＮＡへのアンチセンスオリゴマ
ーの効率的経口送達を提供し、その結果、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテ
ロ二重鎖の存在または非存在の決定が被験体中の標的ＲＮＡの存在または非存在
を反映する。
ーの効率的経口送達を提供し、その結果、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテ
ロ二重鎖の存在または非存在の決定が被験体中の標的ＲＮＡの存在または非存在
を反映する。
【０１１４】 この実施形態の１つの局面では、有効な送達はまた、アンチセンス治療につい
て一般的に有効であり、そして標的ＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーの有効な
送達をもたらすと当業者に公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る。
て一般的に有効であり、そして標的ＲＮＡへのアンチセンスオリゴマーの有効な
送達をもたらすと当業者に公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る。
【０１１５】 本発明によれば、アンチセンスオリゴマー送達のこのような経路としては、種
々の全身経路（非経口経路（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉
内注射および動脈内注射）を含む）、ならびに吸入および経皮送達が挙げられる
がこれらに限定されない。いくつかの場合、特定の組織または部位への直接投与
による標的化された送達が好ましい。薬物を標的部位に送達するかまたは薬物を
血流中に導入するために有効である任意の方法もまた意図されることが認識され
る。
々の全身経路（非経口経路（例えば、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉
内注射および動脈内注射）を含む）、ならびに吸入および経皮送達が挙げられる
がこれらに限定されない。いくつかの場合、特定の組織または部位への直接投与
による標的化された送達が好ましい。薬物を標的部位に送達するかまたは薬物を
血流中に導入するために有効である任意の方法もまた意図されることが認識され
る。
【０１１６】 アンチセンスオリゴマーの標的化はまた、特定の組織または位置への直接注射
（すなわち、腫瘍への直接注射）によって達成され得、それにより、腫瘍に関連
した特定のＲＮＡ配列（すなわち、腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子）の発現の評
価を促進する。あるいは、アンチセンスオリゴマーは、オリゴを特定の組織また
は細胞型へと標的化するのに役立つ分子（例えば、抗体／オリゴマー結合体）を
用いて結合体化され得る。
（すなわち、腫瘍への直接注射）によって達成され得、それにより、腫瘍に関連
した特定のＲＮＡ配列（すなわち、腫瘍抑制遺伝子または癌遺伝子）の発現の評
価を促進する。あるいは、アンチセンスオリゴマーは、オリゴを特定の組織また
は細胞型へと標的化するのに役立つ分子（例えば、抗体／オリゴマー結合体）を
用いて結合体化され得る。
【０１１７】 アンチセンスオリゴマーの経皮送達は、例えば、局所投与に適合した薬学的に
受容可能なキャリアの使用によって達成され得る。モルホリノを送達するために
有用な１つの分子結合体は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４（１９９６年
１１月６日公開、そして本明細書中に参考として援用される）に記載される。
受容可能なキャリアの使用によって達成され得る。モルホリノを送達するために
有用な１つの分子結合体は、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９７／４０８５４（１９９６年
１１月６日公開、そして本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０１１８】 代表的に、１以上の用量のアンチセンスオリゴマーが、一般に定期的な間隔で
約１〜２週間の期間にわたって投与される。経口投与についての好ましい用量は
、約１ｍｇオリゴマー／患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者（７０ｋｇの体重に
基づく）である。いくつかの場合、２５ｍｇオリゴマー／患者を超える用量が必
要であり得る。ＩＶ投与について、好ましい用量は、約０．５ｍｇオリゴマー／
患者〜約１０ｍｇオリゴマー／患者（７０ｋｇという成人体重に基づく）である
。
約１〜２週間の期間にわたって投与される。経口投与についての好ましい用量は
、約１ｍｇオリゴマー／患者〜約２５ｍｇオリゴマー／患者（７０ｋｇの体重に
基づく）である。いくつかの場合、２５ｍｇオリゴマー／患者を超える用量が必
要であり得る。ＩＶ投与について、好ましい用量は、約０．５ｍｇオリゴマー／
患者〜約１０ｍｇオリゴマー／患者（７０ｋｇという成人体重に基づく）である
。
【０１１９】 アンチセンス化合物は一般に、少なくとも２００〜４００ｎＭアンチセンスオ
リゴマーというピーク血液濃度を生じるに有効な量および様式で投与される。体
液（例えば、尿）中でのヘテロ二重鎖の存在は代表的に、投与後３〜１８時間、
好ましくは投与後６〜１２時間モニタリングされる。
リゴマーというピーク血液濃度を生じるに有効な量および様式で投与される。体
液（例えば、尿）中でのヘテロ二重鎖の存在は代表的に、投与後３〜１８時間、
好ましくは投与後６〜１２時間モニタリングされる。
【０１２０】 （ＩＶ．アンチセンス送達をアッセイするための方法） （Ａ．ヘテロ二重鎖の検出） ＲＮＡ発現のインジケーターとして役立てるために、アンチセンスオリゴマー
：ＲＮＡヘテロ二重鎖は、ハイブリダイズされたままでありかつ細胞膜を通過す
る間の分解に抵抗性であるのに十分な安定性を有さねばならない。特に、アンチ
センスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖が尿中に検出される場合、アンチセンス
オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖はまた、間質液を通って血流へと移行されなけ
ればならならず、そして腎臓を通して尿中へと濾過されなければならない。従っ
て、ヘテロ二重鎖は、イオン強度、ｐＨおよび温度（大部分のポリヌクレオチド
二重鎖のＴｍ、すなわち、安定性に影響を与えることが知られている条件）にお
ける変化に耐えなければならない。これらのヘテロ二重鎖は、動物から収集され
る尿において検出可能および定量可能である。
：ＲＮＡヘテロ二重鎖は、ハイブリダイズされたままでありかつ細胞膜を通過す
る間の分解に抵抗性であるのに十分な安定性を有さねばならない。特に、アンチ
センスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖が尿中に検出される場合、アンチセンス
オリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖はまた、間質液を通って血流へと移行されなけ
ればならならず、そして腎臓を通して尿中へと濾過されなければならない。従っ
て、ヘテロ二重鎖は、イオン強度、ｐＨおよび温度（大部分のポリヌクレオチド
二重鎖のＴｍ、すなわち、安定性に影響を与えることが知られている条件）にお
ける変化に耐えなければならない。これらのヘテロ二重鎖は、動物から収集され
る尿において検出可能および定量可能である。
【０１２１】 尿検出において使用するための１つの例示的なアッセイ形式では、オリゴマー
：ＲＮＡへテロ二重鎖を含むサンプルを、オリゴマー：ＲＮＡへテロ二重鎖へ特
異的に結合するかまたは改変する化合物（例えば、特定のヘテロ二重鎖に特異的
なモノクローナル抗体（ｍＡｂ））と反応させ、続いて、改変または結合体化さ
れたオリゴマー：ＲＮＡへテロ二重鎖を検出する。
：ＲＮＡへテロ二重鎖を含むサンプルを、オリゴマー：ＲＮＡへテロ二重鎖へ特
異的に結合するかまたは改変する化合物（例えば、特定のヘテロ二重鎖に特異的
なモノクローナル抗体（ｍＡｂ））と反応させ、続いて、改変または結合体化さ
れたオリゴマー：ＲＮＡへテロ二重鎖を検出する。
【０１２２】 別の例示的なアッセイ形式では、アンチセンスオリゴマーは、アンチセンスオ
リゴマーをレポーター分子と結合体化することによって、被験体への投与の前に
改変され、続いて、複合体化されていないレポーター標識アンチセンスオリゴマ
ーからヘテロ二重鎖が分離され、そしてヘテロ二重鎖関連レポーター分子が検出
される。いくつかの場合、このような分離は、クロマトグラフィーまたは電気泳
動によって実施され得る。
リゴマーをレポーター分子と結合体化することによって、被験体への投与の前に
改変され、続いて、複合体化されていないレポーター標識アンチセンスオリゴマ
ーからヘテロ二重鎖が分離され、そしてヘテロ二重鎖関連レポーター分子が検出
される。いくつかの場合、このような分離は、クロマトグラフィーまたは電気泳
動によって実施され得る。
【０１２３】 代表的な検出方法としては、分光光度検出（例えば、蛍光検出器を用いる）ま
たは抗体を用いる検出（例えば、ＦＡＣＳ分析）が挙げられる。このような方法
は、分析（例えば、同時蛍光検出を伴うクロマトグラフィー分離、またはゲル染
色による検出、蛍光検出もしくはオートラジオグラフィー検出を伴う電気泳動分
離）を促進するために分離方法と組み合わされ得る。このような技術は、当業者
に公知であり、そして所定のアンチセンスオリゴマーおよび標的ＲＮＡ配列に容
易に適応可能である。
たは抗体を用いる検出（例えば、ＦＡＣＳ分析）が挙げられる。このような方法
は、分析（例えば、同時蛍光検出を伴うクロマトグラフィー分離、またはゲル染
色による検出、蛍光検出もしくはオートラジオグラフィー検出を伴う電気泳動分
離）を促進するために分離方法と組み合わされ得る。このような技術は、当業者
に公知であり、そして所定のアンチセンスオリゴマーおよび標的ＲＮＡ配列に容
易に適応可能である。
【０１２４】 核酸を標識するために当該分野で公知の任意の蛍光分子（例えば、フルオレセ
インおよびフルオレセイン誘導体（例えば、カルボキシフルオレセイン、５−（
４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ
）；エオシン；ローダミン（例えば、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）お
よびテトラメチルローダミン）；シアニン色素（例えば、チアゾールオレンジ、
オキサゾールイエローならびに米国特許第４，９５７，８７０号および同第４，
８８８，８６７号に記載される関連色素）；ピレン；ポルフィリン色素（例えば
、Ｌａ ＪｏｌｌａＢｌｕｅ））は、本発明の方法において用いられ得る。蛍光
標識は、その蛍光寿命が、蛍光色素が結合体化されるオリゴヌクレオチドの温度
、粘度およびサイズが全てタンブリング時間に影響を与えることを考慮して、測
定される相関時間に大きさにおいて匹敵するように選択されるべきである。蛍光
標識は、標識からの蛍光の発光または標的配列へのプローブのハイブリダイゼー
ションのいずれも妨害しないように、シグナルプライマーに対して共有結合され
るかまたは結合体化される［米国特許第５，６１４，６１７号および同第５，６
５２，０９９号もまた参照のこと］。
インおよびフルオレセイン誘導体（例えば、カルボキシフルオレセイン、５−（
４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（５−ＤＴＡＦ
）；エオシン；ローダミン（例えば、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）お
よびテトラメチルローダミン）；シアニン色素（例えば、チアゾールオレンジ、
オキサゾールイエローならびに米国特許第４，９５７，８７０号および同第４，
８８８，８６７号に記載される関連色素）；ピレン；ポルフィリン色素（例えば
、Ｌａ ＪｏｌｌａＢｌｕｅ））は、本発明の方法において用いられ得る。蛍光
標識は、その蛍光寿命が、蛍光色素が結合体化されるオリゴヌクレオチドの温度
、粘度およびサイズが全てタンブリング時間に影響を与えることを考慮して、測
定される相関時間に大きさにおいて匹敵するように選択されるべきである。蛍光
標識は、標識からの蛍光の発光または標的配列へのプローブのハイブリダイゼー
ションのいずれも妨害しないように、シグナルプライマーに対して共有結合され
るかまたは結合体化される［米国特許第５，６１４，６１７号および同第５，６
５２，０９９号もまた参照のこと］。
【０１２５】 別の場合、Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．ら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（７
）：２３９９（１９８５）に記載されるように、配列の５’末端に反応性アミノ
基が結合された所定の標的に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴマ
ーが合成され得る。このような場合、ビオチン、ペプチドまたは酵素（例えば、
アルカリホスファターゼ）は、５’アミノ基に結合され得る［米国特許第５，７
８３，３９１号もまた参照のこと］。
）：２３９９（１９８５）に記載されるように、配列の５’末端に反応性アミノ
基が結合された所定の標的に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴマ
ーが合成され得る。このような場合、ビオチン、ペプチドまたは酵素（例えば、
アルカリホスファターゼ）は、５’アミノ基に結合され得る［米国特許第５，７
８３，３９１号もまた参照のこと］。
【０１２６】 なお別の実施形態では、ヘテロ二重鎖は、例えば、体液サンプルからの単離後
に、質量分析によって検出され得る。本発明に支持されて行われる研究では、Ｒ
ＮＡ：モルホリノオリゴマーのヘテロ二重鎖は、質量分析によって２つの異なる
ＭＷ画分（２つのヘテロ二重鎖）へと容易に分離されることが見出された。従っ
て、この方法は、その２つの成分鎖に関してヘテロ二重鎖の正の同定を提供する
。
に、質量分析によって検出され得る。本発明に支持されて行われる研究では、Ｒ
ＮＡ：モルホリノオリゴマーのヘテロ二重鎖は、質量分析によって２つの異なる
ＭＷ画分（２つのヘテロ二重鎖）へと容易に分離されることが見出された。従っ
て、この方法は、その２つの成分鎖に関してヘテロ二重鎖の正の同定を提供する
。
【０１２７】 （Ｂ．アッセイ手順） １つのアッセイ方法では、ヘテロ二重鎖は、適切なレポーターの存在によって
、または適切なレポーター（例えば、蛍光標識ストレプトアビジン）がオリゴマ
ー結合基（例えば、ビオチン）へと結合した後に、直接検出される。
、または適切なレポーター（例えば、蛍光標識ストレプトアビジン）がオリゴマ
ー結合基（例えば、ビオチン）へと結合した後に、直接検出される。
【０１２８】 別のアプローチでは、標的核酸に特異的な標的核酸配列および／またはその相
補体は、例えば、ＰＣＲによってコピー数を選択的に増加させる［Ｓａｉｋｉら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０（１９８５）；米国特許第４，６８３，１
９５および同第４，６８３，２０２号］。
補体は、例えば、ＰＣＲによってコピー数を選択的に増加させる［Ｓａｉｋｉら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１３５０（１９８５）；米国特許第４，６８３，１
９５および同第４，６８３，２０２号］。
【０１２９】 なお別のアプローチでは、体液サンプルを、ヘテロ二重鎖結合薬剤（例えば、
レポーター標識されるか、または一次抗体に対する標識された二次抗体の結合に
よってその後標識されるかのいずれかである抗体）と反応させる。
レポーター標識されるか、または一次抗体に対する標識された二次抗体の結合に
よってその後標識されるかのいずれかである抗体）と反応させる。
【０１３０】 本発明によるアッセイは、同時に、可能な限りほぼ同様の条件下で、１以上の
試験サンプルおよびコントロールサンプルについて実施され得る。当該分野で理
解されるように、コントロールサンプルは、試験サンプルに類似するが、いずれ
の標的をも含まないかまたは特定の試薬を含まないかが既知である。代表的なコ
ントロールとしては、標的ＲＮＡを欠く被験体由来の同じ型の体液のサンプル、
ならびにアンチセンスオリゴマー組成物の投与前および投与後の１以上の時点で
収集された同じ被験体由来のサンプルが挙げられる。添加された標的または添加
されたオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を有するコントロールを用いて、そのレ
ベル未満では、標的を含むサンプルを、標的を含まないサンプルと区別すること
ができないレベルを確立し得る。一定範囲の公知の濃度の標的を有するコントロ
ールサンプルが用いられる場合、試験サンプル中の標的の濃度が評価され得る。
試験サンプルおよびコントロールサンプルについて実施され得る。当該分野で理
解されるように、コントロールサンプルは、試験サンプルに類似するが、いずれ
の標的をも含まないかまたは特定の試薬を含まないかが既知である。代表的なコ
ントロールとしては、標的ＲＮＡを欠く被験体由来の同じ型の体液のサンプル、
ならびにアンチセンスオリゴマー組成物の投与前および投与後の１以上の時点で
収集された同じ被験体由来のサンプルが挙げられる。添加された標的または添加
されたオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を有するコントロールを用いて、そのレ
ベル未満では、標的を含むサンプルを、標的を含まないサンプルと区別すること
ができないレベルを確立し得る。一定範囲の公知の濃度の標的を有するコントロ
ールサンプルが用いられる場合、試験サンプル中の標的の濃度が評価され得る。
【０１３１】 本発明のアッセイ方法が行われるサンプルは、処理していない体液サンプル（
例えば、尿、唾液、血漿、血液または他の体液、組織培養培地または食品原料）
であり得る。いくつかの場合、この方法は、標的の検出を妨害する物質を除去す
るように処理された生物学的サンプルに対して実施される。生物学的サンプルを
処理して、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を検出する種々の方法
についてさらに適切なサンプルを得る方法は、当該分野で周知である。
例えば、尿、唾液、血漿、血液または他の体液、組織培養培地または食品原料）
であり得る。いくつかの場合、この方法は、標的の検出を妨害する物質を除去す
るように処理された生物学的サンプルに対して実施される。生物学的サンプルを
処理して、アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を検出する種々の方法
についてさらに適切なサンプルを得る方法は、当該分野で周知である。
【０１３２】 サンプルを含む関連する体液としては、尿、血漿（または血清）、全血、唾液
、脳脊髄液および生検組織から得られた流体が挙げられる。尿および唾液は、本
発明の方法に従ってオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在を検出するために好
ましい体液である。尿または唾液のサンプルの分析を含むオリゴマー：ＲＮＡヘ
テロ二重鎖の決定は、このような体液サンプルが、特殊化された医学装置または
設備についての必要を伴わずに、そして被験体に対する不快感がほとんどないか
または全くなく、得られ得るという利点を提供する。このサンプルは、例えば、
ＨＰＬＣまたは電気泳動によって前処理されて、ヘテロ二重鎖をその検出または
定量の前に精製または部分精製し得る。
、脳脊髄液および生検組織から得られた流体が挙げられる。尿および唾液は、本
発明の方法に従ってオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在を検出するために好
ましい体液である。尿または唾液のサンプルの分析を含むオリゴマー：ＲＮＡヘ
テロ二重鎖の決定は、このような体液サンプルが、特殊化された医学装置または
設備についての必要を伴わずに、そして被験体に対する不快感がほとんどないか
または全くなく、得られ得るという利点を提供する。このサンプルは、例えば、
ＨＰＬＣまたは電気泳動によって前処理されて、ヘテロ二重鎖をその検出または
定量の前に精製または部分精製し得る。
【０１３３】 （Ｖ．この方法の適用） 上記より、本発明の組成物および方法が、標的遺伝子のｍＲＮＡの翻訳開始コ
ドンに及ぶ領域に相補的である標的塩基配列および非荷電のリン含有サブユニッ
ト間連結を含み、８〜４０ヌクレオチドを有する、あるクラスのモルホリノアン
チセンスオリゴヌクレオチドを有効な経口投与のための手段を提供する際に利点
を提供することが理解され得る。
ドンに及ぶ領域に相補的である標的塩基配列および非荷電のリン含有サブユニッ
ト間連結を含み、８〜４０ヌクレオチドを有する、あるクラスのモルホリノアン
チセンスオリゴヌクレオチドを有効な経口投与のための手段を提供する際に利点
を提供することが理解され得る。
【０１３４】 本明細書中に開示される経口投与方法はまた、適切な標的に特異的に結合し得
、そして体液（例えば、尿）中で容易に検出され得るオリゴマー：ＲＮＡヘテロ
二重鎖を形成する、アンチセンスオリゴマーの送達によって発現された標的ＲＮ
Ａの存在を決定する際に有用性を見出す。本明細書中に記載される方法が、被験
体の体液におけるＲＮＡの存在を決定することが所望される状況への広範な適用
性を有することもまた理解される。
、そして体液（例えば、尿）中で容易に検出され得るオリゴマー：ＲＮＡヘテロ
二重鎖を形成する、アンチセンスオリゴマーの送達によって発現された標的ＲＮ
Ａの存在を決定する際に有用性を見出す。本明細書中に記載される方法が、被験
体の体液におけるＲＮＡの存在を決定することが所望される状況への広範な適用
性を有することもまた理解される。
【０１３５】 本発明の方法は、状態がアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処置され得
る臨床状況における有用性を見出す。本明細書中に記載される非荷電のモルホリ
ノアンチセンスオリゴマーは、有効でかつ非毒性の用量が、少なくとも２００〜
４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血液濃度をもたらすのに有効な量
および様式において経口投与され得るという特定の利点を提供する。
る臨床状況における有用性を見出す。本明細書中に記載される非荷電のモルホリ
ノアンチセンスオリゴマーは、有効でかつ非毒性の用量が、少なくとも２００〜
４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーのピーク血液濃度をもたらすのに有効な量
および様式において経口投与され得るという特定の利点を提供する。
【０１３６】 本発明の方法は、多数の標的遺伝子のうちのいずれかの発現によって生成され
るｍＲＮＡの検出のために有用である。目的の標的は、上記に詳細に記載され、
そして選択的スプライシングされたｍＲＮＡおよび変異、挿入または検出を有す
る発現された遺伝子を含むがこれらに限定されない。
るｍＲＮＡの検出のために有用である。目的の標的は、上記に詳細に記載され、
そして選択的スプライシングされたｍＲＮＡおよび変異、挿入または検出を有す
る発現された遺伝子を含むがこれらに限定されない。
【０１３７】 本発明の方法をまた用いて、環境刺激に応答して起きる遺伝子発現を評価し得
る。例えば、メタロチオネイン遺伝子の発現は、関連した医学的関連について、
重金属への曝露に応答して増加することが示されている。
る。例えば、メタロチオネイン遺伝子の発現は、関連した医学的関連について、
重金属への曝露に応答して増加することが示されている。
【０１３８】 従って、本方法を用いて、例えば、潜在的な重金属曝露を有する環境の労働者
におけるメタロチオネイン発現の定期的評価によってこのような曝露を、この労
働者にメタロチオネインＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴマーを投与するこ
と、およびメタロチオネインＲＮＡおよび１以上のアンチセンスオリゴマーを含
むヘテロ二重鎖の、被験体の尿中への排出をモニタリングすることによって、モ
ニタリングまたは処置し得る。同様に、本発明の方法を用いて、特定の遺伝子の
発現の変化をもたらすことが公知である多数の環境刺激のいずれかへの曝露をモ
ニタリングまたは処置し得る。
におけるメタロチオネイン発現の定期的評価によってこのような曝露を、この労
働者にメタロチオネインＲＮＡに特異的なアンチセンスオリゴマーを投与するこ
と、およびメタロチオネインＲＮＡおよび１以上のアンチセンスオリゴマーを含
むヘテロ二重鎖の、被験体の尿中への排出をモニタリングすることによって、モ
ニタリングまたは処置し得る。同様に、本発明の方法を用いて、特定の遺伝子の
発現の変化をもたらすことが公知である多数の環境刺激のいずれかへの曝露をモ
ニタリングまたは処置し得る。
【０１３９】 本明細書中に記載の方法のいずれもが、所定の標的ＲＮＡの発現の慣用モニタ
リングに使用するためのキット形式に容易に適応可能であることが理解される。
リングに使用するためのキット形式に容易に適応可能であることが理解される。
【０１４０】 本明細書中に引用される全ての特許および文献の参考文献は、その全体が本明
細書中に参考として援用される。
細書中に参考として援用される。
【０１４１】 以下の実施例は、本発明を例示するが、本発明を限定することは全く意図しな
い。
い。
【０１４２】 （実施例１） （ヌクレアーゼ耐性アンチセンスオリゴ：ＲＮＡヘテロ二重鎖のインビトロお
よびインビボでの形成） （インビトロ研究） 二重鎖形成を、種々のｍＲＮＡをアンチセンスオリゴマーと混合し、それによ
ってこれらがハイブリダイズし、続いて二重鎖形成を３６Ｖにて４．７５時間泳
動しそして臭化エチジウムで染色した１２％非変性アクリルアミドゲルで可視化
して、二重鎖形成およびＲＮＡｓｅ耐性を検出することによって評価した。この
ゲルにおけるオリゴヌクレオチドの移動は、質量に対する電荷に基づき、そして
二重鎖の場合、この質量は、ＲＮＡ単独のほぼ二倍であるが、ＰＭＯは中性であ
るので電荷は添加されない。二重鎖の移動は、アクリルアミドゲル濃度に伴って
変化する。
よびインビボでの形成） （インビトロ研究） 二重鎖形成を、種々のｍＲＮＡをアンチセンスオリゴマーと混合し、それによ
ってこれらがハイブリダイズし、続いて二重鎖形成を３６Ｖにて４．７５時間泳
動しそして臭化エチジウムで染色した１２％非変性アクリルアミドゲルで可視化
して、二重鎖形成およびＲＮＡｓｅ耐性を検出することによって評価した。この
ゲルにおけるオリゴヌクレオチドの移動は、質量に対する電荷に基づき、そして
二重鎖の場合、この質量は、ＲＮＡ単独のほぼ二倍であるが、ＰＭＯは中性であ
るので電荷は添加されない。二重鎖の移動は、アクリルアミドゲル濃度に伴って
変化する。
【０１４３】 αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番号１）と、ｃ−ｍｙｃに対してアン
チセンスである非相補的ＰＭＯオリゴマー（配列番号２）または相補的なαグロ
ビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）とを、ＲＮＡｓｅの存在下また
は非存在下で混合した。
チセンスである非相補的ＰＭＯオリゴマー（配列番号２）または相補的なαグロ
ビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）とを、ＲＮＡｓｅの存在下また
は非存在下で混合した。
【０１４４】 αグロビン合成２５マーを、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンスである配列を有
する非相補的ＰＭＯ２５マー（ＰＭＯ １２２−１２６、配列番号２）と混合し
た場合、電気泳動後に１本のバンドのみが観察され、そしてこのバンドの分子量
は、合成ｍＲＮＡ２５マーの分子量と一致した。しかし、αグロビン合成２５マ
ーを相補的なαグロビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）と混合した
場合、ゲル電気泳動後に２本のバンド（ｍＲＮＡ２５マーについて予測された速
度で移動する、より低いバンド、および約２００塩基対のオリゴマーについて予
測される速度で移動する第２のバンド）が観察された。上のバンドは、ローディ
ング前のＲＮＡｓｅＢＭまたはＲＮＡｓｅＴ１での処置に耐性であったが、下の
バンドは耐性でなかった。
する非相補的ＰＭＯ２５マー（ＰＭＯ １２２−１２６、配列番号２）と混合し
た場合、電気泳動後に１本のバンドのみが観察され、そしてこのバンドの分子量
は、合成ｍＲＮＡ２５マーの分子量と一致した。しかし、αグロビン合成２５マ
ーを相補的なαグロビンアンチセンスＰＭＯ２５マー（配列番号３）と混合した
場合、ゲル電気泳動後に２本のバンド（ｍＲＮＡ２５マーについて予測された速
度で移動する、より低いバンド、および約２００塩基対のオリゴマーについて予
測される速度で移動する第２のバンド）が観察された。上のバンドは、ローディ
ング前のＲＮＡｓｅＢＭまたはＲＮＡｓｅＴ１での処置に耐性であったが、下の
バンドは耐性でなかった。
【０１４５】 この結果は、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖について予測されたゲル移動点における薄
いバンドによって、およびＲＮＡ単独についてのバンドが存在しないことによっ
て示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー
（配列番号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で、ＲＮＡｓ
ｅＢｍの存在下で形成されたことを示した。
いバンドによって、およびＲＮＡ単独についてのバンドが存在しないことによっ
て示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー
（配列番号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で、ＲＮＡｓ
ｅＢｍの存在下で形成されたことを示した。
【０１４６】 この結果はさらに、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖についての予測されたゲル移動点に
おけるバンドによって、およびＲＮＡ単独についてのバンドが存在しないことに
よって示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５
マー（配列番号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間でＲＮＡ
ｓｅＴ１の存在下で形成されたことを示した。このことは、二重鎖の一部でない
場合、ＲＮＡが分解し得ることを示す。
おけるバンドによって、およびＲＮＡ単独についてのバンドが存在しないことに
よって示されるように、ＲＮＡｓｅ耐性二重鎖が、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５
マー（配列番号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間でＲＮＡ
ｓｅＴ１の存在下で形成されたことを示した。このことは、二重鎖の一部でない
場合、ＲＮＡが分解し得ることを示す。
【０１４７】 非相補的ｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対混合物に対する、相補的ｍＲＮ
Ａ：アンチセンスオリゴマー対の混合物の電気泳動の結果の比較は、ｍＲＮＡと
その相補的アンチセンスＰＭＯオリゴマーとの間で二重鎖が形成されること、こ
の二重鎖は、ＲＮＡｓｅによる分解に耐性であることを確認した。ＲＮＡｓｅの
存在下および非存在下における相補的ｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対の混
合物の相対ゲル電気泳動移動速度は、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番
号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で二重鎖が形成される
ことおよび過剰なαグロビン合成ｍＲＮＡがＲＮＡｓｅの非存在下で存在するこ
とを示す。
Ａ：アンチセンスオリゴマー対の混合物の電気泳動の結果の比較は、ｍＲＮＡと
その相補的アンチセンスＰＭＯオリゴマーとの間で二重鎖が形成されること、こ
の二重鎖は、ＲＮＡｓｅによる分解に耐性であることを確認した。ＲＮＡｓｅの
存在下および非存在下における相補的ｍＲＮＡ：アンチセンスオリゴマー対の混
合物の相対ゲル電気泳動移動速度は、αグロビン合成ｍＲＮＡ２５マー（配列番
号１）と相補的アンチセンスＰＭＯ（配列番号３）との間で二重鎖が形成される
ことおよび過剰なαグロビン合成ｍＲＮＡがＲＮＡｓｅの非存在下で存在するこ
とを示す。
【０１４８】 （インビボ研究） アンチセンスオリゴマーを、ラットに腹腔内注射し、続いて安定なオリゴマー
：ＲＮＡヘテロ二重鎖をインビボで形成させ、これは続いて、ラット尿中で検出
可能であった。
：ＲＮＡヘテロ二重鎖をインビボで形成させ、これは続いて、ラット尿中で検出
可能であった。
【０１４９】 各試験動物について、投与後２４時間で収集した１ｍｌの尿を、６０００ｍｗ
〜８０００ｍｗのカットオフの透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）中
で標準的アッセイ緩衝液に対して透析して塩を除去した。透析したサンプルを、
ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅＨとともに１０分間インキュベートし、そしてＳａ
ｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で乾燥させた。乾燥したサンプルを５０μｌの
水に溶解し、そして１レーンあたり２５μｌを１２％非変性アクリルアミドゲル
にロードした。
〜８０００ｍｗのカットオフの透析チュービング（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）中
で標準的アッセイ緩衝液に対して透析して塩を除去した。透析したサンプルを、
ＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅＨとともに１０分間インキュベートし、そしてＳａ
ｖａｎｔ Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で乾燥させた。乾燥したサンプルを５０μｌの
水に溶解し、そして１レーンあたり２５μｌを１２％非変性アクリルアミドゲル
にロードした。
【０１５０】 ラットに生理食塩水、または３ｎｍｏｌｅ、７５ｎｍｏｌｅもしくは３７５ｎ
ｍｏｌｅの、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンスであるＰＭＯ １２２−１２６
２５マー（配列番号２）を、部分的肝切除時に投与した。ゲル電気泳動の結果は
、２００ｂｐのＤＮＡラダーバンド付近に移動するＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅ
耐性バンドの存在が、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在と一致することを示す
。このバンドの出現は、投与されるＰＭＯの量に依存し、そしてラットに生理食
塩水を注射した場合には存在しない。３７５ｎｍｏｌｅの、ｃ−ｍｙｃに対して
アンチセンスなＰＭＯ １２２−１２６ ２５マー（配列番号２）を部分的肝切
除時に与えたラットでは、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の移動パターンと一致するバン
ドが観察され、このことは、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出、続いてインビボでの
ＰＭＯに対する曝露を支持する。
ｍｏｌｅの、ｃ−ｍｙｃに対してアンチセンスであるＰＭＯ １２２−１２６
２５マー（配列番号２）を、部分的肝切除時に投与した。ゲル電気泳動の結果は
、２００ｂｐのＤＮＡラダーバンド付近に移動するＤＮＡｓｅおよびＲＮＡｓｅ
耐性バンドの存在が、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在と一致することを示す
。このバンドの出現は、投与されるＰＭＯの量に依存し、そしてラットに生理食
塩水を注射した場合には存在しない。３７５ｎｍｏｌｅの、ｃ−ｍｙｃに対して
アンチセンスなＰＭＯ １２２−１２６ ２５マー（配列番号２）を部分的肝切
除時に与えたラットでは、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の移動パターンと一致するバン
ドが観察され、このことは、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出、続いてインビボでの
ＰＭＯに対する曝露を支持する。
【０１５１】 これらの観察は、動物へのＰＭＯの投与の際の特異的な検出可能なアンチセン
スオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖のインビボでの形成を支持する。このヘテロ
二重鎖は細胞内で形成し、そして細胞膜を通って腎臓血液供給へのその移行、腎
臓を通しての尿へのそのクリアランスを通して、ヌクレアーゼに対して耐性でか
つ重量オスモル濃度の変化に安定なままである。
スオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖のインビボでの形成を支持する。このヘテロ
二重鎖は細胞内で形成し、そして細胞膜を通って腎臓血液供給へのその移行、腎
臓を通しての尿へのそのクリアランスを通して、ヌクレアーゼに対して耐性でか
つ重量オスモル濃度の変化に安定なままである。
【０１５２】 （実施例２） （アンチセンスオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖を用いるインビボ研究） フルオレセイン結合体化オリゴマーを検出し得る装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ６７２ Ｇｅｎｅｓｃａｎｎｅｒ）を用いて行
った較正研究を用いて、種々の長さ（１５マー、２０マー、２４マーおよび３８
マーのリボザイム）のフルオレセイン結合体化オリゴマーの移動速度を決定した
。移動速度を、ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒゲルで評価し、そして較正研究により、
ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒアプローチの、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出の妥当性が
確認された。較正研究は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ
６７２ ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒが、フルオレセイン結合体化オリゴマーを長さ
および濃度の両方に基づいて区別し得ることを示す。
ｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ６７２ Ｇｅｎｅｓｃａｎｎｅｒ）を用いて行
った較正研究を用いて、種々の長さ（１５マー、２０マー、２４マーおよび３８
マーのリボザイム）のフルオレセイン結合体化オリゴマーの移動速度を決定した
。移動速度を、ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒゲルで評価し、そして較正研究により、
ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒアプローチの、ＰＭＯ：ＲＮＡ二重鎖の検出の妥当性が
確認された。較正研究は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ
６７２ ＧｅｎｅＳｃａｎｎｅｒが、フルオレセイン結合体化オリゴマーを長さ
および濃度の両方に基づいて区別し得ることを示す。
【０１５３】 （インビボ研究） ラットに、ラットシトクロムＰ−４５０３Ａ２（配列番号６）に対してアンチ
センスである、カルボキシフルオレセイン結合体化ＰＭＯ（配列番号５）を注射
した。
センスである、カルボキシフルオレセイン結合体化ＰＭＯ（配列番号５）を注射
した。
【０１５４】 注射後１時間にラットから採血した血液から調製した血漿サンプルのＧｅｎｅ
Ｓｃａｎｎｅｒクロマトグラムは、２７０分および３４０分に移動した蛍光成分
（示差的に移動する２つの可能なカルボキシフルオレセイン結合に起因する２つ
のピーク）を含んでいた。注射後２４時間にラットから調製した血漿サンプルは
、約７５分および８０分に移動した蛍光成分を含んでいた。質量分析データ（示
さず）は、より短い移動時間が、ＰＭＯの分解に起因しないことを確認し、そし
てＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖がその時間をかけて形成されたことを示す。
Ｓｃａｎｎｅｒクロマトグラムは、２７０分および３４０分に移動した蛍光成分
（示差的に移動する２つの可能なカルボキシフルオレセイン結合に起因する２つ
のピーク）を含んでいた。注射後２４時間にラットから調製した血漿サンプルは
、約７５分および８０分に移動した蛍光成分を含んでいた。質量分析データ（示
さず）は、より短い移動時間が、ＰＭＯの分解に起因しないことを確認し、そし
てＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖がその時間をかけて形成されたことを示す。
【０１５５】 図３は、Ｐ４５０アンチセンスＰＭＯの投与後の種々の時点で採取したサンプ
ルの分析の結果を表し、そしてこのような投与後のラットの血漿におけるＰＭＯ
モノマーの消失およびＲＮＡ：ＰＭＯヘテロダイマーのそれに対応する出現を示
す。血漿における有意な量の二重鎖の出現は、二重鎖を形成していない大部分の
ＰＭＯが血漿を離れるまで（一般に「分布相」と呼ばれる）生じない。ＰＭＯヘ
テロ二重鎖は、ＰＭＯモノマーが被験体の組織（ここで、相補的ｍＲＮＡ転写物
が局在する）中に分布した後までは血漿中に蓄積しない。荷電したＲＮＡ：ＰＭ
Ｏ二重鎖はおそらく、これらの組織において形成し、そして細胞から放出されて
血漿へと戻る。この全体的なプロセスは、数時間を必要とする。
ルの分析の結果を表し、そしてこのような投与後のラットの血漿におけるＰＭＯ
モノマーの消失およびＲＮＡ：ＰＭＯヘテロダイマーのそれに対応する出現を示
す。血漿における有意な量の二重鎖の出現は、二重鎖を形成していない大部分の
ＰＭＯが血漿を離れるまで（一般に「分布相」と呼ばれる）生じない。ＰＭＯヘ
テロ二重鎖は、ＰＭＯモノマーが被験体の組織（ここで、相補的ｍＲＮＡ転写物
が局在する）中に分布した後までは血漿中に蓄積しない。荷電したＲＮＡ：ＰＭ
Ｏ二重鎖はおそらく、これらの組織において形成し、そして細胞から放出されて
血漿へと戻る。この全体的なプロセスは、数時間を必要とする。
【０１５６】 ｐ４５０アンチセンスＰＭＯ（配列番号５）の投与後、フルオレセインは、腎
臓および肝臓の両方において検出された。
臓および肝臓の両方において検出された。
【０１５７】 腎臓組織サンプルのクロマトグラムは、二重鎖を形成していないＰＭＯと一致
した３５０分でのバンドおよびＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖と一致した８０分で
のバンドを示した。これらは、間質空間または腎臓の細胞内に存在し得る二重鎖
および親のＰＭＯの両方を示す。肝臓組織サンプルは、二重鎖を形成していない
ＰＭＯが本質的に存在しないことおよびＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖が有意に多
いことを示した。これらの結果は、Ｐ４５０ ｍＲＮＡ転写物のレベルが肝臓よ
りも腎臓においてずっと低いという観察と一致する。
した３５０分でのバンドおよびＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖と一致した８０分で
のバンドを示した。これらは、間質空間または腎臓の細胞内に存在し得る二重鎖
および親のＰＭＯの両方を示す。肝臓組織サンプルは、二重鎖を形成していない
ＰＭＯが本質的に存在しないことおよびＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖が有意に多
いことを示した。これらの結果は、Ｐ４５０ ｍＲＮＡ転写物のレベルが肝臓よ
りも腎臓においてずっと低いという観察と一致する。
【０１５８】 二重鎖を形成していないアンチセンスＰＭＯオリゴマーおよびアンチセンスＰ
ＭＯオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の尿クリアランスの時間経過を反映する研
究は、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成および組織から血漿中へのその排出、
続いて尿中でのそれらの最終的な出現に数時間が必要とされることを示す。
ＭＯオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の尿クリアランスの時間経過を反映する研
究は、ＰＭＯ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の形成および組織から血漿中へのその排出、
続いて尿中でのそれらの最終的な出現に数時間が必要とされることを示す。
【０１５９】 本発明を特定の方法および実施形態を参考にして記載してきたが、種々の改変
および変更が、本発明を逸脱することなく行われ得ることが認識される。
および変更が、本発明を逸脱することなく行われ得ることが認識される。
【０１６０】
【表１】
【図１】 図１は、ポリマーを形成するために好ましい、５原子（Ａ）、６原子（Ｂ）、
および７原子（Ｃ−Ｅ）結合基を有するいくつかの好ましいサブユニットを示す
。
および７原子（Ｃ−Ｅ）結合基を有するいくつかの好ましいサブユニットを示す
。
【図２】 図２ＡＡ〜ＥＥは、ＡＡ〜ＥＥと名付けられ、それぞれ図１のサブユニットＡ
〜Ｅを使用して構築された、代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰返しサ
ブユニットセグメントを示す。
〜Ｅを使用して構築された、代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの繰返しサ
ブユニットセグメントを示す。
【図３】 図３は、Ｐ４５０アンチセンスホスホロジチオエートモルホリノオリゴマーを
投与したラットの血漿中の、ＰＭＯモノマーの消失およびＲＮＡ：ＰＭＯヘテロ
ダイマーの出現の、経時的な（分）反応速度論的表現である。白四角は、ホスホ
ロジチオエートモルホリノオリゴマーモノマーに対応し、そして黒丸は、ＲＮＡ
：ホスホロジチオエートモルホリノオリゴマーダイマーに対応する。
投与したラットの血漿中の、ＰＭＯモノマーの消失およびＲＮＡ：ＰＭＯヘテロ
ダイマーの出現の、経時的な（分）反応速度論的表現である。白四角は、ホスホ
ロジチオエートモルホリノオリゴマーモノマーに対応し、そして黒丸は、ＲＮＡ
：ホスホロジチオエートモルホリノオリゴマーダイマーに対応する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/70 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/70 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 AA14 CA09 CA11 CA12 CA20 DA03 GA11 HA11 HA17 HA20 4B063 QA01 QA05 QA13 QA17 QA18 QA19 QQ03 QQ21 QQ52 QQ53 QQ61 QQ89 QR35 QR39 QR40 QR56 QS34 QX02 4C085 HH17 KA01 KA09 LL18
Claims (19)
- 【請求項１】 被験体中のｍＲＮＡ配列をインビボで標的化する方法であっ
て、以下の工程： （ａ）該被験体に、非荷電のリン含有骨格結合を有するヌクレアーゼ耐性モル
ホリノアンチセンス化合物を経口投与する工程；および （ｂ）オリゴマーを、３７℃よりも実質的に高いＴｍで、標的によってコード
される遺伝子産物の改変された発現をもたらすに有効な様式でワトソン−クリッ
ク塩基対合によって該標的ｍＲＮＡ中の領域にハイブリダイズさせる工程、 を包含する、方法。 - 【請求項２】 前記モルホリノアンチセンス化合物が約８〜４０塩基の長さ
を有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記モルホリノアンチセンス化合物が、選択された標的遺伝
子の翻訳開始コドンに及ぶ領域に相補的である標的化塩基配列を含む、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項４】 前記アンチセンスオリゴマー骨格が、図２Ａ−Ａ〜２Ｅ−Ｅ
に示される構造からなる群より選択される構造を有する、請求項１に記載の方法
。 - 【請求項５】 前記標的遺伝子が、増殖性障害に関連した遺伝子である、請
求項３に記載の方法。 - 【請求項６】 前記増殖性障害が癌である、請求項４に記載の方法。
- 【請求項７】 前記モルホリノアンチセンス化合物が、配列番号２として同
定される配列を含む、請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 被験体において、標的ＲＮＡを含む塩基特異的な細胞内結合
事象の出現を検出する方法であって、以下の工程： （ａ）（ｉ）ヒトｃ-ｍｙｃ ｍＲＮＡ遺伝子の開始コドンに及ぶ領域に相補
的である標的化塩基配列を含む８〜４０ヌクレオチド、および（ｉｉ）非荷電の
リン含有サブユニット間結合を有する、モルホリノアンチセンス化合物を、３７
℃よりも実質的に高いＴｍでのワトソン−クリック塩基対合による該標的ＲＮＡ
の領域へのハイブリダイゼーションを減少させるのに有効な量で該被験体に投与
する工程、 （ｂ）該投与後の選択された時間にて、該被験体から体液のサンプルを採取す
る工程、ならびに （ｃ）該サンプル中で、アンチセンスオリゴマーおよび該標的ＲＮＡ領域から
構成されるヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖の存在を検出する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項９】 前記アンチセンスオリゴマーが、約８〜４０塩基の長さを有
する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記投与が、経口投与による、請求項８に記載の方法。
- 【請求項１１】 前記体液が尿である、請求項８に記載の方法。
- 【請求項１２】 前記検出する工程が、前記サンプルを、前記ヘテロ二重鎖
に対して特異的な抗体を用いて反応させ、そして該抗体−ヘテロ二重鎖結合体の
存在を検出することにより達成される、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記アンチセンスオリゴマーが、レポーター部分を含み、
そして前記検出する工程が、前記ヘテロ二重鎖に結合した該レポーター部分の存
在を検出することにより達成される、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記被験体における治療遺伝子に応答した標的遺伝子の発
現における変化を検出する際に使用するための、請求項８に記載の方法であって
、前記標的ＲＮＡが、選択された遺伝子の発現によって生成されるｍＲＮＡであ
る、方法。 - 【請求項１５】 前記選択された遺伝子が、公知の疾患状態に関連した遺伝
子である、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１６】 公知の疾患状態に関連した複数の遺伝子変異のうちの１つ
を検出する際に使用するための、請求項８に記載の方法であって、前記投与する
工程が、複数のアンチセンスオリゴマーを投与することを包含し、そして前記検
出する工程が、前記ヘテロ二重鎖のヌクレオチド配列を決定することをさらに包
含する、方法。 - 【請求項１７】 疑われるウイルスによる前記被験体の感染を検出する際に
使用するための、請求項８に記載の方法であって、前記標的ＲＮＡが、該ウイル
スによる感染に特異的なＲＮＡである、方法。 - 【請求項１８】 標的遺伝子の発現を調節する治療薬剤の有効性をモニタリ
ングする際に使用するための、請求項８に記載の方法であって、該方法は、以下
の工程： （ｉ）工程（ａ）〜（ｃ）に続いて、該治療薬剤を前記被験体に投与する工程
および該治療薬剤を投与した後の選択された時点で工程（ａ）〜（ｃ）を繰り返
す工程；ならびに （ｉｉ）該治療薬剤を投与する前に採取した体液サンプル中で検出されたヘテ
ロ二重鎖の量を、該治療薬剤を投与した後に採取したサンプル中で検出されたヘ
テロ二重鎖の量に対して比較する工程、 をさらに包含する、方法。 - 【請求項１９】 被験体における標的ＲＮＡを含む塩基特異的細胞内結合事
象の存在を検出するためのキットであって、以下： （ａ）３７℃よりも実質的に高いＴｍでの、標的ＲＮＡの領域へのワトソン−
クリック塩基対合によるハイブリダイズを減少させるために有効な量の、（ｉ）
ヒトｃ-ｍｙｃ ｍＲＮＡ遺伝子の開始コドンに及ぶ領域に相補的である標的塩
基配列を含む８〜４０ヌクレオチド、および（ｉｉ）非荷電のリン含有サブユニ
ット間結合を有する、モルホリノアンチセンス化合物；および （ｂ）アンチセンスオリゴマーと該標的ＲＮＡとの間で形成されたヘテロ二重
鎖を検出するための手段 を備える、キット。
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