CN114144524A - 癌症特异性分子及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于鉴定可以用于治疗剂开发的候选靶标的系统和方法。该系统和方法可以包括接收和分析生物学相关数据以鉴定信息或事件，诸如对某些疾病、病症或状况可以是统计显著的或特有的剪接事件。还提供了使用组合物或分子(包括小分子化合物、寡核苷酸、蛋白或细胞)来调节统计显著的事件的系统和方法。
Description
交叉引用
本申请要求2019年4月9日提交的美国临时专利申请第62/831,604号、2019年8月20日提交的美国临时专利申请第62/889,217号、2019年12月6日提交的美国临时专利申请第62/944,913号和2020年2月24日提交的美国临时专利申请第62/980,900号的权益，这些申请的每一个在此以其全部内容通过引用并入。
背景
癌症和遗传病在美国影响数百万人。剪接去调控(deregulation)可能是癌症和遗传病的主要标志，影响进展、转移和治疗耐药性。RNA剪接是内含子(DNA的非蛋白编码区)借以从新生的前体信使RNA(前体mRNA)中去除并且外显子(DNA的蛋白编码区)借以连接在一起形成成熟的信使RNA(mRNA)的过程。RNA剪接错误可能造成剪接的RNA无法产生功能蛋白，从而导致包括许多类型的癌症在内的遗传病。
概述
RNA剪接是RNA加工的一种形式，其中新制造的前体信使RNA(前体mRNA)转录本被转化为成熟的信使RNA(mRNA)。剪接期间，内含子(基因内的非编码区)被去除且外显子(编码区)被连接在一起。RNA剪接不仅提供功能性mRNA，还可能负责生成额外的多样性(即可变剪接、可变RNA剪接或差异剪接)。可变剪接可能造成从同一基因产生不同的mRNA。代表产生于单一基因的异形体(isoform)的mRNA可因使用可变的外显子或保留中断两个外显子的内显子而不同。这一过程通常会导致不同的可能具有相关的或大幅不同的、甚至是对立的细胞功能的蛋白产物。可变剪接可以包括外显子跳读或盒式外显子、互斥外显子、可变供体位点、可变受体位点、内含子保留以及其任意组合或变体中的一个或更多个。
多项研究已经显示了人类和动物模型中特定的剪接事件和剪接因子(诸如SRSF1、SRSF2、ESRP1和RBFOX1)的致癌活性。因此，癌症相关的剪接去调控可以是临床可应用的生物标志物和治疗靶标的新来源。
本文提供了用于在各种疾病或病症诸如癌症中鉴定治疗靶标(例如，疾病特异性剪接事件)的系统和方法。癌症的非限制性实例可以包括前列腺癌、屏障组织癌(即结直肠癌、肺癌)和其他富含TGFb的部位(如卵巢)中的癌、AML/血液病(hematologicaldisorders)、呼吸系统癌、可以包括富含TGFb的环境和长期的潜在饮食诱导的炎症两者的肝细胞癌(肝癌)、胸部癌症(thoracic cancer)、胃癌、肾癌、胰腺癌、皮肤癌或其组合。一些其他疾病的实例可以包括但不限于自闭症(即ST7(ENV19))，淋巴疾病诸如综合征性淋巴水肿-遗传性疾病和米洛病(milory disease)，眼退行性疾病，脑疾病-周围神经病变、神经代谢疾病、罕见遗传性神经性疾病-遗传性运动神经元疾病、精神疾病(psychiatricdisorder)，慢性炎症/自身免疫性疾病，包括IBD、克罗恩病(crohn’s disease)和类似的胃肠道功能紊乱、致病性肥胖症中的炎症，包括遗传性、儿童期、瘦素和非瘦素依赖性疾病、高血压和/或与西方饮食相关的其他共病(comorbidities)。
本公开内容的方法还可以包括检测一种或更多种生物标志物，例如，检测特定的DNA序列、mRNA和/或蛋白异形体的存在或不存在。一种或更多种生物标志物的存在或不存在可用于诊断疾病和/或跟踪疾病进展。
本文还提供了使用各种类型的模态(modalities)诸如寡核苷酸、小分子、抗体或其任意组合来调节治疗靶标(例如疾病特异性剪接事件)的方法。在一些实例中，模态可以将致病性RNA异形体转换为非致病性RNA异形体。在一些实例中，模态是可敲低特定异形体的寡核苷酸，包括剪接转换寡核苷酸(SSO)、反义寡核苷酸(ASO)、小干扰核糖核酸(siRNA)、缀合寡核苷酸或其组合。在一些其他实例中，模态是可以特异性识别可变剪接的RNA的蛋白异形体的抗体或基于细胞的(例如，CAR-T)，和/或特异性靶向异形体以获得治疗益处的治疗化合物(包括ASO、小分子或生物制品)。
在本公开内容中进一步提供了用于治疗疾病或病症(诸如癌症)的方法和系统。系统和方法可以包括向具有疾病或病症的受试者施用有效量的模态。模态可以是被设计成实现疾病特异性靶向的寡核苷酸、小分子、抗体或其任意组合。例如，一些已经被鉴定的疾病特异性剪接事件可以为小分子结合打开沟。在那样的情况下，小分子可被设计成靶向由于剪接变化而产生的区域。在另一个实例中，膜结合蛋白的剪接变化可展示可用抗体特异性靶向的改变的表面表位。
本公开内容的一个方面提供了一种调节生物样品中前体mRNA中的剪接的方法，包括：将生物样品与反义化合物接触，所述反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％的序列同一性的一种或更多种寡核苷酸。
在一些实施方案中，生物样品包括细胞、组织或血液样品。在一些实施方案中，生物样品是体外的。在一些实施方案中，生物样品是细胞。在一些实施方案中，该方法还包括测量细胞的活力。在一些实施方案中，测量在预定时间段内进行。在一些实施方案中，方法还包括在预定时间段内监测细胞的活力。在一些实施方案中，该方法还包括基于细胞的活力降低或增加反义化合物的浓度。在一些实施方案中，方法还包括当细胞的活力低于截止值时降低或增加反义化合物的浓度。在一些实施方案中，截止值为约80％。在一些实施方案中，截止值为约90％。在一些实施方案中，反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。在一些实施方案中，RNA包括小干扰核糖核酸(siRNA)。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。在一些实施方案中，生物样品来自具有或疑似具有疾病或状况的受试者。在一些实施方案中，疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。在一个实施方案中，乳腺癌为三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。在一些实施方案中，至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。在一些实施方案中，一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2'-取代的糖部分。在一些实施方案中，2'-取代的糖部分包括选自2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸的修饰。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子跳读。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子包含。在一些实施方案中，调节包括促进剪接转换。在一些实施方案中，调节包括剪接的下调或上调。在一些实施方案中，反义化合物特异性结合到由包括以下的基因编码的前体mRNA的区段：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。
本公开内容的另一方面提供了一种药物组合物，其包含(i)反义化合物，所述反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％序列同一性的一种或更多种寡核苷酸，以及(ii)药学上可接受的稀释剂或载体。
在一些实施方案中，反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。在一些实施方案中，RNA包括小干扰核糖核酸(siRNA)。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗或缓解疾病或状况。在一些实施方案中，疾病包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，疾病或状况是癌症。在一些实施方案中，癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。在一个实施方案中，乳腺癌为三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包含修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。在一些实施方案中，至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。在一些实施方案中，一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2'-取代的糖部分。在一些实施方案中，2'-取代的糖部分包含选自由2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸组成的组的修饰。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，修饰的核苷各自包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。在一些实施方案中，药物组合物用于调节由包括以下的基因编码的前体mRNA的剪接：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子跳读。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子包含。在一些实施方案中，调节包括促进剪接转换。在一些实施方案中，调节包括剪接的下调或上调。
本公开内容的另一方面提供了用于制备用于治疗疾病或状况的药物的反义化合物，该反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％序列同一性的一种或更多种寡核苷酸。
在一些实施方案中，反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的一种或更多种寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。在一些实施方案中，RNA包括小干扰核糖核酸(siRNA)。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。在一些实施方案中，疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。在一个实施方案中，乳腺癌为三阴性乳腺癌。在一些实施方案中，一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。在一些实施方案中，一种或更多种寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。在一些实施方案中，至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。在一些实施方案中，一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，修饰的糖部分是2'部-取代的糖部分。在一些实施方案中，2代-取代的糖部分包含选自2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸的修饰。在一些实施方案中，修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，修饰的核苷各自包含修饰的糖部分。在一些实施方案中，多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。在一些实施方案中，所述治疗包括调节由包括以下的基因编码的前体mRNA的剪接：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子跳读。在一些实施方案中，调节包括诱导或增强外显子包含。在一些实施方案中，调节包括促进剪接转换。在一些实施方案中，调节包括剪接的下调或上调。
本公开内容的另一个方面提供了一种调节生物样品中前体mRNA中的剪接的方法，包括：将生物样品与特异性结合到前体mRNA的区段的组合物接触，该前体mRNA由选自由以下组成的组的基因编码：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B和CA12。
在一些实施方案中，前体mRNA的区段长度为9-150个核苷酸。在一些实施方案中，组合物包括寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段充分互补。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸包含10-50个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包含15-30个核苷酸。在一些实施方案中，组合物包括小分子、核酸分子、工程细胞、蛋白或其组合或修饰。在一些实施方案中，组合物包括嵌合分子。在一些实施方案中，嵌合分子包含核酸分子和蛋白。在一些实施方案中，核酸分子包括DNA、RNA、PNA或其组合或杂合体(hybrid)。在一些实施方案中，组合物诱导或增强前体mRNA中的外显子跳读。在一些实施方案中，组合物诱导或增强前体mRNA中的外显子包含。在一些实施方案中，组合物促进前体mRNA中的剪接转换。在一些实施方案中，组合物下调或上调前体mRNA中的剪接。在一些实施方案中，该组合物防止前体mRNA中的剪接。
本公开内容的另一方面提供了一种用于在需要治疗疾病或状况的受试者中治疗疾病或状况方法，该方法包括：向受试者施用有效量的组合物，其中组合物特异性结合到选自由以下组成的组的基因编码的前体mRNA的区段：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B和CA12，从而调节前体mRNA中的剪接。
在一些实施方案中，前体mRNA的区段长度为9-150个核苷酸。在一些实施方案中，组合物包括寡核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段充分互补。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段具有至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸与前体mRNA的区段具有至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，寡核苷酸包括10-50个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸包括15-30个核苷酸。在一些实施方案中，组合物包括小分子、核酸分子、工程细胞、蛋白或其组合或修饰。在一些实施方案中，组合物包括嵌合分子。在一些实施方案中，嵌合分子包括核酸分子和蛋白。在一些实施方案中，核酸分子包括DNA、RNA、PNA或其组合或杂合体。在一些实施方案中，该组合物诱导或增强前体mRNA中的外显子跳读。在一些实施方案中，该组合物诱导或增强前体mRNA中的外显子包含。在一些实施方案中，该组合物促进前体mRNA中的剪接转换。在一些实施方案中，该组合物下调或上调前体mRNA中的剪接。在一些实施方案中，该组合物防止前体mRNA中的剪接。在一些实施方案中，有效量包括至少300nM的组合物。在一些实施方案中，有效量包括至多500nM的组合物。在一些实施方案中，疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，疾病或状况是癌症。在一些实施方案中，癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。在一个实施方案中，乳腺癌为三阴性乳腺癌。
本公开内容的另一方面提供了一种用于筛选、诊断或预测受试者中的疾病或状况的方法，该方法包括：(a)分析来自受试者的生物样品以检测蛋白异形体的表达水平，其中蛋白异形体由选自由以下组成的组的基因编码：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B和Ca12；以及(b)确定生物样品中蛋白异形体的表达水平相对于对照的生物样品中蛋白异形体的表达水平的差异，其中该差异是疾病或状况的指示或预测。
在一些实施方案中，生物样品是细胞、组织或血液样品。在一些实施方案中，(a)包括定量检测生物样品中蛋白异形体的量。在一些实施方案中，差异包括生物样品中蛋白异形体的表达水平相对于对照的生物样品中蛋白异形体的表达水平的增加或降低。在一些实施方案中，生物样品中蛋白异形体的表达水平相对于对照的生物样品中蛋白异形体的表达水平的增加指示或预测疾病或状况。在一些实施方案中，生物样品中蛋白异形体的表达水平相对于对照的生物样品中蛋白异形体的表达水平的降低指示或预测疾病或状况的。在一些实施方案中，蛋白异形体包括可变剪接的蛋白异形体。在一些实施方案中，可变剪接的蛋白异形体通过基因的可变剪接形成。在一些实施方案中，可变剪接包括外显子跳读、外显子包含、内含子保留、竞争5'剪接位点、竞争3'剪接位点、多个启动子位点、多个多(A)位点或其组合。在一些实施方案中，该方法还包括检测生物样品中基因的表达水平。在一些实施方案中，该方法还包括检测受试者生物样品中基因的表达水平相对于对照的生物样品中基因的表达水平的差异的存在或不存在。在一些实施方案中，基因的表达水平的差异的存在或不存在进一步指示或预测疾病或状况。在一些实施方案中，差异的存在包括受试者生物样品中基因的表达水平相对于对照中生物样品中基因的表达水平的增加或降低。在一些实施方案中，方法还包括监测受试者中疾病或状况的进展。在一些实施方案中，监测包括在预定时间段内重复(a)多次。在一些实施方案中，该方法还包括在受试者中诊断出疾病或状况后向受试者提供治疗。在一些实施方案中，治疗包括向受试者施用有效量的调节蛋白异形体表达水平的组合物。在一些实施方案中，治疗包括向受试者施用有效量的调节编码蛋白异形体的基因的剪接的组合物。在一些实施方案中，疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施方案中，疾病或状况是癌症。在一些实施方案中，癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌为三阴性乳腺癌。
根据以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入的相同程度。如果说通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包括的公开内容相矛盾，那么说明书旨在取代和/或优先于任何这样的矛盾的材料。
附图简述
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考以下详细描述和附图(本文中也称“图(Figure)在和“图(FIG.)e)将获得对本发明的特征和优点的更好的理解，详细描述阐述了利用本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：
本专利或申请文件包含至少一幅以彩色展示的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。
图1显示了针对三阴性乳腺癌(TNBC)患者样品中剪接相关的RNA结合蛋白重复出现的基因组畸变和转录变化的示例性oncoprint概要。
图2示意性地说明了管腔(luminal)对比TNBC RNA-seq的数据分析及靶标选择的实例。
图3显示了在癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)和细胞系中的剪接变化的示例图，显示出独立的和重叠的事件。
图4显示了示例性逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)图像，显示出管腔细胞系对比TNBC细胞系中选定的候选的差异剪接。
图5显示了示例性的来自管腔细胞系和基底细胞系的蛋白裂解物的蛋白印迹，显示出不同基因在蛋白水平的异形体表达。
图6显示了表达NEDD4L包含异形体对比跳读异形体的乳腺癌患者的生存分析，显示出有跳读异形体的患者的总生存较差。
图7显示了多个乳腺癌亚型之间剪接差异和总基因表达差异的比较。
图8说明了NEDD4L三外显子组(exon trios)附近的SpliceLearn评分和对应的eCLIP峰。评分可用于设计寡核苷酸序列并且下图显示了剪接转换实验结果，其中高评分的ASO(GTGGGTTTCAGGGATTCTGA、CCCTGATTCAGACAGCAGGG在MDA-MB-231细胞中显著转换为包含异形体。
图9显示了用400nM特异性寡核苷酸处理的MCF7和MDA-Mb-231细胞以及用Lipofectamine或PBS处理的对照中关闭NEDD4L的示例性实验验证和定量。放射性RT-PCR在上方显示且结果的定量在下方显示。
图10A显示了靶向NEDD4L的促进包含的SSO(GTGGGTTTCAGGGATTCTGA)的示例性剂量响应曲线。SSO治疗导致与MCF7细胞相比，MDA-Mb-231细胞中的剂量依赖性活力损失。最佳LC50值为约370nM。
图10B显示了靶向NEDD4L的促进包含的SSO(CCCTGATTCAGACAGCAGGG)的示例性剂量响应曲线。SSO治疗导致与MCF7细胞相比，MDA-Mb-231细胞中的剂量依赖性活力损失。最佳LC50值为约420nM。
图11显示了候选基因的示例性PCR验证。
图12显示了候选基因的示例性PCR验证。
图13显示了候选基因的示例性PCR验证。
图14显示了候选基因的示例性PCR验证。
图15显示了对表达候选基因的长异形体和短异形体的乳腺癌患者的示例性生存分析。
图16显示了对表达候选基因长异形体和短异形体的乳腺癌患者的示例性生存分析。
图17显示了示例的选择标准表。
图18显示了如何使用选择标准来鉴定比单独使用剪接更多的靶基因。
详细描述
尽管本文已经显示和描述了本发明的多种实施方案，但对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅通过示例的方式提供。在不偏离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明的实施方案的多种替代选择。
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”位于两个或更多数值系列中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于该数值系列中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。
每当术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”位于两个或更多数值系列中的第一个数值之前时，术语“不超过”、“小于”或“小于或等于”适用于该数值系列中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。
鉴定用于治疗剂开发的候选靶标
在本公开内容的一些方面中，提供了用于检测或鉴定候选药物靶标的方法和系统。候选药物靶标可以与特定的疾病、病症或状况相关。疾病、病症或状况可以包括癌症。疾病、病症或状况的非限制性实例可以包括但不限于乳腺导管组织中的导管癌、髓样癌、胶质癌、管状癌、乳腺癌或其亚型；卵巢癌，包括上皮性卵巢肿瘤诸如卵巢中的腺癌和已经从卵巢迁移到腹腔中的腺癌，子宫癌，宫颈癌诸如宫颈上皮中的腺癌(包括鳞状细胞癌和腺癌)；前列腺癌，诸如选自以下的前列腺癌：腺癌或已经迁移到骨的腺癌；胰腺癌，诸如胰管组织中的上皮样癌和胰管中的腺癌；膀胱癌，诸如膀胱中的移行细胞癌、尿路上皮癌(移行细胞癌)、作为膀胱衬里的上皮细胞中的肿瘤、鳞状细胞癌、腺癌和小细胞癌；白血病，诸如急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系白血病、毛细胞白血病、骨髓发育不良、骨髓增生性疾病(myeloproliferative disorders)、急性髓系白血病(AML)、慢性髓系白血病(CML)、肥大细胞增多症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)和骨髓增生异常综合征(MDS)；骨癌；肺癌，诸如非小细胞肺癌(NSCLC)(其分为鳞状细胞癌、腺癌和大细胞未分化癌)，以及小细胞肺癌；皮肤癌诸如基底细胞癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌和光化性角化病(其是一种有时会发展为鳞状细胞癌的皮肤状况)；眼视网膜母细胞瘤；皮肤或眼内(眼)黑色素瘤；原发性肝癌(始于肝脏中的癌症)；肾癌；甲状腺癌，诸如乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌和间变性癌；与艾滋病相关的淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、B细胞免疫母细胞淋巴瘤和小非裂解细胞淋巴瘤；卡波西肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)；病毒诱发的癌症，包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和肝细胞癌；人嗜淋巴病毒1型(HTLV-1)和成人T细胞白血病/淋巴瘤；以及人乳头瘤病毒(HPV)和宫颈癌；中枢神经系统癌症(CNS)，诸如原发性脑肿瘤，其包括胶质瘤(星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤)、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、脑膜瘤、淋巴瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)和髓母细胞瘤；周围神经系统(PNS)癌症，诸如听神经瘤和恶性周围神经鞘肿瘤(MPNST)，包括神经纤维瘤和神经鞘瘤、恶性纤维细胞瘤、恶性纤维组织细胞瘤、恶性脑膜瘤、恶性间皮瘤和恶性苗勒管混合瘤(mixed Mtillerian tumor)；口腔和口咽癌，诸如下咽癌、喉癌、鼻咽癌和口咽癌；胃癌，诸如淋巴瘤、胃间质瘤和类癌；睾丸癌，诸如生殖细胞肿瘤(GCT)，包括精原细胞瘤和非精原细胞瘤，以及性腺间质瘤，包括睾丸间质细胞瘤和睾丸支持细胞瘤；胸腺癌(thymus cancer)，诸如胸腺瘤、胸腺上皮癌(thymic carcinomas)、霍奇金病(Hodgkindisease)、非霍奇金淋巴瘤类癌或类癌肿瘤；直肠癌；和结肠癌。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗非癌性过度增生性疾病，诸如皮肤良性增生(例如银屑病)、再狭窄或前列腺良性增生(例如良性前列腺肥大(BPH)。
候选药物靶标可以包括一个或更多个差异表达的基因、差异剪接的外显子(例如双外显子组(exon duos)或三外显子组(exon trios))或其组合。该方法和系统可以以外显子为中心并且在检测低丰度的异常mRNA异形体时高度灵敏。
此外，人工智能(AI)可以被本文提供的方法和系统所利用。人工智能可以包括使用机器学习算法，其非限制性实例可以包括监督(或预测性)学习、半监督学习、主动学习、无监督机器学习或强化学习、支持向量机(SVM)、线性、逻辑、树、随机森林、xgboost、神经网络、深度神经网络、增强技术、自举(bootstrapping)技术、集成技术或其组合。
如本文所提供的，该系统或方法可以包括从数据库接收数据。数据库可以是公共数据库(例如，TCGA、GTEX、dbGAP)、私有数据库或其组合。数据库可以包括公共数据、专有数据或其组合。数据库可以包括临床或生物数据。数据库可以包括RNA-seq数据。数据库可以包括从各种样品获得的数据，例如大于或等于约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、15,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、125,000、150,000、175,000、200,000个样品或更多。样品的至少一个子集可以从具有相同或不同疾病、病症或状况的不同受试者获得。
数据库可以包括从来自某些疾病、病症或状况的细胞系和/或来自具有某些不同疾病、病症或状况的受试者的样品提取或得到的数据。在一些情况下，疾病、病症或状况包括乳腺癌或其亚型，例如，管腔A型、管腔B型、Her2+型、TNBC型。细胞系的非限制性实例可以包括BT483、CAMA1、EFM19、HCC1428、HCC712、IBEP2、KPL1、LY2、MCF7、MDAMB134、MDAMB134VI、MDAMB157、MDAMB175、MDAMB175VII、MDAMB231、MDAMB330、MDAMB361、MDAMB415、MDAMB435、MDAMB436、MDAMB453、MDAMB468、T47D、ZR751、ZR75B、BSMZ、BT474、EFM192A、IBEP1、IBEP3、UACC812、ZR7527、ZR7530、21MT1、21MT2、21NT、21PT、AU565、HCC1008、HCC1569、HCC1954、HCC202、HCC2218、HH315、HH375、KPL-4、OCUB-F、SKBR3、SKBR5、SUM190PT、SUM225CWN、UACC893、BT20、CAL148、DU4475、EMG3、HCC38、HCC1143、HCC1187、HCC1395、HCC1599、HCC1739、HCC1806、HCC1937、HCC2157、HCC3153、HCC70、HMT3522、KPL-3C、MA11、MFM223、SUM185PE、SUM229PE、BT549、CAL120、CAL851、HDQ-P1、Hs578T、SKBR7、SUM102PT、SUM1315M02、SUM149PT、SUM159PT或其任意组合。
数据可以经过一个或更多个分析或处理步骤。数据可以被分析和/或量化以鉴定信息或事件，诸如剪接事件。所鉴定的信息或事件对于一种或更多种疾病、病症或状况可以是统计显著的或者特有的。数据分析或处理可以包括将数据映射到基因组、转录组或其组合。数据可以被处理以去除可能与基因组、转录组或其组合无关的任何信息。数据可以基于一个或更多个预定参数或标准(包括诸如疾病、病症或状况的类型或亚型)处理或分析。
在数据库包括与疾病、病症或状况的不同类型或亚型相关的数据的情况下，与每种类型或亚型相关的数据可以被单独地分析或处理以鉴定对于每种类型或亚型可以是统计显著的或特有的信息或事件。所鉴定的信息或事件可以被分组在一起并与一个或更多个对照比较以确定一个或更多个候选靶标。可选地，对每个亚型或类型所鉴定的信息或事件可以彼此进行比较以生成候选靶标的列表。在一些情况下，候选靶标包括由至少两种不同类型或亚型鉴定或共享的信息或事件。
候选靶标列表可以包括任意数量的候选靶标，例如，大于或等于约5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500或更多。在一些情况下，该列表可以包括落在上述任何两个值之间的数值例如，约275个候选靶标。
生成的候选靶标的至少一部分(例如，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)可以经过进一步的数据分析或处理。候选靶标可以基于一个或更多个参数或标准以一定的顺序排列。候选靶标可以基于一个或更多个参数或标准选择，从而生成候选靶标的细化列表。可用于排列候选靶标的参数的非限制性实例包括剪接指数、疾病指数、剪接转换寡核苷酸(SSO)成药性(druggability)指数或其任意组合。
剪接指数可以至少部分地基于以下因素来确定，包括例如与对照相比所分析的样品(或数据)中的剪接变化，给定信息或事件(例如，在患者数据集中)的一致性和/或再现性，多个疾病数据集中给定信息或事件的重复发生，正常或对照数据集中给定信息或事件的不存在。在确定中每个因素可以被赋予相同或不同的权重并且基于该确定，可以生成评分。
疾病指数可以至少部分地基于以下因素确定：包括例如给定信息或事件(诸如剪接变化)对表达产物(诸如蛋白)功能的影响，与疾病、病症或状况的关联程度，途径分析(诸如在京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库中列出的途径)，文献证据或其任意组合。在确定中每个因素可以被赋予相同或不同的权重并且基于该确定，可以生成评分。
SSO成药性指数可以至少部分地基于以下因素来确定：包括例如使用AI(诸如机器学习算法)鉴定独特的和/或特定的剪接校正分子(例如寡核苷酸序列)的能力，映射到所鉴定的靶标(例如外显子)的强增强交联和免疫沉淀(eCLIP)峰的存在或不存在，与基因型-组织表达(GTEx)正常数据相比异形体的疾病特异性表达的存在或不存在，或其任意组合。在确定中每个因素可以被赋予相同或不同的权重并且评分可以基于该确定生成。
在生成候选靶标的细化列表的情况下，包括在列表中的候选靶标可以经历额外的分析或处理步骤。例如，与候选靶标的至少一个子集相关的剪接事件可以经历评估过程。评估过程可以评估例如在RNA水平、在蛋白水平或两者的不同水平的表达。评估过程可以确认来自不同疾病(或其亚型)、病症或状况的样品中的差异异形体表达。在确认后，候选靶标可以被选择并用于治疗剂的进一步开发。在一些情况下，选定的靶标包括一个或更多个基因。一个或更多个基因的非限制性实例可以包括NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、COL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28)或其任意组合。
使用各种模态调节靶标
在本公开内容的一些方面，提供了用于调节剪接靶标的方法和系统。调节可以包括调节与靶标(例如，基因)相关的剪接事件。调节可以包括促进或促使剪接转换。例如，调节可以包括将致病异形体转换为非致病异形体。
调节可以包括使用一个或更多个可以与靶标特异性相互作用(例如杂交)的组合物或分子，从而控制或改变靶标的剪接或在RNA水平、蛋白水平或两者调控靶标的表达。组合物或分子可以靶向调控剪接的任何元件或元件的组合(例如，靶标内的一个或更多个基因组区域)，包括诸如3'剪接位点、5'剪接位点、分支点、多嘧啶区(polypyrimidinetract)、外显子剪接增强子、外显子剪接沉默子、内含子剪接增强子、内含子剪接沉默子或其任意组合。
组合物或分子可以包括例如小分子、聚合物(天然的或合成的)、核苷酸序列(诸如寡核苷酸或RNA)、治疗剂、细胞(诸如CAR-T细胞)、蛋白(诸如抗体)或其任意组合。
组合物或分子可以与其他分子、分子结构或化合物的混合物(例如脂质体、受体靶向分子、口服制剂、直肠制剂、外用(topical)制剂或其他制剂)混合、包封、缀合或以其他方式缔合，用于帮助摄取、分布和/或吸收。
组合物或分子可以在体内或体外应用。为了实现靶标特异性或疾病特异性靶向，组合物或分子可以以一定浓度添加。例如，组合物或分子可以具有小于或等于约5微摩尔/升(μM)、4μM、3μM、2μM、1μM、900纳摩尔/升(nM)、800nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、50nM、10nM或更小的浓度。浓度可以大于或等于约1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM、700nM、800nM、900nM或更多。在一些情况下，浓度可以落在以上讨论的任意两个值之间，例如，约370nM或420nM。
在一些情况下，组合物或分子包括寡核苷酸。寡核苷酸可以包含任意数量的核苷酸或核苷酸残基，例如，大于或等于约5、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60个核苷酸或核苷酸残基，或更多。在一些情况下，寡核苷酸可包含小于或等于约50、45、40、35、30、29、27、25、24、23、22、21、19、18、17、16、13、10、8、6个核苷酸或核苷酸残基，或更少。在一些情况下，寡核苷酸中包含的核苷酸或核苷酸残基的数量可以落在以上描述的任意的值之间，例如，约16(16-mer)、17(17-mer)、18(18-mer)、19(19-mer)、20(20-mer)、21(16-mer)或22(22-mer)。在一些情况下，寡核苷酸包括DNA分子、RNA分子或其组合。
在一些情况下，寡核苷酸包括反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以是与给定序列互补的DNA和/或RNA寡核苷酸，该给定序列可以是靶基因内的区域。
寡核苷酸可以使用各种技术(诸如固相合成、硫代磷酸酯和/或烷基化衍生物)制备。寡核苷酸中包含的核苷酸或核苷酸残基可以包括天然的、未修饰的核苷酸(例如，胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、尿嘧啶或胸腺嘧啶)、修饰的核苷酸或其任意组合。在一些情况下，使用修饰的核苷酸或碱基。修饰可以被设计以增强结合亲和力。修饰可以包括化学修饰。修饰可以包括主链修饰、糖环修饰或其组合。糖环修饰可以包括2'-糖修饰。例如，本公开内容的寡核苷酸可以包含磷酸硫酯修饰的主链和/或修饰以在2'-位置含有甲氧基乙烷(2'MOE)的核糖。包含修饰的核苷酸或碱基的寡核苷酸可能不激活RNA酶H。在一些情况下，核苷酸间桥连的磷酸残基中的一个或更多个(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45个或更多)是修饰的磷酸酯，诸如甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯、吗啉基磷酸酯(phosphoromorpholidates)、哌嗪基磷酸酯(phosphoropiperazidates)、氨基磷酸酯(phosphoroamidates)或其任意组合。在一些情况下，核苷酸或碱基的一个或更多个(例如，至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45个或更多)包含2'-烃基部分(例如，C1-C4烃基、直链或支链、饱和或不饱和的，包括例如甲基、乙基、乙烯基、丙基、1-丙烯基、2-丙烯基、异丙基或其组合或衍生物)。
在一些情况下，组合物或分子包括小分子。小分子可以包括广泛范围的可在前体mRNA水平或蛋白水平转换以上提到的靶标的异形体的化合物。这些化合物可以通过使用化学文库的高通量筛选方法鉴定，其中化合物或化合物组合的添加可能在RNA或蛋白或两者的水平诱导异形体转换或调节(例如，抑制或增强)一个或若干基因(例如以上提到的或本文其他地方描述的基因)的特定的异形体的生物活性。
应用
本公开内容的系统和方法可用于确定或鉴定新的剪接事件或与该新的剪接事件相关的靶标(例如基因)。新的剪接事件对于一种或更多种给定的疾病、病症或状况的类型或亚型可以是统计显著的或者特有的。为了鉴定新的剪接事件，本公开内容的方法和系统可以从一个或更多个公共和/或私有的数据库接收数据，数据可以包括关于正在调查的疾病、病症或状况的类型或亚型的生物学相关数据。数据可以被分析、处理或注释。数据分析、处理和/或注释可以使用机器学习算法来进行。机器学习可以是监督学习、非监督学习或其组合。算法可以是经训练的算法。算法可以使用训练集来训练。训练集可以包括训练样品。训练样品可以是来自某些疾病、病症或状况的细胞系；从具有某些疾病、病症或状况的受试者获得的样品；对照，包括阳性和/或阴性对照；或其任意组合。
数据分析、处理和/或注释可以生成可以潜在地用于治疗剂开发的候选靶标列表。列表中包括的候选靶标可以经历进一步的筛选过程或分析。候选靶标的剪接可以被评估或验证。候选靶标的评估或验证可以产生靶标的细化列表，该细化列表可以经历进一步的治疗剂开发。
细化列表中包括的单独的靶标的剪接可以使用组合物或分子。剪接可以被调节以促进致病异形体向非致病异形体的转换。组合物或分子可以被设计以靶向靶标内的选定区域或选定区域的组合以实现疾病特异性靶向。在一些情况下，组合物或分子被设计以调节两个或更多个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个或更多)不同的靶标的剪接。靶向不同靶标的组合物或分子可以顺序使用或同时使用。
在本公开内容的一些方面，提供了用于向具有或怀疑具有疾病、病症或状况的受试者提供治疗的方法和系统。该方法和系统可以包括从具有或怀疑具有疾病、病症或状况的受试者获得样品。生物学相关数据(例如，DNA、RNA-seq数据)可以从样品中得到或提取。生物学相关数据可以被筛选或处理以去除与基因组或转录组无关的任何数据。经处理的数据可以经历一个或更多个数据分析、处理或注释过程，这些过程可以鉴定一个或更多个对于受试者具有或怀疑具有的疾病、病症或状况是统计显著的或特有的新的剪接事件。所鉴定的剪接事件可以使用一个或更多个参数或过滤标准进一步分析或过滤，这可以生成剪接事件和与之相关的用于治疗的靶标的最终列表。
在靶标鉴定后，该系统和方法还可以包括向具有或怀疑具有该疾病、病症或状况的受试者施用治疗有效量的组合物或分子。施用可以在给定的时间段内进行。受试者可以被监测，并且向受试者施用的组合物或分子的量可以根据监测结果调整。此外，监测可以包括在受试者接受治疗时从受试者获得一个或更多个样品。一个或更多个样品可以被分析或测试以确定治疗是否有效。如果治疗被确定为无效，可以停止治疗和/或可以提供不同的治疗(例如，施用不同类型的组合物或分子)。
实施例
实施例1–三阴性乳腺癌(TNBC)中可变剪接转录本的鉴定以及纠正剪接变化的治
疗剂
乳腺癌是最常被诊断的癌症，并且是女性中癌症死亡率的第二大导致原因，有近30％的初步疾病诊断以转移性乳腺癌为结果。乳腺癌治疗的挑战之一是克服其巨大的异质性和可能需要不同的治疗方法(包括化疗、激素治疗以及人类表皮生长因子受体2(Her2-)靶向治疗(取决于亚型))的独特的癌症亚型。然而，显著数量的患者可能对当前的标准护理疗法产生耐药性。这强调了对鉴定新靶标和开发用于完全疾病缓解的替代疗法的需要。
剪接错误可能是乳腺癌中编码变异的来源。由于乳腺癌中失调的剪接因子表达，可能发生若干基因的异常剪接而没有DNA突变或表观遗传改变。多项研究已经表明乳腺癌中核心剪接因子(诸如SRSF1、SRSF2、ESRP1、RBFOX1等)的致癌作用。例如，过度表达SRSF1可以促进非癌性乳腺上皮细胞的转化。此外，有人提出剪接体成分可能是TNBC亚型中特别重要的因子，并且TNBC肿瘤有时显示出对这些因子的依赖性。例如，图1显示了针对癌症基因组图谱(TCGA)乳腺癌TNBC亚型患者样品中剪接相关的RNA结合蛋白重复出现的基因组畸变和转录变化的oncoprint概要。
此外，已经报道在关键乳腺癌基因诸如ESR1(编码雌激素受体α并赋予对ER阳性乳腺癌中的一线药物诸如他莫昔芬(Tamoxifen)的耐药性)中造成可变异形体表达的剪接位点突变。剪接因子的失调已经显示出通过关键基因诸如CD44和FGFR2的间充质异形体的产生有助于上皮向间充质的转换，从而促进肿瘤的进展和转移。考虑到TNBC患者可用的次优治疗选项以及在TNBC患者RNA-seq数据中观察到的广泛的剪接错误，疾病特异性的可变剪接可能是治疗靶向的可行候选物的来源。
本公开内容的系统可用于发现TNBC患者RNA-seq中重复出现的剪接变化以及设计靶向特定的异形体的模态诸如反义寡核苷酸以促进剪接转换从而实现治疗益处。如以上或本文其他地方讨论的，该系统可以包含在国际专利申请第WO2019/226804号中描述的
软件平台，该申请以其全部内容通过引用并入本文。为了发现发生在TNBC亚型中的剪接变化，使用
软件平台比较了来自TCGA乳腺癌数据集的管腔亚型患者和TNBC亚型患者的RNA-seq数据。此外，对乳腺癌细胞系进行了一式三份RNA测序。使用两种代表性的管腔细胞系(即MCF7、T47D)以及两种代表性的TNBC B亚型细胞系(即HS578T、BT549)和一种TNBC A亚型细胞系(即MDA-MB 468)。TCGA和细胞系RNA seq数据的
分析流程图在图2中说明。
来自TCGA和细胞系的管腔乳腺癌和基底乳腺癌之间剪接变化的比较可能独立地造成不同于TCGA(12,860个变化)的剪接变化和不同于细胞系(944个变化)的剪接变化(图3)的鉴定。在这些变化中，有约274个剪接变化在TCGA和细胞系中均被鉴定(图3)。这274个剪接变化被认为是靶标选择的候选物并且可以经历进一步分析。可以根据许多参数来对分析优先级排序。用于候选物选择的参数(或桶(buckets))可以担任多样化的靶标选择标准，其可以包括例如剪接指数、疾病指数、治疗指数、功能指数、剪接转换寡核苷酸(SSO)成药性指数或其任意组合。示例的选择标准和结果在图17中显示。该图显示了基于以上描述的不同参数的候选物选择评分矩阵的代表性说明。
剪接指数可针对给定病例及对照组中的剪接变化(dPSI)，患者数据集中给定事件的一致性、再现性，以及给定事件在多个疾病数据集中的重复发生和在正常数据集中的不存在进行评分。疾病指数可针对剪接变化对蛋白功能的影响(即“SpliceImpactTM”)、疾病关联(通过开放靶标评分整合)、途径分析(KEGG)和文献证据进行评分。SSO成药性指数可针对使用机器学习(即“SpliceLearnTM评分”)鉴定独特的和特异性的剪接校正寡核苷酸(oligo)序列的能力、映射到所鉴定的外显子的强eCLIP峰的存在，以及异形体的疾病特异性表达(与GTex正常数据比较)进行评分。
图18揭示了本文所描述的白血病治疗的生物学相关靶标的鉴定。对从Leucegeneconsortium获得的急性髓系白血病(AML)患者的约1178个RNA-seq数据集进行了分析以鉴定潜在的治疗靶标。使用不同的方法分析可变剪接事件，方法包括方差评估(选择截止值以上的最强剪接变化)、再现性(选择在生物重复中重复观察到的剪接变化)、交叉验证(在独立数据集中确认的剪接变化)和
剪接(在国际专利申请第WO2019/226804号中描述的软件平台，该申请以其全部内容通过引用并入本文)。对于每种方法，选择前30个基因候选物，并且使用来自OpenTargets(由GSK、Sanofi、Biogen、Takeda、Celgene、EMBL-EBI和Sanger Institute支持的利用基因组学数据进行药物靶标鉴定的公私合作)的记录选择还已知与AML发病机制有联系的基因候选物。如图18中显示的，通过SpliceCore鉴定的前30个候选物中有23个已知与AML有联系。其他方法鉴定了少量已知与AML有联系的候选物：方差方法鉴定了10个靶标；再现性方法鉴定了8个靶标；交叉验证方法鉴定了8个靶标。
在图17中选择标准的示例性应用中，通过观察内部(in-house)细胞系和公共BRCATCGA RNA-seq数据中的一个或更多个可变剪接事件/变化确定可变剪接指数；通过确认一个或更多个可变剪接事件/变化是疾病特异性的并且使用公共GTEx RNA-seq在正常乳腺组织中没有发现确定治疗指数；通过注意到由SpliceImpact(在国际专利申请第WO2019/226804号中描述的软件平台，该申请以其全部内容通过引用并入本文)生成的一个或更多个可变剪接事件/变化的评分具有显著的破坏性确定功能指数；以及通过使用SpliceLearn(在国际专利申请第WO2019/226804号中描述的软件平台，该申请以其全部内容通过引用并入本文)预测一个或更多个可变剪接事件/变化是药物靶标确定成药性指数。在一些情况下，药物靶标是SSO调节性靶标。
在图17中选择标准的另一个示例性应用中，通过观察内部类器官(organoid)和来自Metabrick数据集的公共BRCA TCGA RNA-seq中的一个或更多个可变剪接事件/变化确定可变剪接指数；通过确认一个或更多个可变剪接事件/变化是疾病特异性的并且使用公开的GTEx RNA-seq在各种死后组织(包括肝、心、肌肉和/或肾)中没有发现确定治疗指数；通过注意到一个或更多个可变剪接事件/变化发生在一个或更多个具有高BRCA关联评分(使用OpenTargets估计)的基因中确定功能指数；以及通过使用CLIP-seq数据确认一个或更多个致癌剪接因子结合到一个或更多个具有一个或更多个可变剪接事件/变化的靶基因确定成药性指数。在一些情况下，一个或更多个靶基因可能被基于选择标准分析的ASO阻断。
在图17中选择标准的另一个示例性应用中，通过观察内部细胞系和来自合作伙伴的许可的RNA-seq中的一个或更多个可变剪接事件/变化确定可变剪接指数；通过确认一个或更多个可变剪接事件/变化是疾病特异性的并且在来自伙伴RNA-seq的正常组织中没有发现确定治疗指数；通过使用公开文献确认一个或更多个可变剪接事件/变化是功能上与乳腺癌相关的确定功能指数；以及通过确认一个或更多个可变剪接事件/变化发生在一个或更多个已知为小分子蛋白靶标的基因中确定成药性指数。
基于一个或更多个以上提到的过滤标准或参数，总共28个在TNBC亚型中剪接变化可能显著的候选物(表1-TNBC特异性的最高评分剪接事件及其对应的基因名称的列表)被选择。这些候选物的剪接事件随后通过PCR在实验模型(诸如细胞系、原代细胞、组织、类器官、PDX肿瘤、患者组织材料、体液等)中在RNA水平经历表达评估。在抗体可用的情况下，也可以评估剪接异形体的蛋白表达。杂交方法诸如RNA-FISH也可用于验证肿瘤组织切片中特定异形体的表达。
表1
| TXDBID | 基因(HUGO) | ENV代码 |
| CA-18-58335477-58335537.2267.0 | NEDD4L | ENV2 |
| CA-6-90544551-90544632.1 | MAP3K7 | ENV3 |
| CA-6-41080810-41080897.1 | NFYA | ENV11 |
| CA-7-158752780-158752843.1 | ESYT2 | ENV21 |
| CA-11-63903985-63904147.1 | MARK2 | ENV18 |
| CA-7-117134123-117134192.1 | ST7 | ENV19 |
| CA-22-19971215-19971335.1 | ARVCF | ENV22 |
| CA-11-85717482-85717530.1 | SYTL2 | ENV17 |
| CA-2-135641535-135641604.2 | R3HDM1 | ENV23 |
| CA-5-75399309-75399387.1 | COL4A3BP | ENV9 |
| CA-22-20053436-20053551.3 | TANGO2 | ENV6 |
| CA-17-77307140-77307197.5 | SEPT9 | ENV15 |
| CA-3-78647628-78647655.1 | ROBO1 | ENV4 |
| CA-X-134772142-134772283.1 | FAM122B | ENV5 |
| CA-3-58141857-58141929.1 | FLNB | ENV1 |
| CA-3-108050577-108050602.2 | CD47 | ENV13 |
| CA-1-29058588-29058645.2 | EPB41 | ENV14 |
| CA-1-164820071-164820184.1 | PBX1 | ENV16 |
| CA-19-35262545-35262692.1 | LSR | ENV20 |
| CA-1-155061417-155061489.4 | ADAM15 | ENV7 |
| CA-20-36209487-36209898.2 | EPB41L1 | ENV8 |
| CA-10-26755654-26755741.1 | ABI1 | ENV10 |
| CA-11-57791493-57791673.2 | CTNND1 | ENV12 |
| CA-3-170082616-170082758.1 | GPR160 | ENV24 |
| CA-1-63447564-63447614.1 | ITGB3BP | ENV25 |
| CA-11-62141499-62141511.1 | INCENP | ENV26 |
| CA-1-197647054-197647114.1 | DENND1B | ENV27 |
| CA-15-63328097-63328130.1 | CA12 | ENV28 |
首先，对从表1的列表中选定的候选物进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以确认管腔细胞系对比基底细胞系中差异的异形体表达。代表性的PCR在图4中显示，其中长异形体或短异形体的特异性表达在TNBC细胞系对比管腔细胞系中富集。进一步地，对于选定组的候选物，还进行蛋白印迹分析以验证蛋白表达，并且这些候选物的代表性蛋白印迹图像在图5中显示，其还显示了从管腔细胞系和基底细胞系提取的蛋白裂解物中差异的异形体表达。
接下来，重点测试了特定的候选来看它们是否可作为开发治疗化合物的良好的治疗靶标。NEDD4L被SpliceCore软件平台推荐为顶级候选物之一并且在TCGA数据中显示出最强的dPSI变化和非常高的再现性以及在关键信号途径(即TGFβ)中已知的癌症关联。通过研究所观察到的剪接变化对蛋白功能的影响，确定在TNBC亚型中富集的跳读异形体(短异形体)缺少可能负责蛋白-蛋白相互作用的在WW结构域附近的短环区域。该环含有一个苏氨酸残基，该残基可能经历由激酶进行的翻译后修饰，激酶可以磷酸化NEDD4L以维持TGFβ信号传导的稳态。通过可变剪接的TNBC癌症特异性环损失可以使信号传导级联去调控，导致肿瘤进展。此外，观察到表达NEDD4L包含异形体的乳腺癌患者相比于具有跳读异形体表达的乳腺癌患者具有更好的总生存(图6)。对来自TCGA的亚型分层数据的进一步分析已显示，相比于正常乳腺或者乳腺癌的管腔或HER2亚型，TNBC亚型中的NEDD4L跳读异形体是显著丰富的。该差异仅在可变剪接水平被观察到并且在这些亚型中NEDD4L的总RNA表达只有不太大的差异(图7)。
通过使用
软件平台以及名为SpliceLearn的模块，基于机器学习(基于ML)的方法被用于预测如果使用分子(例如寡核苷酸)阻断有高可能性促进剪接转换的核苷酸序列。这些序列被评分，并针对候选物列表上的每个三外显子组排序。额外的评分标准可以包括RBP结合峰，其可从针对剪接调控蛋白(包括但不限于RBFOX2、TDP-43、HNRNPL)的ENCODE eCLIP-seq数据和/或内部生成的eCLIP-seq数据获得。
接下来，可以生成跨越三外显子组内高评分区域的k-mer序列列表并且可以基于SSO特异性、重复基序和脱靶效应以及二级结构对该列表进一步过滤(图8)。前5个寡核苷酸是化学合成的并且可能含有硫代磷酸酯修饰的主链和/或被均匀修饰以在2’位含有甲氧基乙烷(2’MOE)的核糖。纯化的寡核苷酸可在乳腺癌细胞系中经历功能分析。
对于NEDD4L，总共测试了5个不同的序列(GCTGGCTTTGTCTGGATAGG、GTGGGTTTCAGGGATTCTGA、TCTCACGTCACCTGCCTTAC、AGCGCTGCCACAGCAGTGGG、CCCTGATTCAGACAGCAGGG)，并且发现这些序列中的2个显著促进了中间外显子的包含。GTGGGTTTCAGGGATTCTGA(SSO2-2)在4个实验中的3个中显示促进平均40％的包含率，而(SSO2-5)CCCTGATTCAGACAGCAGGG在4个实验中的4个中显示促进平均30％的包含率(图9)。
进行剂量响应实验以评估两个乳腺癌细胞系(即MCF7(管腔)和MDA-MB-231(TNBC)细胞系)中SSO化合物的LC50值。SSO化合物的转染在MDA-MB-231细胞中而不在MCF7细胞中显示出活力的剂量响应性损失。发现细胞系中的最佳剂量浓度在370nM-420nM之间，在该浓度观察到>50％的细胞死亡。细胞活力可通过使用Celltitre发光测定测量线粒体ATP通量评估。在针对对照未转染的细胞标准化后，平均发光可被转化为活细胞的百分比。两种不同细胞系对两种SSO的剂量响应曲线在图10A-10B中显示。
可变剪接事件对TNMC肿瘤的关键程度也在图11、图12、图13和图14中显示。可变剪接事件可以与如以上或本文其他地方描述的一个或更多个基因，例如，包括以下的基因关联：NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、COL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28)或其组合。进行对含有候选的长异形体和短异形体的TCGA BRCA患者的生存分析，结果分别在15和图16中说明。候选物可以是如以上或本文其他地方描述的一个或更多个基因，例如，包括以下的基因：NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、COL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28)或其组合。分析显示表达任一种异形体的患者中的总生存有显著差异。
因此，以上结果显示TNBC亚型可能是易受剪接变化攻击的。使用本公开内容的软件平台，可在来自患者样品的RNA-seq数据集中鉴定和验证可再现的和高影响的剪接变化。所列的候选物有可能担任TNBC乳腺癌的治疗靶标。该平台还设计和指定了当使用反义寡核苷酸靶向时可促进剪接转换的寡核苷酸序列。针对NEDD4L，使用均匀修饰的2’MOE寡核苷酸化学对平台设计的寡核苷酸进行实验验证。NEDD4L可变剪接是乳腺癌TNBC亚型特异性剪接事件。使用诸如反义寡核苷酸的模态靶向NEDD4L异形体转换在TNBC细胞中特异性地以剂量响应方式表现出选择性活力损失。因此，NEDD4L剪接可作为可行的事件来开发治疗TNBC患者的治疗剂。
应当理解尽管以上实例与TNBC RNA-seq数据集相关，但是如以上或本文其他地方讨论的NEDD4L和其他候选剪接事件在其他实体或血液恶性肿瘤(solid or hematologicalmalignancies)以及神经或代谢疾病中可能也是重要的。所述剪接变化中的一种或更多种可对这样的疾病、紊乱(disorders)或状况的发病机理或进展负责，并且本公开内容的治疗靶标可应用于这样的疾病、紊乱或状况。
可选地或额外地，剪接靶标可以使用包括但不限于小分子、GAPMER寡核苷酸、siRNA、CAR-T细胞或其任意组合的模态调节以实现疾病特异性靶向。例如，一些已经鉴定的疾病特异性剪接事件可为小分子结合打开沟。在这样的情况下，小分子可被设计来靶向由于剪接变化而产生的区域。在另一实例中，膜结合蛋白的剪接变化可以展示可以用抗体特异性靶向的改变的表面表位。SpliceCore软件平台以及如以上和本文其他地方描述的方法可用于分析、设计和开发针对广泛的疾病适应症的多模态治疗靶标。
实施例2–靶标特异性反义寡核苷酸(ASO)
如以上和本文其他地方提供的，ASO可基于外显子位置和SpliceLearnTM特征(诸如RNA结合蛋白)被鉴定。ASO可用于剪接转换实验以促进本文提供的靶标候选物中的外显子包含。在一些情况下，化学修饰的ASO可以基于鉴定的ASO合成。例如，一个或更多个化学修饰被引入到一个或更多个ASO中。化学修饰可以包括硫代磷酸酯主链修饰和/或2’-O-(2-甲氧基乙基)核糖修饰(2’MOE)(对核糖的修饰)。ASO的序列可以用于针对乳腺癌细胞系的一个或更多个离体实验以确定ASO对靶基因候选物的剪接转换的影响。
选定组的ASO可以用于进一步的体外和体内实验以及临床前研究。在一些情况下，特定的剪接转换事件可被鉴定为与三阴性乳腺癌(TNBC)密切关联。在一些实施方案中，反义寡核苷酸可以具有强大的剪接转换效应及较小的毒性。在一些情况下，ASO可用于临床前研究和/或患者中癌症特异性基因靶向的治疗剂开发。例如，通过诱导可能具有抗肿瘤作用的剪接转换，ASO可以用于靶向TNBC乳腺癌患者的治疗剂开发。
表2-8列出了具有可变序列长度的靶标特异性寡核苷酸序列的实例，其可以用于诱导异形体转换或调节(例如，抑制或增强)以上或本文其他地方描述的一种或若干种基因的特定异形体的生物活性(例如，基因包括以下中的一个或更多个：NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、COL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28))。
在一些情况下，表中包括的寡核苷酸序列是对单一靶标特异性的。在一些情况下，表中包括的寡核苷酸序列是对一个以上的靶标特异性的。在一些情况下，包括在一个以上表中的寡核苷酸序列是对单一靶标特异性的。例如，表2-8中包括的寡核苷酸序列可以是对单一靶标特异性的。靶标可以是选自以上或本文其他地方描述的基因的基因。
表2：16-mer靶标特异性ASO
表3：17-mer靶标特异性ASO
表4：18-mer靶标特异性ASO
表5：19-mer靶标特异性ASO
表6：20-mer靶标特异性ASO
表7：21-mer靶标特异性ASO
表8：22-mer靶标特异性ASO
表9-15包括具有可变序列长度的寡核苷酸序列的一些额外的实例，其可以用于诱导异形体转换或调节(例如，抑制或增强)以上或本文其他地方描述的一种或若干种基因的特定异形体的生物活性(例如，基因包括以下中的一个或更多个：NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、COL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28))。
如以上讨论的，包括在表中的寡核苷酸序列可以是对单一靶标或一个以上的靶标特异性的。在一些情况下，包括在一个以上表中的寡核苷酸序列是对单一靶标特异性的。例如，包括在表9-15中的寡核苷酸序列可以是对单一靶标特异性的。靶标可以与表2-8中包括的寡核苷酸序列特异于的靶标相同或不同。靶标可以是选自以上或本文其他地方描述的基因的基因。
表9：16-mer靶标特异性
表10：17-mer靶标特异性ASO
表11：18-mer靶标特异性ASO
表12：19-mer靶标特异性ASO
表13：20-mer靶标特异性ASO
表14：21-mer靶标特异性ASO
表15：22-mer靶标特异性ASO
本文还提供了一些额外的靶标特异性ASO(表16-33)，其可用于本公开内容的方法和/或系统。ASO可用于诱导异形体转换或调节(例如，抑制或增强)以上或本文其他地方描述的一种或若干种基因的特定异形体的生物活性(例如，基因包括以下中的一个或更多个：NEDD4L(ENV2)、MAP3K7(ENV3)、NFYA(ENV11)、ESYT2(ENV21)、MARK2(ENV18)、ST7(ENV19)、ARVCF(ENV22)、SYTL2(ENV17)、R3HDM1(ENV23)、OL4A3BP(ENV9)、TANGO2(ENV6)、SEPT9(ENV15)、ROBO1(ENV4)、FAM122B(ENV5)、CD47(ENV13)、LSR(ENV20)、PBX1(ENV16)、EPB41(ENV14)、ADAM15(ENV7)、EPB41L1(ENV8)、ABI1(ENV10)、FLNB(ENV1)、CTNND1(ENV12)、GPR160(ENV24)、ITGB3BP(ENV25)、INCENP(ENV26)、DENND1B(ENV27)、CA12(ENV28))。
如以上讨论的，包括在表中的寡核苷酸序列可以是对单一靶标或一个以上的靶标特异性的。在一些情况下，包括在一个以上表中的寡核苷酸序列是对单一靶标特异性的。例如，包括在表16-33中的寡核苷酸序列可以各自是对单一靶标特异性的。靶标可以与表2-15中包括的寡核苷酸序列特异于的靶标相同或不同。靶标可以是以上或本文其他地方描述的一个或更多个基因。在一些情况下，表16中包括的ASO是对NEDD4L(ENV2)特异性的。在一些情况下，表17中包括的ASO是对MAP3K7(ENV3)特异性的。在一些情况下，表18中包括的ASO是对ROBO1(ENV4)特异性的。在一些情况下，表19中包括的ASO是对FAM122B(ENV5)特异性的。在一些情况下，表20中包括的ASO是对TANGO2(ENV6)特异性的。在一些情况下，表21中包括的ASO是对ADAM15(ENV7)特异性的。在一些情况下，表22中包括的ASO是对EPB41L1(ENV8)特异性的。在一些情况下，表23中包括的ASO对COL4A3BP(ENV9)是特异性的。在一些情况下，表23中包括的ASO是对ABI1(ENV10)特异性的。在一些情况下，表24中包括的ASO是对NFYA(ENV11)特异性的。在一些情况下，表26中包括的ASO是对CTNND1(ENV12)特异性的。在一些情况下，表27中包括的ASO是对SEPT9(ENV15)特异性的。在一些情况下，表28中包括的ASO是对SYTL2(ENV17)特异性的。在一些情况下，表29中包括的ASO是对MARK2(ENV18)特异性的。在一些情况下，表30中包括的ASO是对ST7(ENV19)特异性的。在一些情况下，表31中包括的ASO是对ESYT2(ENV21)特异性的。在一些情况下，表32中包括的ASO是对ARVCF(ENV22)特异性的。在一些情况下，表33中包括的ASO是对R3HDM1(ENV23)特异性的。
表16：25-mer靶标特异性ASO
表17：25-mer靶标特异性ASO
表18：25-mer靶标特异性ASO
表19：25-mer靶标特异性ASO
表20：25-mer靶标特异性ASO
表21：25-mer靶标特异性ASO
表22：25-mer靶标特异性ASO
表23：25-mer靶标特异性ASO
表24：25-mer靶标特异性ASO
表25：25-mer靶标特异性ASO
表26：25-mer靶标特异性ASO
表27：25-mer靶标特异性ASO
表28：25-mer靶标特异性ASO
表29：25-mer靶标特异性ASO
表30：25-mer靶标特异性ASO
表31：25-mer靶标特异性ASO
表32：25-mer靶标特异性ASO
表33：25-mer靶标特异性ASO
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。并不意图本发明限于本说明书中提供的特定的实例。虽然已参考以上提及的说明书描述了本发明，但本文实施方案的描述和说明并不意图以限制性的意义来解释。本领域技术人员现将想到不偏离本发明的许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面并不限于本文根据各种条件和变量阐述的具体描述、配置或相对比例。应当理解，在实践本发明时可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代选择。因此可以预期，本发明还应涵盖任何此类的替代选择、修改、变化或等同物。所附权利要求意图限定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (155)
1.一种调节生物样品中前体mRNA中的剪接的方法，所述方法包括：将所述生物样品与反义化合物接触，所述反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％序列同一性的一种或更多种寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包括细胞、组织或血液样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述生物样品是体外的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述生物样品是细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，还包括测量所述细胞的活力。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述测量是在预定时间段内。
7.根据权利要求4或5所述的方法，还包括在预定时间段内监测所述细胞的所述活力。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，还包括基于所述细胞的所述活力降低或增加所述反义化合物的浓度。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，还包括当所述细胞的所述活力低于截止值时降低或增加所述反义化合物的浓度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述截止值为约80％。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述截止值为约90％。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。
15.根据权利要求14的所述方法，其中所述RNA包括小干扰RNA(siRNA)。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述生物样品来自具有或疑似具有疾病或状况的受试者。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述疾病是癌症。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述修饰的糖部分是2'-取代的糖部分。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述2'-取代的糖部分包含选自由2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸组成的组的修饰。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中所述修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，所述多于一个修饰的核苷各自包含修饰的糖部分。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述调节包括诱导或增强外显子跳读。
34.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述调节包括诱导或增强外显子包含。
35.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述调节包括促进剪接转换。
36.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述调节包括剪接的下调或上调。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述反义化合物特异性结合到由包括以下的基因编码的前体mRNA的区段：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。
38.一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)反义化合物，所述反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％序列同一性的一种或更多种寡核苷酸，以及(ii)药学上可接受的稀释剂或载体。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
40.根据权利要求38或39所述的药物组合物，其中所述反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
41.根据权利要求38-40中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述RNA包括小干扰RNA(siRNA)。
43.根据权利要求38-42中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。
44.根据权利要求38-43中任一项的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗或缓解疾病或状况。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述疾病包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述疾病或状况是癌症。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。
48.根据如权利要求47所述的药物组合物，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
49.根据权利要求38-48中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。
50.根据权利要求38-49中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸。
51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。
55.根据权利要求54所述的药物组合物，其中所述一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述修饰的糖部分是2'-取代的糖部分。
57.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述2'-取代的糖部分包含选自由2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸组成的组的修饰。
58.根据权利要求50-57中任一项所述的药物组合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，所述多于一个修饰的核苷各自包含修饰的糖部分。
59.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。
60.根据权利要求38-60中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物用于调节由包括以下的基因编码的前体mRNA的剪接：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。
61.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述调节包括诱导或增强外显子跳读。
62.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述调节包括诱导或增强外显子包含。
63.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述调节包括促进剪接转换。
64.根据权利要求60所述的药物组合物，其中所述调节包括剪接的下调或上调。
65.一种用于制备用于治疗疾病或状况的药物的反义化合物，所述反义化合物包括与选自表2-33的寡核苷酸具有至少90％序列同一性的一种或更多种寡核苷酸。
66.根据权利要求65所述的反义化合物，所述反义化合物包括浓度大于或等于约300nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
67.根据权利要求65或66所述的反义化合物，所述反义化合物包括浓度小于或等于约450nM的所述一种或更多种寡核苷酸。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的反义化合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合。
69.根据权利要求68所述的反义化合物，其中所述RNA包括小干扰RNA(siRNA)。
70.根据权利要求65-69中任一项所述的反义化合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或其组合。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的反义化合物，其中所述疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
72.根据权利要求71所述的反义化合物，其中所述疾病是癌症。
73.根据权利要求72所述的反义化合物，其中所述癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。
74.根据权利要求73所述的反义化合物，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
75.根据权利要求65-74中任一项所述的反义化合物，其中所述一种或更多种核苷酸包括选自表2-33的寡核苷酸。
76.根据权利要求65-75中任一项所述的反义化合物，其中所述一种或更多种寡核苷酸包括修饰的寡核苷酸。
77.根据权利要求76所述的反义化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键。
78.根据权利要求77所述的反义化合物，其中所述至少一个修饰的核苷间键是硫代磷酸酯键。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的反义化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷酸。
80.根据权利要求76-79中任一项所述的反义化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含一个或更多个修饰的核苷。
81.根据权利要求80所述的反义化合物，其中所述一个或更多个修饰的核苷的修饰的核苷包含修饰的糖部分。
82.根据权利要求81的所述反义化合物，其中所述修饰的糖部分是2'-取代的糖部分。
83.根据权利要求82所述的反义化合物，其中所述2'-取代的糖部分包含选自由2'-O-甲氧基乙基、2'-氟、2'-二甲氨基氧基乙氧基、2'-二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍基、2'-O-胍基乙基、2'-氨基甲酸酯、2'-氨基氧基、2'-乙酰胺基和锁核酸组成的组的修饰。
84.根据权利要求76-83中任一项所述的反义化合物，其中所述修饰的寡核苷酸包含多于一个修饰的核苷，所述多于一个修饰的核苷各自包含修饰的糖部分。
85.根据权利要求84所述的反义化合物，其中所述多于一个修饰的核苷的至少一个子集彼此不同。
86.根据权利要求65-85中任一项所述的反义化合物，其中所述治疗包括调节由包括以下的基因编码的前体mRNA的剪接：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B或CA12。
87.根据权利要求86所述的反义化合物，其中所述调节包括诱导或增强外显子跳读。
88.根据权利要求86所述的反义化合物，其中所述调节包括诱导或增强外显子包含。
89.根据权利要求86所述的反义化合物，其中所述调节包括促进剪接转换。
90.根据权利要求86所述的反义化合物，其中所述调节包括剪接的下调或上调。
91.一种调节生物样品中前体mRNA中的剪接的方法，所述方法包括：
将所述生物样品与组合物接触，所述组合物特异性结合到由选自由以下组成的组的基因编码的所述前体mRNA的区段：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B和CA12。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述前体mRNA的所述区段长度为9-150个核苷酸。
93.根据权利要求91或92所述的方法，其中所述组合物包括寡核苷酸。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段充分互补。
95.根据权利要求93或94所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段具有至少80％的序列同一性。
96.根据权利要求93-95中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段具有至少90％序列同一性。
97.根据权利要求93至96中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含10-50个核苷酸。
98.根据权利要求93至97中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸。
99.根据权利要求91-98中任一项所述的方法，其中所述组合物包括小分子、核酸分子、工程细胞、蛋白或其组合或修饰。
100.根据权利要求91-99中任一项所述的方法，其中所述组合物包括嵌合分子。
101.根据权利要求100所述的方法，其中所述嵌合分子包含核酸分子和蛋白。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述核酸分子包括DNA、RNA、PNA或其组合或杂合体。
103.根据权利要求91-102中任一项所述的方法，其中所述组合物诱导或增强所述前体mRNA中的外显子跳读。
104.根据权利要求91-102中任一项所述的方法，其中所述组合物诱导或增强所述前体mRNA中的外显子包含。
105.根据权利要求91-102中任一项所述的方法，其中所述组合物促进所述前体mRNA中的剪接转换。
106.根据权利要求91-102中任一项所述的方法，其中所述组合物下调或上调所述前体mRNA中的剪接。
107.根据权利要求91-102中任一项所述的方法，其中所述组合物防止所述前体mRNA中的剪接。
108.一种用于在有相应需要的受试者中治疗疾病或状况的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的组合物，所述组合物特异性结合到选自由以下组成的组的基因编码的前体mRNA的区段：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、INCENP、DENND1B和CA12，从而调节所述前体mRNA的剪接。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述前体mRNA的所述区段长度为9-150个核苷酸。
110.根据权利要求108或109所述的方法，其中所述组合物包括寡核苷酸。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段充分互补。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段具有至少80％序列同一性。
113.根据权利要求110-112中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸与所述前体mRNA的所述区段具有至少90％序列同一性。
114.根据权利要求110至113中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含10-50个核苷酸。
115.根据权利要求110至114中任一项所述的方法，其中所述寡核苷酸包含15-30个核苷酸。
116.根据权利要求108-115中任一项所述的方法，其中所述组合物包括小分子、核酸分子、工程细胞、蛋白或其组合或修饰。
117.根据权利要求108-116中任一项所述的方法，其中所述组合物包括嵌合分子。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述嵌合分子包含核酸分子和蛋白。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述核酸分子包括DNA、RNA、PNA或其组合或杂合体。
120.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述组合物诱导或增强所述前体mRNA中的外显子跳读。
121.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述组合物诱导或增强所述前体mRNA中的外显子包含。
122.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述组合物促进所述前体mRNA中的剪接转换。
123.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述组合物下调或上调所述前体mRNA中的剪接。
124.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述组合物防止所述前体mRNA中的剪接。
125.根据权利要求108-124中任一项所述的方法，其中所述有效量包括至少300nM的所述组合物。
126.根据权利要求108-125中任一项所述的方法，其中所述有效量包括至多500nM的所述组合物。
127.根据权利要求108-126中任一项所述的方法，其中所述疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
128.根据权利要求127所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
129.根据权利要求128所述的方法，其中所述癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
131.一种用于在受试者中筛选、诊断或预后疾病或状况的方法，所述方法包括：
(a)分析来自所述受试者的生物样品以检测蛋白异形体的表达水平，所述蛋白异形体由选自由以下组成的组的基因编码：NEDD4L、MAP3K7、NFYA、ESYT2、MARK2、ST7、ARVCF、SYTL2、R3HDM1、COL4A3BP、TANGO2、SEPT9、ROBO1、FAM122B、CD47、LSR、PBX1、EPB41、ADAM15、EPB41L1、ABI1、FLNB、CTNND1、GPR160、ITGB3BP、NCENP、DENND1B和CA12；以及
(b)确定所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平相对于对照的生物样品中所述蛋白异形体的表达水平的差异，其中所述差异指示或预测所述疾病或状况。
132.根据权利要求131所述的方法，其中所述生物样品是细胞、组织或血液样品。
133.根据权利要求131或132所述的方法，其中(a)包括定量检测所述生物样品中所述蛋白异形体的量。
134.根据权利要求131-133中任一项所述的方法，其中所述差异包括所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平相对于所述对照的所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平的增加或降低。
135.根据权利要求134所述的方法，其中所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平相对于所述对照的所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平的所述增加指示或预测所述疾病或状况。
136.根据权利要求134所述的方法，其中所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平相对于所述对照的所述生物样品中所述蛋白异形体的所述表达水平的所述降低指示或预测所述疾病或状况。
137.根据权利要求131-136中任一项所述的方法，其中所述蛋白异形体包括可变剪接的蛋白异形体。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述可变剪接的蛋白异形体是由所述基因的可变剪接形成的。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述可变剪接包括外显子跳读、外显子包含、内含子保留、竞争5'剪接位点、竞争3'剪接位点、多个启动子、多个多(A)位点或其组合。
140.根据权利要求131-139中任一项所述的方法，所述方法还包括检测所述生物样品中所述基因的表达水平。
141.根据权利要求140所述的方法，所述方法还包括检测所述受试者的所述生物样品中所述基因的所述表达水平相对于所述对照中所述生物样品中所述基因的表达水平的差异的存在或不存在。
142.根据权利要求141所述的方法，其中所述基因的所述表达水平的所述差异的所述存在或所述不存在进一步指示或预测所述疾病或状况。
143.根据权利要求141或142所述的方法，其中所述差异的所述存在包括所述受试者的所述生物样品中所述基因的所述表达水平相对于所述对照中所述生物样品中所述基因的所述表达水平的增加或降低。
144.根据权利要求131-143中任一项所述的方法，所述方法还包括监测所述受试者中所述疾病或状况的进展。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述监测包括在预定时间段内重复(a)多次。
146.根据权利要求131-145中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述受试者中诊断出所述疾病或状况后向所述受试者提供治疗。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述治疗包括向所述受试者施用有效量的调节所述蛋白异形体的所述表达水平的组合物。
148.根据权利要求146或147所述的方法，其中所述治疗包括向所述受试者施用有效量的调节编码所述蛋白异形体的所述基因的剪接的组合物。
149.根据权利要求131-148中任一项所述的方法，其中所述疾病或状况包括遗传病、CNS疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述疾病或状况是癌症。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述癌症包括肺癌、肾癌或乳腺癌。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
153.一种鉴定作为药物靶标的基因的方法，所述方法包括：(a)通过鉴定所述基因的一个或更多个可变剪接事件确定可变剪接指数；和以下的一个或更多个：(b)通过将一个或更多个可变剪接事件与一种或更多种紊乱相关联确定治疗指数；(c)通过将所述一个或更多个可变剪接事件与所述一种或更多种紊乱的一种或更多种病理相关联确定功能指数；以及(d)通过鉴定通过调节所述基因的剪接来治疗所述一种或更多种紊乱的一种或更多种工具确定成药性指数，从而鉴定所述基因为药物靶标。
154.根据权利要求153所述的方法，其中步骤(a)还包括分析一个或更多个细胞系、一个或更多个包含RNA序列的数据库或其组合中的剪接事件，以鉴定所述基因的所述一个或更多个可变剪接事件。
155.根据权利要求153所述的方法，其中步骤(b)还包括确认正常细胞和/或组织中所述一个或更多个可变剪接事件的不存在。
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