JP2007529213A - 腫瘍生細胞から選択されたアプタマ及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
- それらは組織境界を横切ることができないからであり、
- それらは生物体において不安定であるか、又はその他の生体分子との非常に多くの有害な相互作用の原因であるからであり、
- その本来の細胞環境の外におかれた標的の本来の構造が保存されなかったか、又はこの構造のある必須の修飾、例えば:(i) タンパク質の翻訳後修飾又は(ii) 他のタンパク質との相互作用がインビトロで再現できないからである。
- 特異的で
- 調節可能で、かつ
- 妥当な費用で簡単に製造される
新規な分子認識プローブを必要とする。
- 小分子のコンビナトリアルライブラリは、特定のタンパク質に対するリガンドを見出す機会を増加させ得る(例:コンビナトリアルライブラリのサブクラス、酵素を阻害する偽物質、例えばMMP (マトリックスメタロプロテアーゼ)を阻害するもの)。これらの主要な欠点は、これらがインビトロで分類されることである。さらに、それらの選択性は保証されないので、これらの作用剤を用いて、有効なように充分に選択性がありかつ副作用がない化合物を得ることは困難である。例外的に、異常タンパク質の形に特異的な化合物が得られ、これは非特異的結合及び有害作用を導き、乏しい治療係数をもたらす。
- 核酸混合物を標的要素(天然又は合成のポリマー:タンパク質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、細胞表面;小分子:薬剤、代謝産物、補因子、基質、遷移状態類似体;組織、特に全細胞;ウイルスなど)と、結合を促進させる条件下に接触させ、
- 結合しなかった配列を分離し、
- 核酸−標的要素複合体を解離させ(dissociating)、
- 解離した核酸を、リガンド(アプタマ)が富化された混合物を得るように増幅し、そして
- 所望の回数、結合、分離、解離及び増幅の工程を繰り返す。
- 米国特許第5270163号は、SELEX法の最初の原理を記載し;
- 米国特許第5580737号は、類似の構造の2つの物質、すなわちカフェインとテオフィリンを識別できるアプタマの選択への、対抗選択工程を含むこの方法の応用について記載し;
- 米国特許第5660985号は、ピリミジンのレベルでの修飾ヌクレオチドを含む(5位又は2'位での修飾)修飾アプタマの選択へのこの方法の応用について記載し;
- 米国特許第5789157号は、組織の表面、特に細胞の表面に存在するタンパク質に結合できるアプタマの選択へのこの方法の応用について記載している。この特許は、SELEX法を、特に、特定の標的、すなわち組織、特に他の引用した特許において用いられたものよりもより複雑な標的であると考えられ、かつ、通常は分子的に同定された標的(タンパク質など)である腫瘍細胞に適用することを勧めている。この米国特許第5789157号は、SELEX法を行う前、間又は後に対抗選択(又はネガティブ選択)を用いることができることを記載している。米国特許第5580737号により具体的に記載されるネガティブ選択は、異なるが、にもかかわらず非常に似ている組織タイプ間を識別することを可能にする。例えば、ネガティブ選択は、腫瘍細胞に対して高い特異性を示すが、対応する正常細胞に対しては示さないリガンドを同定するのに用いることができる。この特許は、ある受容体を発現する細胞タイプのリガンドである核酸が、該受容体を発現しないようにして構築された細胞系統を用いて対抗選択され得る場合も想定している。しかし、このようなストラテジの使用は、タンパク質が細胞において実質的な表現型の変化を誘導する場合には、実行するのが困難であり得る;
- 米国特許第6232071号は、テネイシンCに特異的なアプタマの選択へのこの方法の応用について記載している。
(a) 核酸混合物を、上記の受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現しないか又はそれを活性化されていない形で発現する細胞(CN細胞)と接触させ、該細胞は、同じ受容体タンパク質−チロシンキナーゼを細胞外ドメインにおける少なくとも1つの変異の存在により活性化された形で発現する細胞と同じ細胞タイプであり(CTe細胞);
(b) 工程(a)においてCN細胞に結合しない核酸の第一部分集合S1を回収し;
(c) 該第一部分集合S1を、CTe細胞と同じ細胞タイプであるが細胞内部分において変異した上記の受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現するCi細胞と接触させ、該Ci細胞は、CTe細胞のものと同じタイプの表現型を示し;
(d) 工程(c)においてCi細胞に結合しない核酸の第二部分集合S2を回収し;
(e) 第二部分集合S2をCTe細胞と接触させ;
(f) 上記のCTe細胞に結合する核酸、すなわち細胞外ドメインにおいて変異した上記の受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(活性化された受容体)を発現する細胞について高親和性を有するものを、細胞−核酸複合体の解離の後に回収し;
(g) 細胞外ドメインにおいて変異した前記受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(活性化された受容体)を発現する細胞について高親和性を有する上記の核酸を増幅して、上記のCTe細胞について高親和性を有する核酸が富化された核酸混合物を得て;そして
(h) (g)で得られた混合物から、活性化された形で受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(RPTK)を発現する細胞に特異的なリガンド又はアプタマを同定する。
- 受容体タンパク質−チロシンキナーゼ (RPTK)
受容体タンパク質−チロシンキナーゼ (RPTK)は、タンパク質の非常に大きいファミリーを構成する。現在、タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)をコードする90を越える既知の遺伝子がヒトゲノムに存在する(Blume-Jensen P.ら, Nature, 2001, 411, 355〜365)。20のファミリーに分類される58個が膜貫通RPTKをコードし、32個が細胞質PKTをコードする。癌に関係するヒト受容体タンパク質−チロシンキナーゼ (RPTK)のうち、次のファミリーを挙げることができる:EGFR (上皮成長因子受容体)、インスリンR (インスリン受容体)、PDGFR (血小板由来成長因子受容体)、VEGFR (血管内皮成長因子受容体)、FGFR (繊維芽細胞成長因子受容体)、NGFR (神経成長因子受容体)、HGFR (肝細胞成長因子受容体)、EPHR (エフリン受容体)、AXL (Tyro 3 PTK)、TIE (内皮細胞のチロシンキナーゼ受容体)、RET (トランスフェクション時の再編成(Rearranged During Transfection))、ROS (ある上皮細胞で発現されるRPTK)及びLTK (白血球チロシンキナーゼ)。以下の記載において、特定の記載なしに用いられる用語「RPTK」は、いずれの受容体(活性化されたか又は活性化されていない;活性化された形又は活性化されていない形)をも包含する。
その正常な形において、該受容体は活性化されていない。活性化は、該正常な受容体を発現する細胞の適切な刺激の後にのみ観察される(刺激後に活性化されたRPTK)。
ある異常な形において、受容体タンパク質−チロシンキナーゼの細胞外ドメインにおける変異のために(1つ又は複数の点突然変異、挿入、欠失及び/又は再編成(rearrangements))、受容体の構成性活性化又は過剰発現が観察される。細胞外部分において変異したこのような活性化された受容体は、キナーゼカスケードの構成性アクチベータである。
このような受容体は、ある細胞内カスケードを活性化できる。本発明の目的のために、これは活性化された受容体とは考えない。一方、活性化された形にあるか又は活性化された形としての受容体の定義に含まれる。
「活性化された形にあるか又は活性化された形としての受容体」の表現は、その理由にかかわらずキナーゼカスケードを活性化するRPTKを意味することを意図する:
・ 成長因子を用いた刺激による活性化(ある条件下での正常活性化)、
・ 受容体の細胞外部分又は細胞内部分のいずれかにおける1又は複数の変異の存在による、受容体の構成性活性化又は過剰発現。
・始めの核酸コンビナトリアルライブラリが、上記のSELEX特許に記載されるものと同じタイプのランダム配列を含むオリゴヌクレオチドからなるのが有利である。これは、少なくとも102核酸、好ましくは109〜1015核酸を含有する。該コンビナトリアルライブラリを構成する核酸は、好ましくは、5'及び3'の端にそれぞれPCR増幅のための固定された配列、好ましくは配列番号1及び配列番号2の配列のオリゴヌクレオチド、又はこれらのオリゴヌクレオチドの少なくとも8つのヌクレオチドを含むランダム配列からなる天然の核酸配列(RNA又はDNA)又は修飾核酸配列(例えば、リボースの2'位においてフッ素原子で修飾されたピリミジン)である。上記のランダム配列はそれぞれ10〜1000ヌクレオチド、好ましくは50ヌクレオチドを含有する。
(a) 受容体 (RPTK)の自己リン酸化の阻害又は活性化、
(b) キナーゼ活性化カスケードの阻害又は活性化、
(c) 適切な刺激(例えば適切な成長因子)により活性化された正常細胞(CN細胞)の正常なRPTKのリン酸化の阻害、
(d) RPTKの活性化に関連する表現型の復帰
である。
EGFR (上皮成長因子受容体)、インスリンR (インスリン受容体)、PDGFR (血小板由来成長因子受容体)、VEGFR (血管内皮成長因子受容体)、FGFR (繊維芽細胞成長因子受容体)、NGFR (神経成長因子受容体)、HGFR (肝細胞成長因子受容体)、EPHR (エフリン受容体)、AXL (Tyro 3 PTK)、TIE (内皮細胞のチロシンキナーゼ受容体)、RET (トランスフェクション時の再編成)、ROS (ある上皮細胞で発現されるRPTK)及びLTK (白血球チロシンキナーゼ)
からなる群より特に選択される活性化されたか又は活性化されていない形の受容体タンパク質−チロシンキナーゼ (RPTK)を発現する細胞に特異的である。
(a) 核酸の混合物を、活性化された形のいずれのRet受容体を発現しないCN細胞と接触させ;
(b) 工程(a)において、前記CN細胞に結合しない核酸の第一部分集合S1を回収し;
(c) 前記第一部分集合S1を、細胞内ドメインにおいて変異したRet受容体、特に変異受容体RetM918Tを発現するCi細胞と接触させ;
(d) 前記Ci細胞に結合しない核酸の第二の部分集合S2を回収し;
(e) 第二部分集合S2を、細胞外ドメインにおける変異により活性化されたRet受容体を発現するCTe細胞と接触させ、該受容体は、細胞外ドメインに位置するシステインの1つ、好ましくはCys609、Cys611、Cys618、Cys620又はCys634に変異を有する変異Ret受容体、好ましくはRetC634Y受容体からなる群より選択され;
(f) 前記CTe細胞に結合する核酸、すなわち工程(e)で規定される変異Ret受容体(活性化された受容体)を発現する細胞について高い親和性及び結合特異性の両方を示す核酸を回収し;
(g) 工程(f)で得られた前記核酸を増幅して、CTe細胞について高親和性を有する核酸が富化された核酸混合物を得て;
(h) 工程(a)〜(g)を、解離定数(Kd)で規定されるCTe細胞に対する親和性が測定可能でありかつ薬理活性に適切な少なくとも1つのアプタマが得られるまで繰り返し;
(i) (h)で得られた混合物から選択される、活性化された形のRet受容体を発現する細胞に特異的なアプタマを同定する
を含む上記で規定されるような方法により同定できる。
Ret (トランスフェクション時に再編成された)腫瘍遺伝子は、チロシンキナーゼファミリーの受容体タイプ表面タンパク質の異常な形をコードする。この癌原遺伝子は、染色体10q11.2に位置する。Ret癌原遺伝子における変異は、種々の疾患、特にヒルシュスプルング病、ならびにMENタイプ2A (MEN 2A)、MENタイプ2B (MEN 2B)及び家族性甲状腺髄様癌(又はFMTC)を含む多発性内分泌腫瘍タイプII (又はMEN 2)に関連する。MEN 2Aは、甲状腺髄様癌、クロム親和細胞腫及び副甲状腺過形成(原発性副甲状腺機能亢進症)を特徴とする。MEN 2Bは、甲状腺髄様癌の特に進行性の形、クロム親和細胞腫、多発性粘膜神経膠腫及び腸節神経腫症を特徴とする。retの短縮された形は、乳頭甲状腺癌(PTC)に関係する細胞内タンパク質をコードする。
- CN細胞は、特に、野生型PC12細胞(参照ECACC番号88022)又は野生型NIH 3T3細胞(参照ECACC番号93061524)であり、
- Ci及びCTe細胞は、それぞれ細胞内及び細胞外に(図2)変異を有する腫瘍遺伝子を、培養CN細胞に、後者が腫瘍遺伝子を発現するように導入することにより得られる。本発明の関係において、類似の形質転換された表現型(図3)が、2つの場合に得られる。PC12細胞は、比較的非接着性の球形から、良好な接着能力を示す偽神経突起を有する伸長された形状に変化する(Califano Dら, PNAS, 1996, 93, 7933〜7937)。
有利には、上記の条件は、まさにその未来の使用、すなわちインビボの条件下で実際に有効な、病理の分子的決定因子(又はマーカー)に対するリガンド又はアプタマを同定することを可能にする。
上記のような活性化されたか又はされていない形のRet受容体のヒト型を発現する細胞に特異的なアプタマの同定は、上記のCTe細胞に対する生物活性を評価することにあるさらなる工程(j)含むのが有利である。
(a) Ret受容体の自己リン酸化の阻害又は活性化、
(b) Erkキナーゼ活性化カスケードの阻害又は活性化(Erkはカスケード中でRetの下流の細胞内タンパク質である)、
(c) GDNFで活性化されたPC12細胞の正常なRet受容体のリン酸化の阻害、及びそれと関連する表現型の復帰、
(d) 腫瘍遺伝子を過剰発現するRPTK (RetC634Y)の活性化に関連する表現型の復帰。
R1-R-R2 (I)
(式中:
R1は、5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAA 3' (配列番号1)又は該配列番号1の1〜23ヌクレオチドの断片を表し;
R2は、5' AACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号2)又は該配列番号2の1〜24ヌクレオチドの断片を表し;かつ
Rは、10〜1000ヌクレオチド、好ましくは50ヌクレオチドのランダム配列を表す)
のアプタマからなる群より選択される。
- センスプライマ(プライマP10):
TAATACGACTCACTATAGGGAGACAAGAATAAACGCTCAA (配列番号16);
- アンチセンスプライマ(プライマP30):
TCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGTT (配列番号17)。
5'R4X6X5X4X3GGAAUAGX2X1R3X'1X'2CGUAUACX'3X'4X'5X'6R5 3' (II)
(この二次構造は、図10に示され、式中:
- プリンのリボースが2'位にOH基を有し、ピリミジンのリボースが2'位にフッ素原子を有し、
- R3は存在するか又は存在せずに、
・ C6〜C30アルキル基又はC6〜C30アリール基からなる群より選択される直鎖状又は分枝鎖状の炭素鎖;
・ ポリマー、例えばPEG又はPEIなど;
・ 官能基、例えばビオチン、ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼなど;
・ 興味対象のその他の分子、例えば有効成分、標識タグ、特に蛍光タグ又は放射性同位体のキレート化剤;
・ 天然(DNA又はRNA)又は修飾ヌクレオチド配列(例えば2'-フルオロ、2'-O-メチル、PNA、LNAなど)
を含む頂端部のバルジ(又はループ)を表し;好ましくは、R3は、次のバルジ又はループ(1)〜(4):
ループ(1):5' UGGAAGGA 3' (配列番号29)
ループ(2):5' CUUUUUU 3' (配列番号30)
ループ(3):5' GNPuA 3'
ループ(4):5' UNCG 3'
を表し、ここでプリンのリボースは2'位の炭素上にヒドロキシル官能基を有し、ピリミジンのリボースが2'位の炭素上にフッ素原子を有し;
X1-X'1がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X2-X'2がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X3-X'3がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X4-X'4がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X5-X'5がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X6-X'6がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当して
Py又はPuを表し、
NはG又はC又はA又はUに相当し、
Puは、リボースが2'位にOH基を有するG又はAに相当し(天然のRNA化学)、
Pyは、リボースが2'位にフッ素原子を有するU又はCに相当し、
- R4及びR5は存在するか又は存在せずに、
・ 1〜数千ヌクレオチド、好ましくは1〜39ヌクレオチドを含む天然(DNA又はRNA)又は修飾ヌクレオチド配列(例えば2'-フルオロ、2'-O-メチル、PNA、LNAなど);該ヌクレオチド配列の一部分又は該配列は、好ましくは、次の配列:
R4:
5'-R1-Z1-3'、ここでZ1=G:
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAG 3' (配列番号18)又は
5'-R1-Z1-3'、ここでZ1=GCGGUAU (配列番号26):
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAGCGGUAU (配列番号19)、及び
R5:
5'-Z2-R2-3'、ここでZ2=CAAUCCAGGGCAACG (配列番号27):
5' CAAUCCAGGGCAACGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号20)又は
5'-Z2-R2-3'、ここでZ2=ACCGCAGCG (配列番号28):
5' ACCGCAGCGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号21)、
の1つを含む
・ ポリマー、例えばPEG又はPEIなど;
・ 官能基、例えばビオチン、ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼなど;
・ 興味対象のその他の分子、例えば有効成分、標識タグ、特に蛍光タグ又は放射性同位体のキレート化剤
を表す)。
R3、R4及びR5が存在しない式IIの構造は、RetC634Y受容体への結合に充分であるが、R3、R4及びR5が存在する式IIの構造は、結合特性のみ又は結合特性と阻害特性との両方のいずれかを示す。これらの特性は、R3、R4及びR5の関数として変動する:
- R3が5' UGGAAGGA 3' (配列番号29:ループ(1))を表し、R4が配列番号18を表しかつR5が配列番号20を表すときに、そのような構造を示すアプタマ(ファミリーD4)は、活性化された形のRet受容体に結合する特性と、該受容体の活性の阻害の特性との両方を有する。この物質の二次構造を図11に示す。これは、R4及びR5がRet受容体の活性の阻害をもたらす充分な数のヌクレオチドを含むファミリーD4の物質を含む。この定義に対応する好ましいアプタマは、5'から3'に、連続して以下の配列を含む:式Iに関して、配列番号1+配列番号3+配列番号2 (配列番号22) (D4:図5A及び図11)。
図5A及び10〜12は、2つの式(I及びII)の間の連結を示す。
- 診断試薬として:インビトロ(診断キット;組織学的マーカー;チップ)及びインビボ(造影剤;放射性医薬品)の両方において。実際に、活性化されたか又はされていない形のRet受容体に特異的に結合する能力を有する本発明によるアプタマは、該受容体を活性化されたか又はされていない形で発現する細胞の検出に適切である。特に、Ret受容体がその細胞外ドメインにおいて変異している場合、上記のアプタマは該受容体を発現する異常細胞の検出に特に適切である。活性化された形の受容体が変異していない場合、タンパク質発現レベルの違いが追跡される。
- 選択されたアプタマのいくつかは、結合活性のみを有し、診断試薬として好ましく用いられる;
- 選択されたその他のアプタマも、細胞外ドメインのシステインで特に変異したヒトRet腫瘍遺伝子により媒介される発癌性の変換(transformation)についての阻害活性、及びそれ自体のリガンド(ファミリーD4又は化学修飾により式IIに由来する配列)による刺激の後の正常Retタンパク質の活性についての阻害効果を示す。このような活性を示すアプタマは、診断試薬又は薬剤のいずれかとして用いることができる。これらの特性決定のために、以下に記載される4種の試験を有利に行うことができる:
(a) Retの自己リン酸化の阻害又は活性化、
(b) Erkキナーゼ活性化カスケードの阻害又は活性化、ErkはカスケードにおいてRetの下流の細胞内タンパク質である、
(c) GDNFにより活性化されたRetリン酸化の阻害、
(d) Ret (特にRetC634Y)の活性化に関連する表現型の復帰。
上記の試薬の有利な実施形態によると、これは、上記で規定するような式II:
5'R4X6X5X4X3GGAAUAGX2X1R3X'1X'2CGUAUACX'3X'4X'5X'6R53'
(式中、R3、R4及びR5は存在しない)
のアプタマに対応する。
5'GUAGGGAAUAGCACGUAUACCUAC3'(配列番号24),
(ここで、X1-X'1 = A-U、X2-X'2 = C-G X3-X'3 = G-C、X4-X'4 = A-U、X5-X'5 = U-A及びX6-X'6 = G-C)
のアプタマに相当する。
上記の薬剤の有利な実施形態によると、これは、上記で規定するアプタマファミリーD4のアプタマに相当する。
- 細胞外ドメインにおいて変異したRPTK受容体、特に例えば細胞外ドメインに位置するシステイン(コドン609、611、618、620及び634)の1つで変異したRet受容体に結合する能力と、この変異された受容体についての阻害作用との両方を有する上記で規定されるアプタマ、
- 別の抗癌性分子、及び
- 少なくとも1つの医薬的に許容される媒体(vehicle)
を含むことを特徴とする医薬組成物でもある。
- 活性化されたか又はされていない形のRPTKを発現する細胞を、試験すべき物質と接触させ、
- 適切な条件下で、上記で規定する任意に標識されたアプタマを、試験すべき物質の前、同時又はその後に加え、そして
- アプタマと試験すべき物質との間の競合的結合を評価する(例えば放射活性、蛍光、発光、表面プラズモン共鳴、BRET、FRETの測定又は分子相互作用を明らかにするいずれのその他の方法により)
ことを含むことを特徴とする。
- 図1:PC12 MEN 2A細胞に特異的なアプタマの選択の概略。
・工程a)及びb):対抗選択
2'-F-Py RNAのコンビナトリアルライブラリを、懸濁液中の野生型PC12細胞(PC12 wt)とインキュベートする。結合しない配列を遠心分離により回収し、PC12 MEN 2B細胞とインキュベートする。上清に存在する結合しない配列を回収して、PC12 MEN 2A細胞とインキュベートする。
結合しない配列を、細胞の数回の洗浄により除き、結合した配列をフェノール抽出により回収する。
・工程d)及びe):増幅
選択された配列を、さらなる選択サイクルの前に、RT-PCR及びインビトロ転写により増幅する。
- 図3:ヒト変異受容体RetC634Y (PC12 MEN 2A)又は変異受容体RetM918T (PC12/EN 2B)をコードする配列を含む発現ベクターで安定にトランスフェクションされたPC12細胞の表現型の図。
- 図5 (A):D4及びD24アプタマの二次構造の予測の比較。二次構造予測は、David H. Mathewsにより作製されたRNAstructureソフトウェアhttp://rna.chem.rochester.edu.を用いて行う。アルゴリズムは、D.H. Mathewsら(Journal of Molecular Biology, 1999, 288, 911〜940, 上記)に記載されるサーチに基づく。
同じ予測は、http://bioinfo.math.rpi.edu/~zukerm/サイトで入手可能なmfoldアルゴリズムを用いて得ることもできる。後者のアルゴリズムは、上記のD.H. Mathewsらの名での文献に記載されるサーチに基づく。コンセンサス構造を太字で示す。(B):D4アプタマのPC12 MEN 2A細胞との結合曲線。D4アプタマは32Pで放射性標識され、細胞単層と種々の濃度でインキュベートする。数回の洗浄の後に、結合したアプタマを定量する。得られた各ポイントについて、スクランブル配列(すなわち同じヌクレオチドを異なる順序で含む)を有する変性した(destructured) D4アプタマ(D4Sc)を用いて得られた値を減ずることにより、バックグラウンドノイズを考慮に入れる。Scatchard分析(挿入)を用いて、結合定数及び標的の数を評価する。
2'-F-Py RNAを得るために、3つの方法により得られる二本鎖DNA鋳型からのインビトロ転写を行うことが必要である:
1. 選択前に、DNA配列のPCR増幅による方法:
B2S0: 5'TCCTGTTGTGAGCCTCCTGTCGTT-N-TTGAGCGTTTATTCTTGTCTCCC3'
(ここで、Nは50ヌクレオチドのランダム配列を表す)
* ハイブリダイゼーション
* 変性
5'GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAA-R-AACGACAGGAGGCUCACAACAGGA3',
(ここで、Rは選択された2'-F-Py RNAの配列を表す)。
* ハイブリダイゼーション
* 変性
* ハイブリダイゼーション
* 変性
プラスミドは、配列:
を含む。
* 変性
PCR増幅されたDNAの2本鎖のうち1本が、二本鎖2'-F-Py RNAのインビトロ転写のための鋳型として働く。下線を引いた配列は、T7ファージRNAポリメラーゼプロモータの領域に相当する。
5'AACGACAGGAGGCUCACAACAGGA3' (R2=配列番号2)
プライマP10と同一の配列の一部分は、5'端にある:
5'GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAA3' (R1= 配列番号1)。
- 細胞培養及びイムノブロッティング分析
PC12細胞及び派生細胞系統の増殖条件は、D'Alessio A.ら(Endocrinology 2003; 144, 10, 4298〜4305)に記載された。
NIH/MEN2A及びNIH/MEN2B細胞は、RetC634Y及びRetM918Tについての発現ベクターで安定にトランスフェクションされたNIH 3T3細胞から得る。Ret活性に対する本発明によるアプタマの影響を評価するために、細胞(160000細胞/プレート3.5 cm)を2時間血清欠乏性にし、短い変性−復元工程の後に、図に記載の量(200 nM)のアプタマ又は最初のRNAのプールで処理した。
細胞抽出物及びイムノブロッティング分析は、Cerchia L.ら(Biochem. J. 2003, 372, 897〜903)に記載のようにして行う。
PC12-α1/wt細胞を、12ウェルを含む培養プレートに等しい密度で播種する。D4アプタマの細胞分化に対する影響を評価するために、細胞を、400 nMのD4アプタマ又は変性D4アプタマと6時間予備処理し、次いで50 ng/mlのGDNF及び最終濃度3μMの適切なアプタマとインキュベートする。GDNFでの24時間の刺激の後に、3μMのD4アプタマ又は変性D4アプタマを細胞に再び加え、刺激を48時間まで続行する。GDNFでの刺激の24時間及び48時間後に、位相差顕微鏡を用いて少なくとも15の視野をランダムに撮影し、フレームあたり50の細胞を計数する。突起の伸長の有無を記録する。細胞体の直径の2倍より大きい直径を有する伸長突起が観察される場合に、突起の伸長が存在するとみなす。
SELEXサイクルを、本質的に以前に記載されたようにして行う(Tuerk Cら, Science 1990, 249, 4968, 505〜510; Ellington ADら, Nature, 1990, 346, 6287, 818〜22)。収率を増大させるために、転写を、1 mMの2'-F-ピリミジン及びT7 RNAポリメラーゼの変異形(T7Y639F)の存在下で行う(Padilla, Rら, Nucleic Acids Res, 1999, 27, 6, 1561〜1563)。2'-F-Py RNAを用いるのは、血清ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの耐性のためである。
細胞表面を非特異的に認識するアプタマの選択を避けるために、最初のRNAのコンビナトリアルライブラリを、まず、5×106のPC12細胞(参照ECACC No. 88022)と37℃で30分間インキュベートし、結合しなかった配列を遠心分離により回収する。後者の配列を、次いで、細胞内ドメインにおいて変異したRet受容体(RetM918T)を発現する5×106の接着性PC12 MEN B2細胞とインキュベートし、結合しなかった配列を選択段階のために回収する。この工程は、細胞外ドメインにおいて変異したRet受容体(Ret9C634Y)を発現するPC12 MEN 2A細胞を特異的に認識する配列を選択することを可能にする。
15回の選択サイクルの後に、配列をTOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、配列決定により分析する。
種々のアプタマ (又はコントロールとしての始めのプール)の、PC12 MEN 2A細胞への結合を、5'-32P-標識したRNAを用いて24ウェルプレートで行う(実験は三重で行う)。ウェルあたり105細胞を、200μlのRPMI中の種々の濃度のアプタマと、非特異的競合剤である100μg/mlのポリイノシンの存在下に、37℃で10分間インキュベートする。数回の洗浄の後に、結合した配列を350μlの0.6% SDS中に回収し、回収された放射活性の量を、各ウェルでのタンパク質含量の測定により細胞数と関連づける。
* 次の等式によるScatchard分析:
[結合したアプタマ]/[アプタマ]= -(1/Kd)×[結合したアプタマ]+[Tmax]/Kd
又は
* 次の等式によるLineweaver-Burk法による分析:
1/[結合したアプタマ]=Kd/([Tmax]×[アプタマ])+1/[Tmax]
により決定する。
個々の配列の種々の細胞系統への結合は、50 nMの単一の濃度で、同じ条件下で行う。
- ex vivoでのSELEX:アプタマの選択
Ret受容体を認識するアプタマを同定するために、SELEX変更プロトコルを実施例1に記載のようにして行った。
- 方法は、ヒト変異受容体 RetC634Yを発現する無傷の細胞、すなわちPC12細胞由来の細胞系統(PC12 MEN 2A)について行う。
- 2'-F-ピリミジンRNAを用いて、生物学的流体中に存在するアプタマのヌクレアーゼ耐性を増大させる。
- 各サイクルで2回:(1) ヒトRet受容体を発現しないPC12細胞について、及び(2) Ret受容体の細胞内チロシンキナーゼドメインにおいて変異した(RetM918T)対立遺伝子を発現するPC12 MEN 2B細胞についての対抗選択工程を行って、Ret受容体に特異的なアプタマの選択を最適化する。
この技術は、組換えRet受容体の使用を避けるという利点を有する。
1回以上見出された全ての配列は、より少ない量で存在する配列(D4及びD24を含む)に加えて試験された。その豊富さにもかかわらず、D14は、PC12 MEN 2A細胞にバックグラウンドノイズを超えて顕著には結合しない。
その他の配列は、PC12 MEN 2A細胞に、30〜70 nMのKdで結合する。
ほとんどのアプタマは、親のPC12細胞、ラット膀胱癌腫細胞(NBTII)及びヒトHeLa細胞に結合しない。
正常細胞(Cn)の正常Ret受容体の活性化は、いくつかの栄養因子についてのGRF-α共通受容体との相互作用を介して起こり、該栄養因子の最も広まったものはGDNF (グリア由来成長因子)である(図4)。Retの正常形を発現する細胞において、カスケードはGDNFの存在下でのみ活性化される。D4の存在下でのこれらの細胞におけるGDNFによるRetのリン酸化の阻害は、D4がRetシグナリング経路と相互作用することの証明であり、このことは、Erkに対するその活性がRetにより媒介されない別の栄養因子であるNGFによる活性化に対するD4の活性が存在しないことを確かにする。D4が、変異が細胞内であるMEN 2B細胞におけるRet及びErkの活性化のいずれかに対するいずれの活性も有さないという事実は、D4とRetとの間の相互作用がRetの細胞外部分を巻き込み、二量体化部位であり得ることを示唆する。しかし、このことは証明されていない。
野生型(wt)又は変異の受容体の二量体化がシグナリング経路に必要である全ての場合に、阻害が起こるという知見は、二量体化がD4アプタマの作用の標的であることを示唆する。
この目的を持って、軸索伸長(又は神経堤)を、GDNFを用いる刺激後のPC12-α1/wt細胞における分化の反映として測定した(実施例1を参照されたい)。
PC12 MEN 2A細胞上のRet受容体又は該タンパク質と複合体を形成する標的と相互作用する分子をスクリーニングするためのD4アプタマの使用を確認するために、2つのアプローチを用いた。
1. 32Pで放射性標識したD4アプタマを50 nMで、細胞又は単離された組換えRetタンパク質のいずれかについて選択された種々のアプタマ400 nMの存在下に、PC12 MEN 2A細胞の単層とインキュベートした。数回の洗浄の後に、結合したD4アプタマの量を定量する。使用した分子の関数としてのD4アプタマの結合の量を比較することにより、その標的がRet受容体であるD12アプタマのみ、特にE38アプタマが、D4アプタマの細胞への結合を減少させることができたことに注目できる。よって、これらの2つのアプタマは、おそらくD4アプタマと同じ部位で該タンパク質に直接存在するか又はRetタンパク質との複合体に存在する別の標的に存在するいずれかのRetタンパク質に関連する標的に結合すると結論付けることができる。
Claims (36)
- 核酸混合物を用いて、細胞により活性化された形又は活性化されていない形で発現される膜受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(RPTK)に特異的なリガンド又はアプタマを同定する方法であって、少なくとも以下の工程:
(a) 核酸混合物を、前記受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現しないか又はそれを活性化されていない形で発現する細胞(CN細胞)と接触させ、前記細胞は、同じ受容体タンパク質−チロシンキナーゼを細胞外ドメインにおける変異の存在により活性化された形で発現する細胞(CTe細胞)と同じ細胞タイプであり;
(b) 工程(a)においてCN細胞に結合しない核酸の第一部分集合S1を回収し;
(c) 前記第一部分集合S1を、CTe細胞と同じ細胞タイプであるが細胞内部分において変異した前記受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現するCi細胞と接触させ、前記Ci細胞は、CTe細胞のものと同じタイプの表現型を示し;
(d) 工程(c)においてCi細胞に結合しない核酸の第二部分集合S2を回収し;
(e) 前記第二部分集合S2をCTe細胞と接触させ;
(f) 前記CTe細胞に結合する核酸、すなわち細胞外ドメインにおいて変異した前記受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現する細胞について高親和性を示すものを、細胞−核酸複合体の解離の後に回収し;
(g) 細胞外ドメインにおいて変異した前記受容体タンパク質−チロシンキナーゼを発現する細胞について高親和性を有する前記核酸を増幅して、前記CTe細胞について高親和性を有する核酸が富化された核酸混合物を得て;そして
(h) (g)で得られた混合物から、活性化された形で受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(RPTK)を発現する細胞に特異的なリガンド又はアプタマを同定する
を含む方法。 - 工程(a)〜(g)が、解離定数(Kd)により規定される親和性が測定できかつ医薬用途に適切な少なくとも1つのアプタマが得られるまで、前のサイクルからのリガンド又はアプタマが富化された混合物を用いて繰り返されることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 始めの核酸コンビナトリアルライブラリが、少なくとも102の核酸、好ましくは109〜1015の核酸を含み、かつ有利には、5'及び3'端にそれぞれPCR増幅のための固定配列、好ましくは配列番号1及び配列番号2の配列又はこれらの配列の少なくとも8ヌクレオチドの断片を含むランダム配列を含む核酸からなることを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記ランダム配列がそれぞれ、10〜1000ヌクレオチド、好ましくは50ヌクレオチドを含み、かつ有利にはDNA、RNA又は修飾核酸であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1つに記載の方法。
- 工程(h)によるCTe細胞に特異的なリガンド又はアプタマの同定が、該アプタマの前記CTe細胞についての生物活性の評価を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
- 有利には評価される前記生物活性が:
(a) RPTKの自己リン酸化の阻害又は活性化;
(b) キナーゼ活性化カスケードの阻害又は活性化;
(c) 適切な刺激により活性化されたCN細胞の正常なRPTKのリン酸化の阻害;及び
(d) RPTKの活性化に関連する表現型の復帰
であることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1つに記載の方法。 - 活性化された形又は活性化されていない形の受容体タンパク質−チロシンキナーゼ(RPTK)を発現する細胞に特異的であり、かつ請求項1〜6のいずれか1つに記載のアプタマを同定する方法により同定できるアプタマ。
- 以下の膜受容体:
EGFR (上皮成長因子受容体)、インスリンR (インスリン受容体)、PDGFR (血小板由来成長因子受容体)、VEGFR (血管内皮成長因子受容体)、FGFR (繊維芽成長因子受容体)、NGFR (神経成長因子受容体)、HGFR (肝細胞成長因子受容体)、EPHR (エフリン受容体)、AXL (Tyro 3 PTK)、TIE (内皮細胞のチロシンキナーゼ受容体)、RET (トランスフェクション時の再編成)、ROS (ある上皮細胞で発現されるRPTK)及びLTK (白血球チロシンキナーゼ)
からなる群より特に選択される活性化された形又は活性化されていない形の受容体タンパク質−チロシンキナーゼ (RPTK)を発現する細胞に特異的であることを特徴とする請求項7に記載のアプタマ。 - 活性化された形のRet受容体、特に、細胞外ドメインに位置するシステイン、好ましくは609、611、618、620又は634のコドンでの変異により活性化されたRet受容体を認識することを特徴とする請求項7又は8に記載のアプタマ。
- (a) 核酸の混合物を、活性化された形のいずれのRet受容体も発現しないCN細胞と接触させ;
(b) 工程(a)において、前記CN細胞に結合しない核酸の第一部分集合S1を回収し;
(c) 前記第一部分集合S1を、細胞内ドメインにおいて変異したRet受容体、特に変異受容体RetM918Tを発現するCi細胞と接触させ;
(d) 前記Ci細胞に結合しない核酸の第二部分集合S2を回収し;
(e) 第二部分集合S2を、細胞外ドメインにおける変異により活性化されたRet受容体を発現するCTe細胞と接触させ、該受容体は、細胞外ドメインに位置するシステインの1つ、好ましくはCys609、Cys611、Cys618、Cys620又はCys634に変異を有する変異Ret受容体、好ましくはRetC634Y受容体からなる群より選択され;
(f) 前記CTe細胞に結合する核酸、すなわち工程(e)で規定される変異Ret受容体を発現する細胞について高い親和性及び結合特性の両方を示す核酸を回収し;
(g) 工程(f)で得られた前記核酸を増幅して、CTe細胞について高親和性を有する核酸が富化された核酸混合物を得て;
(h) 工程(a)〜(g)を、解離定数(Kd)で規定されるCTe細胞に対するその親和性が測定可能でありかつ薬理活性に適切な少なくとも1つのアプタマが得られるまで繰り返し;
(i) (h)で得られた混合物から選択される、活性化された形のRet受容体を発現する細胞に特異的なアプタマを同定する
ことを含む方法により同定できることを特徴とする請求項9に記載のアプタマ。 - - 前記CN細胞が、特に、野生型PC12細胞(参照ECACC番号88022)又は野生型NIH 3T3細胞(参照ECACC番号93061524)であり、
- 前記Ci及びCTe細胞が、それぞれ細胞内及び細胞外に変異を有する腫瘍遺伝子を、培養にあるCN細胞に、後者が腫瘍遺伝子を発現するように導入することにより得られる
ことを特徴とする請求項10に記載のアプタマ。 - 請求項1〜11で規定される同定の方法により得ることができ、かつ式(I):
R1-R-R2 (I)
(式中:
R1は、5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAA 3' (配列番号1)又は前記配列番号1の1〜23ヌクレオチドの断片を表し;
R2は、5' AACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号2)又は前記配列番号2の1〜24ヌクレオチドの断片を表し;そして
Rは、10〜1000ヌクレオチド、好ましくは50ヌクレオチドのランダム配列を表す)
のアプタマからなる群より選択されることを特徴とするアプタマ。 - Rが、以下の配列:
- プリンのリボースが2'位の炭素上にヒドロキシル官能基を有し、ピリミジンのリボースが2'位の炭素上にフッ素原子を有することを特徴とする請求項12又は13に記載のアプタマ。
- 次の配列:配列番号31〜33の1つを有することを特徴とする請求項12〜14のいずれか1つに記載のアプタマ。
- 二次構造が図10に示される、次の式(II):
5'R4X6X5X4X3GGAAUAGX2X1R3X'1X'2CGUAUACX'3X'4X'5X'6R53' (II)
(式中:
- プリンのリボースが2'位にOH基を有し、ピリミジンのリボースが2'位にフッ素原子を有し、
- R3は存在するか又は存在せずに、
・ C6〜C30アルキル基又はC6〜C30アリール基からなる群より選択される直鎖状又は分枝鎖状の炭素鎖;
・ ポリマー、例えばPEG又はPEIなど;
・ 官能基、例えばビオチン、ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼ;
・ 興味対象のその他の分子、例えば有効成分、標識タグ、特に蛍光タグ又は放射性同位体のキレート化剤;
・ 天然又は修飾ヌクレオチド配列
を含む頂端部のバルジ(又はループ)を表し;
好ましくは、R3は、次のバルジ又はループ(1)〜(4):
ループ(1):5' UGGAAGGA 3' (配列番号29)
ループ(2):5' CUUUUUU 3' (配列番号30)
ループ(3):5' GNPuA 3'
ループ(4):5' UNCG 3'
を表し、ここでプリンのリボースは2'位の炭素上にヒドロキシル官能基を有し、ピリミジンのリボースは2'位の炭素上にフッ素原子を有し;
- X1、X'1、X2、X'2、X3、X'3、X4、X'4、X5、X'5、X6及びX'6は、好ましくは
X1-X'1がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X2-X'2がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X3-X'3がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X4-X'4がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X5-X'5がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当し、
X6-X'6がC-G、A-U、G-C又はU-Aに相当して
Py又はPuを表し、
NはG又はC又はA又はUに相当し、
Puは、リボースが2'位にOH基を有するG又はAに相当し、
Pyは、リボースが2'位にフッ素原子を有するU又はCに相当し、
- R4及びR5は存在するか又は存在せずに、
・ 1〜数千ヌクレオチド、好ましくは1〜39ヌクレオチドを含む天然又は修飾ヌクレオチド配列;該ヌクレオチド配列の一部分又は該配列は、好ましくは、次の配列:
R4:
5'-R1-Z1-3'(ここでZ1=G):
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAG 3' (配列番号18)又は
5'-R1-Z1-3'(ここでZ1=GCGGUAU (配列番号26)):
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAGCGGUAU (配列番号19)、及び
R5:
5'-Z2-R2-3'(ここでZ2=CAAUCCAGGGCAACG (配列番号27)):
5' CAAUCCAGGGCAACGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号20)又は
5'-Z2-R2-3'(ここでZ2=ACCGCAGCG (配列番号28)):
5' ACCGCAGCGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号21)、
R4について
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAG 3' (配列番号18)又は
5' GGGAGACAAGAAUAAACGCUCAAGCGGUAU (配列番号19)、及び
R5について
5' CAAUCCAGGGCAACGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号 20)又は
5' ACCGCAGCGAACGACAGGAGGCUCACAACAGGA 3' (配列番号21)
の1つを含む
・ C6〜C30アルキル基又はC6〜C30アリール基からなる群より選択される直鎖状又は分枝鎖状の炭素鎖;
・ ポリマー、例えばPEG又はPEIなど;
・ 官能基、例えばビオチン、ストレプトアビジン、ペルオキシダーゼ;
・ 興味対象のその他の分子、例えば有効成分、標識タグ、特に蛍光タグ又は放射性同位体のキレート化剤
を表す)
を有することを特徴とする請求項12〜14のいずれか1つに記載のアプタマ。 - R3が5' UGGAAGGA 3' (ループ(1))を表し、R4が配列番号18を表し、R5が配列番号20を表し、そのような構造を示すアプタマ(ファミリーD4)が、前記Ret受容体に結合する特性と前記受容体の活性を阻害する特性との両方を有することを特徴とする請求項16に記載のアプタマ。
- 配列番号22の配列を有することを特徴とする請求項17に記載のアプタマ。
- R3が5' CUUUUUU 3' (ループ(2))、5' GNPuA 3' (ループ(3))又は5' UNCG 3' (ループ(4))を表し、R4が配列番号19から選択される1〜30ヌクレオチド、又は配列番号18から選択される1〜24ヌクレオチドを含み、R5が配列番号21から選択される1〜33ヌクレオチド、又は配列番号20から選択される1〜39ヌクレオチドを含み、そのような構造を示すアプタマが、活性化された形又は活性化されていない形の前記Ret受容体、特に細胞外ドメインにおいて変異したRet受容体に結合する特性のみを有することを特徴とする請求項16に記載のアプタマ。
- R3が5' CUUUUUU 3' (ループ(2))を表し、R4が配列番号19を表し、R5が配列番号21を表すことを特徴とする請求項19に記載のアプタマ。
- 配列番号25を有することを特徴とする請求項19又は20に記載のアプタマ。
- R3が5' UGGAAGGA 3' (ループ(1))を表し、R4及びR5が存在せず、このような構造を示すアプタマが活性化された形又は活性化されていない形の前記Ret受容体に結合する特性のみを有し、配列番号23の配列を有することを特徴とする請求項16に記載のアプタマ。
- 請求項12〜22のいずれか1つに記載のアプタマからなることを特徴とする腫瘍の診断試薬。
- 式(II):
5'R4X6X5X4X3GGAAUAGX2X1R3X'1X'2CGUAUACX'3X'4X'5X'6R53'
(式中、R3、R4及びR5は存在しない)
のアプタマに相当することを特徴とする請求項23に記載の試薬。 - 配列:
5' GUAGGGAAUAGCACGUAUACCUAC 3' (配列番号24)
のアプタマに相当することを特徴とする請求項24に記載の試薬。 - 式(II)のアプタマ(ここで、R3は5' CUUUUUU 3'を表す)に相当し、配列番号25の配列に相当することを特徴とする請求項23に記載の試薬。
- 請求項12〜22のいずれか1つに記載の少なくとも1つのアプタマからなることを特徴とする、活性化された形又は活性化されていない形のRet受容体の診断又は検出試薬。
- RPTK受容体に結合する能力と活性化された形の前記受容体についての阻害活性との両方を有する請求項7〜22のいずれか1つに記載のアプタマを含むことを特徴とする薬剤。
- 活性化されたRPTK受容体、特に細胞外ドメインにおいて変異した受容体、特に細胞外ドメインに位置するシステイン(コドン609、611、618、620及び634)の1つで変異したRet受容体に結合する能力と、この変異した受容体についての阻害作用との両方を有する請求項7〜22のいずれか1つに記載のアプタマを含むことを特徴とする、腫瘍の治療用の薬剤。
- 請求項13、16又は17で規定されるアプタマファミリーD4のアプタマに相当することを特徴とする請求項28又は29に記載の薬剤。
- RPTK受容体に結合する能力と活性化された形の前記受容体についての阻害作用との両方を有する請求項7〜22のいずれか1つに記載のアプタマを含むことを特徴とする医薬組成物。
- - 活性化されたRPTK受容体、特に細胞外ドメインにおいて変異した受容体、特に細胞外ドメインに位置するシステイン(コドン609、611、618、620及び634)の1つで変異したRet受容体に結合する能力と、この変異した受容体についての阻害作用との両方を有する請求項7〜22のいずれか1つに記載のアプタマ、
- 別の抗癌性分子、及び
- 少なくとも1つの医薬的に許容される媒体
を含むことを特徴とする医薬組成物。 - RPTK受容体に結合する能力とこのRPTK受容体についての阻害作用との両方を有するアプタマの、RPTK受容体と相互作用しかつこれを阻害し得るか又はできない物質をスクリーニングするための使用。
- 活性化されたRPTK受容体、特に細胞外ドメインに位置するシステイン(コドン609、611、618、620及び634)の1つで変異したRet受容体に結合する能力と、この活性化されたRPTK受容体についての阻害作用との両方を有するアプタマの、該RPTK受容体と相互作用する物質をスクリーニングするための使用。
- RPTK受容体又は活性化された形若しくは活性化されていない形の該RPTKとの複合体を形成する標的と相互作用する物質をスクリーニングする方法であって:
- 活性化された形又は活性化されていない形のRPTKを発現する細胞を、試験すべき物質と接触させ、
- 適切な条件下で、請求項7〜22のいずれか1つに記載のアプタマを、試験すべき物質の前、同時又は後に加え、
- (例えば、放射活性、蛍光、発光、表面プラズモン共鳴、BRET、FRET又は分子相互作用を明らかにするいずれのその他の方法により)該アプタマと試験すべき分子との競合的結合を評価する
ことを含むことを特徴とする方法。 - RPTKを示す細胞にアプタマと競合的に結合する物質を同定した後に、該細胞の生物活性に対するこれらの物質の影響を、RPTKを示す細胞の前記生物活性を阻害又は活性化する物質を見つけるために評価できることを特徴とする請求項35に記載の方法。
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