CN104402998A - 分离的抗体 - Google Patents

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阿龙·肯·萨拓
刘远程
莫林·菲奇·布鲁恩斯
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Abstract

本发明涉及一种分离的抗体。

Description

分离的抗体
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/US2009/003994，中国国家申请号为200980126470.X，申请日为2009年7月8日，发明名称为“Notch结合剂和拮抗剂及其应用方法”。
技术领域
本发明涉及包含结合人类Notch受体的试剂的组合物和使用所述组合物来治疗癌和其它疾病的方法。更具体而言，本发明提供了例如与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合，并抑制肿瘤生长的抗体。本发明还提供了癌的治疗方法，所述方法包括施用治疗有效量的抗体，所述抗体与人类Notch受体蛋白的胞外域的非配体结合区特异性结合，并抑制肿瘤生长。
背景技术
Notch信号传导途径是胚胎模式形成、胚后组织维持和干细胞生物学的几种关键调节方式之一。更特别的是，Notch信号传导参与相邻细胞命运之间的侧抑制过程，并且在不对称细胞分裂其间在细胞命运确定中起重要作用。失调的Notch信号传导与许多人类癌有关，在这些癌中Notch信号传导可以改变肿瘤细胞的发育命运，将其维持在未分化的增殖状态(Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69)。因此，由于篡夺控制着正常发育和由干细胞群进行的组织修复的体内平衡机制，可以导致癌形成(Beachy等，2004，Nature 432：324)。
Notch受体首先在果蝇突变体中鉴定出，所述果蝇突变体患有单倍不足，导致翅缘处的缺刻，而功能丧失型产生胚胎致死“神经性”表型，该表型中表皮的细胞命运转变成神经组织(Moohr，1919，Genet.4：252；Poulson，1937，PNAS 23：133；Poulson，1940，J.Exp.Zool.83：271)。Notch受体是单跨膜的跨膜受体，在大胞外域中含有许多串联的表皮生长因子(EGF)-样重复和三个富含半胱氨酸的Notch/LIN-12重复(Wharton等，1985，Cell 43：567；Kidd等，1986，Mol.Cell.Biol.6：3094；Artavanis等的综述，1999，Science 284：770)。已经鉴定出4种哺乳动物Notch蛋白(Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)，这些受体中的突变总是导致发育异常和人类病变，所述发育异常和人类病变包括如以下详细说明的几种癌症(Gridley，1997，Mol.CellNeurosci.9：103；Joutel&Tournier-Lasserve，1998，Semin.Cell Dev.Biol.9：619-25)。
Notch受体受Delta,Serrated,Lag-2(DSL)家族的单次跨膜配体激活。哺乳动物中存在5种已知的Notch配体：Delta-样1(DLLl)、Delta-样3(DLL3)、Delta-样4(DLL4)、Jagged 1(JAG1)和Jagged 2(JAG2)，其特征在于DSL域和在胞外域内的串联的EGF-样重复。Notch受体的胞外域与通常位于相邻细胞上的其配体的胞外域相互作用，导致Notch的2个蛋白水解切割，一个由ADAM(A Disintegrin And Metallopeptidase,解整合素-金属肽酶)蛋白酶介导的胞外切割和一个由γ分泌酶介导的跨膜域内的切割。后一切割产生Notch胞内域(ICD)，该Notch胞内域然后进入细胞核，在细胞核中其激活CBF1,Suppressor of Hairless[Su(H)],Lag-2(CSL)家族的转录因子，上述家族的转录因子作为主要下游效应子增加Hairy和Split增强子[E(spl)]家族的细胞核碱性螺旋-环-螺旋转录因子的转录(Artavanis等，1999，Science 284：770；Brennan和Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69；Iso等，2003，Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.23：543)。哺乳动物中还可以存在涉及果蝇中鉴定出的胞质蛋白Deltex的替代性细胞内途径(Martinez等，2002，Curr.Opin.Genet.Dev.12：524-33)，并且该Deltex-依赖性途径可以起到抑制Wnt靶基因表达的作用(Brennan等，1999，Curr.Biol.9：707-710；Lawrence等，2001，Curr.Biol.11：375-85)。
哺乳动物Notch受体经过切割以形成成熟受体，然后进行配体结合从而激活下游的信号传导。成熟期间弗林(furin)-样蛋白酶切割Notch受体，从而产生近膜异二聚体，该近膜异二聚体包含结合在一起处于自身抑制状态的非共价连接的胞外亚基和跨膜亚基。配体结合解除了这种抑制并且诱导Notch受体被ADAM-型金属蛋白酶和γ-分泌酶切割，其中γ-分泌酶将胞内域(ICD)释放到细胞质中，使得其易位到细胞核从而激活基因转录。ADAM进行的切割发生在位于近膜负调节区内的非配体结合切割域内。
造血干细胞(HSC)是体内了解最清楚的干细胞，并且Notch信号传导涉及其正常维持以及白血病转化(Kopper&Hajdu，2004，Pathol.Oncol.Res.10：69-73)。HSC是稀少的细胞群体，存在于成体骨髓内的间质小生境(stromal niche)中。这些细胞的特征在于独特的基因表达图谱和连续产生更加分化的祖细胞以重建整个造血系统的能力。HSC和祖细胞中的Notch1信号传导的组成型激活在体外和在长期重建测试中建立了同时产生淋巴样细胞和骨髓细胞的永生化细胞系(Varnum-Finney等，2000，Nat.Med.6：1278-81)，并且Jagged1的存在增加了HSC富集的人类骨髓细胞群的移植(Karanu等，2000，J.Exp.Med.192：1365-72)。最近，已经在体内于HSC中证明了Notch信号传导，并且其显示参与抑制HSC分化。另外，Notch信号传导似乎是Wnt-介导的HSC自我更新所需要的(Duncan等，2005，Nat.Immunol.6：314)。
Notch信号传导途径还在神经干细胞的维持中起关键作用，并且涉及其正常维持和脑癌(Kopper&Hajdu，2004，Pathol.Oncol.Res.10：69-73；Purow等，2005，CancerRes.65：2353-63；Hallahan等，2004，Cancer Res.64：7794-800)。神经干细胞在发育期间产生哺乳动物神经系统中的所有神经元细胞和神经胶质细胞，并且最近已经在成体脑中得到鉴定(Gage，2000，Science 287：1433-8)。Notch1缺陷型小鼠、Notch靶基因Hes1、3和5缺陷型小鼠；和Notch信号传导早衰蛋白1(PSl)的调节子缺陷型小鼠显示胚胎神经干细胞数量减少。另外，在PSl杂合小鼠脑中成体神经干细胞减少(Nakamura等，2000，J.Neurosci.20：283-93；Hitoshi等，2002，Genes Dev.16：846-58)。神经干细胞的减少似乎是由于其过早分化成神经元(Hatakeyama等，2004，Dev.131：5539-50)，表明Notch信号传导调节神经干细胞分化和自我更新。
异常Notch信号传导涉及许多人类癌。人类中的Notch1基因首次在T-细胞急性淋巴母细胞白血病亚类中鉴定为可导致Notch途径激活的易位的基因座(Ellisen等，1991，Cell 66：649-61)。小鼠模型中T细胞内的Notch1信号传导的组成型激活类似地产生T-细胞淋巴瘤，表明了发病原因(Robey等，1996，Cell 87：483-92；Pear等，1996，J.Exp.Med.183：2283-91；Yan等，2001，Blood 98：3793-9；Bellavia等，2000，EMBO J.19：3337-48)。还已经发现，产生异常Notch1信号传导的Notch1点突变、插入和缺失经常存在于儿童和成体T细胞急性淋巴母细胞白血病/淋巴瘤中(Pear&Aster，2004，Curr.Opin.Hematol.11：416-33)。
小鼠乳腺瘤病毒在乳腺瘤的Notch1和Notch4基因座中的频繁插入以及所导致的活化Notch蛋白片段首先涉及乳癌中的Notch信号传导(Gallahan&Callahan，1987，J.Virol.61：66-74；Brennan&Brown，2003，Breast Cancer Res.5：69，Politi等，2004，Semin Cancer Biol.14：341-7)。转基因小鼠中的进一步研究已经确认了Notch在正常乳腺发育期间的导管分支(ductal branching)中的作用，并且在乳房上皮细胞中Notch4的组成型激活形式抑制上皮分化和导致肿瘤发生(Jhappan等，1992，Genes&Dev.6345-5；Gallahan等，1996，Cancer Res.56：1775-85，Smith等，1995，Cell Growth Differ.6：563-77，Soriano等，2000，Int.J.Cancer 86：652-9，Uyttendaele等，1998，Dev.Biol.196：204-17；Politi等，2004，Semin.Cancer Biol.14：341-7)。表明Notch受体在乳癌中的表达及其与临床结果的关联性的数据Notch在人类乳癌中的作用提供了证据(Weijzen等，2002，Nat.Med.8：979-86，Parr等，2004，Int.J.Mol.Med.14：779-86)。另外，在宫颈癌(Zagouras等，1995，PNAS 92：6414-8)、肾细胞癌(Rae等，2000，Int.J.Cancer 88：726-32)、头颈鳞状细胞癌(Leethanakul等，2000，Oncogene 19：3220-4)、子宫内膜癌(Suzuki等，2000，Int.J.Oncol.17：1131-9)和神经母细胞瘤(vanLimpt等，2000，Med.Pediatr.Oncol.35：554-8)中已经观察到Notch途径的过表达，表明Notch在许多赘生物的发生中具有潜在作用。令人感兴趣的是，Notch信号传导可能在结肠的Ape-突变赘生性细胞的未分化状态的维持中起作用(van Es&Clevers，2005，Trends in Mol.Med.11：496-502)。
Notch途径还涉及血管发育的多个方面，包括增殖、迁移、平滑肌分化、血管发生和动脉-静脉分化(Iso等，2003，Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.23：543)。例如，在动脉发育和卵黄囊血管形成中，Notch1/4和Jaggedl的纯合型无效突变以及DLL4的杂合丧失导致严重但是可变的缺陷。另外，DLLl–缺陷和Notch2-减效小鼠胚胎显示出血，这可能是由于血管结构的不良发育(Gale等，2004，PNAS，101：15949-54；Krebs等，2000，Genes Dev.14：1343-52；Xue等，1999，Hum.Mel.Genet.8：723-30；Hrabe de Angelis等，1997，Nature 386：717-21；McCright等，2001，Dev.128：491-502)。人类中，Jagged l的突变与阿拉吉耶综合征(Alagille syndrome,一种包括血管缺陷的发育障碍)相关，Notch 3的突变是遗传性血管性痴呆(Cadasil)(其中血管体内平衡有缺陷)的原因(Joutel等，1996，Nature 383：707-10)。
之前已经报道了抗Notch抗体及其作为抗癌治疗剂的可能应用。例如参见美国专利申请公开第2008/0131434号，本文通过参考并入其全部内容。还参见国际申请公开WO 2008/057144和WO 2008/076960，以及美国专利申请公开第2008/0226621、2008/0118520和2008/0131908号。
发明内容
本发明提供了新型Notch结合剂和一种或多种人类Notch受体的新型拮抗剂，以及使用所述试剂和拮抗剂的方法。本发明还提供新型多肽，例如结合一种或多种人类Notch受体的抗体，所述抗体的片段，和与所述抗体相关的其它多肽。在特定实施方式中，本发明提供人类Notch2和/或人类Notch3的拮抗剂，包括但不限于，特异性结合人类Notch2和/或人类Notch3的抗体。如本文所用，短语“Notch2和/或Notch3”表示“Notch2”、“Notch3”或“Notch2和Notch3二者”。在特定实施方式中，所述抗体或其它拮抗剂与在配体结合域(例如，Notch2的EGF10或Notch3的EGF9)外的Notch受体的区域结合。在特定实施方式中，所述抗体特异性结合人类Notch2。在特定实施方式中，所述抗体特异性结合人类Notch2和人类Notch3。在某些实施方式中，所述抗体特异性结合人类Notch3。还提供了包含编码所述多肽的核酸序列的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的载体。还提供包含本发明多肽和/或多核苷酸的细胞。还提供包含所述新型Notch拮抗剂的组合物(例如，药物组合物)。还提供使用所述试剂和拮抗剂的方法，例如使用所述Notch拮抗剂来抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性、抑制血管发生、和/或治疗癌或其它与血管发生相关的疾病的方法。
在一方面，本发明提供与一种或多种人类Notch受体的EGF10域(或EGF10域的等效物)特异性结合的试剂(例如，抗体)。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。在特定实施方式中，所述试剂与人类Notch2的EGF10和/或人类Notch3的EGF9特异性结合。EGF9是人类Notch3内的EGF，其对应于其它人类Notch受体Notch1、Notch2和Notch4中的EGF10。在某些实施方式中，所述试剂与Notch 2的EGF10特异性结合。在某些实施方式中，所述试剂可与Notch2的EGF10特异性结合，并且可与Notch 3的EGF9特异性结合。在某些实施方式中，所述试剂与Notch3的EGF9特异性结合。在其它实施方式中，所述试剂与位于Notch2EGF10内的序列HKGAL(SEQ ID NO：28)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述试剂与位于Notch3EGF9内的序列HEDAI(SEQ ID NO：29)的至少一部分结合。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式的每一特定实施方式中，所述试剂抑制配体与人类Notch2和/或Notch3的结合。在某些实施方式中，所述试剂抑制配体与人类Notch2的结合。在某些实施方式中，所述试剂抑制配体与Notch2和Notch3的结合。在其他实施方式中，所述试剂抑制配体与Notch3的结合。在特定实施方式中，所述配体是DLL4、JAG1或JAG2。在其它实施方式中，所述试剂抑制人类Notch2和/或Notch3的信号传导。在某些实施方式中，所述试剂抑制人类Notch2的信号传导。在某些实施方式中，所述试剂抑制Notch2和Notch3的信号传导。在其它实施方式中，所述试剂抑制Notch3的信号传导。在某些实施方式中通过DLL4、JAG1或JAG2诱导Notch2和/或Notch3信号传导。还提供包含所述试剂的药物组合物，和将上述试剂用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另一方面，本发明提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有SIFYTT(SEQ IDNO：51)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有SIFYTT(SEQ ID NO：51)的重链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将所述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另一方面，本发明提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有GIFFAI(SEQ IDNO：7)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在特定实施方式中，所述抗体特异性结合Notch2。在某些实施方式中，所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有GIFFAI(SEQ ID NO：7)的重链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有GASSRAT(SEQ IDNO：9)的轻链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将所述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在其它方面，本发明提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有(G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N)(SEQ ID NO：30)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含含有SIFYPT(SEQ ID NO：22)的重链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含含有SSSFFAS(SEQ ID NO：23)的重链CDR3。在其它实施方式中，所述抗体包含含有SSFYAS(SEQ ID NO：24)的重链CDR3。在特定实施方式中，所述抗体包含含有SSFFAT(SEQ ID NO：25)的重链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含含有SIFYPS(SEQ ID NO：26)的重链CDR3。在其它实施方式中，所述抗体包含含有SSFFAN(SEQ ID NO：27)的重链CDR3。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将上述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另一方面，本发明提供一种多肽，所述多肽包含：(a)与SEQ ID NO：50、SEQID NO：14、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57或SEQ ID NO：20(带有或不带有信号序列)具有至少约80％序列同一性的多肽(例如，重链可变区)；和/或(b)与SEQID NO：13，SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：39(带有或不带有信号序列)具有至少约80％序列同一性的多肽(例如，轻链可变区)。在特定实施方式中，所述多肽是抗体。在特定实施方式中，所述多肽特异性结合人类Notch2和/或Notch3。在某些实施方式中，所述多肽与人类Notch2特异性结合。在某些实施方式中，所述多肽与Notch2和Notch3结合。在其它实施方式中，所述多肽与Notch3结合。在特定实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：50具有至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％或约100％序列同一性的多肽。还提供包含所述多肽的药物组合物，和将上述多肽用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在还另一方面，本发明提供一种多肽(例如，抗体或抗体的重链或轻链)，所述多肽包含：(a)与SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：2(带有或不带有信号序列)具有至少约80％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：4(带有或不带有信号序列)具有至少约80％序列同一性的多肽。在特定实施方式中，所述多肽包含与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：40具有至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％或约100％序列同一性的多肽。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在另一方面，本发明提供一种多肽(例如，抗体或抗体的重链或轻链)，所述多肽包含：(a)与SEQ ID NO：50具有至少约80％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ IDNO：13具有至少约80％序列同一性的多肽。在特定实施方式中，所述多肽包含与SEQID NO：50或SEQ ID NO：13具有至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约98％或约100％序列同一性的多肽。在特定实施方式中，所述多肽是结合人类Notch2和/或人类Notch3的抗体。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在另一方面，本发明提供包含59R1IgG2抗体的抗体、由59R1IgG2抗体组成的抗体或基本上由59R1IgG2抗体组成的抗体，所述59R1IgG2抗体包含分别为SEQ IDNO：16和18(带有或不带有信号序列)的重链和轻链，或由DNA编码，所述DNA于2008年10月15日根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA，USA，并赋予保藏号PTA-9547。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将上述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另外方面，本发明提供包含59R5IgG2抗体的抗体、由59R5IgG2抗体组成的抗体或基本上由59R5IgG2抗体组成的抗体，所述59R5IgG2包含分别为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：18(带有或不带有信号序列)的重链和轻链，或由DNA编码，所述DNA于2009年7月6日保藏在ATCC，并赋予保藏号[...]。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将上述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另一方面，本发明提供与包含含有SEQ ID NO：14的重链可变区和含有SEQ IDNO：13的轻链可变区的抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述抗体与59R1IgG2抗体竞争特异性结合，所述59R1IgG2抗体包含分别为SEQ ID NO：16和18(带有或不带有信号序列)的重链和轻链，或由DNA编码，所述DNA于2008年10月15日保藏在ATCC，并赋予保藏号PTA-9547。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch2的结合。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch2和Notch3的结合。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch3的结合。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将上述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在另一方面，所述抗体与包含含有SEQ ID NO：50的重链可变区和含有SEQ IDNO：13的轻链可变区的抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与59R5抗体竞争特异性结合，所述59R5抗体包含分别为SEQID NO：49和18的重链和轻链，或由DNA编码，所述DNA于2009年7月6日保藏在ATCC，并赋予保藏号[...]。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch2的结合。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch2和Notch3的结合。在某些实施方式中，所述抗体竞争与人类Notch3的结合。还提供包含所述抗体的药物组合物，和将上述抗体用于诸如抑制血管发生、抑制肿瘤生长、减少肿瘤的致瘤性和/或治疗癌等应用上的方法。
在特定的其它方面，本发明提供一种多肽(带有或不带有信号序列)以及编码所述多肽的多核苷酸，所述多肽包含选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57组成的组的序列。在特定实施方式中，所述多肽是抗体。在特定实施方式中，所述抗体与人类Notch2和/或人类Notch3特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与Notch2特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与人类Notch2和人类Notch3特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与Notch3特异性结合。在另一方面，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60组成的组的序列。
在另一方面，本发明提供调节受试对象中(例如，在受试对象中的肿瘤或其它异常血管发生位置处)周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的方法。在特定实施方式中，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的特异性结合人类Notch2和/或人类Notch3的试剂。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在某些实施方式中，所述试剂是在上述方面或实施方式、以及本文所述其它方面和/或实施方式中任一所述的抗体。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。在特定实施方式中，所述试剂与人类Notch3特异性结合，并且是人类Notch3的拮抗剂。在特定实施方式中，周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的调节对导致血管发生和/或肿瘤生长的抑制。
在另一方面，本发明提供抑制受试对象中血管发生(例如，肿瘤血管发生)的方法。在特定实施方式中，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的特异性结合人类Notch2和/或人类Notch3的试剂。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。在某些实施方式中，所述试剂与人类Notch2特异性结合，并且是人类Notch2的拮抗剂。在特定实施方式中，所述试剂与人类Notch3特异性结合，并且是人类Notch3的拮抗剂。在某些实施方式中，所述试剂是Notch2和Notch3二者的拮抗剂。在某些实施方式中，所述拮抗剂是抗体。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在某些实施方式中，所述试剂是在上述方面或实施方式、以及本文所述其它方面和/或实施方式中任一所述的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂不是抗体。在某些实施方式中，抑制血管发生的方法还包括对所述受试对象施用血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂或VEGF受体的拮抗剂。在特定实施方式中，所述方法是通过调节周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能从而抑制血管发生的方法。
在另一方面，本发明提供抑制受试对象中肿瘤生长的方法。在特定实施方式中，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的人类Notch2和/或人类Notch3的拮抗剂。在特定实施方式中，所述拮抗剂是特异性结合人类Notch2的抗体。在某些实实施方式中，所述拮抗剂是特异性结合人类Notch2和人类Notch3的抗体。在特定实施方式中，所述拮抗剂是特异性结合人类Notch3的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂是在上述方面或实施方式、以及本文所述其它方面和/或实施方式中任一所述的抗体。在特定实施方式中，所述肿瘤包含磷酸酶和张力蛋白(tensin)同源物(PTEN)基因的缺失或其它突变。在特定实施方式中，所述肿瘤是乳肿瘤。
在另一方面，本发明提供选择受试对象以用于使用人类Notch2和/或人类Notch3拮抗剂进行治疗的方法。在特定实施方式中，所述方法包括(a)确定所述肿瘤是否包含磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)基因中的缺失或突变；和(b)如果所述肿瘤包含所述缺失或突变，则选择所述受试对象以用于使用Notch2和/或Notch3拮抗剂进行治疗。在某些实施方式中，使用Notch2拮抗剂治疗所述受试对象。在某些实施方式中，使用Notch2和Notch3的拮抗剂治疗所述受试对象。在某些实施方式中，使用Notch3的拮抗剂治疗所述受试对象。在某些实施方式中，所述拮抗剂是抗体。在特定实施方式中，所述肿瘤是乳肿瘤。
在另一方面，本发明提供与至少一种人类Notch受体(例如，Notch受体1、2、3或4)的胞外域的非配体结合区特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述非配体结合区包括人类Notch受体的EGF重复10(或EGF10的等效物，例如人类Notch3的EGF9)，或由人类Notch受体的EGF重复10(或EGF10的等效物，例如人类Notch3的EGF9)组成。在某些实施方式中，所述抗体抑制肿瘤生长。在某些实施方式中，所述抗体抑制配体与Notch受体的结合。在特定实施方式中，所述抗体抑制通过所述Notch受体进行的信号传导。在某些实施方式中，所述Notch受体是人类Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受体。在特定实施方式中，所述抗体与Notch2(例如，Notch2的EGF10)特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与Notch2和至少一种其它Notch受体特异性结合。在特定实施方式中，所述其它Notch受体是Notch3。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在另外方面，本发明提供与两种以上(即，至少两种或两种、三种或四种)人类Notch受体特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述抗体与两种以上人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合。在特定实施方式中，如果所述两种以上人类Notch受体包含Notch1、Notch2或Notch4，则所述抗体与Notch1、Notch2或Notch4的EGF10结合，如果所述两种以上人类Notch受体包含Notch3，则所述抗体与Notch3的EGF9结合。在特定实施方式中，所述非配体结合区不是EGF4。在特定实施方式中，所述两种以上人类Notch受体包含Notch2。在特定实施方式中，所述两种以上人类Notch受体包含Notch3。在另外的实施方式中，所述两种以上人类Notch受体包含Notch2和Notch3。在特定实施方式中，所述抗体是所述两种以上人类Notch受体的拮抗剂。在特定实施方式中，所述抗体抑制肿瘤生长。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在另一方面，本发明提供一种分离的抗体，所述分离的抗体与人类Notch2受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长，其中所述非配体结合区包含人类Notch2受体的EGF重复10(例如，SEQ ID NO：36)，或由人类Notch2受体的EGF重复10(例如，SEQ ID NO：36)组成。在某些实施方式中，所述抗体不与EGF重复10外的人类Notch2的任何区域结合。在特定实施方式中，所述抗体还与至少一种其它人类Notch受体的EGF重复10(或等效物)(例如，Notch3的EGF9)特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类Notch2EGF10和Notch3EGF9结合。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在另一方面，本发明提供一种分离的抗体，所述分离的抗体与人类Notch3受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长，其中所述非配体结合区包含人类Notch3受体的EGF重复9(其它Notch受体中的EGF10的等效物)，或由人类Notch3受体的EGF重复9(其它Notch受体中的EGF10的等效物)组成。在某些实施方式中，所述抗体不与EGF重复9外的人类Notch3的任何区域结合。在特定实施方式中，所述抗体还与至少一种其它人类Notch受体的EGF重复10特异性结合。在某些实施方式中，所述抗体与Notch3EGF9和人类Notch2EGF10结合。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。
在其它方面，本发明提供一种抗体，所述抗体结合人类Notch受体的胞外域的非配体结合区，并且包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有GIFFAI(SEQ IDNO：7)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在特定实施方式中，所述人类Notch受体是Notch2。在特定实施方式中，所述抗体与人类Notch2受体的EGF10和/或人类Notch3受体的EGF9结合。在另外方面，本发明提供在竞争结合检测中与所述抗体竞争对Notch2的胞外域的非配体结合区的特异性结合的抗体。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。还提供抑制血管发生的方法，所述方法包括施用所述组合物。
在另一方面，本发明提供一种抗体，所述抗体结合人类Notch受体的胞外域的非配体结合区，并且包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有SIFYTT(SEQ IDNO：51)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在特定实施方式中，所述人类Notch受体是Notch2。在某些实施方式中，所述抗体与人类Notch2和Notch3受体结合。在特定实施方式中，所述抗体与人类Notch2受体的EGF10和/或人类Notch3受体的EGF9结合。在另一实施方式中，本发明提供在竞争结合检测中与所述抗体竞争对Notch2的胞外域的非配体结合区的特异性结合的抗体。还提供了包含所述抗体的药物组合物和治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的所述抗体。还提供抑制血管发生的方法，所述方法包括施用所述组合物。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，所述抗体与人类Notch2和人类Notch3特异性结合。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，所述抗体是重组抗体。在特定实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在特定实施方式中，所述抗体是嵌合抗体。在特定实施方式中，所述抗体是人源化抗体。在特定实施方式中，所述抗体是人类抗体。在某些实施方式中，所述抗体是单价的、双价的或多价的。在特定实施方式中，所述抗体是单特异性抗体。在特定实施方式中，所述抗体的各抗原-结合位点结合(或能够结合)超过一种人类Notch受体(例如，Notch2和Notch3)的胞外域的非配体结合区。在某些替代性实施方式中，所述抗体是双特异性抗体。在特定实施方式中，所述抗体是IgG1抗体。在特定实施方式中，所述抗体是IgG2抗体。在特定实施方式中，所述抗体与细胞毒性基团(cytotoxic moiety)缀合。在特定实施方式中，所述抗体是分离的。在其它实施方式中，所述抗体基本上是纯化的。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，用所述抗体治疗的癌或肿瘤是乳腺、结直肠、肺、胰腺、前列腺或头颈癌或肿瘤。在特定实施方式中，所述癌或肿瘤是黑色素瘤。在特定实施方式中，所述癌或肿瘤是乳癌或乳肿瘤。在特定实施方式中，所述癌或肿瘤是结直肠癌或结直肠肿瘤。在特定实施方式中，所述癌或肿瘤是胰腺癌或胰腺肿瘤。在特定实施方式中，所述癌或肿瘤是前列腺癌或前列腺肿瘤。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，治疗癌的方法包括抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，治疗癌的方法包括(例如，通过减少癌干细胞在肿瘤中的频率)减少肿瘤的致瘤性。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，将所述拮抗剂或抗体与用于癌的其它治疗对受试对象组合施用。在特定实施方式中，所述用于癌的其它治疗包括放射治疗、化学治疗和/或其它抗体治疗剂。在某些实施方式中，所述其它用于癌的治疗包括化学治疗剂。在特定实施方式中，所述化学治疗包括紫杉醇(例如，TAXOL)、伊立替康、吉西他滨和/或奥沙利铂。在特定实施方式中，所述其它抗体治疗剂是特异性结合人类Notch受体(例如，Notch1、2、3或4)或人类Notch受体配体(例如，DLL4或JAG1)的抗体。在某些实施方式中，所述其它抗体治疗剂是抗DLL4抗体。在某些替代性实施方式中，所述其它抗体治疗剂是特异性结合血管内皮细胞生长因子(VEGF)的抗体。在特定实施方式中，其它治疗剂结合VEGF受体。
在上述方面或实施方式、以及本文别处所述其它方面和/或实施方式中每一特定实施方式中，将所述抗体与第二治疗剂组合施用于受试对象，所述第二治疗剂是抗血管发生剂。
本发明还提供包含或产生本文所述抗体或其它多肽的细胞系(例如，杂交瘤细胞系)。还提供包含本文所述多核苷酸的多核苷酸(例如，载体)，包括编码本文所述多肽、或者抗体的轻链可变区或重链可变区的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸的细胞系。
在特定实施方式中，本发明提供治疗癌的方法，其中所述癌包含癌干细胞，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的结合Notch受体的抗体。在更具体的方面，本发明提供治疗癌的方法，其中所述癌包含表达一种或多种Notch受体家族成员的干细胞，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的结合这些Notch受体家族成员的抗体。本发明提供与人类Notch受体的胞外域的非配体结合域结合并且对于癌是治疗有效的抗体。因此，在特定实施方式中，本发明提供与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，本发明还提供治疗癌的方法，所述方法包括施用治疗有效量的抗体，所述抗体与人类Notch受体蛋白的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长。
本文涉及使用可结合Notch受体家族成员或这些Notch受体的配体的抗体治疗这些癌症的各种优点。在某些实施方式中，某些Notch受体在某些实体瘤中(例如乳肿瘤或结肠肿瘤中)高度表达，并且这提供活性药物的汇点(sink)，其中所述药物与Notch受体结合。据预期，结合过表达Notch受体的抗体比目前可获得的化学治疗药物具有更安全的特性。
本发明还提供一种治疗人类癌症的方法，其中包含癌干细胞的癌的特征不在于癌干细胞的一种或多种Notch受体的过表达，所述方法包括对人施用治疗有效量的抗体，所述抗体与Notch受体结合并且阻断Notch受体的配体激活。
本发明还提供一种治疗人类癌症的方法，所述方法包括对人施用治疗有效量的(a)结合Notch受体并抑制过表达Notch受体的癌干细胞的生长或增殖的第一抗体，和(b)结合Notch受体并阻断Notch受体的配体激活的第二抗体。
本发明还提供一种治疗癌的方法，其中所述癌选自由乳癌、结肠癌、直肠癌和结直肠癌组成的组，所述方法包括施用治疗有效量的结合Notch的抗体。本发明还提供了另一治疗癌的方法，其中所述癌选自由乳癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌和结直肠癌组成的组，所述方法包括施用治疗有效量的阻断Notch受体的配体激活的抗体。本发明还提供了另一治疗癌的方法，其中所述癌选自由乳癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌和结直肠癌组成的组，所述方法包括施用治疗有效量的结合Notch的抗体和阻断Notch受体的配体激活的抗体。
在另外的实施方式中，本发明提供用于(尤其在)在上述方法中使用的制造品(article)。例如，本发明提供一种制造品，所述制造品包括容器和容器中容纳的组合物，其中所述组合物包含结合Notch的抗体，还包含表明所述组合物可用于治疗包含癌干细胞的癌的药品说明书。在某些实施方式中，本发明提供一种制造品，所述制造品包括容器和容器中容纳的组合物，其中所述组合物包含结合Notch的抗体，还包含表明所述组合物可用于治疗包含癌干细胞的癌的药品说明书，所述癌干细胞表达一种或多种Notch受体。
在特定实施方式中，本发明另外涉及一种制造品，所述制造品包括容器和容器中容纳的组合物，其中所述组合物包含结合Notch受体并且阻断Notch受体的配体激活的抗体，还包含表明所述组合物可用于治疗癌的药品说明书，其中所述癌包含特征不在于所述Notch受体的过表达的癌干细胞。
在特定实施方式中，提供一种制造品，所述制造品包括(a)其中容纳组合物的第一容器，其中所述组合物包含结合Notch受体并且抑制包含过表达Notch的癌干细胞的癌细胞的生长的第一抗体；和(b)其中容纳组合物的第二容器，其中所述组合物包含结合Notch并且阻断Notch受体的配体激活的第二抗体。
在某些实施方式中，提供另一种制造品，所述制造品包括容器和容器中容纳的组合物，其中所述组合物包含结合Notch并且阻断Notch受体的配体激活的抗体，并且还包含表明所述组合物可用于治疗癌的药品说明书，其中所述癌选自由结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、直肠癌和结直肠癌组成的组。
本发明另外提供：结合Notch并且阻断Notch受体的配体激活的抗体(例如，人类抗体或人源化抗体)；包含所述抗体和药学上可接受的载体的组合物；和包含缀合有细胞毒性剂的抗体的免疫缀合物。
在一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码上述方面以及本文别处所述其它方面/实施方式的任何抗体和/或多肽。在某些实施方式中，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。在某些实施方式中，宿主细胞包含所述多核苷酸或所述载体。在其它实施方式中，生产所述抗体的方法包括培养包含所述多核苷酸的宿主细胞，从而表达所述多核苷酸，并且可选的是，所述方法还包括从宿主细胞培养物(例如，从宿主细胞培养基)回收所述抗体。
另外，本发明提供编码上述实施方式或方面以及本文别处所述其它实施方式或方面所述的人源化抗体或人类抗体的分离的多核苷酸；包含所述多核苷酸的载体；包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞；以及生产所述抗体的方法，所述方法包括培养包含所述多核苷酸的宿主细胞，从而表达所述多核苷酸，并且可选的是，所述方法还包括从宿主细胞培养物(例如，从宿主细胞培养基)回收所述抗体。
本发明还涉及包含与一种或多种加利车霉素分子缀合的结合Notch的抗体的免疫缀合物，和所述缀合物在治疗表达Notch的癌，例如其中癌干细胞过表达Notch的癌中的应用。
在根据马库什组或可选择要素的其它分组(包括以“和/或”或“或”隔开的可选择要素的组)描述了本发明的方面或实施方式的情况下，本发明不仅包括作为整体列出的整个组，还个别包括所述组的各成员和主要组的所有可能亚组，以及缺少一个或多个组成员的主要组。本发明还设想到明确排除要求保护的发明中任何组成员中的一个或多个。例如，诸如“X和/或Y”等语言包括单独“X”、单独“Y”以及“在一起的X”和“Y”。
附图说明
图1：59R1抗体和变体结合人类Notch2并且阻断配体结合。(A)59R1Fab与人类Notch2结合的FACS分析。“克隆1”是显示与位于稳定转染的HEK293细胞上的人类Notch2结合的59R1Fab。“克隆5”是从噬菌体文库中分离的不结合Notch2的不同克隆的Fab。(B)通过59R1Fab阻断配体(JAG1)结合的FACS分析。“克隆1”是显示阻断hJaggedl ECD-Fc融合物与位于稳定转染的HEK293细胞上的人类Notch2结合的59R1Fab。“克隆5”是从噬菌体文库中分离的在检测中不阻断配体结合的不同克隆的Fab。(C)59R1IgG2抗体与位于稳定转染的HEK293细胞上的人类Notch2结合的FACS分析。59R1IgG2抗体显示与位于稳定转染的HEK293细胞上的人类Notch2结合。(D)通过59R1IgG2抗体阻断配体(DLL4)结合的FACS分析。59R1IgG2抗体显示阻断hDLL4ECD-Fc融合物与位于稳定转染的HEK293细胞上的人类Notch2的结合。(E)用于59R1的重链CDR3亲和成熟策略。59R1的重链CDR3的亲本序列示于框中。可行的残基改变示于该图中的亲本序列之下。(F)亲和成熟的59R1序列的JAG1阻断能力的筛选。改善的变体用箭头指出。
图2：59R1IgG2抗体与四种人类Notch同源物的交叉反应性的FACS分析。发现59R1结合位于瞬时转染的HEK-293细胞上的hNotch2和hNotch3，但是未发现其展示与相同细胞上的hNotch1和hNotch4的明显结合。
图3：59R1抗体的表位作图。(A)抗Notch2/3抗体59R1与人类Notch2的EGF重复10结合。将来自表达重组Notch2-Fc融合蛋白的HEK 293细胞的上清液用于以抗Notch2/3抗体59R1进行的ELISA，所述融合蛋白具有在1至12(x轴)的指出的Notch2的EGF重复。OD(y轴)表示抗体仅与包含EGF重复10的Notch2融合蛋白结合(阴影线棒)。(该图显示分别示于上图和下图的从两个单独实验获得的数据。)(B)EGF重复11和12不参与抗Notch2/3抗体59R1与全长hNotch2的结合。用绿色荧光蛋白(GFP)(x轴)单独(左上)转染或用GFP与全长完整Notch2共转染或用GFP与缺失EGF重复11(ΔEGF11)或缺失EGF重复12(ΔEGF12)的全长Notch 2共转染的HEK 293细胞的FACS分析。对于在GFP-表达细胞中的所有三种Notch2蛋白，沿y轴(PE)表示59R1的结合。(C)EGF重复10参与抗Notch2/3抗体59R1与全长hNotch2的结合，但不参与配体结合。通过与hNotch2的EGF 1-4结合的抗Notch2抗体59M70进行的结合表示为“抗Notch2结合”。通过DLL4进行的结合表示为“配体结合”。
图4：抗Notch2/3抗体59R1抑制荧光素酶报告子检测中的Notch2信号传导。(A)59R1阻断hDLL4-诱导的Notch2报告子活性。(B)59R1阻断hJAG1-诱导的Notch2报告子活性。(C)59R1阻断hJAG2-诱导的Notch2报告子活性。
图5：Notch2/3受体抗体59R1体内抑制肿瘤形成和生长。(A)抗Notch2/3(59R1)抑制PE13乳肿瘤的形成。PE13乳瘤细胞注射两天后，用对照抗体(正方形)或抗Notch2/3抗体59R1(空心三角)治疗注射有PE13乳瘤细胞的NOD/SCID小鼠，并且测定肿瘤随时间(x轴，细胞注射后天数)的体积(y轴，mm3)。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗显著抑制肿瘤形成(p<0.001)。(B)抗Notch2/3(59R1)抑制T3乳瘤的形成。T3乳瘤细胞注射两天后，用对照抗体(正方形)或抗Notch2/3抗体59R1(空心三角)治疗注射有T3乳瘤细胞的NOD/SCID小鼠，并且测定肿瘤随时间(x轴，细胞注射后天数)的体积(y轴，mm3)。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗显著抑制肿瘤形成(p<0.001)。(C)抗Notch2/3(59R1)抑制Colo-205结肠瘤的生长。肿瘤体积达到65mm3～200mm3的尺寸后，用对照抗体(正方形)或抗Notch2/3抗体59R1(菱形)治疗用Colo-205结肠瘤细胞注射的6～8周大的免疫缺陷bg/nu XID雌性小鼠，所述小鼠具有Swiss CD-1背景。测定随时间(x轴，细胞注射后天数)的平均肿瘤体积(y轴，mm3)。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗抑制肿瘤生长(40天后***p<0.001)。(D)抗Notch2/3(59R1)抑制PN4胰腺瘤的生长。肿瘤体积达到65mm3～200mm3的尺寸后，用对照抗体(正方形)或抗Notch2/3抗体59R1(菱形)治疗注射有PN4胰腺瘤细胞的NOD/SCID小鼠。测定随时间(x轴，细胞注射后天数)的平均肿瘤体积(y轴，mm3)。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗抑制肿瘤生长(70天后***p<0.001)。(E)抗Notch2/3(59R1)抑制PE13乳瘤的生长。肿瘤体积达到65mm3～200mm3的尺寸后，用对照抗体(正方形)或抗Notch2/3抗体59R1(菱形)治疗注射有PE13乳瘤细胞的NOD/SCID小鼠。测定随时间(x轴，细胞注射后天数)的平均肿瘤体积(y轴，mm3)。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗抑制肿瘤生长(57天后*p<0.05)。(F)抗Notch2/3(59R1)抑制T3乳瘤的生长。肿瘤体积达到65mm3～200mm3的尺寸后，用对照抗体(实心柱)或抗Notch2/3抗体59R1(空心柱)治疗注射有T3乳瘤细胞的NOD/SCID小鼠。在细胞注射后第18、25、39和42天测定平均肿瘤体积。与对照相比，用59R1抗体进行的治疗抑制肿瘤生长(在第42天***p<0.001)。
图6：抗Notch2/3抗体59R1延迟紫杉醇治疗后的乳瘤复发。
图7：抗Notch2/3抗体59R1减少B51乳瘤中癌干细胞的频率。
图8：与吉西他滨组合，抗Notch2/3抗体59R1抑制PN4胰腺瘤的生长。
图9：抗Notch2/3抗体59R1抑制M4黑色素瘤异种移植物模型中的肿瘤生长。
图10：抗Notch2/3抗体59R1可单独抑制C28结肠瘤的生长，也可与伊立替康组合抑制C28结肠瘤的生长。
图11：59R1IgG2抗体显著抑制体内已建立的人类肿瘤异种移植物的肿瘤生长。每周一次以15mg/kg的标出的抗体(1B711，LZ-1对照抗体，黑色正方形；59R1，黑色三角形；阿瓦斯汀，黑色圆形；阿瓦斯汀+59R1，黑色菱形)治疗已建立的Colo-205(A)、C8(B)、PN8(C)、B34(D)、B39(E)、B44(F)、PE-13(G)和T1(H)肿瘤(皮下，n＝10/组)。肿瘤体积(x轴)相对于时间(y轴)绘图。在Colo-205异种移植物模型中，59R1与AVASTIN的组合治疗比任一抗体单独治疗显著地更有效。图11B至11H中，星号表示在所示天时的显著肿瘤生长抑制：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，学生t检验：符号(Symbols),平均值：误差棒，SEM。
图12：在各种异种移植物肿瘤模型中59R1治疗显著调节了所选择基因的相对表达水平。从之前测试的异种移植物模型通过分析单独测试HEYL(A)、Notch3(B)、RGS5(C)、ANGPT1(D)和ANGPT2(E)的表达水平。值得注意的是，缺乏雌激素(ne)终止了59R1在减少携带有T1的小鼠的宿主间质中的ANGPT1和ANGPT2表达方面的作用。空心圆对应于所分析的各肿瘤。水平线，平均值。
图13：肿瘤抑制子PTEN基因在许多59R1显示出抗肿瘤功效的乳瘤中缺失。显示了PTEN外显子、Affymetrix探针分布和染色体10中PTEN基因的缺失。深灰和浅灰阴影条分别表示染色体片段的纯合缺失和杂合缺失。
图14.59R1抗体的表位作图。(A)人类Notch同源物的蛋白比对。通过CloneManager软件进行所述比对。所示的是人类Notch1、Notch2和Notch4的EGF 10重复以及人类Notch3中的等效EGF。框区表示含有一个或多个氨基酸的区域，所述一个或多个氨基酸组成通过59R1IgG2抗体与hNotch2H385N AL 388-89SN突变体(图14B)和与其中aa 382-386已经突变成对应hNotch2序列的hNotch1构建体(图14C)的FACS结合定义的59R1表位的至少一部分。(B)59R1IgG2抗体与hNotch2结合，但不与其中某些EGF 10残基已突变成hNotch1残基的突变体hNotch2(H385N AL 388-89SN)结合。(C)59R1IgG2抗体不与hNotch1结合，但与其中某些EGF 10残基(aa382-387)已突变成匹配hNotch2残基385-389的突变体hNotch1结合。
图15.59R5的体外表征。(A)图15A显示抗体59R5能够阻断Notch2和Notch3的配体-诱导的信号传导。对PC3肿瘤细胞用人类或小鼠Notch受体(hN2，人类Notch2；mN2，鼠类Notch2；hN3，人类Notch3；mN3，鼠类Notch3)和GFP诱导型报告子构建体瞬时转染。使经转染细胞与不同浓度的抗体59R1和59R5在被动固定的DLL4Fc的存在下一起温育。(B)图15B显示59R5结合与59R1类似的表位。对HEK 293细胞用编码人类Notch2、人类Notch1或残基382-386突变成相应的人类Notch2残基的人类Notch1的表达载体瞬时转染。还用编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒对细胞进行共转染，从而标记接受所转染质粒的那些细胞。使细胞与59R1或59R5以及荧光第二抗体一起温育，然后通过FACS进行检查。通过框突出显示的区域表明用所示Notch表达载体转染的细胞能够与59R1或59R5结合。
图16.Notch受体抗体59R5抑制体内肿瘤形成和生长。图16A显示使用抗体59R5对PE13乳瘤细胞进行的体内治疗。图16B显示使用抗体59R5对C28结肠细胞进行的体内治疗。图16C显示使用抗体59R5对Colo205结肠细胞进行的体内治疗。
图17.组合治疗中使用Notch2/3抗体59R5对肿瘤的体内治疗。(A)用PN8胰腺瘤细胞注射小鼠。使肿瘤生长33天直到它们达到120mm3的平均体积。将对照Ab(正方形)、59R1(三角形)或59R5(圆形)与每周一次20mg/kg的吉西他滨组合治疗所述动物4周。(B)用PE13乳瘤细胞注射小鼠。开始治疗前使肿瘤生长40天。每周两次用15mg/kg的紫杉醇加上对照抗体(正方形)或59R5(圆形)治疗所述动物5周。5周后，停止紫杉醇治疗，继续抗体治疗。
图18.用抗体59R5治疗后肿瘤中基因表达的调节。图18显示用59R1、59R5或对照抗体治疗后，所选择基因在间质细胞中的表达水平和所选择人类基因在PE13肿瘤细胞中的表达水平。
图19.59R1对PE13乳癌干细胞频率的降低。(A)用对照抗体、紫杉醇加上对照抗体，59R1或紫杉醇加上59R1治疗已建立的肿瘤。治疗3周后收获肿瘤，进行处理，并将来自四个治疗组中每一组的连续滴定的人类细胞移植到新的小鼠组(每细胞剂量n＝10)中。75天后确定肿瘤生长速率。利用L-calc程序(Stem Cell Technologies，Inc.)使用生长75天后的肿瘤生长速率来计算CSC频率。(B)用59R1和/或紫杉醇治疗后癌干细胞在PE13乳瘤中的频率。(C)用59R1和/或吉西他滨治疗后癌干细胞在PN4胰腺瘤中的频率。(D)用59R5和/或紫杉醇治疗后癌干细胞在PE13乳瘤中的频率。单星号表示相对于对照抗体治疗组的统计学显著差异(p<0.05)，双星号表示相对于紫杉醇和对照抗体治疗组的显著差异。
具体实施方式
本发明提供了与一种或多种人类Notch受体(例如Notch2和/或Notch3)结合的新型试剂，包括但不限于诸如抗体等多肽。所述Notch结合剂包括人类Notch受体的拮抗剂。还提供了相关的多肽和多核苷酸，包含Notch结合剂的组合物，以及制备Notch结合剂的方法。还提供了使用所述新型Notch结合剂的方法，例如抑制肿瘤生长、抑制血管发生和/或治疗癌或其它血管发生相关疾病的方法。
本发明还鉴定了与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并抑制体内肿瘤生长的分子(例如抗体)。已经将是配体结合充要条件的Notch的配体结合区，鉴定为EGF重复11和12，表明Notch受体的该区在Notch信号传导和肿瘤发生中是重要的(Rebay等，1991，Cell 67：687；Lei等，2003，Dev.130-6411；Hambleton等，2004，Structure 12：2173)。预料之外的是，已经发现在人类Notch受体的胞外域的配体结合域的外部结合的抗体抑制体内肿瘤细胞生长(参见美国专利公开第2008/0131434号，通过引用将其整体并入本文)。因此，在一种或多种人类Notch受体Notch1、Notch2、Notch3和Notch4-的胞外域的配体结合域外部结合的抗体具有作为潜在的癌治疗剂的价值。
已经鉴定出与含有人类Notch2的EGF重复10内的残基的表位特异性结合的抗体(实施例1和3以及图3A-3C)。抗体59R1抑制配体与Notch2的结合(实施例1和图1A-1D)，并且抑制配体诱导的Notch2信号传导(实施例4和图4A-4C)，不过可与Notch2在配体结合区外的区域中结合。59R1还特异性结合人类Notch3(实施例2和图2)。已经发现所述抗体可单独地或与第二抗癌剂组合时防止或抑制各种不同的异种移植物模型中的体内肿瘤细胞生长(实施例5、6、7和9以及图5A-F、6、8-10和11A-H)。所述抗体还通过减少癌干细胞的频率而显示出减少多种异种移植物模型中体内肿瘤的致瘤性(实施例8和23以及图7和19A-C)。另外，发现使用59R1的治疗下调RGS5(一种周细胞和/或血管平滑肌细胞的标记物)、Notch3和HeyL在各种肿瘤的间质中的表达(实施例10和图12A-E)，和上调乳瘤和结肠瘤中的缺氧(实施例11)。不受理论限制，这些数据表明59R1抗体对肿瘤血管发生具有抑制效果，这至少部分是由于对周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的调节。还发现使用59R1的治疗调节乳瘤中的其它基因。发现59R1下调了细胞周期基团途径、myc-激活基因和几种干细胞基因集(实施例22)。
还开发出另外的人类抗体59R5。59R5具有与59R1相似的性质，例如与Notch2和Notch3相似的结合亲和性和它们表位的相似性或重叠(实施例13和图15B)。已经显示抗体59R5在阻断Notch2和Notch 3信号传导方面具有与59R1相似的活性(实施例13和图15A)。还显示该59R5抗体可单独地或与第二抗癌剂组合时抑制几种异种移植物模型中体内肿瘤生长(实施例14和15以及图16A-C和17A-B)。另外，已经发现使用59R5进行的治疗与使用59R1的治疗类似，下调各种肿瘤的间质中RGS5、Notch3和HeyL的表达，并且还发现59R5治疗将肿瘤细胞中人类基因ID4、EDNRA和EGLN3的表达调节至与59R1相似的程度(实施例16)。59R5还显示通过减少癌干细胞的频率而减少异种移植物模型中的体内致瘤性(实施例23和19D)。
定义
Notch受体的“拮抗剂”是包括部分或全部阻断、抑制或中和Notch途径的生物学活性的任何分子的术语。合适的拮抗剂分子特别包括拮抗性抗体或抗体片段。
使用术语“抗体”来指通过至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区内的抗原识别位点，识别和特异性结合诸如蛋白、多肽、肽、糖类、多核苷酸、脂质或上述物质的组合等靶标的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语包括完整的多克隆抗体、完整的单克隆抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、由至少两个完整抗体产生的诸如双特异性抗体等多特异性抗体、包含抗体部分的融合蛋白和任何其它包含抗原识别位点的经修饰免疫球蛋白分子，只要所述抗体显示所需的生物活性。基于分别称为α、δ、ε、γ和μ的抗体重链恒定域的同一性，抗体可以是五个主要种类免疫球蛋白中的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。不同种类的免疫球蛋白具有不同的众所周知的亚基结构和三维构造。抗体可以是裸露的或与诸如毒素、放射性同位素等其它分子缀合。
如本文所用，术语“抗体片段”表示完整抗体的一部分，和表示完整抗体的抗原性决定可变区。抗体片段的实例包括，但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
“Fv抗体”是指含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段，可以是其中一个重链和一个轻链可变域形成非共价二聚体的双链，也可以是其中一个重链和一个轻链可变域通过柔性肽连接子共价连接的单链(scFv)，从而使得2条链以类似的二聚结构连接。在该构造中各可变域的互补决定区(CDR)相互作用从而限定出Fv二聚体的抗原结合特异性。作为选择，可以使用单可变域(或Fv的一半)来识别和结合抗原，虽然通常而言亲和性较低。
本文所用的“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别和结合单抗原决定簇(或表位)的同源性抗体群。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括完整的全长单克隆抗体以及抗体片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和任何其它包含抗原识别位点的经修饰免疫球蛋白分子。另外，“单克隆抗体”是指以包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物在内的任何数量的方式制得的此类抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为含有最小非人类序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段。通常而言，人源化抗体是其中互补决定区(CDR)的残基被非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的具有所需特异性、亲和性和能力的CDR的残基置换的人类免疫球蛋白。在某些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被来自非人类物种的具有所需特异性、亲和性和能力的抗体中的相应残基置换。可以通过在Fv框架区中和/或在经置换的非人类残基内取代另外的残基而进一步修饰所述人源化抗体，从而改善和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。通常，人源化抗体会包含基本上不少于(all of)至少一个，通常两个或三个可变域，所述可变域含有所有，或基本上所有的与非人类免疫球蛋白对应的CDR区，而所有，或基本上所有的FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。所述人源化抗体还可以包含免疫球蛋白(通常为人类免疫球蛋白)恒定区或域(Fc)的至少一部分。用于产生人源化抗体的方法的实例描述于美国专利第5,225,539号，通过参考将其并入本文。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各由通过三个还称为高变区的互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FR)组成。各链中的CDR通过FR邻近(in close proximity)保持在一起，并且与来自另一链的CDR帮助形成抗体的抗原结合位点。至少有两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，(第5版，1991，National Institutes of Health，Bethesda Md.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，1997，J.Molec.Biol.273：927-948)。另外，本领域有时使用这两种方法的组合来确定CDR。
本文使用的术语“人类抗体”是指由人类产生的抗体或通过使用本领域已知的任何技术制备的具有与由人类产生的抗体相应的氨基酸序列的抗体。人类抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段和/或包含至少一个人类重链和/或轻链多肽的抗体，例如，包含鼠类轻链和人类重链多肽的抗体。
“杂交抗体”是其中将来自具有不同抗原决定簇区域的重链和轻链对组装在一起，从而使得所得四聚体可以识别和结合两个不同的表位或两个不同的抗原的免疫球蛋白分子。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列源自两个以上物种的抗体。通常而言，轻链和重链的可变区对应于源自一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和性和/或能力的抗体的可变区，而恒定区与源自另一物种(通常是人类)的抗体中的序列具有同源性，从而避免引发该物种中的免疫应答。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可相互替换地使用，并且是指抗原的能够被特定抗体识别和特异性结合的那部分。当抗原是多肽时，表位可由连续的氨基酸形成和由通过蛋白的三级折叠而并置的不连续氨基酸形成。当蛋白变性时通常会保留由连续的氨基酸形成的表位，而当蛋白变性时通常会失去通过三级折叠形成的表位。在单独空间构象中表位通常包括至少3个，或更经常至少5个或8个至10个氨基酸。
通过其中所研究的免疫球蛋白抑制参照抗体与通用抗原的特异性结合的检测来确定抗体之间的竞争。已知许多类型的竞争性结合检测，例如：固相直接或间接放射免疫检测(RIA)、固相直接或间接酶免疫检测(EIA)、夹心竞争检测(参见Stahh等，1983，Methods in Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等，J.Immunol.1986，137：3614-3619)；固相直接标记的检测、固相直接标记的夹心检测(参见Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress)；使用I-125标签的固相直接标记RIA(参见Morel等，1988，Molec.Immunol.25(1)：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，1990，Virology 176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J Immunol.，1990，32：77-82))。通常而言，所述检测包括使用与固体表面或携带未标记的测试免疫球蛋白和经标记的参照免疫球蛋白中任一的细胞结合的经纯化抗原。通过确定在测试免疫球蛋白的存在下与固体表面或细胞结合的标签的量来测定竞争性抑制。通常测试免疫球蛋白是过量存在的。通过竞争检测鉴定出的抗体(竞争性抗体)包括与参照抗体结合相同表位的抗体，和与相邻表位结合的抗体，该相邻表位与参照抗体所结合的表位足够近，从而使得出现空间位阻。通常而言，当竞争性抗体过量存在时，其会将参照抗体与通用抗原的特异性结合抑制至少50％或75％。
抗体与表位或受体“选择性结合”或“特异性结合”是指抗体与该表位或受体的反应或结合比与其它物质(包括不相关蛋白)的反应或结合更频繁、更迅速、持久性更高、亲和性更高或上述情况的某些组合。“选择性结合”或“特异性结合”例如是指，抗体与蛋白结合的KD为约0.1mM以下，更通常为约1μM以下。“选择性结合”或“特异性结合”有时是指，抗体与蛋白结合的KD为约0.1mM以下，有时为约1μM以下，有时为约0.1μM以下，有时为约0.01μM以下或有时为约1nM以下。由于不同物种中同源性蛋白之间的序列同一性，特异性结合可以包括识别超过一个物种中Notch受体的抗体。类似地，由于不同Notch受体(例如，Notch2和Notch3)之间在受体的多肽序列的特定区中的同源性，特异性结合可以包括识别超过一种Notch受体的抗体。应该理解，在特定实施方式中，与第一靶标特异性结合的抗体或结合部分可以与第二靶标特异性结合或不与第二靶标特异性结合。这样，“特异性结合”不必然地需要(尽管其可以包括)专一性结合，即，与单个靶标结合。因此，在特定实施方式中，抗体可以与超过一个靶标(例如，人类Notch2和Notch3)特异性结合。在特定实施方式中，多种靶标可以被所述抗体上的相同抗原结合位点结合。例如，在特定情况下，抗体可以包含两个相同的抗原结合位点，其每一个位点特异性结合两种以上人类Notch受体(例如，人类Notch2和Notch3)。在某些替代性实施方式中，抗体可以具有双特异性，并且包含至少两个具有不同特异性的抗原结合位点。借助于非限制性实例，双特异性抗体可以包含识别位于一种Notch受体(例如人类Notch2)上的表位的一个抗原结合位点，并且还包含识别位于另一种Notch受体(诸如人类Notch3)上的不同表位的另一不同抗原结合位点。通常而言，但不是必然地，本文“结合”是指“特异性结合”。
如本文所用，当提到抗体与蛋白或肽的相互作用而使用时术语“非特异性结合”和“背景结合”，是指不依赖于特定结构的存在的相互作用(即，所述抗体一般性地与蛋白结合而不是与诸如表位等特定结构结合)。
术语“分离的”或“纯化的”是指实质上或基本上不含在该材料的天然状态下通常附带的组分的材料。通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术确定纯度和均一性。作为制剂中存在的主要物种(species)的蛋白(例如抗体)或核酸是基本上纯的。特别地，将分离的核酸与开放阅读框分离，所述开放阅读框天然地位于所述基因侧翼并且编码除了由所述基因编码的蛋白之外的蛋白。将分离的抗体与其它非免疫球蛋白和其它具有不同抗原结合特异性的免疫球蛋白分离。其还可以指核酸或蛋白具有至少85％的纯度、具有至少95％的纯度和在某些实施方式中，具有至少99％的纯度。
如本文所用，术语“癌(cancer)”或“癌性的(cancerous)”是指或描述其中一群细胞的特征在于失调的细胞生长的哺乳动物中的生理状况。癌的实例包括，但不限于，癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，所述癌的实例包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝脏癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝脏癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌。
术语“增殖性障碍”和“增殖性疾病”是指与异常细胞增殖有关的障碍，如癌。
本文所用的“肿瘤”和“赘生物”是指任何由过度的细胞生长或增殖导致的组织的团块，其可以是良性的(非癌的)或恶性的(癌的)，包括癌前病变。
本文所用的“转移”是指癌从原始位置扩散或转移到身体的其它区域的过程，并且伴随着位于新位置处的类似的癌病变的发生。“转移”或“转移性”细胞是失去与相邻细胞的粘附接触并且经由血流或淋巴从疾病的原发位置迁移从而侵袭邻近的身体结构的细胞。
如本文所用，术语“受试对象”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物和啮齿类动物等，其是特定治疗的接收者。通常而言，对于人类受试对象，术语“受试对象”和“患者”在本文中可相互替换地使用。
术语“癌干细胞”或“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”在本文中可相互替换地使用，并且指具有以下性质的实体瘤的细胞群：(1)具有广泛的增殖能力；2)能够进行不对称细胞分裂从而产生增殖或发育潜能减少的一种以上分化子代；和(3)能够进行对称分裂以用于自我更新或自我维持。当连续移植到免疫妥协小鼠时，与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比，“癌干细胞”或“肿瘤干细胞”或“实体瘤干细胞”的这些性质赋予这些癌干细胞以形成可察觉的肿瘤的能力。癌干细胞以无序方式进行自我更新而不是分化，从而形成具有异常细胞类型的肿瘤，当发生突变时所述异常细胞类型可以随时间而改变。
术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”和语法等效物是指源自肿瘤的全部细胞群体，包括占肿瘤细胞群大部分的非致瘤性细胞和致瘤性干细胞(癌干细胞)。
如本文所用，“致瘤性的”是指实体瘤干细胞的功能特征，包括自我更新(产生另外的致瘤性癌干细胞)的性质和增殖以产生所有其它肿瘤细胞(产生分化的因而非致瘤性的肿瘤细胞)的性质，从而使实体瘤干细胞形成肿瘤。
如本文所用，肿瘤的“致瘤性”是指当连续移植到免疫妥协小鼠时，来自肿瘤的细胞的随机样品形成可察觉的肿瘤的能力。
如本文所用，术语“干细胞癌标记”或“癌干细胞标记”或“肿瘤干细胞标记”或“实体瘤干细胞标记”是指基因，或由基因表达的蛋白、多肽或肽，与非致瘤性细胞相比，所述基因的表达水平(单独或与其它基因组合)与致瘤性癌细胞的存在相关。该相关可以涉及基因的表达增加或减少(例如，mRNA或由所述基因编码的肽的水平增加或减少)。
术语“癌干细胞基因标签”或“肿瘤干细胞基因标签”或“癌干细胞标签”在本文中可相互替换地使用，来指包含与其它细胞或细胞群体(例如正常乳腺上皮组织)相比在癌干细胞中差异性表达的基因的基因标签。在某些实施方式中癌干细胞基因标签包含与正常乳腺上皮相比在癌干细胞中差异性表达的基因，所述表达差异成倍变化，例如表达减少/或增加2倍，并且还通过统计学分析，例如根据多个样品间的t检验的P值来进一步限制。在另一实施方式中，将在癌干细胞中差异性表达的基因基于其表达与所选择基因的相关性以及表达改变的倍数或百分比，分成各种癌干细胞基因标签。癌干细胞标签是临床变化方面(包括但不限于转移和死亡)是可回顾和前瞻性预期的。
如本文所用术语“遗传测试”是指对患者或患者肿瘤样品的遗传组成进行分析的程序。该分析可以包括检测DNA、RNA、染色体、蛋白或代谢物，从而检测可遗传的或与身体疾病相关的基因型或核型以用于临床目的。
如本文所用，术语“活检样”或“活检组织”是指出于确定所述样品是否含有癌组织的目的而从受试对象中取得的组织或流体的样品。在某些实施方式中，由于受试对象疑似患有癌而获得活检组织或流体。然后检查活检组织或流体是否存在癌。
如本文所用，“可接受的药物载体”是指当与药物组合物的活性成分(例如抗体)组合时，允许所述抗体例如保留其生物活性的任何材料。另外，“可接受的药物载体”在接受者受试对象中不触发免疫应答。实例包括，但不限于任何标准的药物载体，例如磷酸盐缓冲的盐水溶液、水、各种油/水乳液。某些用于气溶胶或胃肠外施用的稀释剂是磷酸盐缓冲的盐水或生理(0.9％)盐水。
术语“治疗有效量”是指对于“治疗”受试对象或哺乳动物中的疾病或障碍有效的抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其它药物的量。在癌的情况下，治疗有效量的药物可以减少癌细胞的数量；减少肿瘤尺寸；抑制或停止癌细胞向周围器官中的浸润；抑制和停止肿瘤转移；抑制和停止肿瘤生长；某种程度上减轻与癌有关的一种或多种症状；或所述效应的组合。在药物阻止生长和/或杀死现有的癌细胞的情况下，可将其称为具有细胞抑制性和/或细胞毒性。
诸如“治疗”或“处理”或“要治疗”或“缓解”或“要缓解”等术语是指1)治愈、减慢、减轻诊断的病理性状况或障碍的症状，和/或使诊断的病理性状况或障碍的进展停止的治疗措施；和2)防止或减缓所靶向的病理性状况或障碍的发展的预防性或防备性措施。因此需要治疗的受试对象包括已经患有疾病的受试对象；有倾向患疾病的受试对象和要预防疾病的受试对象。如果所述患者显示出以下情况的一种或多种，则根据本发明的方法成功地“治疗”了受试对象：癌细胞的数量减少或完全不存在、肿瘤尺寸的减少；对癌细胞向外围器官的浸润(包括癌向软组织和骨的扩散)的抑制或不存在；肿瘤转移的抑制或不存在；肿瘤生长的抑制或不存在；减轻一种或多种与特定癌相关的症状；发病率和致死率减少；和生活质量改善。因此，在特定实施方式中，癌的治疗包括受试对象中肿瘤生长的抑制。
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指由许多经由磷酸二酯键连接的核苷酸单元(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或相关的结构变体)组成的聚合物，包括但不限于，DNA或RNA。该术语包括含有DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述碱基类似物包括但不限于，4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1–甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q苷、S'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸和2,6-二氨基嘌呤。
术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如，rRNA，tRNA)所需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。多肽可由全长编码序列或由所述编码序列的任何部分编码，只要保留全长多肽或片段的所需活性或功能性质(例如酶促活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)。该术语还包括结构基因的编码区和在任一端以约1kb以上的距离与5'和3'末端的编码区相邻的序列，从而使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区的5'并且存在于mRNA上的序列是指5'非翻译序列。位于编码区的3'或下游并且存在于mRNA上的序列是指3'非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有由被称为“内含子”或“间隔区”和“间隔序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因的区段；内含子可以含有诸如增强子等调节元件。从核或初始转录物中除去或“剪接下”内含子；因此内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。翻译中mRNA起到规定新生多肽中氨基酸的序列或顺序的作用。除了含有内含子之外，基因的基因组形式还可以包括位于存在于RNA转录物上的序列的5'和3'末端的序列。这些序列还称为“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于存在于mRNA转录物上的非翻译序列的5'或3')。5'侧翼序列可以含有控制或影响基因的转录的诸如启动子和增强子等调节序列。3'侧翼区可以含有指导转录终止、转录后切割和多腺苷酸化的序列。
当关于细胞、核酸、蛋白或载体使用时，术语“重组”是指已经通过导入异源核酸或蛋白、改变天然核酸或蛋白而对所述细胞、核酸、蛋白或载体进行修饰，或所述细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因或表达过表达或异常表达(例如表达为非天然存在的片段或剪接变体)的基因。本文的术语“重组核酸”是指以自然中正常未发现的形式的、通常通过例如使用聚合酶和内切核酸酶操作核酸，最初在体外形成的核酸。以此方式，实现了不同序列的可操作连接。因此，线性形式的分离的核酸，或通过将通常不接合的DNA分子进行连接而在体外形成的表达载体，都认为是用于本发明目的的重组体。应该理解，一旦制得重组核酸并将其导入宿主细胞或生物体中，其会非重组(即使用宿主细胞的体内细胞机构而不是体外操作)地复制；但是，所述核酸一旦重组地产生，虽然随后进行非重组地复制，仍然被认为是用于本发明目的的重组体。类似地，“重组蛋白”是使用重组技术(即，通过上述重组核酸的表达)制备的蛋白。
如本文所用，使用术语“载体”来指将DNA区段从一个细胞转移到另一细胞的核酸分子。术语“载剂”有时与“载体”相互替换地使用。载体通常源自质粒、噬菌体或植物病毒或动物病毒。
如本文所用，术语“基因表达”是指下述过程：通过基因的“转录”(例如经由RNA聚合酶的酶促作用)将基因中编码的遗传信息转化成RNA(例如，mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)，并且对于编码蛋白的基因，通过mRNA的“翻译”转化成蛋白。可以在该过程中的许多阶段对基因表达进行调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(例如，RNA或蛋白)的产生的调节，而“下调”或“抑制”是指减少产生的调节。参与上调或下调的分子(例如转录因子)通常分别称为“激活子”和“抑制子”。
术语“多肽”或“肽”或“蛋白”或“蛋白片段”在本文中可相互替换地使用，来指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一种或多种氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸功能类似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后经过修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ–羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(例如与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物可具有经修饰的R基团(例如正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通常化学结构不同的结构，但与天然存在的氨基酸功能类似的化合物。
“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。“氨基酸变体”是指氨基酸序列。对于特定的核酸序列，保守性修饰变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当所述核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同或相关(例如天然连续)的序列。由于遗传编码的简并性，大量功能上相同的核酸编码大多数蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，该密码子可以改变成所述相应密码子中的另一个而不会改变所编码的多肽。所述核酸变化是“沉默变化”，其是保守性修饰变化的一种。编码多肽的本文的每个核酸序列也描述了核酸的沉默变化。认识到的是，在某些背景下可以对核酸中的各密码子(除了通常是蛋氨酸的唯一密码子的AUG，和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG)进行修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变化涉及关于表达产物的所述序列，而不是关于实际的探针序列的所述序列。关于氨基酸序列，认识到的是，在所编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的、对核酸、肽、多肽或蛋白序列进行的各取代、缺失或添加，是“保守性修饰变体”，包括其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。所述保守性修饰变体是除了本发明的多态变体、种间同源物和等位基因之外但不排除其的变体。提供用于保守性氨基酸取代的功能相似氨基酸的表是本领域众所周知的。通常而言保守性取代包括：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)，5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。(还参见本文表1)。
如本说明书和权利要求所用，单数形式的"a"、"an"和"the"包括复数形式，除非上下文明确指出。
应该理解每当在本文用词汇“包含”来描述实施方式时，还提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似实施方式。
本发明的特定实施方式
本发明提供了用于研究、诊断、表征和治疗癌的组合物和方法。特别地，在特定实施方式中，本发明提供了结合Notch受体的试剂(包括拮抗剂)和使用所述试剂或拮抗剂来抑制肿瘤生长和治疗人类患者的癌症和其它疾病的方法。在特定实施方式中，所述拮抗剂是特异性识别一种或多种人类Notch受体的抗体。
在一个方面，本发明提供与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的抗体。在某些实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的抗体抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体，与至少两种Notch受体家族成员的胞外域的非配体结合区特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体与Notch2和/或Notch3受体的胞外域的非配体结合区结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类Notch2的非配体结合区结合。在某些实施方式中，所述抗体与Notch2和Notch3的胞外域的非配体结合区结合。在某些实施方式中，所述抗体与人类Notch3的非配体结合区结合。在某些实施方式中，所述抗体与Notch1和/或Notch4结合。
在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是单克隆抗体。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是嵌合抗体。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是人源化抗体。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是人类抗体。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是单特异性抗体。在特定实施方式中，与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体是双特异性抗体。在特定实施方式中，本发明提供产生与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体的杂交瘤。
在特定实施方式中，本发明提供与人类Notch受体的胞外域的包含EGF重复1-10的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，本发明提供与人类Notch受体的胞外域的包含EGF重复10(或等效物)的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，本发明提供与人类Notch受体的胞外域的包含EGF重复13-36的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。某些实施方式提供与人类Notch受体的胞外域的包含EGF重复4的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。某些实施方式提供与人类Notch受体的胞外域的包含EGF重复13的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述抗体与包含LNR-HD域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长。
在特定实施方式中，本发明提供了对需要治疗癌症的受试对象进行癌症治疗的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的与人类Notch受体蛋白的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制所述受试对象中肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌症的方法包括施用治疗有效量的与至少两种Notch受体家族成员特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述对需要治疗癌症的受试对象进行癌症治疗的方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的与Notch2和/或Notch3受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。
在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的单克隆抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的嵌合抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的人源化抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的人类抗体。在某些实施方式中，所述抗体是单特异性抗体。在某些实施方式中，所述抗体是双特异性抗体。
在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与包含EGF重复1-10的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与包含EGF重复10(或如果是Notch3的话则是其等效物)的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与包含EGF重复13-36的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与包含EGF重复4的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与包含EGF重复4的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在某些其它实施方式中，施用的抗体与人类Notch受体的LNR-HD域特异性结合。
在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的与细胞毒性基团(cytotoxic moiety)缀合的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括与放射治疗组合施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括与化学治疗组合施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体，所述肿瘤生长来自乳肿瘤、结直肠肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤或头颈肿瘤。
在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括使用遗传测试鉴定可使用抗体进行治疗的患者，所述抗体与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合；和施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。在特定实施方式中，所述治疗癌的方法包括使用检测癌干细胞标签的遗传测试鉴定可使用抗体进行治疗的患者，所述抗体与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合；和施用治疗有效量的与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长的抗体。
在特定实施方式中，本发明提供鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合并且抑制肿瘤生长的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子与人类Notch受体的胞外域的非配体结合域一起温育；ii)确定所述分子是否与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合；和iii)确定所述分子是否抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，本发明提供鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合并且抑制肿瘤生长的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子与包含EGF重复1-10的人类Notch受体的胞外域的非配体结合域一起温育；ii)确定所述分子是否与包含EGF重复1-10的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合；和iii)确定所述分子是否抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，本发明提供鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合并且抑制肿瘤生长的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子与包含EGF重复10(或如果是Notch3则是等效物)的人类Notch受体的胞外域的非配体结合域一起温育；ii)确定所述分子是否与包含EGF重复10(或如果是Notch3则是等效物)的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合；和iii)确定所述分子是否抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，本发明提供鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合并且抑制肿瘤生长的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子与包含EGF重复13-36的人类Notch受体的胞外域的非配体结合域一起温育；ii)确定所述分子是否与包含EGF重复13-36的人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合；和iii)确定所述分子是否抑制肿瘤生长。
在特定实施方式中，本发明提供包含抗体的药物组合物，所述抗体与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长。
在特定实施方式中，本发明提供制备抗体的方法，所述抗体与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长。
在特定实施方式中，本发明提供编码抗体的分离的核酸，所述抗体与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合并且抑制肿瘤生长。
在某些实施方式中，本发明提供与一种或多种人类Notch受体的EGF10域(或如果是Notch3的话则是EGF10域的等效物)特异性结合的试剂(例如，抗体)。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。在特定实施方式中，所述试剂与人类Notch2的EGF10和/或人类Notch3的EGF9特异性结合。EGF9是人类Notch3内的EGF，其等效于其它人类Notch受体Notch1、Notch2和Notch4中的EGF10。在特定实施方式中，所述试剂特异性结合人类Notch2。在特定实施方式中，所述试剂特异性结合人类Notch2和Notch3。在特定实施方式中，所述试剂特异性结合人类Notch3。
在一方面，本发明提供59R1抗体，所述59R1抗体包含分别在SEQ ID NO：16和18(带有或不带有信号序列)中提供的的重链和轻链序列，或由DNA编码，所述DNA于2008年10月15日保藏在ATCC，并赋予保藏号PTA-9547。本发明还提供包含所述59R1抗体的重链可变区(例如，SEQ ID NO：14)和/或轻链可变区(例如，SEQID NO：13)的多肽或抗体。本发明还提供包含所述59R1抗体的1个或多个(例如1个、2个或3个)重链CDR和/或1个或多个轻链CDR的多肽或抗体。在另外的实施方式中，本发明提供了所结合表位与59R1抗体相同的抗体或与59R1抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合的抗体。
在另一方面，本发明提供59R5抗体，所述59R5抗体包含分别在SEQ ID NO：49和18(带有或不带有信号序列)中提供的重链和轻链序列，或由DNA编码，所述DNA于2009年7月6日保藏在ATCC，并赋予保藏号[...]。本发明还提供包含重链可变区和/或轻链可变区序列SEQ ID NO：50和/或SEQ ID NO：13的多肽或抗体。本发明还提供包含59R5抗体的1个或多个(例如1个、2个或3个)重链CDR和/或1个或多个轻链CDR的多肽或抗体。在另外的实施方式中，本发明提供了所结合表位与59R5抗体相同的抗体或与59R5抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合的抗体。
在某些其它实施方式中，本发明提供了与两种以上(即，至少两种或者两种、三种或四种)人类Notch受体特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述抗体与两种以上人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合。在特定实施方式中，所述抗体是与两种以上人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的单特异性抗体。在特定实施方式中，所述抗体与Notch1、Notch2或Notch4的EGF10、和/或Notch3的EGF9结合。在特定实施方式中，所述抗体结合的非配体结合区不是EGF4或不包含EGF4。在特定实施方式中，所述两种以上人类Notch受体包括Notch2和/或Notch3。在特定实施方式中，所述两种以上人类Notch受体包括Notch2和Notch3。在特定实施方式中，所述抗体是所述两种以上人类Notch受体的拮抗剂。
本发明还提供调节受试对象中周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的方法，其中所述方法包括对受试对象施用有效量的特异性结合人类Notch2和/或人类Notch3的试剂。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。
本发明还提供抑制受试对象中血管发生的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的特异性结合人类Notch2和/或人类Notch3的试剂的步骤。在特定实施方式中，所述试剂是抗体。在特定实施方式中，所述试剂是拮抗剂。在特定实施方式中，所述拮抗剂是Notch2的拮抗剂。在特定实施方式中，所述拮抗剂是Notch3的拮抗剂。在特定实施方式中，所述拮抗剂是Notch2和Notch3的拮抗剂。在某些实施方式中，所述抑制血管发生的方法包括调节周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能。在某些实施方式中，所述血管发生是肿瘤血管发生。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂是与人类Notch受体特异性结合的拮抗剂。在某些替代性实施方式中，所述Notch结合剂是与人类Notch受体特异性结合的激动剂。
在特定实施方式中，与一种或多种Notch受体特异性结合并且是所述一种或多种Notch受体的拮抗剂的试剂抑制所结合Notch受体的一种或多种活性的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。
在特定实施方式中，所述一种或多种人类Notch受体(例如，Notch2和/或Notch3)的拮抗剂具有一种或多种以下效果：抑制一种或多种人类Notch受体的配体结合，抑制一种或多种人类Notch受体的配体诱导的信号传导；抑制肿瘤细胞的增殖；通过减少癌干细胞在肿瘤中的频率而减少肿瘤的致瘤性；抑制肿瘤生长；增加存活、触发肿瘤细胞的细胞死亡；抑制血管发生；或防止肿瘤细胞的转移。
在特定实施方式中，所述拮抗剂具有一种或多种以下效果：干扰Notch受体的表达；通过例如空间上抑制Notch受体和一种或多种其配体之间的相互作用、或与人类Notch受体结合而干扰Notch受体信号转导途径的激活和触发细胞死亡或抑制细胞增殖。
在特定实施方式中，针对诸如Notch2或Notch3等Notch受体的拮抗剂在胞外对Notch受体起作用，或抑制所述Notch受体的功能。在特定实施方式中，拮抗剂是与Notch受体的胞外域结合的小分子。在特定实施方式中，Notch受体的拮抗剂是蛋白质性的(proteinaceous)。在某些实施方式中，Notch受体的蛋白质性拮抗剂是与Notch受体的细胞外表位特异性结合的抗体。针对Notch受体的拮抗剂的细胞外结合通过抑制Notch受体的固有激活(例如激酶活性)和/或通过空间上抑制例如Notch受体与其配体之一的相互作用，从而能够抑制Notch受体的信号传导。另外，针对Notch受体的拮抗剂的细胞外结合通过例如使Notch受体内化和/或减少Notch受体的细胞表面运输，从而能够下调Notch受体的细胞表面表达。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂(例如，抗体)与至少一种人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合，其中所述非配体结合区包含EGF重复10(或如果是Notch3的话则是其等效物)。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与Notch2特异性结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与Notch3特异性结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与人类Notch2和人类Notch3特异性结合。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂(例如，抗体)与人类Notch2的EGF10域特异性结合。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂不与EGF10域外的人类Notch2的任何区域结合。在某些替代性实施方式中，与人类Notch2的EGF10域特异性结合的Notch结合剂或拮抗剂还与人类Notch2的另一区域结合。换言之，在某些实施方式中，所述试剂或拮抗剂的全部表位落入EGF10中。在某些其它实施方式中，与人类Notch2结合的试剂或拮抗剂的表位与EGF10部分重叠。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与位于人类Notch2EGF10内的序列HKGAL(SEQID NO:28)的至少一部分结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂还与人类Notch2EGF10内的其它氨基酸结合(例如，抗Notch2抗体的完整表位不必全部包含于序列HKGAL内)。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂还与至少一种其它人类Notch受体(例如，Notch1、Notch3或Notch4)特异性结合。在特定实施方式中，与人类Notch2的EGF10结合的Notch结合剂或拮抗剂还与人类Notch1的EGF10域、人类Notch3的EGF9域和/或人类Notch4的EGF10域结合。在特定实施方式中，所述其它人类Notch受体是人类Notch3。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂(例如，抗体)与人类Notch3的EGF9域结合。从人类Notch2和人类Notch3的胞外域的序列之间的同源性明显看出，在人类Notch3中EGF9是Notch2EGF10的功能/结构等效物。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂不与EGF9外的人类Notch3的任何区域结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与位于人类Notch3EGF9域内的序列HEDAI(SEQ IDNO：29)的至少一部分结合。HEDAI(SEQ ID NO：29)是与人类Notch2EGF10内的序列HKGAL(SEQ ID NO：28)相对应的Notch3EGF9域内的序列。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂还与人类Notch3EGF9内的其它氨基酸结合。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂还与至少一种其它人类Notch受体(例如，Notch1、Notch2和/或Notch4)的EGF10域特异性结合。在特定实施方式中，所述其它人类Notch受体是人类Notch2，例如与人类Notch2的EGF10域结合的试剂或拮抗剂。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂不与EGF10外的人类Notch2的任何区域结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与位于人类Notch2EGF10内的序列HKGAL(SEQ ID NO:28)的至少一部分结合。在某些实施方式中，所述试剂或拮抗剂是与Notch2中的序列HKGAL(SEQ ID NO：28)的至少一部分结合并且还与Notch3中的序列HEDAI(SEQ ID NO：29)的至少一部分结合的单特异性抗体。
在某些替代性实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂与除了EGF10之外的区域的Notch1、Notch2或Notch4受体的胞外域的非配体结合区的至少一部分结合，或与除了EGF9之外的区域的Notch3受体的胞外域的非配体结合区的至少一部分结合。例如，在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与一种或多种Notch受体的LNR-HD域结合。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与一种或多种Notch受体的胞外域的EGFl、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5、EGF6、EGF7、EGF9、EGF10、EGF13、EGF14、EGF15、EGF16、EGF17、EGF18、EGF19、EGF20、EGF21、EGF22、EGF23、EGF24、EGF25、EGF26、EGF27、EGF28、EGF29、EGF30、EGF31、EGF32、EGF33、EGF34、EGF35和/或EGF36结合。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂与一种或多种人类Notch受体的胞外域的配体结合区结合。因此，在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂可以与Notch1、2或4的EGF11和/或EGF12结合(Rebay等，1991，Cell 67：687；Lei等，2003，Dev.130：6411；Hambleton等，2004，Structure 12：2173)或与Notch3的EGF10和/或EGF11结合(Peters等，2004，Experimental Cell Research，299：454-464)。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂(例如，抗体)与两种以上人类Notch受体(例如，Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4)特异性结合。换言之，在特定实施方式中，所述试剂或抗体结合至少两种人类Notch受体(即，两种、三种或四种人类Notch受体)。所涵盖的有与两种人类Notch家族受体(例如，Notch2和Notch3、Notch1和Notch2、Notch1和Notch3、Notch1和Notch4、Notch2和Notch4，或Notch3和Notch4)特异性结合的试剂和抗体。还设想了与三种人类Notch受体家族成员特异性结合的试剂和抗体(例如，与Notch1、Notch2和Notch3；Notch1、Notch2和Notch4；或Notch2、Notch3和Notch4特异性结合的试剂和抗体)，以及与四种人类Notch受体家族成员特异性结合的试剂和抗体(例如，与Notch1、Notch2、Notch3和Notch4特异性结合的试剂和抗体)。在特定实施方式中，所述试剂或抗体与人类Notch2和Notch3特异性结合。在某些替代性实施方式中，所述试剂或抗体与人类Notch1和Notch2特异性结合。在某些实施方式中，所述试剂或抗体与人类Notch1和Notch3特异性结合。在另外实施方式中，所述试剂或抗体与人类Notch1和Notch4特异性结合。在特定实施方式中，所述试剂或抗体是所述两种以上人类Notch受体的拮抗剂。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂与Notch受体(例如，Notch2和/或Notch3)结合的解离常数是约1μM以下、约100nM以下、约40nM以下、约20nM以下或约10nM以下。在特定实施方式中，所述试剂或拮抗剂与一种或多种人类Notch受体(例如人类Notch2和/或人类Notch3)结合的KD为1nM以下。在某些实施方式中，所述Notch结合剂是与Notch2结合的KD为约1nM以下的抗体。在某些实施方式中，所述Notch结合剂是与Notch3结合的KD为约1nM以下的抗体。在特定实施方式中，相对于特定Notch受体的试剂或拮抗剂的解离常数是使用固定在Biacore芯片上的包含Notch胞外域和/或包含EGF10的胞外域的一部分的Notch-Fc融合蛋白确定的解离常数。
在特定实施方式中，所述拮抗剂与人类Notch3特异性结合并且抑制配体(例如，DLL4、JAG1和/或JAG2)与人类Notch3的结合和/或抑制人类Notch3的信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂与人类Notch2特异性结合并且抑制配体(例如，DLL4、JAG1和/或JAG2)与人类Notch2的结合和/或抑制人类Notch2的信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂抑制DLL4诱导的Notch2信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂抑制DLL4诱导的Notch3信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂抑制JAG2诱导的Notch2信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂抑制JAG2诱导的Notch3信号传导。在特定实施方式中，由Notch2和/或Notch3进行的信号传导被减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在特定实施方式中，一种或多种配体与Notch2和/或Notch3的结合被减少至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。
在某些实施方式中，针对Notch受体的拮抗剂与Notch受体结合并且具有一种或多种以下效果：抑制肿瘤细胞的增殖、直接在肿瘤细胞中触发细胞死亡或防止肿瘤细胞转移。在特定实施方式中，Notch受体的拮抗剂经由缀合毒素、化学治疗剂、放射性同位素或其它此类试剂触发细胞死亡。例如，针对Notch受体的抗体与通过蛋白内化而在表达Notch受体的肿瘤细胞中激活的毒素缀合。在其它实施方式中，Notch受体的拮抗剂经由抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)而介导表达Notch受体的细胞的细胞死亡。ADCC涉及通过识别抗体的Fc部分的效应细胞进行的细胞裂解。例如，许多淋巴细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、粒细胞和嗜酸性粒细胞具有Fc受体并且能够介导细胞溶解(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497)。在某些实施方式中，Notch受体的拮抗剂是通过激活补体-依赖性细胞毒性(CDC)触发表达Notch受体的细胞的细胞死亡的抗体。CDC参与针对抗体的Fc部分的血清补体的结合和补体蛋白级联的随后激活，导致细胞膜损伤和最终的细胞死亡。在很大程度上，已知抗体的生物活性由抗体分子的恒定域或Fc区确定(Uananue和Benacerraf，教科书Immunology，第2版，Williams&Wilkins，第218页(1984))。不同类别和亚类的抗体在该方面有所不同，正如相同亚类但来自不同物种的抗体一样。人类抗体中，IgM是结合补体最有效类别的抗体，然后是IgGl、IgG3和IgG2，而IgG4在激活补体级联方面似乎非常不足(Dillman，1994，J.Clin.Oncol.12：1497；Jefferis等，1998，Immunol.Rev.163：59-76)。根据本发明，制备了具有所需生物活性的这些类别的抗体。
可以测定针对Notch受体的任何特定抗体通过补体激活和/或ADCC介导靶细胞的裂解的能力。使目的细胞在体外生长和进行标记；向细胞培养物添加所述抗体以及通过抗原抗体复合物而激活的血清补体或免疫细胞。例如通过来自被裂解的细胞的标记的释放检测靶细胞的细胞溶解。事实上，可以使用患者自身血清作为补体和/或免疫细胞的来源对抗体进行筛选。然后可以将在体外测试中能够激活补体或介导ADCC的抗体治疗性用于该特定患者。
在特定实施方式中，Notch结合剂或拮抗剂是不具有一种或多种效应子功能的抗体。例如，在某些实施方式中，所述抗体不具有抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)活性，和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在特定实施方式中，所述抗体不与Fc受体和/或补体因子结合。在特定实施方式中，所述抗体不具有效应子功能。
在其它实施方式中，Notch受体的拮抗剂通过抑制血管发生可间接触发细胞死亡。血管发生是通过新血管从已有脉管形成的过程，并且是在例如胚胎发育、伤口愈合和排卵反应期间的正常生长所需的基础过程。大于1mm2～2mm2的实体瘤生长也需要血管发生来供应营养物和氧，否则肿瘤细胞就会死亡。因此在特定实施方式中，Notch受体的拮抗剂靶向表达Notch受体的血管细胞，例如内皮细胞、平滑肌细胞或血管组装所需的细胞外基质的组分。在特定实施方式中，Notch受体(例如，Notch2和/或Notch3)的拮抗剂靶向周细胞和/或血管平滑肌细胞。在其它实施方式中，Notch受体的拮抗剂抑制血管细胞募集(recruitment)、组装、维持或存活所需的生长因子信号传导。在特定实施方式中，所述拮抗剂调节周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂(例如，抗体)单独地或与第二治疗剂组合时能够抑制肿瘤生长。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂能够抑制体内(例如，在异种移植物小鼠模型中和/或在患有癌症的人类中)肿瘤生长。在特定实施方式中，在异种移植物模型中在给定时间点所述Notch结合剂或拮抗剂能够将肿瘤生长抑制至少约10％、至少约25％、至少约50％、少约75％、少约90％。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂预防肿瘤生长。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂抑制肿瘤复发。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂能够减少肿瘤的致瘤性。在特定实施方式中，所述试剂或抗体能够减少诸如小鼠异种移植物模型等动物模型中包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性。在特定实施方式中，肿瘤中癌干细胞的数量或频率减少至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍(例如，在异种移植物模型中)。在特定实施方式中，通过使用动物模型进行有限稀释检测确定了癌干细胞频率的减少。以下在实施例8中提供用于测试抗Notch抗体的功效的有限稀释检测的实例。关于使用有限稀释检测来确定肿瘤中癌干细胞的数量和频率的减少的其它实例和指南可以发现于例如国际公开WO 2008/042236、美国专利申请公开第2008/0064049和2008/0178305号，本文通过参考并入每一篇的全文。
本发明提供各种多肽，包括但不限于抗体或抗体的片段。在特定实施方式中，所述多肽是分离的。在某些替代性实施方式中，所述多肽基本上是纯的。
在特定实施方式中，本发明的多肽可以是包含序列SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57(带有或不带有指出的信号序列)的重组多肽、天然多肽或合成多肽，以及包含由多核苷酸SEQ ID NO：1、3、15、17、47、48、58、59或60(带有或不带有指出的信号序列)编码的多肽的多肽。
本发明提供了包含分别在SEQ ID NO：16和/或SEQ ID NO：18中提供的59R1的重链和/或轻链的多肽。在特定实施方式中，所述多肽是抗体。在特定实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和/或Notch3。在某些实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和Notch3。
本发明提供了包含分别在SEQ ID NO：49和/或SEQ ID NO：18中提供的59R5的重链和/或轻链的多肽。在特定实施方式中，所述多肽是抗体。在特定实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和/或Notch3。在某些实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和Notch3。
本发明还提供包含SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：14的多肽。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：14的可变重链序列。在某些实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和含有SEQ ID NO：14的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：50的可变重链序列。在某些实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和含有SEQ IDNO：50的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：52的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：53的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：54的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：55的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：56的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽包含含有SEQ ID NO：13的可变轻链序列和/或含有SEQ ID NO：57的可变重链序列。在特定实施方式中，所述多肽是抗体。在特定实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和/或Notch3。在某些实施方式中，所述多肽特异性结合Notch2和Notch3。在某些实施方式中，所述多肽特异性结合人类Notch2。在某些实施方式中，所述多肽特异性结合人类Notch3。
本领域承认可以对本发明的某些氨基酸序列进行变化而不会显著影响蛋白的结构或功能。如果关注序列上的所述差异，应该记得在蛋白上存在确定活性的关键区域。因此，本发明还包括显示基本活性的多肽的改变。此类突变包括缺失、插入、倒置、重复和类型取代。可以在Bowie等，Deciphering the Message in Protein Sequences：Tolerance to Amino Acid Substituations，1990，Science 247：1306-1310中发现关于哪一种氨基酸变化可能是表型上沉默的指南。
因此，本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是：(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(经常是保守性氨基酸残基)取代的多肽的片段、衍生物或类似物，并且这种取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码所编码的氨基酸；或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基的多肽的片段、衍生物或类似物；或(iii)其中成熟多肽与另一化合物融合的多肽的片段、衍生物或类似物，所述化合物例如是增加所述多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽融合的多肽的片段、衍生物或类似物，例如前导序列或分泌序列或用于对成熟多肽或前蛋白序列进行纯化的序列。这种片段、衍生物或类似物被视为在本文教导的范围之内。
特别感兴趣的是带电氨基酸被另一带电氨基酸和被中性或带负电氨基酸取代。后者产生正电荷减少的蛋白质。蛋白的正电荷减少可导致蛋白聚集，而防止凝集是高度期望的。蛋白的凝集不仅导致活性丧失，由于其具有免疫原性，在制备药物制剂时也有问题。(Pinckard等，1967，Clin.Exp.Immunol.2：331-340，Robbins等，1987，Diabetes 36：838-845；Cleland等，1993，Crit.Rev Therapeutic Drug Carrier Systems 10：307-377)。
如所示，氨基酸变化通常对于微小的性质，例如不显著影响蛋白的折叠或活性的保守性氨基酸取代(参见表1)。
表1.保守性氨基酸取代
当然，进行的氨基酸取代的数量取决于许多因素，包括上文所述的那些。在特定实施方式中，对于任何给定的多肽，取代的数量不超过50个、40个、30个、25个、20个、15个、10个或3个。
在特定实施方式中，本发明的多肽和多核苷酸以分离形式提供，并且有时经纯化以使其具有均一性。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽，和与SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽具有至少90％相似性(在某些时候具有至少90％序列同一性)的多肽，和与SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽具有至少95％相似性(在某些时候具有至少95％序列同一性)的多肽，以及在其它实施方式中，与SEQ IDNO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多肽具有至少96％、97％、98％或99％相似性(在某些时候具有至少96％、97％、98％或99％序列同一性)的多肽。本领域已知，通过将一个多肽的氨基酸序列和其保守性氨基酸取代与第二多肽的序列进行比较来确定两个多肽之间的“相似性”。
使用本发明多肽的片段或部分可以通过肽合成来生产相应的全长多肽；因此可以将所述片段用作生产全长多肽的中间体。本发明多核苷酸的片段或部分可用于合成本发明的全长多核苷酸。
在特定实施方式中，本发明蛋白的片段是能够与Notch1受体蛋白结合的蛋白的部分或全部。该片段对Notch受体或Notch受体的配体具有高亲和性。融合蛋白的某些片段是包含与免疫球蛋白的至少部分恒定区融合的所述多肽试剂或拮抗剂的至少部分Notch结合域的蛋白片段。亲和性通常为约10-11M～10-12M，不过亲和性可以随着片段尺寸的不同而从10-7M～10-13M显著变化。在某些实施方式中，所述片段长度为约10～110个氨基酸，并且包含与免疫球蛋白的至少部分恒定区连接的多肽试剂或拮抗剂的Notch结合域。
可以对所述多肽和类似物进一步进行修饰以含有正常情况下不是所述蛋白部分的其它化学基团(chemical moieties)。这些衍生的基团可以改善蛋白的溶解度、生物半衰期和/或吸附。该基团还可以减少或消除所述蛋白的任何不期望的副作用等。可以在雷明顿药典(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第20版，Mack Publishing Co.，Easton，PA(2000)中发现关于化学基团的综述。
可以通过本领域已知的任何合适的方法生产本文所述的分离的多肽。所述方法从直接蛋白合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并在合适的经转化宿主中表达这些序列。
在重组方法的某些实施方式中，通过分离或合成编码野生型目的蛋白的DNA序列来构建DNA序列。可选的是，可以通过位点特异性突变来对所述序列进行诱变从而提供其功能类似物。参见，例如Zoeller等，1984，Proc.Nat Acad.Sci.USA 81：5662-5066和美国专利第4,588,585号。另一构建编码目的多肽的DNA序列的方法通过使用寡核苷酸合成仪的化学合成进行。可以基于所需多肽的氨基酸序列和选择在会产生重组目的多肽的宿主细胞中受偏爱的那些密码子来设计所述寡核苷酸。
可以应用标准方法来合成编码分离的目的多肽的分离的多核苷酸序列。例如，可以使用完整氨基酸序列来构建反译(back-translated)基因。另外，可以合成含有编码特定分离的多肽的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的各部分的小型寡核苷酸并将其连接。各寡核苷酸通常含有5'或3'突出端以用于互补组装。
一旦进行组装(通过合成、定点突变或另一方法)，则将编码特定的分离的目的多肽的突变DNA序列插入表达载体中并可操作地连接至适合在所需宿主中表达蛋白的表达控制序列。可以通过核苷酸测序、限制酶作图和在合适宿主中表达生物活性多肽来确认合适的组装。如本领域众所周知，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，将该基因可操作地连接至转录和翻译表达控制序列，该表达控制序列在所选表达宿主中具有功能。
可以使用重组表达载体来扩增和表达编码多肽的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，其具有编码Notch受体融合物或生物等效类似物的合成或cDNA来源的DNA片段，所述DNA片段与源自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调节元件可操作地连接。如以下详细描述，转录单元通常包括以下组件的组装体：(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件，例如，转录启动子或增强子，(2)转录为mRNA并且翻译成蛋白的结构或编码序列，和(3)合适的转录和翻译启动和终止序列。所述调节元件可以包括用于控制转录的操作子序列。可以另外引入通常赋予在宿主中复制的能力的复制原点，和便于识别转化体的选择基因。当DNA区域相互功能上相关时，将它们可操作地连接。例如，如果信号肽(分泌前导)的DNA表达为参与多肽分泌的前体，则信号肽(分泌前导)的DNA可操作地与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子控制编码序列的转录，则启动子与编码序列可操作地连接；或如果核糖体结合位点经定位而允许翻译，则核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意味着是连续的，并且在分泌前导区的情况下，意味着连续并且在阅读框中。旨在在酵母表达系统中使用的结构元件包括能够使宿主细胞将翻译蛋白分泌到胞外的前导序列。作为选择，当表达不具有前导序列或转运序列的重组蛋白时，其可以包括N末端蛋氨酸残基。可选地是可以随后从表达重组蛋白中切割下该残基以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择取决于宿主的选择。可以使用各种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括，例如，包含来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，例如包括pCR1、pBR322、pMB9和其衍生物等在内的来自大肠杆菌的质粒，以及诸如M13和丝状单链DNA噬菌体等广宿主范围质粒。
用于在合适启动子的控制下表达多肽的合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高级真核细胞包括本文所述哺乳动物来源的已建立细胞系。还可以使用无细胞翻译系统。Pouwels等描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体(Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985)，在此通过参考并入其相关内容。
有利的是还使用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白。可以在哺乳动物细胞中进行重组蛋白的表达，因为所述蛋白通常正确地折叠、合适地修饰和具有完全功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括Gluzman 1981，Cell 23：175所述的猴肾细胞的COS-7系，和能够表达合适载体的其它细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可以包含与待表达基因连接的诸如复制原点、合适的启动子和增强子等非转录元件和其它5'或3'侧翼非转录序列，以及诸如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列等5'或3'非翻译序列。用于在昆虫细胞中产生异源性蛋白的杆状病毒系统由Luckow和Summers，1988，Bio/Technology，6：47综述。
可以根据任何合适的方法对由经转化宿主产生的蛋白进行纯化。所述标准方法包括色谱(例如离子交换色谱、亲和色谱和分级柱(sizing column)色谱)、离心、差别溶解度或通过用于蛋白纯化的任何其它标准方法。诸如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶等亲和标签可以与蛋白连接，从而允许通过合适的亲和柱容易地进行纯化。使用诸如蛋白水解、核磁共振和X-射线晶体学也可以物理地表征分离的蛋白。
例如，可以首先使用商购的蛋白浓缩过滤器，例如Amicon或Milhpore Pellicon超滤装置对来自将重组蛋白分泌到培养基中的系统的上清液进行浓缩。浓缩步骤后，将浓缩物施加到合适的纯化基质。作为选择，可以使用阴离子交换树脂，例如具有下垂的二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或基底。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白纯化中常用的其它种类。作为选择，可以使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种含有磺丙基或羧甲基的不溶性基质。最后，可以使用一种或多种反相高效液相色谱(RP-HPLC)步骤来进一步纯化癌干细胞蛋白-Fc组合物，所述反相高效液相色谱步骤采用诸如具有下垂甲基或其它脂肪族基团的硅胶等疏水性RP-HPLC介质。还可以以各种组合使用上述纯化步骤中的一些或全部，从而提供均一性的重组蛋白。
细菌培养物中产生的重组蛋白通常通过起始提取从细胞团块中分离，然后是一步或多步浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。对于最后的纯化步骤可以使用高效液相色谱(HPLC)。可以通过任何常规方法破坏重组蛋白表达中所用的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破坏或是使用细胞裂解剂。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂包含抗体。在特定实施方式中，所述抗体是分离的。在特定实施方式中，所述抗体基本上是纯的。
本发明提供了这样的抗体：该抗体与包含含有SEQ ID NO：14的重链可变区和含有SEQ ID NO：13的轻链可变区的抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合。本发明还提供了这样的抗体：该抗体与包含59R1IgG2的抗体、由59R1IgG2组成的抗体或基本上由59R1IgG2组成的抗体竞争对人类Notch2和/或Notch3的特异性结合，59R1IgG2抗体包含分别为SEQ ID NO：16和18(带有或不带有信号序列)的重链和轻链，或由DNA编码，所述DNA于2008年10月15日保藏在ATCC，并赋予保藏号PTA-9547。
本发明还提供与一种或多种Notch受体特异性结合的抗体，所述抗体包含SEQ IDNO：5至10、22至27、30或51的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个CDR，每个CDR具有最多4(即，0、1、2、3或4)个保守性氨基酸取代(例如见表1)。本发明还提供与一种或多种Notch受体特异性结合的抗体，所述抗体包含59R1的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个CDR(即，SEQ ID NO：5至10)，每个CDR具有最多4个保守性氨基酸取代。因此，本发明提供与一种或多种Notch受体特异性结合的抗体，所述抗体包含59R1的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个CDR。在特定实施方式中，所述抗体包含具有最多4个保守性氨基酸取代的59R1的重链CDR3和/或具有最多4个保守性氨基酸取代的59R1的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有GIFFAI(SEQ ID NO：7)的重链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有GASSRAT(SEQ IDNO：9)的轻链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体。
本发明还提供与一种或多种Notch受体特异性结合的抗体，所述抗体包含59R5的1个、2个、3个、4个、5个和/或6个CDR(即，SEQ ID NO：5、6、8至10、51)，每个CDR具有最多4个保守性氨基酸取代。在特定实施方式中，所述抗体包含具有最多4个保守性氨基酸取代的59R5的重链CDR3和/或具有最多4个保守性氨基酸取代的59R5的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQID NO：5)的重链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有SIFYTT(SEQ ID NO：51)的重链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体；和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3，或包含1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代的其变体。在特定实施方式中，所述抗体包含含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和/或含有SIFYTT(SEQ IDNO：51)的重链CDR3。
还提供的是特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ IDNO：6)的重链CDR2和/或含有(G/I)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N)(SEQ ID NO：30)的重链CDR3。在特定实施方式中，所述重链CDR3选自由SIFYPT(SEQ ID NO：22)、SSFFAS(SEQ ID NO：23)、SSFYAS(SEQ ID NO：24)、SSFFAT(SEQ ID NO：25)、SIFYPS(SEQ ID NO：26)和SSFFAN(SEQ ID NO：27)组成的组。在特定实施方式中，所述抗体包含含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2、和/或含有GIFFAI(SEQ ID NO：7)的重链CDR3。在特定实施方式中，所述重链CDR位于抗体重链的可变区内。在特定实施方式中，所述抗体还包含含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在特定实施方式中，所述轻链CDR位于抗体轻链的可变区内。在特定实施方式中，对所述重链CDR和/或轻链CDR通过1个、2个、3个或4个保守性氨基酸取代进行修饰。在特定实施方式中，通过不超过1至2个保守性氨基酸取代对各CDR进行修饰。
例如，在特定实施方式中，本发明提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含：(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和含有GIFFAI(SEQ ID NO：7)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。在某些实施方式中，所述抗体同时包含所指出的轻链CDR和重链CDR。
在某些实施方式中，本发明提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含(a)含有SSSGMS(SEQ ID NO：5)的重链CDR1、含有VIASSGSNTYYADSVKG(SEQ ID NO：6)的重链CDR2和含有SIFYTT(SEQ IDNO：51)的重链CDR3；和/或(b)含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和含有QQYSNFPI(SEQ IDNO：10)的轻链CDR3。在特定实施方式中，所述抗体同时包含所指出的轻链CDR和重链CDR。
本发明还提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含含有RASQSVRSNYLA(SEQ ID NO：8)的轻链CDR1、含有GASSRAT(SEQ ID NO：9)的轻链CDR2和/或含有QQYSNFPI(SEQ ID NO：10)的轻链CDR3。
本发明还提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO：13或SEQ IDNO：19具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的多肽。因此，在特定实施方式中，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO：14具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO：13具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在特定实施方式中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：20的多肽(例如，重链可变区)；和/或(b)包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19的多肽(例如，轻链可变区)。
本发明还提供特异性结合人类Notch2和/或Notch3的抗体，其中所述抗体包含：(a)与SEQ ID NO：50具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的多肽；和/或(b)与SEQ ID NO：13具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％序列同一性的多肽。因此，在特定实施方式中，所述抗体包含(a)与SEQ ID NO：50具有至少约95％序列同一性的重链可变区；和/或(b)与SEQ ID NO：13具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在特定实施方式中，所述抗体包含：(a)包含SEQ ID NO：50的多肽(例如，重链可变区)；和/或(b)包含SEQ ID NO：13的多肽(例如，轻链可变区)。
在特定实施方式中，所述拮抗剂是可以接到补体依赖性细胞毒性或抗体依赖性细胞的细胞毒性从而杀死表达靶抗原的肿瘤的抗体。在某些替代性实施方式中，所述抗体与毒素或放射性同位素直接缀合从而介导肿瘤细胞杀死。另外，肿瘤存活取决于新血管化形成，并且在特定实施方式中，所述抗体具有抗血管发生效果。
本发明提供针对诸如人类Notch2和/或Notch3等Notch受体的分离的抗体。所述抗体或抗体片段可以是特异性识别所述Notch受体的任何单克隆抗体或多克隆抗体。在某些实施方式中，本发明提供与本文所述Notch受体特异性结合的单克隆抗体或其片段。在某些实施方式中，所述单克隆抗体或其片段是与本文所述的Notch受体的胞外域特异性结合的嵌合抗体或人源化抗体。在其它实施方式中，所述单克隆抗体或其片段是与本文所述的Notch受体的胞外域特异性结合的人类抗体。在特定实施方式中，所述抗体是IgG1或IgG2抗体。
发现针对Notch受体的抗体可用于本文所述的实验、诊断和治疗方法。在特定实施方式中，使用本发明的抗体来检测生物样品中Notch受体的表达，所述生物样品例如患者组织活检物、胸腔积液或血液样品。可以对组织活检物进行切片并且使用例如免疫荧光或免疫组织化学法检测蛋白。作为选择，分离来自样品的个体细胞，并通过FACS分析在固定细胞或活细胞上检测蛋白表达。另外，可以在蛋白阵列上使用所述抗体来检测例如肿瘤细胞上、细胞裂解物中或其它蛋白样品中的Notch受体的表达。在其它实施方式中，在体外基于细胞的检测中或在体内动物模型中，通过使肿瘤细胞与本发明的抗体接触，从而使用本发明的抗体来抑制肿瘤细胞的生长。在其它实施方式中，通过施用治疗有效量的针对Notch受体的抗体，从而使用所述抗体来治疗人类患者中的癌。
可以通过任何已知方法制备多克隆抗体。通过用相关抗原(经纯化的肽片段、全长重组蛋白、融合蛋白等)的多次皮下或腹膜内注射对动物(例如兔、大鼠、小鼠、羊、驴等)进行免疫来产生多克隆抗体，所述相关抗原可选地与匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白等缀合、稀释于无菌盐水并与佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂)组合以形成稳定的乳液。然后从如此免疫的动物的血液和腹水等中回收多克隆抗体。使收集的血液凝固，滗析血清，通过离心使其澄清，并且测定抗体滴度。可以根据本领域的标准方法从血清或腹水中纯化多克隆抗体，所述标准方法包括亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳、透析等。
使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，所述杂交瘤方法例如Kohler和Milstein，1975，Nature 256：495中所述的方法。使用所述杂交瘤方法，如上所述对小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物进行免疫，从而引起淋巴细胞产生会与免疫抗原特异性结合的抗体。作为选择，可以在体外对淋巴细胞进行免疫。免疫后，分离淋巴细胞，并使用例如聚乙二醇将其与合适的骨髓瘤细胞系融合，从而形成杂交瘤细胞，然后将该杂交瘤细胞从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞中选择出。然后可以使用标准方法(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Academic Press，1986)进行体外培养或在动物中体内地作为腹水肿瘤使产生特异性针对所选择抗原的单克隆抗体的杂交瘤增殖，所述所选择抗原通过免疫沉淀、免疫印迹，或通过诸如放射免疫检测(RIA)或酶联免疫吸附检测(ELISA)等体外结合检测确定。然后可以按照关于以上多克隆抗体所述从培养基或腹水流体中对单克隆抗体进行纯化。
作为选择还可以使用美国专利第4,816,567号中所述的重组DNA方法制备单克隆抗体。例如通过RT-PCR使用特异性扩增编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物，从成熟B细胞或杂交瘤细胞中分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并且使用常规方法确定其序列。然后将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，当其被转染到宿主细胞中时就在宿主细胞中表达单克隆抗体，所述宿主细胞未被转染时就不产生免疫球蛋白，例如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。另外，例如如本文所述，可以从噬菌体展示文库中分离所需物种的重组单克隆抗体或其片段。
可以使用重组DNA技术以多种不同的方式对编码单克隆抗体的多核苷酸进行进一步修饰，从而产生替代性的抗体。在某些实施方式中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定域可以被：1)被例如人类抗体的那些区域取代从而产生嵌合抗体或2)被非免疫球蛋白多肽取代从而产生融合抗体。在其它实施方式中，将所述恒定区截短或除去从而产生单克隆抗体的所需抗体片段。另外，可使用可变区的定点突变或高密度突变发生来优化单克隆抗体的特异性、亲和性等。
通常而言，可以从任何抗体获得或衍生出可用于本发明的修饰抗体。另外，用于产生所述经修饰抗体的亲本抗体或前体抗体，或其片段，可以是鼠类的、人类的、嵌合的、人源化的、非人灵长类的或灵长源化的。在其它实施方式中，本发明的经修饰抗体可以包括具有本文所述的经改变的恒定域的单链抗体构建体(例如美国专利第5,892,019号中公开的，通过参考将其并入本文)。因此，根据本文教导修饰的这些类型抗体中的任何抗体都与本发明相容。
根据本发明，使技术适于生产对本发明的多肽具有特异性的单链抗体(参见美国专利第4,946,778号)。另外，可使方法适于构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science，246：1275-1281)，从而允许快速有效地鉴定对Notch或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab片段。可以通过本领域技术生产含有对本发明多肽是独特型的抗体片段，所述片段包括，但不限于：(a)通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，和(d)Fv片段。
双特异性抗体也在本发明的范围之内。双特异性抗体是对至少两个不同抗原(或，在特定实施方式中，对同一抗原上的至少两个不同表位)具有结合特异性的单克隆抗体，优选是人类或人源化抗体。在本案中，结合特异性之一针对本发明的抗原性多肽(Notch，或其片段)，而第二结合靶标是任何其它抗原，并且有利地是细胞表面蛋白，或受体或受体亚基。还提供包含特异性结合一种人类Notch受体(例如，Notch2)的一个抗原结合位点并且还包含特异性结合第二人类Notch受体(例如，Notch3)的第二个不同的抗原结合位点的双特异性抗体。
本领域已知制备双特异性抗体的方法。常规上双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello，Nature 1983，305：537-539)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生十种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和色谱实现对正确分子的纯化。
作为选择，在特定实施方式中，本文所述抗体可以是单特异性的。例如，在特定实施方式中，抗体含有的一个或多个抗原结合位点中的每个都结合或能够结合相同的一种或多种人类Notch受体(例如，Notch2、Notch3、或在Notch2和Notch3上的同源性表位)。在特定实施方式中，本文所述的单特异性抗体的抗原结合位点结合或能够结合人类Notch3的EGF重复9和Notch2的EGF重复10。
可以将具有所需结合特异性的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。融合物具有免疫球蛋白重链恒定域，包括至少部分铰链、CH2和CH3区。含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)可以存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物和如果需要的话，免疫球蛋白轻链的DNA，插入到单独的表达载体中，并将其共转染到合适的宿主生物体中。在Suresh等，1986，Methods in Enzymology，121：210中可以发现产生双特异性抗体的更详细描述。
可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段。在该文献中已经描述了用于从抗体片段产生双特异性抗体的技术。例如，可以使用化学键制备双特异性抗体。另外，Brennan等，1985，Science，229：81描述了其中将完整抗体进行蛋白水解切割以产生F(ab')2片段的步骤。
另外，可以直接从大肠杆菌回收Fab'片段，并对其进行化学偶联以形成双特异性抗体(Shalaby等，J.Exp.Med.1992，175：217-225)。这些方法可用于生产全长人源化双特异性抗体F(ab')2分子。
还涉及具有超过两价的抗体。例如，可以制备三特异性抗体(Tutt等，1991，J.Immunol.147：60)。
示例性的双特异性抗体可以与两个不同的表位结合，其中至少一个表位源自本发明的多肽。作为选择，免疫球蛋白分子的抗-抗原性臂可以与可结合位于白细胞上的触发分子的臂组合，从而将细胞防御机制集中到表达特定抗原的细胞，所述触发分子例如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)，或IgG的Fc受体。还可使用双特异性抗体来将细胞毒性剂导向表达特定抗原的细胞。这些抗体拥有抗原结合臂和结合诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA等细胞毒性剂或放射性核素螯合剂的臂。
异源偶联抗体(Heteroconjugate antibody)也在本发明的范围之内。异源偶联抗体由两个共价结合的抗体组成。例如，已经提出所述抗体可使免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)。设想的是可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备所述抗体，所述合成蛋白质化学包括涉及交联剂的合成蛋白质化学。例如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(或酯)(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸盐(或酯)。
为了本发明的目的，应该意识到经修饰抗体可以包括任何类型的可变区，所述可变区提供所述抗体与Notch多肽的结合。在这点上，所述可变区可以包括或源自任何类型的哺乳动物，可以诱导所述哺乳动物发动体液应答和产生针对所需肿瘤相关抗原的免疫球蛋白。因此，经修饰抗体的可变区可以是例如人类、鼠类、非人灵长类(如食蟹猴、弥猴等)或狼来源。在某些实施方式中经修饰免疫球蛋白的可变区和恒定区是人类的。在其它实施方式中，可以对相容性抗体的可变区(通常源自非人类来源)进行工程化或特异性剪裁，从而改善结合性质或减少所述分子的免疫原性。在这点上，可以对本发明所用的可变区进行人源化，或通过包含所引入的氨基酸序列而进行改变。
在本发明的某些实施方式中，针对Notch受体的单克隆抗体是人源化抗体。人源化抗体是在可变区内含有来自非人类(例如鼠类)抗体的最小序列的抗体。当对人类受试对象施用所述抗体时，治疗学上使用所述抗体来减少免疫原性和HAMA(人抗鼠抗体)应答。实际上，人源化抗体通常是具有最小非人类序列至不含非人类序列的人类抗体。人类抗体是由人类产生的抗体或具有与由人类产生的抗体相应的氨基酸序列的抗体。
可以使用本领域已知的各种技术生产人源化抗体。可以通过用具有所需特异性、亲和性和/或能力的非人类抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的CDR取代人类抗体的CDR而使抗体人源化(Jones等，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等，1988，Nature，332：323-327；Verhoeyen等，1988，Science，239：1534-1536)。可以通过在Fv框架区中和/或在已置换的非人类残基内取代另外的残基而进一步对所述人源化抗体进行修饰，从而改善和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。
作为人源化的替代性方案，可以产生人类抗体。可以使用包括转基因动物、噬菌体文库和体外活化的人类B细胞在内的本领域已知的各种技术制备人类抗体。
例如，可以生产含有人类免疫球蛋白基因座的转基因动物(例如小鼠)，当免疫时，在不存在内源性免疫球蛋白产生下所述人类免疫球蛋白基因座能够产生全部指令集(repertoire)的人类抗体。例如，已经描述了在嵌合的种系突变小鼠中使抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制内源性抗体的产生。将人类种系免疫球蛋白基因阵列转移到所述种系突变小鼠中会导致当抗原挑战时人类抗体的产生。参见，例如，Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551；Jakobovits等，1993，Nature，362：255-258；Bruggemann等，1993，Year in Iminuno.7：33；美国专利第5,545,806；第5,569,825号；第5,591,669号；第5,545,807号；第5,545,807号；第5,625,126号；第5,633,425号和WO 97/17852。
作为选择，可以使用噬菌体展示技术来体外从来自未经免疫供体的免疫球蛋白可变(V)域基因指令集(repertoire)中生产人类抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体V域基因在框架内克隆到诸如M13或fd等丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且作为功能抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能性质的选择还导致编码展示这些性质的抗体的基因的选择。因此，该噬菌体模拟B细胞的某些性质。可以以各种形式进行噬菌体展示。对于噬菌体展示可使用几种来源的V-基因区段。已经从源自经免疫小鼠的脾的V基因的小随机组合文库中分离出抗噁唑酮抗体的各种阵列。可以构建来自未经免疫人类供体的V基因的指令集，并且可以分离针对抗原(包括自体抗原)的各种阵列的抗体。从表达人类抗体的噬菌体文库选择人类抗体的方法是本领域众所周知的(Vaughan等，1996，Nature Biotechnology 14：309-314；Sheets等，1998，PNAS 95：6157-6162；Hoogenboom和Winter，1991，J.Mol.Biol.227：381；McCafferty等，1990，Nature348：552-554；Clackson等，1991，Nature 352：624-628；和Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222：581-597)。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述于美国专利第5,969,108号；第6,172,197号；第5,885,793号；第6,521,404号；第6,544,731号；第6,555,313号；第6,582,915号；第6,593,081号；第6,300,064号；第6,653,068号；第6,706,484；和第7,264,963号；以及Rothe等，2008，J.Mol.Bio.376：1182-1200(通过参考并入每一篇的全文)。诸如链改组等亲和熟化策略(Marks等，1992，Bio/Technology 10：779-783，通过参考并入其全文)是本领域已知的，并且可用于产生高亲和性人类抗体。
可以使用本领域已知的各种技术直接制备人类抗体。可以产生体外免疫的或分离自经免疫个体的永生化人B淋巴细胞，所述经免疫个体产生针对靶抗原的抗体(参见，例如，Cole等，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页；Boemer等，1991，J.Immunol.，147(1)86-95；和美国专利第5,750,373号；第5,567,610号；和第5,229,275号)。
应该意识到将整个非人类可变域移植到人类恒定区会产生“经典”嵌合抗体。在本申请的情况中，术语“嵌合抗体”用来指其中免疫反应区或位点获自或源自第一物种，并且恒定区(根据本发明其可以是完整、部分或经修饰的)获自第二物种的任何抗体。在某些实施方式中，抗原结合区或位点会来自非人类来源(例如小鼠)，并且恒定区是人类的。虽然可变区的免疫原性特异性通常不受其来源影响，与来自非人类来源的恒定区相比，人类恒定区更不可能引发人类受试对象的免疫应答。
通过至少部分置换一个或多个CDR，以及必要时通过部分框架区置换和序列改变，可改变重链和轻链中的可变区。虽然所述CDR可以源自与框架区所源自的抗体相同类别或甚至相同亚类的抗体，可以设想所述CDR源自不同类别的抗体，并且优选源自不同物种的抗体。必须强调为了将一个可变域的抗原结合能力转移到另一个可变域，不需要将全部CDR用来自供体可变区的完整CDR置换。相反，可以仅需要转移对于维持抗原结合位点活性所必需的那些残基。根据美国专利第5,585,089号、第5,693,761号和第5,693,762号中提出的解释，在本领域内可以很好地通过进行常规实验或通过试错试验以获得免疫原性降低的功能抗体。
虽然对可变区进行了改变，但应该意识到本发明的经修饰抗体会包含下述抗体或其免疫反应性片段：其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已经缺失或改变从而提供所需生化和/或生物学特性，例如当与包含天然或未经改变恒定区的免疫原性近似相同的抗体相比，肿瘤定位增加或血清半衰期减少。在某些实施方式中，经修饰抗体的恒定区会包含人类恒定区。与本发明相容的对恒定区的修饰包括在一个或多个域中的一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代。即，本文所述的经修饰抗体可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或轻链恒定区(CL)中的一个或多个进行改变或修饰。在本发明的某些实施方式中涉及其中一个或多个域部分或完全缺失的经修饰恒定区。在其它实施方式中经修饰抗体会包含其中除去整个CH2域的域缺失构建体或变体(ΔCH2构建体)。在其它实施方式中省略的恒定区域会被短的氨基酸间隔子(例如10个残基)置换，所述间隔子提供通常由缺少的恒定区赋予的某些分子柔性。
除了其构造之外，本领域已知恒定区介导几种效应子功能。例如，补体的C1组分与抗体的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的激活还刺激炎性反应，并且还可以涉及自体免疫超敏性。另外，抗体经由Fc区与细胞结合，伴随着位于抗体Fc区上的Fc受体位点与位于细胞上的Fc受体(FcR)结合。存在许多对不同种类的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与位于细胞表面上Fc受体的结合触发许多重要的各种生物应答，包括抗体包被颗粒的内吞和破坏、免疫复合物的清除、抗体包被靶细胞被杀伤细胞裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移和免疫球蛋白产生的控制。虽然已经对各种Fc受体和受体位点研究到一定程度，关于其定位、结构和功能仍然存在许多未知。
虽然不限制本发明的范围，据信包含本文所述进行修饰的恒定区的抗体提供经改变的效应子功能，这进而影响所施用抗体的生物特征。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可以减少Fc受体与循环的经修饰抗体的结合，由此增加肿瘤定位。在其它情况下，可以的是，与本发明相容的恒定区修饰缓和补体结合并且由此减少血清半衰期和缀合细胞毒素的非特异性结合。还可使用恒定区的其它修饰来消除双硫键或寡糖基团，从而由于抗原特异性或抗体柔性增加而增强定位。类似地，使用众所周知的生化或分子生物工程化技术可以容易地进行根据本发明对恒定区的修饰。
应该注意可以对经修饰抗体进行工程化以将CH3域直接融合到各经修饰抗体的铰链区。在其它构建体中理想的是在铰链区和经修饰CH2和/或CH3域之间提供肽间隔子。例如，可以表达相容性构建体，所述构建体中CH2域已经缺失，并且剩余的CH3域(经修饰或未经修饰)与具有5～20个氨基酸的间隔子的铰链区结合。例如，可以添加所述间隔子，从而确保恒定域的调节元件保持自由并且是可接触的，或确保铰链区保持柔性。但是，应该注意在某些情况下，可以证明氨基酸间隔子具有免疫原性，并且引发不想要的针对所述构建体的免疫应答。因此，如果可以维持经修饰抗体的所需生化和/或生物学质量，则向构建体添加的任何间隔子应是相对非免疫原性的，甚至可以一起省略。
除了缺失整个恒定区结构域之外，应意识到可以通过几个甚至单个氨基酸的部分缺失或取代来提供本发明的抗体。例如，在CH2域的所选区域中单个氨基酸的突变可能足以实质地减少Fc结合并由此增加肿瘤定位。类似地，理想的是可简单地缺失一个或多个控制待调节的效应子功能(例如补体Clq结合)的恒定区结构域的部分。恒定区的所述部分缺失可以改善抗体的所选特性(血清半衰期)，同时使与受试对象恒定区结构域有关的其它所需功能保持完整。另外，如上所述，可以通过增强所得构建体性质的一个或多个氨基酸的突变或取代而对所公开抗体的恒定区进行修饰。在这点上，可以破坏由保守结合位点提供的活性(例如Fc结合)，同时基本上保持经修饰抗体的构造和免疫原性特征。其它实施方式还包括将一个或多个氨基酸添加到恒定区，从而增强诸如效应子功能等所需特性或提供更多的细胞毒素或糖类粘附。在所述实施方式中可以期望插入或复制源自所选恒定区结构域的特异性序列。
本发明还包含特异性识别Notch受体的双特异性抗体。双特异性抗体是能够特异性识别和结合至少两个不同表位的抗体。不同的表位可以位于同一分子(例如同一Notch受体多肽)内或位于不同的分子上。例如所述抗体可以特异性识别和结合Notch受体，以及，例如1)白细胞上的效应分子，例如T细胞受体(如CD3)或Fc受体(如CD64、CD32或CD 16)或2)本文详细描述的细胞毒性剂。双特异性抗体可以是完整抗体或抗体片段。用于制备双特异性抗体的技术是本领域常见的(Millstein等，1983，Nature，305：537-539；Brennan等，1985，Science，229：81；Suresh等，1986，Methodsin Enzymol.，121：120；Traunecker等，1991，EMBO J.，10：3655-3659；Shalaby等，1992，J.Exp.Med.，175：217-225；Kostelny等，1992，J.Immunol.，148：1547-1553；Gruber等，1994，J.Immunol.，152：5368；和美国专利第5,731,168号)。
在本发明的特定实施方式中，可以期望使用抗体片段而不是完整抗体，来例如增加肿瘤渗透。已知用于生产抗体片段的各种技术。常规上，这些片段经由蛋白水解消化完整抗体衍生(例如Morimoto等，1993，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24：107-117和Brennan等，1985，Science，229：81)。但是，现在这些片段通常通过本文所述的重组宿主细胞直接产生。因此Fab、Fv和scFv抗体片段可以都在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达和分泌，从而允许生产大量的这些片段。作为选择，可以从本文讨论的抗体噬菌体文库中分离所述抗体片段。所述抗体片段还可以例如是美国专利第5,641,870号中所述的线性抗体，并且可以是单特异性或双特异性的。用于生产抗体片段的其它技术是显而易见的。
特别在抗体片段的情况下，还可以期望对抗体进行修饰从而增加其血清半衰期。这可以通过下述方式实现：例如通过在抗体片段中合适区域的突变从而将补救受体(salvage receptor)结合表位引入到抗体片段中，或通过将所述表位引入到肽标签中，然后所述肽标签与在任一端或在中间的抗体片段融合(例如通过DNA或肽合成)。
本发明还包括与本文提出的嵌合抗体、人源化抗体和人类抗体，或其抗体片段基本上同源的变体或等效物。这些可以含有例如，保守性取代突变，即一个或多个氨基酸被类似的氨基酸取代。例如，保守性取代是指氨基酸被同一总种类的另一氨基酸取代，例如，一个酸性氨基酸被另一酸性氨基酸取代，一个碱性氨基酸被另一碱性氨基酸取代或一个中性氨基酸被另一中性氨基酸取代。保守性氨基酸取代所指含义是本领域众所周知的。
本发明还涉及包含与细胞毒性剂缀合的免疫缀合物。细胞毒性剂包括化学治疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素，或其片段)、放射性同位素(即放射缀合物)等。用于产生此类免疫缀合物的化学治疗剂包括，例如，氨甲蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、道诺红菌素或其它嵌入剂。可以使用的酶促活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美国商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、有丝分裂毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和新月毒素。可以使用各种双官能蛋白偶联剂制备抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双功能蛋白偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二甲基己二亚氨酯HCL)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮苯甲酰)己二胺)、双重氮基衍生物(例如双(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如亚甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。还可以使用抗体与一种或多种小分子毒素的缀合物，所述小分子毒素例如加利车霉素、美登醇、单端孢霉烯(trichothene)和CC1065，以及具有毒素活性的这些毒素的衍生物。
缀合抗体由两个共价结合的抗体组成。例如，已经提出所述抗体可使免疫细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)。设想的是可以使用合成蛋白质化学中的已知方法在体外制备所述抗体，所述合成蛋白质化学包括涉及交联剂的合成蛋白质化学。例如，可以利用二硫键交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。用于该目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(或酯)(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁亚氨酸盐(或酯)。
在某些实施方式中，本发明的抗体含有人类Fc区，所述人类Fc区经修饰以增强效应子功能，例如抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在所述抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。例如，将半胱氨酸残基引入Fc区从而可在该区链内形成二硫键，从而改善补体介导的细胞杀死和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)(Caron等，1992，J.Exp Med.176：1191-1195；Shopes，1992，Immunol.148：2918-2922)。还可以使用如Wolff等，1993，Cancer Research 53：2560-2565中所述的异双功能交联剂制备具有增强抗肿瘤活性的同型二聚抗体。作为选择，可以工程化具有双Fc区的抗体(Stevenson等，1989，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230)。
无论如何获得可用量，本发明的抗体可以以许多缀合(即免疫缀合物)或未缀合形式中的任一种使用。本发明抗体可以以未缀合或“裸”形式使用，从而利用受试对象的天然防御机制以消除恶性细胞，所述天然防御机制包括补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在某些实施方式中，可以使用许多众所周知的螯合剂或直接标记法使所述抗体与放射性同位素缀合，所述放射性同位素包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、212Bi、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu，186Re和188Re等。在其它实施方式中，所公开的组合物可以包含与药物、前药、或生物应答修饰剂如氨甲蝶呤、阿霉素，和诸如干扰素等淋巴因子偶联的抗体。本发明的其它实施方式包括使用与诸如蓖麻毒蛋白或白喉毒素等特定生物毒素缀合的抗体。在其它实施方式中经修饰抗体可以与其它免疫活性配体(例如抗体或其片段)络合，其中所得分子与瘤细胞和诸如T细胞等效应细胞都结合。选择何种缀合或未缀合的经修饰抗体来使用取决于癌的种类和阶段、附加治疗(例如化学治疗或外部辐射)的使用和患者情况。应该意识到，根据本文的教导能够容易地进行所述选择。
抗Notch抗体的制备和表征还教导于例如美国专利申请公开第2008/0131434号，本文通过参考并入其全文。
在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂为不是抗体的多肽。本领域已知用于鉴定和生产与蛋白靶标高亲和性地结合的非抗体多肽的各种方法。参见，例如，Skerra，2007，Curr.Opin.Biotechnol，18：295-304；Hosse等，2006，Protein Science，15：14-27；Gill等，2006，Curr.Opin.Biotechnol，17：653-658；Nygren，2008，FEBSJ.，275：2668-76；和Skerra，2008，FEBS J.，275：2677-83，本文通过参考并入每一篇的全文。在特定实施方式中，已经使用噬菌体展示技术来鉴定/生产所述Notch结合多肽。在特定实施方式中，所述多肽包含种类是选自由蛋白A、脂钙蛋白(lipocalin)、纤连蛋白域、锚蛋白通用重复域和硫氧还蛋白组成的组中的蛋白支架。
在某些实施方式中，所述试剂是非蛋白分子。在特定实施方式中，所述试剂是小分子。对本领域技术人员而言用于鉴定非蛋白Notch结合剂的组合化学文库和技术是已知的。参见，例如，Kennedy等，2008，J.Comb.Chem.，10：345-354；Dolle等，2007，J.Comb.Chem.，9：855-902；和Bhattacharyya，2001，Curr.Med.Chem.，8：1383-404，本文通过参考并入每一篇的全文。在其它特定实施方式中，所述试剂是糖类、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在特定实施方式中，所述试剂是核酸适体。适体是基于其与另一分子结合的能力而选择(例如，从随机库或诱变库中选择)的多核苷酸分子。在某些实施方式中，所述适体包含DNA多核苷酸。在某些替代性实施方式中，所述适体包含RNA多核苷酸。在特定实施方式中，所述适体包含一个或多个经修饰的核酸残基。产生和筛选与蛋白结合的核酸适体的方法是本领域众所周知的。参见，例如，美国专利第5,270,163；5,683,867；5,763,595；6,344,321；7,368,236；5,582,981；5,756,291；5,840,867；7,312,325；和7,329,742号；国际专利公开WO02/077262；WO03/070984；美国专利申请公开第2005/0239134；2005/0124565；和2008/0227735号，本文通过参考并入每一篇的全文。
可以通过本领域已知的任何方法检测本发明抗体的免疫特异性结合。可以使用的免疫检测包括，但不限于使用下述技术的竞争性和非竞争性检测系统：如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、蛋白质印迹分析、放射免疫检测、ELISA、“夹心”免疫检测、免疫沉淀检测、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散检测、凝集检测、补体固定检测、免疫放射度检测、荧光免疫检测和蛋白A免疫检测。所述检测在本领域中是常规的并且是众所周知的(参见，例如Ausubel等，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York，本文通过参考并入其全文)。
在本发明的某些实施方式中，使用ELISA确定针对Notch受体的抗体的免疫特异性。ELISA检测包括：制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，向所述孔中添加与诸如酶的底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)等可检测化合物缀合的针对Notch受体的抗体，温育一段时间，并且检测所述抗原的存在。作为选择，针对Notch受体的抗体不与可检测化合物缀合，而是向所述孔中添加识别针对Notch受体的抗体的第二缀合抗体。另外，代替用抗原包被所述孔的是，可以用针对Notch受体的抗体包被所述孔，并且在向经包被的孔中添加抗原后添加与可检测化合物缀合的第二抗体。本领域中已知经改编而可以增加检出信号的参数，并且本领域还已知ELISA的其它变化形式(参见例如Ausubel等，eds，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley&Sons，Inc.，New York at 11.2.1)。
可以通过竞争结合检测确定抗体与Notch受体的结合亲和力和抗体抗原相互作用的解离率(off-rate)。竞争结合检测的一个实例是放射免疫检测，所述放射免疫检测包括在增加量的未标记抗原的存在下使经标记抗原(例如3H或125I)或其片段或变体与目的抗体一起温育，然后检测与经标记抗原结合的抗体。可以从根据斯卡恰特作图分析获得的数据确定针对Notch受体的抗体的亲和力和结合解离率。在某些实施方式中，使用Biacore动力学分析来确定针对Notch受体的抗体的结合速率和解离率。Biacore动力学分析包括分析抗体与表面上固定有Notch抗原的芯片的结合和解离。
本发明提供编码多肽SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的分离的多核苷酸，以及多核苷酸SEQ ID NO：1、3、15、17、47或48。本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA的形式，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。所述DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链的话，所述DNA可以是编码链或非编码(反义)链。因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有所述多肽的编码序列的多核苷酸以及含有另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。在某些实施方式中，本发明提供与编码多肽SEQ ID NO：2、4、13、14、16、18、19、20、39、40、49、50、52、53、54、55、56或57的多核苷酸杂交的多核苷酸。在某些实施方式中，所述多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：1、3、15、17、47、48、58、59或60杂交。在某些实施方式中，所述多核苷酸在严谨杂交条件下杂交。
如本文所用，术语“杂交”或“选择性杂交”或“特异性杂交”是指当特定的核苷酸序列存在于复杂混合物(例如，DNA或RNA的文库)中时，分子仅与该特定的核苷酸序列在严谨杂交条件下结合或形成双链(duplexing)。参见，例如Andersen(1998)NucleicAcid Hybridization Springer-Verlag；Ross(1997年编辑)Nucleic Acid HybridizationWiley。
如本文所用，短语“严谨杂交条件”是指探针或其它多核苷酸与其靶亚序列(subsequence)或其它互补序列通常以核酸的复杂混合物形式杂交，但通常不与其它序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，并且在不同环境下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。在Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes，"Overview of principles of hybridization andthe strategy of nucleic acid assays"(1993)中可发现核酸杂交的详尽指南。通常而言，在规定的离子强度下将严谨条件选择成比特定序列的热熔解温度(Tm)低约5℃～10℃。Tm是(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)在该温度下平衡时50％的与靶标互补的探针与靶序列杂交时的温度(因为靶序列过量存在，在Tm下，平衡时50％的探针被占据)。严谨条件是pH为7.0～8.3时盐浓度低于约1.0M钠离子，通常是约0.01M～1.0M钠离子浓度(或其它盐)，对于短探针(例如10～50个核苷酸)温度是至少约30℃，对于长探针(例如，大于50个核苷酸)温度是至少约60℃。还可以添加诸如甲酰胺等去稳定剂来实现严谨条件。对于高严谨杂交，阳性信号是背景的至少两倍，或背景杂交的10倍。示例性的高严谨性或严谨杂交条件包括：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃温育或5×SSC和1％SDS在65℃下温育，在0.2×SSC和0.1％SDS中于65℃下洗涤。对于PCR，对于低严谨扩增温度通常是约36℃，不过根据引物长度退火温度可以是约32℃～约48℃。对于高严谨PCR扩增，温度通常是约62℃，不过根据引物长度和特异性高严谨退火温度可以是约50℃～约65℃。用于高严谨扩增和低严谨扩增的典型循环条件包括90℃～95℃的变性阶段30秒～120秒，退火阶段持续30秒～120秒，以及约72℃延伸阶段1分钟～2分钟。
本发明还涉及编码片段、类似物和衍生物的上文所述多核苷酸的变体。所述多核苷酸的变体可以是所述多核苷酸的天然存在的等位变体或所述多核苷酸的非天然存在的变体。
如上文指出，所述多核苷酸可以具有编码序列，所述编码序列是所公开多肽的编码序列的天然存在的等位变体。本领域已知，等位变体是具有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加的多核苷酸序列的替代形式，其基本上不改变所编码多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，所述多核苷酸中成熟多肽的编码序列融合在有助于多肽表达和从宿主细胞分泌的多核苷酸的同一阅读框中，所述有助于多肽表达和从宿主细胞分泌的多核苷酸例如有前导序列，其充当用于控制所述细胞的多肽的转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是前蛋白(preprotein)，并且可以使前导序列被宿主细胞切割，从而形成所述多肽的成熟形式。所述多核苷酸还可以编码蛋白原(proprotein)，所述蛋白原是成熟蛋白加上另外的5'氨基酸残基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白是蛋白原，并使是蛋白的失活形式。序列原被切割时，保留活性成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多肽可以编码成熟蛋白，或编码具有序列原的蛋白，或编码同时具有序列原和前序列(presequence，前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有与标记物序列框内融合的编码序列，所述标记物序列允许对本发明的多肽进行纯化。例如，所述标记物序列可以是pQE-9载体提供的六聚组氨酸标签，从而在细菌宿主的情况下提供对与所述标记物融合的成熟多肽的纯化。或例如，当使用诸如COS-7细胞等哺乳动物宿主时，所述标记物序列可以是血凝素(HA)标签。所述HA标签对应于源自流感病毒血凝素蛋白的表位(Wilson等，1984，Cell 37：767)。
本发明的另外实施方式包括分离的核酸分子，所述核酸分子包含具有与SEQ IDNO：l、3、15、17、47、48、58、59或60具有至少90％同一性、95％同一性和在某些实施方式中具有至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的多核苷酸。在某些实施方式中，包含具有至少90％同一性、95％同一性和在某些实施方式中具有至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的所述多核苷酸与多核苷酸SEQ IDNO：l、3、15、17、47、48、58、59或60杂交。在某些实施方式中，包含具有至少90％同一性、95％同一性和在某些实施方式中具有至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列的所述多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：58、59或60杂交。在某些实施方式中，所述多核苷酸在严谨杂交条件下杂交。在某些实施方式中，所述多核苷酸与多核苷酸SEQ ID NO：58、59或60在严谨杂交条件下杂交。提到具有与参照核苷酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，是指该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相似，不同之处在于该多核苷酸序列可以在参照核苷酸序列的每100个核苷酸中包括最多5个点突变。换言之，为了获得具有与参照核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参照序列中最多5％的核苷酸可以缺失或被其他核苷酸取代，或数量最多是参照序列中总核苷酸5％的核苷酸可以插入参照序列中。参照序列的这些突变可以出现在参照核苷酸序列的氨基或羧基末端位置，或这些末端位置之间的任何地方，单独散布在参照序列内的核苷酸中，或位于参照序列内的一个或多个连续基团中。
实际上，常规上使用诸如Bestfit程序等已知的计算机程序可以确定任何特定的核酸分子是否与参照序列具有特定的百分比序列同一性(例如，与参照序列具有至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约97％序列同一性，或与参照序列具有95％、96％、97％、98％或99％同一性)(Wisconsin Sequence Analysis Package，用于Unix的第8版本，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)。Bestfit使用Smith和Waterman，1981，Advances in AppliedMathematics 2：482-489的局部同源性算法，来发现两个序列之间的同源性最佳区段。当然，当使用Bestfit或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否与本发明的参照序列具有例如95％同一性时，对参数进行设定，使得在参照核苷酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许同源性的空位最多是参照序列中核苷酸总数的5％。
多核苷酸变体可以含有编码区和/或非编码区的改变。在某些实施方式中多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失，但不改变所编码多肽的性质或活性。在某些实施方式中，由于遗传编码的简并性通过沉默取代而产生核苷酸变体。可以出于各种原因生产多核苷酸变体，从而例如对特定宿主优化密码子表达，例如将人类mRNA中的密码子改变为诸如大肠杆菌等细菌宿主偏好的密码子)。
本发明还提供包含靶向Notch受体的拮抗剂(例如，抗体)的药物组合物。发现这些药物组合物可用于抑制肿瘤细胞生长和治疗人类患者中的癌。
通过将本发明的经纯化Notch结合剂或拮抗剂(例如，抗体)与药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂组合，制备无菌冻干粉磨、水溶液等形式的用于贮存和使用的制剂(Remington，The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing，2000)。合适的载体、赋形剂或稳定剂包括：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等无毒缓冲剂；诸如氯化钠等盐；诸如抗坏血酸和蛋氨酸等抗氧化剂；防腐剂，如十八烷基二甲基苄基氯化铵、六甲氯铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苯甲醇、诸如尼泊金甲酯或尼泊金丙酯等尼泊金烷基酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(小于约10个氨基酸)；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白；诸如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；诸如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精等糖类；诸如EDTA等螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇等糖；诸如钠等成盐对离子；诸如Zn-蛋白复合物等金属复合物；和/或诸如吐温或聚乙二醇(PEG)等非离子表面活性剂。
可以以用于局部治疗或系统性治疗的任何方式施用本发明的药物组合物。施用可以是局部的(例如施用至黏膜，包括阴道递送和直肠递送)，诸如透皮贴剂、膏剂、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷剂、液体剂和粉末剂；(例如包括通过喷雾器在内的通过吸入或吹入粉末或气溶胶；气管内、鼻内、表皮和透皮)等肺递送；口服；包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肿瘤内或肌肉内注射或输注等胃肠外递送；或颅内(例如鞘内或心室内)施用。
治疗制剂可以是单位剂量形式。所述制剂包括用于口服、胃肠外或直肠施用或用于通过吸入施用的片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、水中或非水性介质中的溶液或悬浮液、或栓剂。在诸如片剂等固体组合物中主要活性成分与药物载体混合。常规的制片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶和其它稀释剂(例如水)，从而形成含有本发明化合物或其无毒药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预制剂组合物。然后所述固体预制剂组合物再分成本文所述种类的单位剂型。可以对该新型组合物的片剂、丸剂等进行包衣或配制，从而提供具有延长作用优点的剂型。例如，所述片剂或丸剂可以包括被外部组分覆盖的内部组分。另外，两种组分可以通过肠溶层分隔，所述肠溶层用于抵抗崩解，并且允许内部组分完整地通过胃或延迟释放。对于所述肠溶层或包衣可以使用各种材料，所述材料包括许多聚合酸和聚合酸的混合物，所述材料是虫漆、十六烷醇和乙酸纤维素。
药物制剂包括与脂质体复合的本发明的拮抗剂(例如抗体)(Epstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl..Acad Sci.USA，77：4030，和美国专利第4,485,045和4,544,545号)。具有延长循环时间的脂质体公开于美国专利第5,013,556号。可以利用脂质组合物通过反相蒸发生产某些脂质体，脂质组合物包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。将脂质体通过规定孔径的过滤器挤出，从而产生具有所需直径的脂质体。
还可以将所述拮抗剂(例如，抗体)包埋在微胶囊中。例如根据Remington's，TheScience and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing(2000)所述，在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在大乳液中分别通过凝聚技术或通过界面聚合，从而制备所述微胶囊，例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊或聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。
另外可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有抗体的由固体疏水性聚合物制成的半透性基质，所述基质是成型物的形式(例如膜或微胶囊)。缓释基质的实例包括聚酯、诸如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)等水凝胶、聚交酯(美国专利第3,773,919号)，L-谷氨酸和7乙基-L-谷氨酰胺的共聚物、不可降解乙烯-乙酸乙烯酯、诸如Lupron Depot(由乳酸乙醇酸共聚物以及乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)等可降解乳酸-乙醇酸共聚物、蔗糖乙酸异丁酸酯和聚-D(-)-3-羟基丁酸。
在特定实施方式中，所述药物组合物包含所述Notch结合剂或拮抗剂以及第二治疗剂。在特定实施方式中，第二治疗剂是抗癌剂和/或抗血管发生剂。
本发明提供用于使用本文所述Notch受体拮抗剂抑制表达Notch受体的致瘤性细胞的生长或增殖的方法。在某些实施方式中，所述方法包括使用任何一种本文所述抗体或多肽抑制表达Notch2和/或Notch3受体的致瘤性细胞的生长。在某些实施方式中，所述抑制表达Notch受体的致瘤性细胞的生长的方法包括使所述细胞与针对Notch受体的拮抗剂体外接触。例如，在添加有与Notch2和/或Notch3特异性结合并且抑制细胞生长的抗体的培养基中培养表达Notch受体的永生化细胞系或癌细胞系。或从诸如组织活检样、胸腔积液或血液样品等患者样品分离肿瘤细胞和/或肿瘤干细胞，并将其在添加有与Notch2和/或Notch3特异性结合并且抑制细胞生长的抗体的培养基中培养。在某些实施方式中，所述拮抗剂是特异性识别Notch2和/或Notch3受体的表位的抗体。
在某些实施方式中，所述抑制表达Notch受体的致瘤性细胞的生长或增殖的方法包括使所述细胞与针对Notch受体的拮抗剂(例如，Notch2和/或Notch3的拮抗剂)体内接触。在特定实施方式中，在动物模型中使致瘤性细胞与针对Notch受体的拮抗剂接触。例如，使表达Notch受体的异种移植物在免疫妥协小鼠(例如，NOD/SCID小鼠)中生长。对所述小鼠施用针对Notch受体的拮抗剂以抑制肿瘤生长。作为选择，从诸如组织活检样、胸腔积液或血液样品等患者样品分离表达Notch受体的癌干细胞，并将其注入免疫妥协小鼠中。然后对所述小鼠施用针对Notch受体的拮抗剂以抑制肿瘤细胞生长。在某些实施方式中，在将致瘤性细胞导入动物的同时，或稍后不久施用Notch受体的拮抗剂从而预防肿瘤生长。在其它实施方式中，在致瘤性细胞已经生长至规定尺寸之后施用作为治疗剂的Notch受体的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂是与Notch受体特异性结合的Notch受体蛋白融合物。在特定实施方式中，所述拮抗剂是特异性识别Notch受体的表位的抗体。在某些实施方式中，所述抗体是任何一种本文所述抗体或多肽。
在特定实施方式中，致瘤性细胞与针对Notch受体的拮抗剂的接触在诊断患有癌的人类患者中发生。在某些实施方式中，所述拮抗剂是与Notch受体特异性结合的抗体。在其它实施方式中，所述拮抗剂是特异性识别Notch受体的表位的抗体。例如，本发明提供抑制受试对象中肿瘤生长的方法，所述方法包括对所述受试对象施用治疗有效量的人类Notch2和/或Notch3的拮抗剂。在某些实施方式中，所述拮抗剂是与Notch2结合的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂是与Notch3结合的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂是与Notch2和Notch3结合的抗体。在某些实施方式中，所述拮抗剂是在上述方面或实施方式、以及本文所述任何其它方面或实施方式中任一所述的抗体或多肽。在特定实施方式中，所述肿瘤包含磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)基因中的失活缺失或突变。
本发明还提供抑制细胞中Notch信号传导(例如，Notch2和/或Notch3)的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的Notch拮抗剂接触。这些方法可以是体内方法或体外方法。在某些实施方式中，所述Notch拮抗剂是抗体。在某些实施方式中，所述方法包括抑制细胞中Notch2信号传导，包括使所述细胞与有效量的上述方面或实施方式、以及本文所述任何其它方面或实施方式中的任何一种抗体或多肽接触。在某些实施方式中，所述Notch拮抗剂是抗体。在某些实施方式中，所述方法包括抑制细胞中Notch3信号传导，包括使所述细胞与有效量的上述方面或实施方式、以及本文所述任何其它方面或实施方式中的任何抗体或多肽接触。
本发明还提供调节周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的方法，所述方法包括对受试对象施用有效量的人类Notch3的拮抗剂。在某些实施方式中，所述方法通过调节周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能抑制血管发生。在某些实施方式中，所述拮抗剂是在上述方面或实施方式、以及本文所述任何其它方面或实施方式中任一所述的抗体或多肽。在特定实施方式中，受抑制的血管发育是异常血管发育。在特定实施方式中，受抑制的血管发育在肿瘤中。在特定实施方式中，所述方法还包括对所述受试对象施用VEGF的拮抗剂或VEGF受体的拮抗剂。
另外，本发明提供抑制受试对象中血管发生或血管发育的方法，所述方法包括对所述受试对象施用有效量的Notch拮抗剂。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是Notch3拮抗剂。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是Notch2拮抗剂。在特定实施方式中，所述拮抗剂是Notch2和/或Notch3的拮抗剂。在某些实施方式中，所述拮抗剂是抗Notch2/3抗体。在某些实施方式中，抑制血管发生的方法包括施用上述方面或实施方式、以及本文所述任何其它方面或实施方式中任一的抗体或多肽。在特定实施方式中，所述血管发生是肿瘤血管发生。在特定实施方式中，所述血管发育位于肿瘤位置。在某些替代性实施方式中，所述血管发生不是肿瘤血管发生。在特定实施方式中，血管发生或血管发育的抑制至少部分是由于周细胞和/或血管平滑肌细胞的功能的调节。在特定实施方式中，所述方法还包括对所述受试对象施用血管内皮细胞生长因子(VEGF)的拮抗剂或VEGF受体的拮抗剂。
还提供减少肿瘤(例如包含癌干细胞的肿瘤)的致瘤性的方法。在特定实施方式中，所述方法包括对有需要的受试对象(例如，具有肿瘤的受试对象)施用治疗有效量的Notch拮抗剂。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是结合Notch2的抗体。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是结合Notch3的抗体。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是结合Notch2和Notch3的抗体。在特定实施方式中，所述Notch拮抗剂是上述方面或实施方式、以及本文他处所述任何其它方面或实施方式中任一所述的抗体或多肽。在特定实施方式中，通过施用所述抗体减少所述肿瘤中癌干细胞的频率。在某些实施方式中，所述肿瘤是结直肠肿瘤、乳肿瘤、胰腺肿瘤或黑色素瘤。
还设想可以使用本发明的试剂和拮抗剂来治疗特征在于Notch受体的表达和/或细胞对Notch受体的应答性增加的各种疾病。本发明提供治疗增殖性疾病如癌、与血管发生相关的疾病(例如，血管发生依赖性疾病)和其中Notch信号传导的上调或下调起作用的疾病的方法。
在特定实施方式中使用Notch结合剂或拮抗剂要治疗的疾病是Notch相关疾病。在特定实施方式中，所述疾病的特征在于Notch信号传导(例如，Notch2和/或Notch3信号传导)的上调或下调。在特定实施方式中，所述疾病或肿瘤是Notch2和/或Notch3-依赖性的。
具体而言，设想使用针对Notch受体的拮抗剂(例如，抗体)来治疗增殖性疾病，所述疾病包括但不限于，肾、肝、膀胱、乳腺、胃、卵巢、结肠、直肠、前列腺、肺、外阴、甲状腺、头颈、脑(成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、成髓细胞瘤等)、血液和淋巴(白血病和淋巴瘤)的良性肿瘤和恶性肿瘤。在特定实施方式中，使用Notch结合剂或拮抗剂治疗的增殖性疾病是结直肠癌、乳癌、胰腺癌或黑色素瘤。在特定实施方式中，所述癌包含癌干细胞。
在特定实施方式中，所治疗的肿瘤是实体瘤。可以使用本发明的治疗组合物(例如，结合Notch的抗体)治疗的实体瘤的实例包括，但不限于肉瘤和癌，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。本发明适用于肉瘤和上皮癌，例如卵巢癌和乳癌。在特定实施方式中，所述肿瘤是结直肠瘤、乳瘤、胰腺瘤或黑色素瘤。在特定实施方式中，所述肿瘤是卵巢瘤。在特定实施方式中，所述肿瘤是成神经管细胞瘤。在特定实施方式中，所述肿瘤包含癌干细胞。
在特定实施方式中，用所述Notch结合剂或拮抗剂要治疗的疾病是与血管发生相关的疾病。在特定实施方式中，所述疾病是癌。在某些其它实施方式中，所述疾病不是癌性疾病。例如，所述疾病可以是视网膜黄斑变性(wet macular degeneration)、年龄相关性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、血管瘤、类风湿性关节炎、银屑病、新生血管性青光眼、多囊卵巢病、子宫内膜异位和炎症性肠病。
在特定实施方式中，所述肿瘤表达Notch结合剂或拮抗剂靶向的一种或多种Notch受体。在特定实施方式中，所述肿瘤表达Notch2和/或Notch3。在特定实施方式中，所述肿瘤过表达Notch2和/或Notch3。在特定实施方式中，所述肿瘤取决于与施用的抗体特异性结合的一种或多种Notch受体。例如，在特定实施方式中，可以使用特异性结合Notch2(或Notch2和Notch3)的抗体来抑制所述生长或靶向Notch2依赖性肿瘤。在特定实施方式中，可以使用特异性结合Notch3(或Notch2和Notch3)的抗体来抑制所述生长或靶向Notch3依赖性肿瘤。在特定实施方式中，所述肿瘤包含癌干细胞。
在特定实施方式中，对于编码肿瘤抑制子磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的基因中的失活缺失或突变，所述肿瘤是纯合性或杂合性的。在特定实施方式中，包含缺失或突变的肿瘤是乳瘤。
根据已知的方法将所述拮抗剂作为合适的药物组合物对人类患者施用。合适的施用方法包括作为推注的静脉内施用或通过连续输注一段时间，通过肌肉内、腹膜内、静脉内、肿瘤内、动脉内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。
在特定实施方式中，除了施用Notch拮抗剂之外，所述方法或治疗还包括(在施用所述Notch拮抗剂之前、同时和/或之后)施用第二治疗剂。在特定实施方式中，所述第二治疗剂是抗癌剂和/或抗血管发生剂。还提供包含所述Notch拮抗剂和第二治疗剂的药物组合物。
应意识到可以以任何顺序或同时施用Notch拮抗剂(例如，抗体)和第二治疗剂的组合。在所选实施方式中，对之前已经接受第二抗癌剂治疗的患者施用Notch拮抗剂。在某些其它实施方式中，可以基本上同时或并行施用所述Notch拮抗剂和第二治疗剂。例如，受试对象可以被给予Notch拮抗剂，同时经受使用第二治疗剂进行治疗的过程(例如化学治疗)。在特定实施方式中，在使用第二治疗剂进行治疗1年内施用所述Notch拮抗剂。在某些替代性实施方式中，在使用第二治疗剂进行任何治疗的10个月、8个月、6个月、4个月或2个月之内施用所述Notch拮抗剂。在某些其它实施方式中，在使用第二治疗剂进行任何治疗的4周、3周、2周或1周之内施用所述Notch拮抗剂。在某些实施方式中，在使用第二治疗剂进行任何治疗的5天、4天、3天、2天或1天之内施用所述Notch拮抗剂。还应意识到可以在大约几小时或几分钟之内(即，基本上同时)对所述受试对象施用两种试剂或治疗。
可用类别的抗癌剂包括，例如抗微管蛋白剂、敖瑞斯汀(auristatins)、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷基化剂(铂复合物如，诸如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂复合物以及卡铂)、蒽环霉素(anthracycline)、抗生素、抗叶酸盐、抗代谢药、化学治疗敏感剂、倍癌霉素(duocarmycins)、足叶乙甙、氟化嘧啶、离子载体、莱希特平(lexitropsins)、亚硝基脲、顺铂(platinols)、执行化合物(performing compounds)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射敏感剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂或长春花生物碱等。在特定实施方式中，所述第二抗癌剂是抗代谢药、拓扑异构酶抑制剂或血管发生抑制剂。
可以与Notch拮抗剂组合施用的抗癌剂包括化学治疗剂。因此，在某些实施方式中，所述治疗包括组合施用本发明的拮抗剂和化学治疗剂或多种不同的化学治疗剂的混合物。可以在施用化学治疗剂之前、与其同时或在其之后进行使用拮抗剂的治疗。本发明涉及的化学治疗剂包括本领域已知并且为商购可得的化学物质或药物，例如多柔比星、5-氟尿嘧啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷("Ara-C")、环磷酰胺、噻替派、白消安、胞毒素(cytoxin)、紫杉醇、氨甲蝶呤、顺铂、美法仑、长春碱和卡铂。组合施用可以包括以单一药物制剂或使用分开制剂的共施用，或以任何顺序但通常在一段时间内的连续施用，从而使得所有活性剂可以同时发挥其生物活性。可以根据制造商说明书或根据经验确定，来使用用于所述化学治疗剂的制剂和给药方案。用于所述化学治疗的制剂和给药方案还描述于Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams&Wilkins，Baltimore，Md.(1992)。
用于本发明的化学治疗剂还包括，但不限于，诸如噻替派和环磷酰胺(CYTOXAN)等烷基化剂；诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡等烷基磺酸酯；诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)等氮丙啶；包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamime)氮芥在内的乙烯亚胺和甲基蜜胺(methylamelamines)，所述三羟甲蜜胺(trimethylolomelamime)氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯代环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥、胆甾醇对苯乙酸氮芥、泼尼氮芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；诸如卡莫司汀、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀等亚硝基脲；诸如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌素、色霉素、更生霉素、道诺红菌素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星等抗生素；诸如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)等抗代谢药；诸如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙等叶酸类似物；诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤等嘌呤类似物；诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；诸如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯等雄激素；诸如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺药；诸如亚叶酸(frolinic acid)等叶酸补充剂；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百托布(bestrabucil)；比山群；依达曲沙、得福安(defofamine)；脱羧秋水仙碱；地吖醌；艾福敏(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK.；雷佐生；西索菲兰(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷("Ara-C")、环磷酰胺、噻替派；诸如紫杉醇(TAXOL)和多西他赛(Taxotere)等紫杉烷；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；诸如顺铂和卡铂等铂类似物；长春碱；铂；足叶乙甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；异长春花碱；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；CPT 11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素，如抗雌激素剂，对肿瘤的作用的抗激素剂，包括例如，三苯氧胺、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬盐酸盐(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素剂，如氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在特定实施方式中，所述化学治疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶(例如拓扑异构酶I或II)作用的化学治疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括，但不限于，盐酸多柔比星，道诺红菌素柠檬酸盐、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、足叶乙甙、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康。在特定实施方式中，所述第二抗癌剂是伊立替康。在特定实施方式中，要治疗的肿瘤是结直肠瘤，并且所述第二抗癌剂是诸如伊立替康等拓扑异构酶抑制剂。
在特定实施方式中，所述化学治疗剂是抗代谢药。抗代谢药是具有以下结构的化学药品，所述结构与正常生化反应所需的代谢物类似，但是不同之处足够干扰细胞的一种或多种正常功能，例如细胞分裂。抗代谢药包括，但不限于，吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲塞(ralitrexed)、培美曲塞、喃氟啶、胞嘧啶阿拉伯糖苷、硫鸟嘌呤、5-氮胞苷、6-巯基嘌呤、咪唑硫嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、氟达拉滨磷酸盐和克拉屈滨，以及这些中任何一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在特定实施方式中，所述第二抗癌剂是是吉西他滨。在特定实施方式中，要治疗的肿瘤是胰腺瘤，并且所述第二抗癌剂是抗代谢药(例如，吉西他滨)。
在其它实施方式中，所述治疗包括将本发明的拮抗剂与放射治疗组合施用。可以在施用放射治疗之前、与其同时或在其之后使用抗体进行治疗。可以使用用于所述放射治疗的任何给药方案。
在其它实施方式中，所述治疗包括组合施用本发明的抗体以及针对与另外肿瘤相关的抗原的其它抗体，所述抗体包括，但不限于，与EGF受体(EGFR)erbB2受体(HER2)和血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。在某些替代性实施方式中，所述第二抗癌剂包含与人类DLL4或Notch受体的其它配体特异性结合的抗体或与另外的人类Notch受体特异性结合的抗体。举例而言，抗DLL4抗体例如描述于美国专利申请公开第US 2008/0187532号，本文通过参考并入其全文。另外的抗DLL4抗体描述于例如国际专利公开WO2008/091222和WO2008/0793326，和美国专利申请公开US 2008/0014196、US 2008/0175847；US2008/0181899；和US 2008/0107648，本文通过参考并入每一篇的全文。示例性的抗Notch抗体例如描述于美国专利申请公开US 2008/0131434，本文通过参考并入其全文。在特定实施方式中，所述第二抗癌剂是Notch信号传导的抑制剂。在特定实施方式中，所述第二抗癌剂是作为血管发生抑制剂的抗体(例如，抗VEGF抗体)。在特定实施方式中，所述第二治疗剂是特异性结合VEGF受体的抗体。在特定实施方式中，所述第二治疗剂是AVASTIN(贝伐单抗)、HERCEPTIN(曲妥珠单抗)、VECTIBIX(帕尼单抗)或ERBITUX(西妥昔单抗)。组合施用可以包括在单一药物制剂中或使用分开制剂的共施用，或以任何顺序但通常在一段时间内的连续施用，从而使得所有活性剂可以同时发挥其生物活性。
另外，治疗可以包括施用一种或多种细胞因子(例如，淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)，或可以伴随有外科手术除去癌细胞或治疗医师确信必须的任何其它治疗。
对于所述疾病的治疗，本发明的拮抗剂的合适剂量取决于待治疗疾病的类型，疾病的严重性和进展，疾病的应答性，是否为了治疗或预防目的施用所述抗体、之前的治疗、患者临床史等，所有这些都由治疗医师判断。所述拮抗剂可以施用一次，或在持续几天到几个月的一系列治疗中施用，或直到治愈，或直到达到疾病状态消退(例如肿瘤尺寸减少)。最佳给药方案可以由对患者体内的累积药物的测定来计算，并且可以根据各拮抗剂的相对效力而变化。施用医师可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复速率。通常，剂量为0.01μg～100mg/千克体重，并且可以每天、每周、每月或每年给予1次或多次。治疗医师可以基于体液或组织中药物的测定的停留时间和浓度估算给药的重复速率。
在特定实施方式中，在用所述Notch拮抗剂进行治疗之前，对考虑进行Notch拮抗剂治疗的患者进行筛选。在特定实施方式中，对患者中的肿瘤或已经从患者取出的肿瘤测试癌干细胞的存在。在特定实施方式中，对所述肿瘤测试与所述拮抗剂结合的一种或多种Notch受体(例如，Notch2和/或Notch3)的表达。在特定实施方式中，对所述肿瘤测试编码肿瘤抑制子磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)的基因中的失活缺失或突变的存在。在特定实施方式中，所测试的肿瘤是乳瘤。
例如，本发明提供了选择受试对象用于使用Notch2和/或Notch 3拮抗剂进行治疗的方法，其中所述受试对象具有肿瘤或已移除肿瘤。在特定实施方式中，所述方法包括(a)确定所述肿瘤是否包含PTEN基因中的缺失或突变；和(b)如果所述肿瘤包含所述缺失或突变，则选择所述受试对象以用于使用Notch3拮抗剂进行治疗。
在本发明的某些替代性实施方式中，经由遗传测试对经筛查存在结肠腺瘤或息肉的患者测试等位基因损失和体细胞突变。在某些实施方式中，所述遗传测试筛选Wnt途径中的损失或突变，包括，例如在APC、Axin2或β-连环蛋白中的损失或突变。
在另一方面，本发明提供可用于执行本文所述方法的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒在一个或多个容器中包括对Notch受体具有特异性的抗体、经纯化抗体。在某些实施方式中，试剂盒还包括基本上分离的Notch受体，不与所述Notch受体反应的对照抗体和/或用于检测抗体与Notch受体结合的工具(means)(例如，与针对Notch受体的抗体或与识别针对Notch受体的抗体的第二抗体缀合的荧光生色团、酶底物、放射活性化合物或发光化合物)，所述基本上分离的Notch受体包含与试剂盒里包括的所述抗体具有特异性免疫反应性的表位。在其它实施方式中，试剂盒包含对于一种或多种Notch受体的mRNA或cDNA(例如，寡核苷酸探针或引物)检测具有特异性的试剂。在某些实施方式中，所述试剂盒含有所有对执行检测测试而言必须和/或充分的组分，包括所有对照、执行测试的指导和用于分析和呈现结果的任何必需的软件。
区室试剂盒(compartment kit)包括其中试剂容纳在分开的容器中的任何试剂盒。所述容器包括小型玻璃容器、塑料容器或塑料条或纸条。所述容器允许有效地将试剂从一个区室转移到另一区室，从而使得所述样品和试剂不交叉污染，并且可以以定量方式将各容器的试剂或溶液从一个区室添加到另一区室。所述容器可包括接收测试样品的容器、含有本方法中所用抗体或探针的容器、含有洗涤试剂(例如磷酸盐缓冲的盐水、Tris-缓冲液等)的容器和含有用于检测结合的抗体或探针的试剂的容器。可容易地意识到的是，可以容易地将本发明公开的多核苷酸、多肽和抗体并入本领域公知的已建立的试剂盒形式中。
在某些实施方式中，本发明还提供包括Notch结合剂或拮抗剂和第二治疗剂的试剂盒。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂是与Notch2和/或Notch3特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述Notch结合剂或拮抗剂是与Notch2和Notch3特异性结合的抗体。在特定实施方式中，所述第二治疗剂是抗癌剂和/或抗血管发生剂。
在一方面，本发明提供鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合并且抑制肿瘤生长的分子的方法，所述方法包括：i)使所述分子与人类Notch受体的胞外域的非配体结合域一起温育；ii)确定所述分子是否与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区结合；和iii)确定所述分子是否抑制肿瘤生长。特异性结合人类Notch受体的胞外域的非配体结合区的分子包括，但不限于，小有机分子、多肽和抗体。
可以使用本领域已知的任何合适的方法进行筛选。在特定实施方式中，筛选在体外进行。在某些实施方式中，使表达人类Notch受体的胞外域的非配体结合区的细胞与经标记的分子一起温育，并且通过FACS分析确定经标记的分子与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区的特异性结合。在某些实施方式中，通过噬菌体展示表达人类Notch受体的胞外域的非配体结合区，并且鉴定与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子。用于鉴定与人类Notch受体的非配体结合区特异性结合的分子的其它适合的方法包括，但不限于，ELISA、蛋白质(或免疫)印迹和酵母双杂交。
然后测试与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子对肿瘤细胞生长的抑制。可以使用本领域已知的任何合适的方法进行测试。在特定实施方式中，对与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子测试体外抑制肿瘤生长的能力。在某些实施方式中，使与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子与培养物中的肿瘤细胞一起温育，在与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子的存在下确定肿瘤细胞的增殖，并且将其与非结合对照分子一起温育的肿瘤细胞进行比较。在特定实施方式中，对与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子测试体内抑制肿瘤生长的能力。在特定实施方式中，将与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子注入动物异种移植物模型，确定在用与人类Notch受体的胞外域的非配体结合区特异性结合的分子治疗的动物中肿瘤的生长，并且将其与用非结合对照分子治疗的动物进行比较。
实施例
应该理解本文所述实施例和实施方式仅是用于举例目的，根据这些实施例和实施方式本领域技术人员会提出各种改变或变化，并且这些改变或变化包括在本申请的精神和范围内。
实施例1
针对Notch2的人类抗体的制备
使用噬菌体展示技术分离特异性识别Notch2受体的胞外域的非配体结合部分的人类抗体。对含有人类抗体可变域的合成抗体文库进行Notch2受体的特异性和高亲和性识别的筛选。
简言之，在第1轮使2x1013个Fab展示噬菌体颗粒与被动固定的重组Notch2Fc融合蛋白(SEQ ID NO：21)温育，所述Notch2Fc融合蛋白包含Notch2的胞外配体结合位点和周围的EGF重复(EGF 1-12)。洗掉非特异性噬菌体，然后用DTT洗脱特异性噬菌体。使用洗脱产物来感染TG1F+细菌，用辅助噬菌体进行援助(rescue)，然后用IPTG(0.25mM)诱导Fab展示。将该过程重复另外两轮，然后在针对被动固定的重组Notch2(EGFl-12)Fc融合物(5μg/ml)的ELISA中筛选第3轮。
鉴定出特定的Fab(59R1)，所述Fab结合人类Notch2受体并阻断Jagged 1与人类Notch2的结合。使用过表达人类Notch2(hN2)的稳定的人细胞系HEK-293通过FACS测试验证59R1Fab与人类Notch2的结合(图1A)。通过藻红蛋白(PE)-缀合的山羊抗-人Fab(Jackson Immunochemicals)检测Fab结合。59R1Fab(图1A中称为克隆1)显示与hN2的良好结合。在使用相同的稳定细胞系的结合检测中，59R1Fab还显示针对Notch配体人Jagged1的良好阻断活性(图1B)。通过使与人类Fc恒定区融合的hJagged1胞外域(ECD)与细胞和选自噬菌体文库的Fab一起温育并使用用于检测的PE-缀合的山羊抗人Fcγ特异性抗体(Jackson Immunochemicals)，从而确定配体结合和阻断。
59R1Fab的VH和VL的序列分别提供于SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12(包括当分泌时切割去的N-末端细菌信号序列)中。59R1Fab的CDR如以下表2所示。
表2.59R1人类Fab和IgG抗体的CDR
基于59R1Fab的CDR的可变区克隆到Ig表达载体中，所述Ig表达载体含有用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达的人类IgG2重链和κ轻链以及它们各自的哺乳动物信号序列。提供分别作为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的59R1IgG抗体的VH和VL。提供分别作为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18的59R1IgG抗体的重链和轻链的氨基酸序列(包括信号序列)。位于各链的氨基酸序列的N末端处的信号序列当分泌时被切割下。提供分别作为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3的编码59R1IgG抗体的重链和轻链的核酸序列。利用蛋白A纯化来纯化所述抗体。含有编码所述59R1IgG抗体DNA的重链和轻链的合成DNA插入物的细菌质粒DNA作为“59R1”于2008年10月15日根据布达佩斯条约的规定保藏在ATCC，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA，USA，并赋予保藏号PTA-9547。
另外，通过FACS分析对所述59R1IgG2抗体的阻断DLL4与人类Notch 2受体结合的能力进行检测。使稳定过表达人类Notch2的HEK-293细胞与各种浓度的抗体一起温育，然后通过PE-缀合的山羊抗人Fcγ特异性抗体检测hNotch2结合(图1C)，或检测配体阻断活性(图1D)。通过使所述细胞与标记有兔Fc恒定区的人类DLL4ECD以及一个浓度范围内的59R1抗体温育，然后通过PE-缀合的驴抗兔抗体检测所述hDLL4，从而确定配体阻断。对于59R1IgG2抗体如此确定hNotch2的结合和配体阻断活性。
还表达和纯化了59R1的种系变体(称为“59RGV”)。提供分别作为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的59RGV抗体的VH和VL。提供分别作为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4的59RGV抗体的重链和轻链的氨基酸序列(包括信号序列)。位于各链的氨基酸序列的N末端处的信号序列当分泌时被切割下。提供分别作为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：17的编码59RGV抗体的重链和轻链的核酸序列。
在某些情况下，高度疏水性CDR有可能允许抗体进行不利的非特异性结合。由于59R1的重链CDR3的氨基酸序列不寻常程度的疏水特性，因此制备了含有疏水特性降低的重链CDR3序列的59R1的变体。如图1E所示，通过允许从亲本序列(GIFFAI；SEQ ID NO：7)进行有限性变化，从而进行重链CDR3亲和性熟化。使位于各位置处的容许氨基酸从亲本残基改变成图1E中所示的残基。如图1F所示(用箭头表示)，通过对变体的改善的JAG1阻断能力进行筛选来分离得到改善的变体。简言之，使Fab(1μg/ml和10μg/ml)与hJAG1-rb Fc(使5μg/ml与2μl/ml PE-缀合的驴抗-兔抗体预成簇(preclustered))混合，然后将其添加至hNotch2稳定转染的293细胞。然后使用流式细胞法评估hJAG1结合。分离出6个改善的变体(相对于59R1Fab)，它们的HCCDR3序列如下：SIFYPT(SEQ ID NO：22)、SSFFAS(SEQ ID NO：23)、SSFYAS(SEQID NO：24)、SSFFAT(SEQ ID NO：25)、SIFYPS(SEQ ID NO：26)和SSFFAN(SEQID NO：27)。这些变体的重链可变区的序列是序列SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57。
实施例2
抗Notch2/359R1抗体的交叉反应性和结合亲和性。
使用用人类Notch1、Notch2、Notch3或Notch4表达质粒和作为转染对照的绿色荧光蛋白(GFP)瞬时转染的HEK-293细胞，通过FACS检测确定59R1IgG2抗体与其它Notch受体的交叉反应能力。GFP阳性细胞表明转基因的表达。向所述细胞添加2μg/ml的59R1IgG2，并且通过PE-缀合的山羊抗-人Fcγ特异性(JacksonImmunochemicals)对其进行检测。所有Notch构建体都是全长的。结果示于图2。如图2所示，59R1IgG2抗体与人类Notch3和人类Notch2都特异性结合，但不与全长人类Notch1或人类Notch4显著结合。
使用Biacore 2000仪器确定人类和小鼠Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的亲和性。简言之，使用标准的基于胺的化学(NHS/EDC)将重组人类和小鼠Notc蛋白(Notch1，2，&4的EGF 10-15；Notch3的EGF9-14)固定在CM5芯片上。对于hNotch2，还测试EGF1-12的结合。将不同浓度的抗体(1nM～100nM)注射在蛋白表面上，并且收集动力学随时间的数据。使用同步全拟合方程(simultaneous global fit equation)对数据进行拟合，从而生成各Notch的解离常数(KD，nM)(表3)。
表3
59R1IgG解离常数(KD)
*N2(EGF1-12)
**N2(EGF10-155)
实施例3
抗Notch2/3抗体59R1的表位作图
为了鉴定可识别Notch受体胞外域的特异性非配体结合区的抗体，进行表位作图。
通过ELISA测试抗Notch2/3抗体与来自HEK 293细胞的上清的结合，所述HEK293细胞转染有编码重组人类Notch2Fc融合蛋白的序列，所述序列包括全长人类Notch2蛋白或各种含有EGF重复1～12的各种缺失的人类Notch2缺失构建体。参见以下表4。用带有编码与人类IgG的恒定区(hFc)融合的所示氨基酸的hNotch2cDNA的pcDNA 3.1(Invitrogen)瞬时转染HEK-293细胞。48小时后收获上清液。为了捕获hN2-hfc蛋白，首先在4°下用在碳酸氢钠缓冲液中的100ng/孔的山羊抗-人Fcγ特异性IgG(Jackson Immunochemicals，#109-006-098)包被96孔板过夜。对板进行洗涤和在5％牛血清/PBS-Tween-20中进行封闭。向板添加上清液并在室温下温育1小时。在PBS-T中洗涤板。添加5％血清/PBS-T中的10μg/ml的59R1Fab，并在室温下温育1小时。在PBS-T中洗涤板。通过以1：5000稀释于5％血清/PBS-T中的与辣根过氧化物酶(Thermo，#31414)缀合的山羊抗-人Fab特异性抗体在室温下1小时检测Fab结合。对板进行洗涤和用1Step Ultra TMB(Thermo，#34028)显色。在Perkin ElmerVictor 1420读板仪上对板进行读数。抗Notch2/359R1抗体仅与来自表达包含EGF10的重组Notch2蛋白的细胞的上清液结合(图3A)，所述EGF10由人类Notch 2的氨基酸375至417组成。
表4.人类Notch2缺失构建体
另外，FACS分析显示，当EGF 1l或EGF 12从由HEK 293细胞表达的全长Notch2重组蛋白中缺失时，59R1Fab抗体结合得以保留(图3B)。在Notch2融合蛋白的EGF10内进行点突变，并且通过FACS分析确定59R1与各EGF10突变体的结合。用所示Notch表达质粒和作为转染对照的GFP瞬时转染HEK-293细胞。GFP阳性细胞表明转基因的表达。向所述细胞添加10μg/ml的所述59R1Fab抗体，并且通过PE-缀合的山羊抗-人(Jackson Immunochemicals)对其进行检测。
为了验证EGF重复10的丧失不干扰配体结合，产生了失去氨基酸375-412的突变体hNotch2并且测试其与59R1、针对EGF 1-4的hNotch2单克隆59M70的结合，以及与配体人类DLL4的结合(图3C)。对用所示Notch表达质粒和作为转染对照的GFP瞬时转染的HEK-293细胞进行FACS分析。GFP阳性细胞表明转基因的表达。添加20μg/ml的抗Notch2(59M70)，并且通过PE-缀合的山羊抗-鼠(Caltag，#3004-4)对其进行检测。向所述细胞添加2μg/ml的59R1(IgG2)，并且通过PE-缀合的山羊抗-人Fcγ特异性(Jackson Immunochemicals)对其进行检测。通过使所述细胞与5μg/ml的与兔IgG恒定区融合的人类DLL4胞外域(ECD)一起温育确定配体结合，并且通过PE-缀合的驴抗-兔抗体进行检测。如图3C所示，在不存在EGF 10时，配体和59M70都与hNotch2结合，但59R1不结合。
进行人类Notch1、Notch2和Notch4的EGF 10区域与人类Notch3的EGF 9区域(其它Notch受体中的EGF 10的等效物)的比较分析从而确定59R1的可能结合位点(图14A)。作为分析的结果，在全长Notch2内生成几个点突变，将EGF10内的残基转换成人类Notch1中的相应氨基酸。另外，相反地，在hNotch1EGF 10中进行点突变，将残基转换成相应的hN2残基。通过突变法(Stratagene)产生全长Notch序列的突变体，并通过测序进行验证。通过FACS分析确定与突变体的结合(图14B和14C)。通过PE-缀合的山羊抗-人Fcγ特异性抗体(Jackson Immunochemicals，#109-116-170)对59R1进行检测。因此确定对于59R1与hNotch 2结合所需的氨基酸是组氨酸385、丙氨酸388和亮氨酸389(位于图14A中所示的加框hNotch2序列中的残基)。hNotch3中相应的残基是组氨酸361、丙氨酸364和异亮氨酸365。
实施例4
抗Notch2/3抗体59R1抑制Notch2信号传导。
使用荧光素酶报告子检测来测试59R1抗体阻断hDLL4-，hJAG1-和hJAG2-诱导的Notch2信号传导的能力。
用具有合成8X CBS启动子的萤火虫荧光素酶(Ong等，2006，J.of BiologicalChemistry，281：5106-5119)、pSPORT6MAML-1和作为转染对照的Renilla荧光素酶-CMV瞬时转染稳定过表达人类Notch2的HeIa细胞。使细胞与100ng用所示抗体固定的hDLL4(R&D系统)一起温育16小时，然后使用Dual-Glo(Promega)根据制造商说明进行检测。对照抗体的浓度为40μg/ml。滴定59R1IgG2抗体，在40μg/ml开始，然后稀释四分之一。使用1μM的γ分泌酶抑制剂(GSI)二苯并氮卓(DBZ)作为对照。如图4A中所示，发现59R1抗体抑制hDLL4-诱导的Notch2报告子活性。
用具有合成8X CBS启动子的萤火虫荧光素酶、pSPORT6MAML-1和作为转染对照的Renilla荧光素酶-CMV瞬时转染稳定过表达人类Notch2的HeIa细胞。使细胞与用200ng的经固定hJAG1(R&D系统)或hJAG2(R&D系统)一起温育16小时，然后使用Dual-Glo(Promega)根据制造商说明进行检测。59R1IgG2抗体的浓度为40μg/ml。使用1μM的γ分泌酶抑制剂(GSI)二苯并氮卓(DBZ)作为对照。分别如图4B和4C中所示，发现59R1抗体抑制hJAG1-和hJAG2-诱导的Notch2报告子活性。
实施例5
抗Notch2/3抗体59R1预防体内肿瘤生长。
该实施例描述使用结合Notch受体的非配体结合区(Notch2的EGF10和Notch3的EGF10)的抗Notch2/3受体抗体(59R1)来预防异种移植物模型中的肿瘤生长。
在特定实施方式中，注射有50,000PE13或T3乳瘤细胞的NOD/SCID小鼠在细胞注射两天后，用抗Notch2/3抗体59R1或对照抗体1B7.11进行治疗。以10mg/kg每周两次给药抗体。与对照相比，抗Notch2/3抗体59R1显著地减少PE13(图5A)和T3(图5B)肿瘤生长。
实施例6
使用抗Notch 2/3抗体59R1体内治疗肿瘤。
该实施例描述使用抗Notch 2/3抗体来治疗异种移植物模型中的癌。
在一个实验中，将1×107的活Colo-205结肠瘤细胞注入在Swiss CD-1背景下的6～8周大的免疫妥协bg/nu XID雌性小鼠中。使肿瘤生长至65mm3～200mm3的尺寸，然后对小鼠进行随机分组(每实验组n＝10)，并且开始抗体施用。每周一次用15mg/kg的对照1B7.11抗体或抗Notch2/359R1抗体治疗动物。对肿瘤尺寸每周测定两次，如(参见Michieli等，2004，Cancer Cell，6：61-73)所述计算肿瘤体积。与对照相比，抗Notch2/3抗体59R1显著地减少Colo-205肿瘤生长(图5C)。
在另一实验中，测试抗Notch2/3抗体对胰腺瘤生长的作用。用30,000个PN4胰腺瘤细胞皮下(sub-cu)在右胁腹注射NOD/SCID小鼠，使肿瘤生长直到它们达到100mm3的平均体积。使动物随机化并开始抗Notch2/3抗体59R1或对照抗体1B711的给药。以15mg/kg每周一次给药抗体。与对照相比，抗Notch2/3抗体59R1显著地减少PN4肿瘤生长(图5D)。
在另一实验中，测试抗Notch2/3抗体对乳瘤生长的作用。用50,000个PE13或T3乳瘤细胞注射NOD/SCID小鼠，使肿瘤生长达到65mm3～200mm3的尺寸，然后使小鼠随机分组(每实验组n＝10)，并且开始抗体施用。每周两次用15mg/kg的对照1B7.11抗体或抗Notch2/359R1抗体治疗动物。对肿瘤尺寸每周测定两次，如(参见Michieli等，2004)所述计算肿瘤体积。与对照相比，抗Notch2/3抗体59R1显著地减少PE13(图5E)和TE(图5E)肿瘤的生长(图5F)。
抗体治疗的终点时，可收获肿瘤以用于进一步分析。在某些实施方式中，通过免疫荧光分析肿瘤的一部分，从而评估抗体向肿瘤中的渗透和肿瘤应答。将来自抗Notch2/3抗体治疗的小鼠和对照抗体治疗的小鼠的各收获的肿瘤的一部分在液氮中新鲜冷冻，包埋在O.C.T.中并且在低温保持器上切成在载玻片上的10um切片。作为选择，对各肿瘤的一部分进行福尔马林固定、石蜡包埋和在切片机上切成在载玻片上的10um切片。对切片进行后固定并与特异性识别所注射抗体的生色团标记抗体一起温育，从而检测在肿瘤活检样中存在的抗Notch2/3抗体或对照抗体。另外，可以使用检测不同肿瘤和肿瘤募集细胞(recruited cell)类型的抗体来评价抗体治疗对血管发生、肿瘤生长和肿瘤形态的影响，所述检测不同肿瘤和肿瘤募集细胞类型的抗体例如有检测血管内皮细胞的抗-VE钙粘蛋白(CD 144)或抗-PECAM-1(CD31)抗体、检测血管平滑肌细胞的抗-平滑肌α-肌动蛋白抗体、检测增殖细胞的抗-Ki67抗体、检测死细胞的TUNEL检测和检测Notch信号传导的抗-胞内域(ICD)Notch片段抗体。
还可以评估抗Notch2/3抗体治疗对肿瘤细胞基因表达的影响。从来自Notch2/3抗体治疗的小鼠和对照抗体治疗的小鼠的各收获肿瘤的一部分提取总RNA，并用于进行定量RT-PCR。相对于作为内部对照的持家基因GAPDH，分析Notch2/3的表达水平、Notch2和/或Notch3信号传导途径的组分，以及包括例如CD44等在内的癌干细胞标记物。由此确定当Notch2/3抗体治疗时肿瘤细胞基因表达上的变化。
另外，可以评价抗Notch2/3抗体治疗对肿瘤中癌干细胞的存在的影响。将来自Notch 2/3抗体治疗的小鼠以及相对的对照抗体治疗的小鼠的肿瘤样品切成小块，使用无菌刀片完全切碎，并且通过酶促消化和机械破坏获得单细胞悬浮液。然后通过FACS分析对解离的肿瘤细胞分析致瘤性癌干细胞的存在，所述致瘤性癌干细胞基于如上详细所述的ESA+,CD44+,CD24-/low,Lin-表面细胞标记物表达。
然后评估在抗Notch2/3抗体治疗后基于ESA+,CD44+,CD24-/low,Lin-表达分离的细胞的致瘤性。在一个实验中，将5,000、1,000、500和100个来自Notch 2/3抗体治疗的小鼠以及相对的对照抗体治疗的小鼠的分离的ESA+,CD44+,CD24-/low,Lin-癌干细胞皮下再注入NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。基于持续肿瘤形成所需注射细胞的数量，由此确定癌干细胞的致瘤性。
实施例7
抗Notch 2/3抗体59R1延迟紫杉醇治疗后体内肿瘤复发。
将B51乳瘤细胞(每只小鼠50,000个细胞)皮下注入NOD/SCID小鼠的乳腺脂肪垫中。使肿瘤生长50天直到它们达到～100mm3的平均体积。使动物随机分组(n＝10/组)并开始治疗。一组接受每周两次的10mg/kg的对照抗体(1B711)和每周两次的15mg/kg的紫杉醇(Taxol)，另一组接受每周两次的10mg/kg的59R1和每周两次的15mg/kg的紫杉醇。在指定日期测定肿瘤体积。治疗进行38天直到肿瘤体积消退到～50mm3，然后停止紫杉醇治疗，在实验的持续时间内继续抗体治疗。
结果示于图6。观察到与用59R1治疗的组相比，对照组中复发更迅速。
实施例8
抗Notch 2/3抗体59R1减少体内肿瘤中癌干细胞的频率。
可以使用有限稀释检测(LDA)来评估Notch结合剂对实体瘤癌干细胞的影响和对包含癌干细胞的肿瘤的致瘤性的影响。可以使用上述检测来确定用Notch结合剂或其它试剂治疗的动物的肿瘤中癌干细胞的频率，并与对照动物的肿瘤中癌干细胞的频率进行比较。
使用LDA来评估如以上实施例7中所述的用对照抗体(1B711)加上紫杉醇(Taxol)的组合进行治疗的或用59R1和紫杉醇的组合治疗的B51乳瘤的致瘤性的影响。另外，还通过LDA确定用单独的对照抗体或单独的59R1治疗B51乳瘤的效果。关于以上其它两个治疗组，对照抗体组和59R1组的抗体和紫杉醇的剂量以及给药方案与实施例7中所述相同。3剂的抗体和/或紫杉醇后，收获肿瘤，对其处理并解离成单细胞。通过在冰上与生物素化的小鼠抗体(1：200稀释的α-小鼠CD45-生物素和1：100稀释的大鼠α-小鼠H2Kd-生物素，BioLegend，San Diego，CA)温育30分钟，然后添加链亲和素-标记的磁珠并且在磁体的帮助下除去小鼠细胞，从而由异种移植物肿瘤细胞中分离人类肿瘤细胞。收获悬浮液中的人类细胞并对其计数。
将来自四个治疗组中每组的连续滴定细胞(30、90、270和810个细胞)于FACS缓冲液和基质胶(Matrigel)的1：1(v/v)混合物中注入新的NOD-SCID小鼠组(n＝10/组)。使肿瘤生长72天。在所有组中确定具有可检测肿瘤的小鼠的百分比。然后使用L-CalcTM软件(StemCell Technologies Inc.；可从www.stemcell.com/search/default.asp下载)计算癌干细胞频率。
结果示于图7。对照-治疗的小鼠(“对照”)的肿瘤中癌干细胞的频率经确定为1：66。紫杉醇-治疗的小鼠(“紫杉醇”)的肿瘤中癌干细胞的频率显示为1：25，表明与对照相比用紫杉醇进行的治疗实际上使肿瘤中癌干细胞的频率增加超过两倍。另一方面，使用单独的59R1抗体(“59R1”)或59R1抗体与紫杉醇组合(“紫杉醇+59R1”)进行的治疗，减少肿瘤中癌干细胞的频率。与对照相比，单独的59R1抗体使肿瘤中癌干细胞的频率减少超过两倍。使用59R1抗体和紫杉醇的组合进行的治疗使肿瘤中癌干细胞的频率相对于单独的59R1进行的治疗减少约两倍(p<0.0001)，相对于用对照抗体进行的治疗减少约4.5倍，相对于单独的紫杉醇的治疗减少约12倍。这些结果表明，无论是单独给予还是与紫杉醇组合给予，使用59R1抗体进行的治疗在减少乳瘤的致瘤性上是有效的，不过使用单独的紫杉醇进行的治疗具有相反作用。
实施例9
另外的使用抗Notch 2/3抗体59R1体内治疗肿瘤。
将PN4胰腺瘤细胞(每只小鼠50,000个细胞)皮下注入Nod-Scid小鼠的胁腹区域。使肿瘤生长27天直到它们达到～120mm3的平均体积。使动物随机分为4个治疗组(n＝10/组)并开始治疗。一组接受每周两次的10mg/kg的对照抗体(1B711)；一组接受每周一次的40mg/kg的吉西他滨加上每周两次的10mg/kg的对照抗体；一组接受每周两次的10mg/kg的59R1，第四组接受每周两次的10mg/kg的59R1与每周一次的40mg/kg的吉西他滨的组合。在指定日期测定肿瘤体积。结果示于图8。发现59R1和吉西他滨的组合抑制肿瘤生长(p<0.001)。
将M4黑色素瘤细胞(每只小鼠10,000个细胞)皮下注入NOD-SCID小鼠的胁腹区域。使肿瘤生长25天直到它们达到～80mm3的平均体积。使动物随机分为治疗组(n＝10/组)并开始治疗。一组接受每周两次的10mg/kg的对照抗体(1B711)，一组接受每周两次的10mg/kg的59R1。在指定日期测定肿瘤体积。结果示于图9。发现59R1抑制肿瘤生长。
将C28结肠瘤细胞(每只小鼠10,000个细胞)皮下注入NOD-SCID小鼠的胁腹区域。使肿瘤生长24天直到它们达到～130mm3的平均体积。使动物随机分为4个治疗组(n＝10/组)并开始治疗。一组接受每周两次的10mg/kg的对照抗体(1B711)；一组接受每周一次的7.5mg/kg的伊立替康加上每周两次的10mg/kg的对照抗体；一组接受每周两次的10mg/kg的59R1，第四组接受每周两次的10mg/kg的59R1与每周一次的7.5mg/kg的伊立替康的组合。在指定日期测定肿瘤体积。结果示于图10。发现，与对照抗体组相比单独的59R1抑制肿瘤生长，与伊立替康组相比59R1和伊立替康的组合抑制肿瘤生长。
还在乳瘤异种移植物系OMP-B34、OMP-B39、OMP-B44、PE13和UM-Tl，胰腺瘤异种移植物系OMP-PN8，和结肠瘤异种移植物系OMP-C8中体内测试了59R1IgG2抗体。根据Al-Hajj等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，100：3983-3988中所述步骤建立这些肿瘤异种移植物系。7～10周大的雌性NOD/SCID免疫妥协小鼠用于建立乳瘤异种移植物，雄性NOD/SCID小鼠用于OMP-Pn8和OMP-C8肿瘤模型(Harlan，Indianapolis，Indiana)。还在Colo-205结肠瘤异种移植物模型中体内测试了59R1IgG2抗体。Swiss CD-1背景下的雌性免疫缺陷性bg/nu XID小鼠用于Colo-205异种移植物肿瘤模型。在乳癌模型的情况下，必须植入缓释雌激素团块(0.36mg)。分别用在PBS(不含镁或钙)和基质胶的比例为1：1的混合物中的50,000个(OMP-B34、OMP-B39、OMP-B44、PE13和UM-T1)或1×107个(Colo-205)活细胞在右胁腹对小鼠进行皮下注射。每只小鼠的注射总体积是200μl，50％是基质胶。一旦肿瘤达到65mm3～200mm3的尺寸，使小鼠随机化。每周施用抗体，并且每周两次测定肿瘤。LZ1(识别溶菌酶的人类抗体)或1B711(识别半抗原三硝基苯酚的鼠类IgG1抗体)用作各肿瘤类型治疗的对照抗体。如Al-Hajj等(2003)所述计算肿瘤体积。数据表示为平均值和平均值±S.E.M。使用学生双尾非配对t检验比较组平均值。<0.05的概率(P)值解释为显著差异。使用Microsoft EXCEL和Graph Pad PRISM进行所有统计分析。
Colo205、C8、PNA、B34、B39、B44、PE13和T1异种移植物模型的另外的体内实验结果分别示于图11A～11H。如图11A中所示，与对照抗体(LZ1)相比使用59R1抗体的单一疗法显著抑制Colo205肿瘤的生长(p<0.01)。59R1加上抗VEGF抗体贝伐单抗(AVASTIN)的组合疗法提供了比单独的59R1或单独的贝伐单抗更大的对肿瘤生长的抑制(p<0.001)。在另一结直肠异种移植物模型C8中，与对照抗体相比59R1同样也显示抑制肿瘤生长(图11B)。类似地，发现在PN8异种移植物模型中59R1抑制胰腺瘤生长(相对于对照抗体)(图11C)。在五个乳癌异种移植物模型B34(图11D)、B39(图11E)、B44(图11F)和PE13(图11G)的每个模型中，相对于对照抗体，59R1也显示抑制乳癌生长。同样发现59R1抗体在T1乳癌模型(图11H)中对于抑制肿瘤生长也是有效的，虽然其仅在雌激素的存在下有效，尽管T1是雌激素受体阴性肿瘤。
实施例10
在异种移植物肿瘤模型中使用抗Notch2/3抗体59R1进行的治疗对基因调节的影响
通过微阵列分析对用59R1IgG2抗体治疗的各种异种移植物肿瘤模型中的基因表达水平进行分析。在Affymetrix HG-U133plus 2.0microarray(Affymetrix，SantaClara，CA)上进行全基因表达图谱分析。根据制造商说明，分离来自对照组和治疗组的异种移植物全肿瘤的三个独立RNA样品，并使其与所述微阵列杂交。使用开源bioconductor软件(www.bioconductor.org)中的GCRMA算法进行扫描阵列背景调整和信号强度标准化。通过对对照(CTRL)组和治疗(59R1)组中样品的z-分数转换，使各基因的表达水平标准化。用Bayesian t检验(Baldi等，2001，Bioinformatics，17：509-519)鉴定两个组之间差异表达(p<0.05并且倍数变化>2.0)的基因。在所选肿瘤异种移植物模型(Colo205、B44、PE13和T1)中所选相关差异调节的基因的表达模式示于以下表5。各基因的P值(PVal)是使用Bayesian t检验的由59R1偶然地对所述基因进行显著调节的概率。相对于对照小鼠，在59R1治疗的小鼠的间质中许多基因显示被显著下调，所述基因包括编码G-蛋白信号传导5的调节子(RGS5)、Notch3和与YRPW基序相关的多毛/分裂增强子-样(HEYL)蛋白的基因。(相反，未发现编码RGS5、Notch3和HEYL的这些特定基因在人类肿瘤细胞中显著下调)。
表5.在59R1治疗的肿瘤的间质中差异表达的基因
通过分析对来自异种移植物模型Colo205、B29、B34、B44、PE13、T1(未用雌激素处理)、T1(用雌激素处理)、C8和PN8的间质中所选择基因(heyl、notch3、rgs5、angpt1和angpt2)的表达水平进行进一步分析，所述所选择基因已经在微阵列分析中鉴定为受59R1治疗调节。结果示于图12A(heyl)、12B(notch3)、12C(rgs5)、12D(angpt1)和12E(angpt2)。
分析的结果确认各种肿瘤类型中每个类型的间质中notch3和rgs5响应于使用59R1进行的治疗(相对于对照)而下调(图12B和图12C)。RGS5是周细胞和血管平滑肌细胞的众所周知的标记物(Berger等，2005，Blood，105：1094-1101；Lovschall等，2007，Int.J.Dev.Biol.，51：715-721；Cho等，2003，FASEB J.，17：440-2)。Notch3已经鉴定为在血管发生期间在周细胞中与RGS5共表达，并且在周细胞和血管平滑肌细胞的命运调节中起重要作用(Lovschall等，2007，Int.J.Dev.Biol.，51：715-721；Domenga等，2004，Genes&Dev.，18：2730-2735；Sweeney等，2004，FASEB J.，18：1421-3；Morrow等，2005，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，289：C1188-C1196)。
另外，还确认heyl在除了B34之外的每个异种移植物模型的间质中下调(图12A)。HeyL属于Notch信号传导的下游转录因子的Hey家族(Hey1、Hey2和HeyL)。heyl通过59R1的下调表明59R1抗体通过使heyl下调直接影响Notch信号传导。
还确定血管生成素-1(angiopoietin-1，angpt1)和血管生成素-2(angiopoietin-1，angpt2)在许多乳癌模型的间质中下调(图12D和12E)ANGPT1和2(血管生成素-1和血管生成素-2)是TIE1和2受体的配体。类似VEGF的TIE受体，是新血管发生过程中的关键信号传导分子(Jones等，2001，Nature Reviews，2：257-267)。
但是，值得注意的是，在使用雌激素治疗时(使用59R1进行的治疗有效对抗肿瘤生长的条件下)的T1模型("T1e")的间质中angpt1和angpt2下调，但在不存在雌激素治疗(使用59R1进行的治疗对于肿瘤生长无效的条件下)的相同模型("T1ne")的间质中不下调(如上，参见实施例9)。因此，在T1肿瘤的间质中59R1对血管生成素-1和血管生成素-2的下调的作用在不存在雌激素治疗时消除。该作用的一种可能解释是，在不存在雌激素治疗时，T1间质中生长因子血管生成素-1和血管生成素-2的水平对于提供当使用59R1抗体进行治疗时表达水平的可测定降低而言不足够高。已经显示雌激素对肿瘤微环境具有显著影响(Banka等，2006，Cancer Res.66：3667-3672)。该数据的一种可能解释是雌激素导致肿瘤对ANGPT2信号传导的依赖，其然后导致对59R1治疗的敏感性。
实施例11
抗Notch2/3抗体59R1显著诱导结肠瘤和乳瘤中缺氧。
在已经用59R1IgG2抗体或用1B711对照抗体治疗的Colo-205结肠瘤和PE-13乳瘤中进行对缺氧区的染色。如Ridgway等，2006，Nature 444：1083-1087中所述进行染色。简言之，为了测定缺氧，在杀死之前1小时将盐酸哌莫硝唑(HypoxyProbe，NPI，Burlington，MA)以60mg/kg腹膜内注射，所述盐酸哌莫硝唑在氧分压小于约10mm Hg时形成寿命长的蛋白加合物。然后对肿瘤进行处理以用于组织学分析，按照制造商策略(NPI)使用抗-哌莫硝唑抗体对肿瘤切片进行染色。使用BX51显微镜(Olympus，Center Valley，PA)拍摄照片。
如相对均匀和稠密的DAPI染色所示，发现活肿瘤细胞相等地存在于1B711治疗的和59R1治疗的肿瘤中(数据未示出)。CD31-阳性细胞的数量也保持不变，表明内皮细胞数量不受59R1治疗影响。但是，在59R1-治疗的Colo-205和PE13肿瘤中，缺氧区(如通过抗-哌莫硝唑抗体检测)比在1B711治疗的肿瘤中显著更明显(数据未示出)。使用AF594-缀合的山羊抗-大鼠F(ab')2来检测抗-CD31抗体，并且使用FITC-缀合的山羊抗-兔抗体来检测抗-哌莫硝唑抗体。
实施例12
包含PTEN肿瘤抑制子基因缺失的乳瘤对使用59R1进行的治疗具有应答性。
从异种移植物乳癌的肿瘤细胞制备DNA样品。DNA分离前，使用缀合有小鼠细胞特异性抗体的磁珠使异种移植物肿瘤中的小鼠间质细胞耗尽。根据制造商说明，使经纯化DNA样品与Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0基因芯片(Affymetrix，Santa Clara，CA)杂交，所述基因芯片具有超过946,000个探针用于检测拷贝数量变化(CNV)。通过各样品的隐马尔可夫模型(HMM)评估拷贝数量状态变化，并使用Hapmap270作为基线通过等级分割(rank segmentation)获得它们的变化(CNV)。由于阵列中的固有噪音，使用-0.5与-1.0log2比值作为在显著阈值<1.0×10-6和每区段的探针最小值＝5下的杂合缺失和纯合缺失的截止点。
图13显示染色体10中磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)基因的外显子、Affymetrix探针分布和缺失。发现B29、B34、B37、B40、B51、T2、T3和T6乳瘤在其基因组中具有完整的PTEN基因。确定B39肿瘤中PTEN基因携带有纯合缺失，而确定B44、PE13和T1肿瘤具有该基因的杂合缺失。如上讨论，确定59R1对这四种包含PTEN的纯合缺失或杂合缺失的乳瘤中的每一种都具有抗-肿瘤功效。这些结果表明，因携带纯合性或杂合性PTEN缺失的肿瘤，特别是乳瘤，可能特别适于使用诸如59R1等抗Notch2/3抗体进行的治疗。
实施例13
59R5抗体的表征
鉴定出特异性结合人类Notch 2和人类Notch 3的另外的人类抗体59R5。提供分别作为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：18的重链序列和轻链序列。重链可变区在SEQID NO：50中提供，轻链可变区在SEQ ID NO：13中提供。59R5的重链CDR3包含SIFYTT，SEQ ID NO：51。59R5的其它CDR序列与59R1的具有同一性。对59R1和59R5结合亲和性进行的Biacore分析表明，59R5与Notch2和Notch3的结合性质与59R1类似。两种抗体都结合人类和鼠类Notch2和Notch3受体，具有亚纳摩尔的亲和性(参见表6)。
表6
确定了59R5在阻断Notch2和Notch3信号传导上与59R1具有相似的活性。在基于荧光素酶的检测中确定了受体激活。对PC3肿瘤细胞用人类或小鼠Notch受体(人类Notch2、鼠类Notch2、人类Notch3或鼠类Notch3)和GFP诱导型报告子构建体进行瞬时转染。使经转染细胞与不同浓度的59R1或59R5抗体在被动固定的DLL4-Fc蛋白的存在下一起温育。通过测定荧光素酶活性确定Notch受体激活。如图15A所示，59R5以与59R1类似的水平阻断人类Notch2、鼠类Notch2、人类Notch3和鼠类Notch3受体信号传导的配体-诱导的激活。
确定59R5的结合表位。对于抗体59R1的分析如实施例3中所述，在全长Notch1内形成几个点突变，将EGF10内的残基转换成人类Notch2中的相应氨基酸。通过突变法(Stratagene)产生全长Notch序列中的突变，并通过测序进行验证。用编码人类Notch2、人类Notch1或残基382-386突变成相应的人类Notch2残基的人类Notch1的表达载体对HEK 293细胞进行瞬时转染。对细胞还用编码绿色荧光蛋白(GFP)的质粒共转染，从而标记接受所转染质粒的那些细胞。使细胞与59R1或59R5以及荧光第二抗体一起温育，然后通过FACS进行检查。通过PE-缀合的山羊抗-人Fcγ特异性抗体(Jackson Immunochemicals，#109-116-170)检测59R1和59R5。如图15B所示，59R5与Notch2结合并且不与Notch1结合。但是，当将对应于Notch2氨基酸385-389的氨基酸取代到Notch1中时，59R5能够与突变的Notch1结合。这表明对于59R5与人类Notch 2结合必需的至少一个或多个氨基酸位于氨基酸385-389内(在图14A中所示的加框hNotch2序列中的残基)，并且表明59R5与59R1结合相同的表位，或与59R1的表位类似的表位，或与59R1的表位重叠的表位。
实施例14
使用Notch2/3抗体59R5的肿瘤体内治疗
在一个实施方式中，用PE13乳瘤细胞注射NOD/SCID小鼠。用抗Notch2/3抗体59R1、抗Notch2/3抗体59R5或对照抗体治疗所述小鼠。当细胞注射后两天开始给药时，以“预防性”模式每周一次以15mg/kg给药抗体。图16A显示，与使用59R1看到的效果类似，59R5治疗对肿瘤生长的抑制大于80％。
在另一实施方式中，用C28结肠瘤细胞注射NOD/SCID小鼠。用抗Notch2/3抗体59R1、抗Notch2/3抗体59R5或对照抗体治疗所述小鼠。当细胞注射后两天开始给药时，以“预防性”模式每周一次以15mg/kg给药抗体。图16B显示59R1和59R5都抑制C28结肠瘤的生长。
在另一实施方式中，用Colo205结肠瘤细胞注射NOD/SCID小鼠。用抗Notch2/3抗体59R1、抗Notch2/3抗体59R5或对照抗体治疗所述小鼠。肿瘤已经建立后，每周一次以15mg/kg给药抗体。图16C显示59R1和59R5都以类似的水平抑制Colo208结肠瘤的生长。
实施例15
组合治疗中使用Notch2/3抗体59R5对肿瘤进行的体内治疗
在一个实施方式中，用PN8胰腺瘤细胞注射NOD/SCID小鼠。使肿瘤生长约33天直到它们达到150mm3的平均肿瘤体积。与对照抗体、抗Notch2/3抗体59R1或抗Notch2/3抗体59R5组合，用20mg/kg的吉西他滨每周一次治疗所述小鼠4周。如图17A所示，抗体59R5以与抗体59R1类似的水平抑制肿瘤生长，并且该组合治疗延长的肿瘤复发时间比单独的吉西他滨更长。
在一个实施方式中，为了评价59R5对癌干细胞的作用，在PE13乳瘤模型中进行肿瘤复发研究。用PE13乳瘤细胞注射NOD/SCID小鼠。开始治疗前使肿瘤生长40天。与对照抗体或抗Notch 2/3抗体59R5组合，每周两次用15mg/kg的紫杉醇治疗小鼠5周。5周后，停止紫杉醇治疗，并且继续抗体治疗。观察到59R5显著地延迟了高剂量的紫杉醇治疗后的肿瘤复发(图17B)。这些结果表明59R5治疗减少癌干细胞频率。
此前实施方式中描述的59R1和59R5的体内活性的总结示于表7。各实验的肿瘤体积和p值相对于对照组显示。如实施例14中所述进行PE13、C28和Colo205研究。如上所述进行PN8研究。对于PN8实验，对照是单独的吉西他滨，而59R1和59R5的值是与吉西他滨的组合。对于所有实验而言，以15mg/kg每周一次给药抗体。
表7
实施例16
59R5治疗后肿瘤中的基因表达的调节
为了确定59R5和59R1是否通过相同的机制在体内起作用，检查肿瘤细胞和肿瘤间质中关键靶基因的表达。在PE13肿瘤细胞和间质细胞中通过定量PCR检测基因表达。相对于对照抗体治疗组的基因表达水平示于图18。59R1和59R5将鼠类HeyL、Notch3和RGS5在间质细胞中的表达调节到类似的程度(左框图)。在C28肿瘤中观察到相同模式的调节(数据未示出)。因此，59R5保留对于肿瘤脉管系统和周细胞的功能而言关键的、在肿瘤间质中调节基因方面之前对于59R1鉴定出的作用机制。类似地，59R5和59R1将肿瘤细胞中的人类基因ID4、EDNRA和EGLN3的表达调节到相同的程度(右框图)。
与该基因家族的其它成员不同，ID4通常在肿瘤中表达不足，并且已经显示ID4是乳癌中的肿瘤抑制剂，其经常通过甲基化而被沉默。ID4表达的损失与乳瘤患者中的不良预后相关(Noetzel等，2008，BMC Cancer 8：154)。因此，ID4在PE13乳瘤细胞中的上调可以是抗Notch2/3的抗肿瘤机制的一部分。EDNRA是编码内皮素受体的基因，所述内皮素受体促进内皮细胞和肿瘤细胞生长并且刺激肿瘤细胞的转移活性(Bagnato和Rosano 2008，Int.J.Biochem.Cell.Biol.40：1443-51)。EGLN3(还称为HIF-3α)是缺氧诱导型基因。抗Notch2/3对EGLN3的诱导与所治疗肿瘤中功能性脉管系统的破坏一致。这些数据表明59R1和59R5的生物活性和作用机制非常类似。
表8显示对经59R1和59R5治疗的PE13肿瘤进行微阵列分析的结果。数值是治疗动物相对于对照动物的平均差异表达值，每组3只动物。
表8
微阵列分析揭示，如通过基因表达(例如，Foxc2、Hey2、Heyl、Notch3)测定，59R5显著抑制Notch途径(p<0.01)。这些结果与59R1相当。Foxc2是Hedgehog途径的下游靶标，并且参与细胞分化。在59R1和59R5之间，参与凋亡(例如，颗粒酶A)和肿瘤相关组织重塑(MMP-9)的其它基因也类似地表达。这些数据表明59R1和59R5的生物活性和作用机制非常类似。
实施例17
另外的Notch2和/或Notch3抗体的制备
抗原制备
在特定实施方式中，产生人类Notch2或人类Notch3胞外域的重组多肽片段作为用于制备抗体的抗原。例如可以使用标准重组DNA技术来分离编码Notch2的氨基酸1-493的多核苷酸(SEQ ID NO：33)，其包括EGF 1-12。将该多核苷酸框架内N末端地连接至人类Fc标签或组氨酸标签，并且克隆到转移质粒载体中，以用于在昆虫细胞中进行杆状病毒-介导的表达。使用标准转染、感染和细胞培养策略来产生表达相应Notch2多肽(SEQ ID NO：34)的重组昆虫细胞(O'Reilly等，1994，BaculovirusExpression Vectors：A Laboratory Manual，Oxford：Oxford University Press)。
使用切割预测软件SignalP 3.0估计人类Notch2的内源性信号序列的切割，但是实际的体内切割点可以在任一方向相差几个氨基酸。Notch2的预测切割位于氨基酸1和26之间，因此Notch2抗原蛋白包含约氨基酸27～氨基酸493。可以使用蛋白A和Ni++-螯合亲和色谱从昆虫细胞条件培养基中纯化抗原蛋白。然后对经纯化的抗原蛋白以PBS(pH＝7)进行透析，浓缩至约1mg/ml，并且在免疫用制剂中无菌过滤。
免疫
使用标准技术以经纯化Notch2或Notch3抗原蛋白对小鼠进行免疫。使用ELISA和FACS分析在初始免疫后约70天就抗原识别对来自个体小鼠的血液进行筛选(以下详细描述)。然后选择具有最高抗体滴度的动物以用于最终的抗原增强，其后分离脾细胞以用于杂交瘤制备。在96孔板中将杂交瘤细胞以每孔1个细胞铺板，针对抗原蛋白通过ELISA和FACS分析来筛选各孔的上清液。选择几株具有高抗体滴度的杂交瘤，并且以静态瓶培养扩增。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖色谱从杂交瘤上清液中对抗体进行纯化，通过如下所述的FACS测试抗体。
FACS分析
为了选择由杂交瘤(可识别天然细胞-表面Notch2(和/或Notch3)蛋白的克隆)产生的单克隆抗体，使用了FACS分析。以编码Notch2的全长cDNA克隆和转染标记GFP的表达载体对HEK293细胞进行共转染。转染后24小时～48小时，收集悬浮液中的细胞，使其在冰上与抗Notch2(或抗Notch3或抗Notch2/3)抗体或用于检测背景抗体结合的对照IgG一起温育。洗涤细胞，使用与荧光发色团缀合的抗-鼠二抗检测一抗。然后通过FACS分选经标记的细胞，从而鉴定特异性识别天然细胞表面Notch2和/或Notch3蛋白的细胞表面表达的抗Notch2、抗Notch3或抗Notch2/3抗体。
嵌合抗体
在鉴定出特异性识别Notch受体的非配体结合域的单克隆抗体后，对这些抗体进行修饰，从而克服当使用啮齿动物抗体作为治疗剂时的人类抗-鼠抗体(HAMA)免疫应答。通过RT-PCR从杂交瘤细胞分离所选择单克隆抗体的重链和轻链的可变区，并将其在哺乳动物表达载体中分别框架内连接至人类IgG1重链和κ轻链恒定区。作为选择，使用诸如TCAE 5.3等人类Ig表达载体，该表达载体在同一质粒中含有人类IgG1重链和κ轻链恒定区基因(Preston等，1998，Infection&Immunity 66：4137-42)。然后将编码嵌合重链和轻链的表达载体共转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，以用于嵌合抗体生产。通过ELISA和FACS将嵌合抗体的免疫反应性和亲和性与亲本鼠类抗体比较。
人源化抗体
由于嵌合抗体治疗剂仍然经常具有抗原性，产生人类抗-嵌合抗体(HACA)免疫应答，可能需要对针对Notch2或Notch3受体的嵌合抗体进一步进行人源化。为了产生人源化抗体，使用重组DNA技术将上述嵌合抗体重链和轻链可变域的三个短的高可变区，或互补决定区(CDR)分别工程化到人类重链和轻链序列的可变域框架中，然后克隆到哺乳动物表达载体中以用于在CHO细胞中表达。通过ELISA和FACS将人源化抗体的免疫反应性和亲和性与亲本嵌合抗体比较。另外，可利用可变区的定点或高密度突变来优化人源化抗体的特异性、亲和性等。
实施例18
评价针对Notch受体的抗体的其它体外检测
该实施例描述测试针对Notch2和/或Notch3受体产生的抗体对细胞增殖和细胞毒性的活性的体外检测方法。
增殖检测
使用基于BrdU的检测对针对Notch2和/或Notch3的抗体测试其对体外肿瘤细胞生长的影响。使新鲜解离的、Lin-耗尽乳瘤细胞在低氧中培养2～5天。然后将细胞以20,000个细胞/孔与2.5μg/mL或5.0μg/mL抗Notch抗体、对照非特异性鼠类IgG或不与抗体一起培养3天，然后进行18小时的BrdU标记。以多个重复进行所有实验。然后确定与对照抗体相比，抗Notch抗体抑制细胞增殖的能力。
补体依赖性细胞毒性检测
使用表达Notch2受体和/或Notch3受体的癌细胞系，或作为选择使用在免疫妥协小鼠中作为异种移植物传代的从患者样品中分离的癌干细胞，来测定由针对Notch2和/或Notch3受体的抗体介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)。将细胞以106细胞/ml悬浮于补充有抗生素和5％FBS的200μl RPMI 1640培养基中。然后一式三份地使悬浮的细胞与200μl具有针对Notch2和/或Notch3受体的抗体或对照抗体的血清或热灭活血清混合。使细胞混合物在37℃下在5％CO2中温育1～4小时。然后收集经处理的细胞，使其再悬浮在100μl稀释于培养基中的FITC-标记的膜联蛋白V，并在室温下温育10分钟。添加100ml稀释于HBSS中的碘化丙啶溶液(25μg/ml)，并在室温下温育5分钟。收集细胞，使其再悬浮于培养基中并通过流式细胞法进行分析。FITC染色细胞的流式细胞分析提供总细胞计数，并且使用被作为总细胞数的百分比的死细胞摄入的碘化丙啶来测定在血清和针对Notch2和/或Notch3受体的抗体的存在下相对于在热灭活血清和对照抗体的存在下的细胞死亡。因而确定抗Notch2/3抗体介导补体依赖性细胞毒性的能力。
抗体依赖性细胞的细胞毒性检测
使用表达Notch2受体和/或Notch3受体的癌细胞系，或作为选择使用在免疫妥协小鼠中作为异种移植物传代的从患者样品中分离的癌干细胞(以下详细描述)，来测定由针对Notch2和/或Notch3受体的抗体介导的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。将细胞以106细胞/ml悬浮于补充有抗生素和5％FBS的不含酚红的200μl RPMI 1640培养基中。通过Ficoll-Paque密度梯度离心从肝素化的外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)，以用作效应细胞。然后使靶细胞(T)与PBMC效应细胞(E)以25：1，10：1和5：1的E/T比在96孔板中在Notch2或Notch3受体或对照抗体的存在下混合。对照包括在抗体的存在下温育单独的靶细胞和单独的效应细胞。使细胞混合物在37℃下在5％CO2中温育1～6小时。然后通过比色检测(例如，CytoTox96Non-radioactiveCytotoxicity Assay；Promega；Madison，WI)测定释放的乳酸脱氢酶(LDH)，其是当细胞裂解时释放的一种稳定的胞浆酶。用标准96孔板读板仪收集490nm下的吸光度数据并进行背景校对。特定细胞毒性的百分比根据以下公式计算：％细胞毒性＝100×(实验LDH释放–效应子自发LDH释放–靶标自发性LDH释放)/(靶标最大LDH释放–靶标自发性LDH释放)。由此确定针对Notch2和/或Notch3受体的抗体介导抗体依赖性细胞的细胞毒性的能力。
实施例19
针对Notch受体的EGF10(或等效的EGF)的抗体的制备
特异性结合Notch2的第10EGF重复和Notch3的相应EGF重复(第9EGF重复)并且减少动物中肿瘤生长的抗体的鉴定表明了非配体结合域，特别是EGF重复10(或其等效物)对于有效癌治疗的重要性。为了靶向Notch受体家族成员中的EGF重复10(或等效EGF)，制备并分析了针对Notch1、Notch2或Notch4的EGF10或针对Notch3的EGF9的抗体。特别地，用包含Notch1(SEQ ID NO：35)；Notch2(SEQ ID NO：36)或Notch4(SEQ ID NO：38)的第10EGF重复或Notch3(SEQ ID NO：37)的第9EGF重复的抗原对小鼠进行免疫。对以上详细所述的用各Notch受体转染的HEK 293细胞使用FACS分析，从而鉴定了识别特异性Notch受体的抗体以及识别四种Notch受体的不同组合的抗体。设想识别两个Notch受体家族成员的第10EGF重复(或等效EGF)的抗体(例如识别Notch1EGF10和Notch2EGF10；Notch1EGF10和Notch3EGF9；Notch1EGF10和Notch4EGF10；Notch2EGF10和Notch3EGF9；Notch2EGF10和Notch4EGF10；或者Notch3EGF9和Notch4EGF10的抗体)。同样构想了识别三个Notch受体家族成员的第10EGF重复(或等效EGF)的抗体(例如，识别Notch1EGF10、Notch2EGF10和Notch3EGF9；Notch1EGF10、Notch2EGF10和Notch4EGF10；或者Notch2EGF10、Notch3EGF9和Notch4EGF10的抗体)。设想识别四个Notch受体家族成员的第10EGF重复(或等效EGF)的抗体(例如，识别Notch1EGF10、Notch2EGF10、Notch3EGF9和Notch4EGF10的抗体)。
实施例20
使用抗Notch受体抗体对人类癌进行的治疗
该实施例描述使用针对Notch受体的抗体以靶向包含癌干细胞和/或肿瘤细胞的肿瘤而治疗癌的方法，所述癌干细胞和/或肿瘤细胞中已经检测出Notch受体表达。
可以首先从肿瘤活检样中确定癌干细胞标记物表达的存在。在无菌条件下移取来自诊断患癌的患者活检样的肿瘤细胞。在某些实施方式中，将组织活检样在液氮中新鲜冷冻，包埋在O.C.T.中，并且在低温保持器上切成在载玻片上的10μm切片。作为选择，对组织活检样进行福尔马林固定、石蜡包埋和在切片机上切成在载玻片上的10μm切片。使切片与针对Notch受体的抗体一起温育以检测蛋白表达。另外，可以确定癌干细胞的存在。将组织活检样品切成小块，使用无菌刀片完全切碎，并且使细胞经受酶促消化和机械破坏，从而获得单细胞悬浮液。然后使解离的肿瘤细胞与抗-ESA,-CD44,-CD24和-Lin抗体一起温育以检测癌干细胞，通过如上详细所述的流式细胞法确定ESA+,CD44+,CD24-/low,Lin-肿瘤干细胞的存在。
用抗Notch受体抗体治疗诊断其肿瘤表达Notch受体的癌症患者。对如上所述产生的人源化或人类单克隆抗Notch受体抗体进行纯化，并与合适的药物载体一起配制在注射用PBS中。每周1次用Notch抗体治疗患者，持续至少10周，但在某些情况下每周1次持续至少约14周。抗体每次施用应该为约2mg/ml～约100mg/ml的药学有效剂量，在某些情况下为约5mg/ml～约40mg/ml。施用抗体可以在标准放射治疗方案或化学治疗方案之前、与其同时或在其之后，所述化学治疗方案使用一种或多种化学治疗剂，例如紫杉醇、吉西他滨、伊立替康、奥沙利铂、氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸或链佐星。例如基于肿瘤消退、新肿瘤发生率的减少、肿瘤抗原表达下降、癌干细胞的数量下降或评价疾病预后的其它手段，对患者进行监视以确定所述治疗是否导致抗肿瘤应答。
实施例21
针对Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4EGF重复4的抗体的制备
为了靶向Notch受体家族成员中的EGF重复4，制备并分析了针对Notch1、Notch2、Notch3和/或Notch4EGF重复4的抗体。特别地，用包含Notch1(SEQ ID NO：41)、Notch2(SEQ ID NO：42)、Notch3(SEQ ID NO：43)或Notch4(SEQ ID NO：44)的第4EGF重复的抗原对小鼠进行免疫。对以上详细所述的用各Notch受体转染的HEK 293细胞使用FACS分析，鉴定识别特异性Notch受体的抗体以及识别四种Notch受体的不同组合的抗体。设想识别两个Notch受体家族成员的第4EGF重复的抗体(例如识别Notch1和Notch2；Notch1和Notch3；Notch1和Notch4；Notch2和Notch3；Notch2和Notch4；或者Notch3和Notch4的第4EGF重复的抗体)。设想识别三个Notch受体家族成员的第4EGF重复的抗体(例如识别Notch1、Notch2和Notch3；Notch1、Notch2和Notch4；或者Notch2、Notch3和Notch4的第4EGF重复的抗体)。设想识别四个Notch受体家族成员的第4EGF重复的抗体(例如识别Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的第4EGF重复的抗体)。
可结合Notch1的EGF4的单克隆抗体，13M57的示例性制备和表征的描述可见于美国专利申请公开第2008/0131434，本文通过参考并且其全文。
实施例22
在用59R1治疗的肿瘤细胞中的其它基因表达检测
鉴定在异种移植物模型内的肿瘤细胞中响应于59R1治疗的基因表达的改变。
使用Gene Set Enrichment Analysis(Mootha等，2003，Nature Genetics 34：267-73；Subramanian等，2005，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：15545-50)在乳瘤T1、PE13和B51中鉴定出在肿瘤细胞中受抗体59R1调节的几种途径/基因集合(表9)。值得注意的是，在该分析中59R1下调细胞周期基因途径、myc-激活基因和几个干细胞基因集合。已经显示cMyc是Notch途径的直接靶标(Weng等，2006，Genes Dev.20：2096-109)。通过59R1下调的干细胞基因集合源自来源于五个独特群体的分子标签：人胎造血干细胞(HCS)、鼠胎和成体HSC、神经干细胞(NSC)和胚胎干细胞(ESC)(Ivanova等，2002，Science 298：601-604)，和最近描述的核ESC基因集合(Ben-Porath等，2008，Nature Genetics 40：499-507)以及其下调引起分化的ESC自我更新基因集合(Hu等，2009，Genes Dev.23：837-48)。
表9
FDR<15％
实施例23
通过Notch2/3抗体减少癌干细胞频率
使用与实施例8中所述类似的实验，在PE13乳癌细胞中进行通过有限稀释分析对癌干细胞频率进行的分析。用对照抗体、紫杉醇加上对照抗体、59R1、或紫杉醇加上59R1对携带PE13乳瘤的动物进行持续3周的治疗。3个周后收获肿瘤，分析所治疗肿瘤中的CSC频率。将来自四个治疗组中每组的连续滴定人类细胞移植入新的小鼠组(每细胞剂量n＝10)。利用L-calc程序(Stem Cell Technologies，Inc.)，用生长75天后的肿瘤生长速率(图19A)来计算CSC频率。对照抗体治疗的肿瘤经确定具有1：74的肿瘤起始细胞频率。用紫杉醇单独进行治疗将CSC频率增加至1：30。相反，用59R1进行治疗将CSC频率减少至1：179，59R1加上紫杉醇的组合将CSC频率减少至1：319(图19B)。单星号表示相对于对照抗体治疗组的统计学显著差异(p<0.05)，双星号表示相对于紫杉醇和对照抗体治疗组的显著差异。该实验表明，59R1作为单独试剂对PE13乳瘤的治疗使CSC频率减少，59R1在与紫杉醇组合时对PE13乳瘤的治疗使CSC频率更显著地减少。相反，用紫杉醇单独进行治疗，虽然有效地减少肿瘤体积，但是增加了所治疗肿瘤的CSC频率，这表明肿瘤起始细胞优先对该化学治疗剂的作用具有抗性。
除了研究59R1在肿瘤中的影响和对CSC频率的影响之外，还在与紫杉醇组合的59R1治疗后研究基因变化。在PE13乳瘤中进行该实验，所述PE13乳瘤中之前已经观察到(并且本文已经能够描述了)用59R1单独进行治疗或59R1加上紫杉醇治疗后CSC频率降低。对来自进行了PE13的有限稀释分析以用于CSC定量的相同实验的肿瘤进行微阵列分析(图19)。在收获以用于微阵列分析之前，用59R1加上紫杉醇、对照和紫杉醇对携带PE13乳瘤的动物进行3周治疗。计算紫杉醇相对于对照和59R1加紫杉醇相对于紫杉醇治疗的动物(每组3只动物)的平均差异表达值。严格来自，在基因表达微阵列数据中，据发现与紫杉醇组合的59R1以与使用单独紫杉醇后观察到的基因改变相反的倍数方向影响凋亡、缺氧、分化和干细胞相关基因(表10)，这与这些化合物对CSC频率的影响一致。
表10
在该数据集中调节的凋亡-相关基因包括BNIP3、NDRG1HSPB6和XAF1。BNIP3(Bcl-2/E1B 19kDa相互作用蛋白)是在肿瘤的缺氧区表达的Bcl-2家族的促凋亡成员(Kothari等，2003，Oncogene 22：4734-44)。BNIP3被单独的紫杉醇下调和被组合治疗上调，表明59R1加上紫杉醇可以促进凋亡。与该想法一致的是观察到：HSPB6在紫杉醇治疗的肿瘤中下调；HSPB6过表达可以在某些生物系统中防止凋亡(Fan等，2005，Trends Cardiovasc.Med.15：138-41)。在组合治疗中上调的NDRG1(N-myc下游调节基因1)，对于p53-依赖性凋亡是必需的(Stein等，2004，J.Biol.Chem.279：48930-40)。令人感兴趣的是，NDRG1还是结直肠癌转移的推定抑制剂。其表达增加与前列腺癌和乳癌中存活改善有关(Shah等，2005，Clin.Cancer Res.11：3296-302)。另外，NDRG1参与促进分化。已经显示NDRG1的表达在良好分化的胰腺癌细胞中高度表达，但在分化较差的肿瘤细胞中不表达(Angst等，2006，Br.J.Cancer 95：307-13)。还观察到诸如BMPR1B和同源盒包含基因LHX8等其它干细胞相关基因，被单独的紫杉醇上调，然后被与紫杉醇组合的59R1治疗下调。
与推定的干细胞标记物ALDH1a1功能类似的、参与类视色素(retinoid)代谢的几个基因(RARRES1、RARRES3、RBP2)，被紫杉醇上调，然后被紫杉醇加上59R1治疗下调。已经显示视黄酸信号传导与细胞分化相关(Appel和Eisen，2003，Neuron 40：461-4)。总之，这些数据显示59R1对PE13乳瘤细胞中的基因表达具有显著影响，并且可以开始阐明作为所观察到的用59R1和紫杉醇组合疗法进行治疗后该肿瘤中癌干细胞频率下降基础的某些机制。
在另一实施方式中，使用PN4胰腺瘤模型来测试用59R1治疗后癌干细胞频率的减少。对PN4胰腺瘤用对照抗体、抗Notch2/359R1、吉西他滨或者59R1和吉西他滨的组合进行治疗3周。抗体以10mg/kg每周两次给药，吉西他滨以50mg/kg每周两次给药。收获来自各组的肿瘤，并且经处理获得单细胞悬浮液。分离异种移植物中的人类肿瘤细胞并对其计数。将滴定的细胞(30、90或210个细胞)再注入NOD-SCID小鼠(每组n＝10)。在第84天检测肿瘤生长，由肿瘤获得比率(tumor take rate)计算肿瘤起始细胞频率。对照抗体治疗的肿瘤经确定具有1：137的肿瘤起始细胞频率。用吉西他滨单独治疗将CSC频率增加至1：61。相反，用59R1进行治疗将CSC频率减少至1：281，59R1加上吉西他滨的组合将CSC频率减少至1：675(图19C)。单星号表示相对于对照抗体治疗组的统计学显著差异(p<0.05)，双星号表示相对于吉西他滨和对照抗体治疗组的显著差异。
在另一实施方式中，使用PE13乳瘤模型来测试用59R5治疗后癌干细胞频率的减少。对PE13乳瘤用对照抗体、抗Notch2/359R5、紫杉醇或者59R5和紫杉醇的组合进行治疗3周。抗体以20mg/kg每周一次给药，紫杉醇以15mg/kg每周两次给药。收获来自各组的肿瘤，并且经处理获得单细胞悬浮液。分离异种移植物中的人类肿瘤细胞并对其计数。将滴定的细胞(50、150或450个细胞)再注入NOD-SCID小鼠(每组n＝10)。在第39天检测肿瘤生长，从肿瘤获得比率(tumor take rate)计算肿瘤起始细胞频率。对照抗体治疗的肿瘤经确定具有1：70的肿瘤起始细胞频率。用紫杉醇单独治疗将CSC频率增加至1：30。相反，用59R5进行治疗将CSC频率减少至1：202，59R5加上紫杉醇的组合将CSC频率减少至1：382(图19D)。单星号表示相对于对照抗体治疗组的统计学显著差异(p<0.05)，双星号表示相对于紫杉醇和对照抗体治疗组的显著差异。
如其它实验中所观察到的，这些结果表明作为单一试剂，59R1对PN4胰腺瘤的治疗和59R5对PE13乳瘤的治疗减少CSC频率，或59R1在分别与吉西他滨或紫杉醇治疗组合时对PN4胰腺瘤的治疗和对PE13乳瘤的治疗更显著地减少CSC频率。相反，用紫杉醇或吉西他滨单独进行治疗，虽然有效地减少肿瘤体积，但是增加了所治疗肿瘤的CSC频率，这表明肿瘤起始细胞优先对这些化学治疗剂的作用具有抗性。
通过参考方式将以上说明书所提及的所有出版物和专利并入本文。对本领域技术人员而言，对本发明所述方法和系统作出各种改进和变化是显而易见的，且并不背离本发明的范围和精神。虽然已经结合具体实施方式描述了本发明，但应该理解，要求保护的本发明不应不适当地限于所述具体实施方式。实际上，对相关领域技术人员而言显而易见的对用于实施本发明的所述模式作出的各种改进也所附权利要求的范围之内。
序列
人类抗Notch2/3抗体序列
SEQ ID NO：1：编码抗Notch2/3IgG259R1重链的核苷酸序列，加上信号序列。编码信号序列的序列加下划线。
ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTGCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTCTGGTATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTTATCGCTTCTTCTGGTAGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTATTTTTTTTGCTATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGCCAGCACAAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCTCCCTGCAGCAGGAGCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：16：抗Notch2/359R1IgG2重链的预测蛋白序列，加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：3：编码抗Notch2/3 59R1轻链的核苷酸序列，加上信号序列。编码信号序列的序列加下划线。
ATGGTGTTGCAGACCCAGGTCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGGATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTCTGTTCGTTCTAATTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTTCTCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTAATTTTCCTATTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：18：抗Notch2/3 59R1轻链的预测蛋白序列，加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：5：59R1重链CDR1
SSSGMS
SEQ ID NO：6：59R1重链CDR2
VIASSGSNTYYADSVKG
SEQ ID NO：7：59R1重链CDR3
GIFFAI
SEQ ID NO：8：59R1轻链CDR1
RASQSVRSNYLA
SEQ ID NO：9：59R1轻链CDR2
GASSRAT
SEQ ID NO：10：59R1轻链CDR3
QQYSNFPI
SEQ ID NO：11：59R1Fab的59R1轻链VL加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：12：59R1Fab的59R1重链VH加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MKQSTIALALLPLLFTPVTKAQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：13：59R1IgG抗体的59R1轻链VL
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：14：59R1IgG抗体的59R1重链VH
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：39：59R1轻链VL加上哺乳动物信号序列(加下划线)
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：40：59R1重链VH加上哺乳动物信号序列(加下划线)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：15：编码抗Notch2/3 59RGV IgG2抗体(59R1的种系变体)的重链的核苷酸序列，加上信号序列。编码信号序列的序列加下划线.
ATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTCGCCGCTCCTAGATGGGTGCTGTCCGAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCCTGCGCTGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTCCGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCGTGATCGCCTCCAGCGGCTCCAACACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGGCATCTTCTTCGCCATCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCCGAGTCCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGCCCTGCCCCTCCTGTGGCTGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCCTGGCAAGTAG
SEQ ID NO：2：抗Notch2/3 59RGV(59R1的种系变体)的重链的预测蛋白序列，加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：17：抗Notch2/359RGV抗体(59R1的种系变体)的核苷酸序列，加上信号序列。编码信号序列的序列加下划线.
ATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTCATCTCCCTGCTGCTGTGGATCTCCGGCGCCTACGGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGCCACACTGAGCCTGAGCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGGCGGGCCTCCCAGTCCGTGCGGTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAACCCGGACAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCCCGGGCTACCGGCATCCCTGCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTCCAACTTCCCTATCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAATCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACAGCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCTGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGCTAG
SEQ ID NO：4：抗Notch2/3 59RGV抗体(59R1的种系变体)的轻链的预测蛋白序列，加上信号序列。所述信号序列加下划线。
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：19：59RGV抗体(59R1的种系变体)的59R1轻链VL
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRRASQSVRSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYSNFPITFGQGTKVEIKR
SEQ ID NO：20：59RGV抗体(59R1的种系变体)的59R1重链VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGIFFAIWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：22(替代性重链CDR3)
SIFYPT
SEQ ID NO：23(替代性重链CDR3)
SSFFAS
SEQ ID NO：24(替代性重链CDR3)
SSFYAS
SEQ ID NO：25(替代性重链CDR3)
SSFFAT
SEQ ID NO：26(替代性重链CDR3)
SIFYPS
SEQ ID NO：27(替代性重链CDR3)
SSFFAN
SEQ ID NO：30(重链CDR3共有序列)：
(G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N)
SEQ ID NO：47：59R5轻链核苷酸序列(不带有信号序列)
GACATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCACACTGTCCCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGTCGGGCCTCCCAGTCCGTGCGGTCCAACTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCTCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCTCCAGGGCTACCGGCGTGCCTGCCCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACTCCAACTTCCCTATCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCCCCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCTCCGTGGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCCGGCAACTCCCAGGAGTCCGTCACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGAGCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCTCTCCCGTGACCAAGTCCTTCAACCGGGGCGAGTGC
SEQ ID NO：48：59R5重链核苷酸序列(不带有信号序列)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCAGCGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAAGGACTCGAGTGGGTGTCCGTGATCGCCTCCTCCGGCTCCAACACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTCCATCTTCTACACCACCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGCTCCCGGTCCACCTCTGAGTCTACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGGACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGACCGTGGAGCGGAAGTGCTGCGTGGAGTGCCCTCCTTGTCCTGCTCCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCTCTAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTCTACACCCTGCCTCCTAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCTCCTGGCAAG
SEQ ID NO：49：59R5重链
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYTTWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ YD NO：50：59R5重链可变区
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYTTWGQGTLVTVSSAST
SEQ ID NO：51：59R5重链CDR3
SIFYTT
SEQ ID NO：52：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYPTWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：53：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFASWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：54：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFYASWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：55：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFATWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：56：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSIFYPSWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：57：变体59R1重链可变区
QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSGMSWVRQAPGKGLEWVSVIASSGSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSSFFANWGQGTLVTVSSA
SEQ ID NO：58：59R5重链可变区核苷酸序列(不带有信号序列)
GAGGTGCAGCTGGTCGAGTCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCCTGCGCCGCTTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCAGCGGCATGTCCTGGGTGCGCCAGGCACCTGGCAAAGGACTCGAGTGGGTGTCCGTGATCGCCTCCTCCGGCTCCAACACCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTCCATCTTCTACACCACCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACC
SEQ ID NO：59：59R1轻链可变区核苷酸序列(不带有信号序列)
GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTCTGTTCGTTCTAATTATCTGGCTTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGTGCTTCTTCTCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGTATTCTAATTTTCCTATTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGT
SEQ ID NO：60：59R1重链可变区核苷酸序列(不带有信号序列)
CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTTCTTCTTCTGGTATGTCTTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGTTATCGCTTCTTCTGGTAGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTATTTTTTTTGCTATTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGCC
人类Notch相关序列：
SEQ ID NO：21：Notch2(EGF 1-12)Fc融合蛋白氨基酸序列
MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCEKNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKECQWTDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGFTGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTCRQTGDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNCRCPPQWTGQFCTEDVDECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVASFSCMCPEGKAGLLCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDECAMANSNPCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCELGRADKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：28(人类Notch2的EGF10内的59R1结合位点的潜在组成)：HKGAL
SEQ ID NO：29(与人类Notch2EGF10内的59R1结合位点的潜在组成相对应的人类Notch3EGF9内的位点)：HEDAI
SEQ ID NO：45：hNotch1
氨基酸1至1732胞外域，(加下划线)
氨基酸372至414EGF重复10(双下划线并且斜体)
MPPLLAPLLCLALLPALAARGPRCSQPGETCLNGGKCEAANGTEACVCGGAFVGPRCQDPNPCLSTPCKNA GTCHVVDRRGVADYACSCALGFSGPLCLTPLDNACLTNPCRNGGTCDLLTLTEYKCRCPPGWSGKSCQQAD PCASNPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQDVNECGQKPGLCRHGGTCHNEVGSYRCVCRATHTGP NCERPYVPCSPSPCQNGGTCRPTGDVTHECACLPGFTGQNCEENIDDCPGNNCKNGGACVDGVNTYNCRCP PEWTGQYCTEDVDECQLMPNACQNGGTCHNTHGGYNCVCVNGWTGEDCSENIDDCASAACFHGATCHDRVA SFYCECPHGRTGLLCH ECSLGANPCEHA GKCINTLGSFECQCLQGYTGPRCEIDVNECVSNPCQNDATCLDQIGEFQCICMPGYEGVHCEVNTDECASS PCLHNGRCLDKINEFQCECPTGFTGHLCQYDVDECASTPCKNGAKCLDGPNTYTCVCTEGYTGTHCEVDID ECDPDPCHYGSCKDGVATFTCLCRPGYTGHHCETNINECSSQPCRHGGTCQDRDNAYLCFCLKGTTGPNCE INLDDCASSPCDSGTCLDKIDGYECACEPGYTGSMCNINIDECAGNPCHNGGTCEDGINGFTCRCPEGYHD PTCLSEVNECNSNPCVHGACRDSLNGYKCDCDPGWSGTNCDINNNECESNPCVNGGTCKDMTSGYVCTCRE GFSGPNCQTNINECASNPCLNQGTCIDDVAGYKCNCLLPYTGATCEVVLAPCAPSPCRNGGECRQSEDYES FSCVCPTGWQGQTCEVDINECVLSPCRHGASCQNTHGGYRCHCQAGYSGRNCETDIDDCRPNPCHNGGSCT DGINTAFCDCLPGFRGTFCEEDINECASDPCRNGANCTDCVDSYTCTCPAGFSGIHCENNTPDCTESSCFN GGTCVDGINSFTCLCPPGFTGSYCQHDVNECDSQPCLHGGTCQDGCGSYRCTCPQGYTGPNCQNLVHWCDS SPCKNGGKCWQTHTQYRCECPSGWTGLYCDVPSVSCEVAAQRQGVDVARLCQHGGLCVDAGNTHHCRCQAG YTGSYCEDLVDECSPSPCQNGATCTDYLGGYSCKCVAGYHGVNCSEEIDECLSHPCQNGGTCLDLPNTYKC SCPRGTQGVHCEINVDDCNPPVDPVSRSPKCFNNGTCVDQVGGYSCTCPPGFVGERCEGDVNECLSNPCDA RGTQNCVQRVNDFHCECRAGHTGRRCESVINGCKGKPCKNGGTCAVASNTARGFICKCPAGFEGATCENDA RTCGSLRCLNGGTCISGPRSPTCLCLGPFTGPECQFPASSPCLGGNPCYNQGTCEPTSESPFYRCLCPAKF NGLLCHILDYSFGGGAGRDIPPPLIEEACELPECQEDAGNKVCSLQCNNHACGWDGGDCSLNFNDPWKNCT QSLQCWKYFSDGHCDSQCNSAGCLFDGFDCQRAEGQCNPLYDQYCKDHFSDGHCDQGCNSAECEWDGLDCA EHVPERLAAGTLVVVVLMPPEQLRNSSFHFLRELSRVLHTNVVFKRDAHGQQMIFPYYGREEELRKHPIKR AAEGWAAPDALLGQVKASLLPGGSEGGRRRRELDPMDVRGSIVYLEIDNRQCVQASSQCFQSATDVAAFLG ALASLGSLNIPYKIEAVQSETVEPPPPAQLHFMYVAAAAFVLLFFVGCGVLLSRKRRRQHGQLWFPEGFKVSEASKKKRREPLGEDSVGLKPLKNASDGALMDDNQNEWGDEDLETKKFRFEEPVVLPDLDDQTDHRQWTQQHLDAADLRMSAMAPTPPQGEVDADCMDVNVRGPDGFTPLMIASCSGGGLETGNSEEEEDAPAVISDFIYQGASLHNQTDRTGETALHLAARYSRSDAAKRLLEASADANIQDNMGRTPLHAAVSADAQGVFQILIRNRATDLDARMHDGTTPLILAARLAVEGMLEDLINSHADVNAVDDLGKSALHWAAAVNNVDAAVVLLKNGANKDMQNNREETPLFLAAREGSYETAKVLLDHFANRDITDHMDRLPRDIAQERMHHDIVRLLDEYNLVRSPQLHGAPLGGTPTLSPPLCSPNGYLGSLKPGVQGKKVRKPSSKGLACGSKEAKDLKARRKKSQDGKGCLLDSSGMLSPVDSLESPHGYLSDVASPPLLPSPFQQSPSVPLNHLPGMPDTHLGIGHLNVAAKPEMAALGGGGRLAFETGPPRLSHLPVASGTSTVLGSSSGGALNFTVGGSTSLNGQCEWLSRLQSGMVPNQYNPLRGSVAPGPLSTQAPSLQHGMVGPLHSSLAASALSQMMSYQGLPSTRLATQPHLVQTQQVQPQNLQMQQQNLQPANIQQQQSLQPPPPPPQPHLGVSSAASGHLGRSFLSGEPSQADVQPLGPSSLAVHTILPQESPALPTSLPSSLVPPVTAAQFLTPPSQHSYSSPVDNTPSHQLQVPEHPFLTPSPESPDQWSSSSPHSNVSDWSEGVSSPPTSMQSQIARIPEAFK
SEQ ID NO：31：人类Notch2
氨基酸1至1677：胞外域(加下划线)
氨基酸375至417：EGF重复10(双下划线并且斜体)
MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCEKN RCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKEC QWTDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGF TGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTCRQTGDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNC RCPPQWTGQFCTEDVDECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCID RVASFSCMCPEGKAGLLCH ECAMANSNP CEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCELEINE CQSNPCVNNNGQCVDKVNRFQCLCPPGFTGPVCQIDIDDCSSTPCLNGAKCIDHPNGYECQCATGFTGVLCE ENIDNCDPDPCHHGQCQDGIDSYTCICNPGYMGAICSDQIDECYSSPCLNDGRCIDLVNGYQCNCQPGTSG VNCEINFDDCASNPCIHGICMDGINRYSCVCSPGFTGQRCNIDIDECASNPCRKGATCINGVNGFRCICPE GPHHPSCYSQVNECLSNPCIHGNCTGGLSGYKCLCDAGWVGINCEVDKNECLSNPCQNGGTCDNLVNGYRC TCKKGFKGYNCQVNIDECASNPCLNQGTCFDDISGYTCHCVLPYTGKNCQTVLAPCSPNPCENAAVCKESP NFESYTCLCAPGWQGQRCTIDIDECISKPCMNHGLCHNTQGSYMCECPPGFSGMDCEEDIDDCLANPCQNG GSCMDGVNTFSCLCLPGFTGDKCQTDMNECLSEPCKNGGTCSDYVNSYTCKCQAGFDGVHCENNINECTES SCFNGGTCVDGINSFSCLCPVGFTGSFCLHEINECSSHPCLNEGTCVDGLGTYRCSCPLGYTGKNCQTLVN LCSRSPCKNKGTCVQKKAESQCLCPSGWAGAYCDVPNVSCDIAASRRGVLVEHLCQHSGVCINAGNTHYCQ CPLGYTGSYCEEQLDECASNPCQHGATCSDFIGGYRCECVPGYQGVNCEYEVDECQNQPCQNGGTCIDLVN HFKCSCPPGTRGLLCEENIDDCARGPHCLNGGQCMDRIGGYSCRCLPGFAGERCEGDINECLSNPCSSEGS LDCIQLTNDYLCVCRSAFTGRHCETFVDVCPQMPCLNGGTCAVASNMPDGFICRCPPGFSGARCQSSCGQV KCRKGEQCVHTASGPRCFCPSPRDCESGCASSPCQHGGSCHPQRQPPYYSCQCAPPFSGSRCELYTAPPST PPATCLSQYCADKARDGVCDEACNSHACQWDGGDCSLTMENPWANCSSPLPCWDYINNQCDELCNTVECLF DNFECQGNSKTCKYDKYCADHFKDNHCDQGCNSEECGWDGLDCAADQPENLAEGTLVIVVLMPPEQLLQDA RSFLRALGTLLHTNLRIKRDSQGELMVYPYYGEKSAAMKKQRMTRRSLPGEQEQEVAGSKVFLEIDNRQCV QDSDHCFKNTDAAAALLASHAIQGTLSYPLVSVVSESLTPERTQLLYLLAVAVVIILFIILLGVIMAKRKRKHGSLWLPEGFTLRRDASNHKRREPVGQDAVGLKNLSVQVSEANLIGTGTSEHWVDDEGPQPKKVKAEDEALLSEEDDPIDRRPWTQQHLEAADIRRTPSLALTPPQAEQEVDVLDVNVRGPDGCTPLMLASLRGGSSDLSDEDEDAEDSSANIITDLVYQGASLQAQTDRTGEMALHLAARYSRADAAKRLLDAGADANAQDNMGRCPLHAAVAADAQGVFQILIRNRVTDLDARMNDGTTPLILAARLAVEGMVAELINCQADVNAVDDHGKSALHWAAAVNNVEATLLLLKNGANRDMQDNKEETPLFLAAREGSYEAAKILLDHFANRDITDHMDRLPRDVARDRMHHDIVRLLDEYNVTPSPPGTVLTSALSPVICGPNRSFLSLKHTPMGKKSRRPSAKSTMPTSLPNLAKEAKDAKGSRRKKSLSEKVQLSESSVTLSPVDSLESPHTYVSDTTSSPMITSPGILQASPNPMLATAAPPAPVHAQHALSFSNLHEMQPLAHGASTVLPSVSQLLSHHHIVSPGSGSAGSLSRLHPVPVPADWMNRMEVNETQYNEMFGMVLAPAEGTHPGIAPQSRPPEGKHITTPREPLPPIVTFQLIPKGSIAQPAGAPQPQSTCPPAVAGPLPTMYQIPEMARLPSVAFPTAMMPQQDGQVAQTILPAYHPFPASVGKYPTPPSQHSYASSNAAERTPSHSGHLQGEHPYLTPSPESPDQWSSSSPHSASDWSDVTTSPTPGGAGGGQRGPGTHMSEPPHNNMQVYA
SEQ ID NO：32：人类Notch3
氨基酸1至1640：胞外域(加下划线)
氨基酸351至393：EGF重复9(双下划线并且斜体)
MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAAAPPCLDGSPCANGGRCTQLPSREAACLCPPGW VGERCQLEDPCHSGPCAGRGVCQSSVVAGTARFSCRCPRGFRGPDCSLPDPCLSSPCAHGARCSVGPDGRF LCSCPPGYQGRSCRSDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCENPAVPCAPSPCRNGGTCR QSGDLTYDCACLPGFEGQNCEVNVDDCPGHRCLNGGTCVDGVNTYNCQCPPEWTGQFCTEDVDECQLQPNA CHNGGTCFNTLGGHSCVCVNGWTGESCSQNIDDCATAVCFHGATCHDRVASFYCACPMGKTGLLCH ECSIGANPCEHLGRCVNTQGSFLCQCGRGYTGP RCETDVNECLSGPCRNQATCLDRIGQFTCICMAGFTGTYCEVDIDECQSSPCVNGGVCKDRVNGFSCTCPS GFSGSTCQLDVDECASTPCRNGAKCVDQPDGYECRCAEGFEGTLCDRNVDDCSPDPCHHGRCVDGIASFSC ACAPGYTGTRCESQVDECRSQPCRHGGKCLDLVDKYLCRCPSGTTGVNCEVNIDDCASNPCTFGVCRDGIN RYDCVCQPGFTGPLCNVEINECASSPCGEGGSCVDGENGFRCLCPPGSLPPLCLPPSHPCAHEPCSHGICY DAPGGFRCVCEPGWSGPRCSQSLARDACESQPCRAGGTCSSDGMGFHCTCPPGVQGRQCELLSPCTPNPCE HGGRCESAPGQLPVCSCPQGWQGPRCQQDVDECAGPAPCGPHGICTNLAGSFSCTCHGGYTGPSCDQDIND CDPNPCLNGGSCQDGVGSFSCSCLPGFAGPRCARDVDECLSNPCGPGTCTDHVASFTCTCPPGYGGFHCEQ DLPDCSPSSCFNGGTCVDGVNSFSCLCRPGYTGAHCQHEADPCLSRPCLHGGVCSAAHPGFRCTCLESFTG PQCQTLVDWCSRQPCQNGGRCVQTGAYCLCPPGWSGRLCDIRSLPCREAAAQIGVRLEQLCQAGGQCVDED SSHYCVCPEGRTGSHCEQEVDPCLAQPCQHGGTCRGYMGGYMCECLPGYNGDNCEDDVDECASQPCQHGGS CIDLVARYLCSCPPGTLGVLCEINEDDCGPGPPLDSGPRCLHNGTCVDLVGGFRCTCPPGYTGLRCEADIN ECRSGACHAAHTRDCLQDPGGGFRCLCHAGFSGPRCQTVLSPCESQPCQHGGQCRPSPGPGGGLTFTCHCA QPFWGPRCERVARSCRELQCPVGVPCQQTPRGPRCACPPGLSGPSCRSFPGSPPGASNASCAAAPCLHGGS CRPAPLAPFFRCACAQGWTGPRCEAPAAAPEVSEEPRCPRAACQAKRGDQRCDRECNSPGCGWDGGDCSLS VGDPWRQCEALQCWRLFNNSRCDPACSSPACLYDNFDCHAGGRERTCNPVYEKYCADHFADGRCDQGCNTE ECGWDGLDCASEVPALLARGVLVLTVLLPPEELLRSSADFLQRLSAILRTSLRFRLDAHGQAMVFPYHRPS PGSEPRARRELAPEVIGSVVMLEIDNRLCLQSPENDHCFPDAQSAADYLGALSAVERLDFPYPLRDVRGEP LEPPEPSVPLLPLLVAGAVLLLVILVLGVMVARRKREHSTLWFPEGFSLHKDVASGHKGRREPVGQDALGMKNMAKGESLMGEVATDWMDTECPEAKRLKVEEPGMGAEEAVDCRQWTQHHLVAADIRVAPAMALTPPQGDADADGMDVNVRGPDGFTPLMLASFCGGALEPMPTEEDEADDTSASIISDLICQGAQLGARTDRTGETALHLAARYARADAAKRLLDAGADTNAQDHSGRTPLHTAVTADAQGVFQILIRNRSTDLDARMADGSTALILAARLAVEGMVEELIASHADVNAVDELGKSALHWAAAVNNVEATLALLKNGANKDMQDSKEETPLFLAAREGSYEAAKLLLDHFANREITDHLDRLPRDVAQERLHQDIVRLLDQPSGPRSPPGPHGLGPLLCPPGAFLPGLKAAQSGSKKSRRPPGKAGLGPQGPRGRGKKLTLACPGPLADSSVTLSPVDSLDSPRPFGGPPASPGGFPLEGPYAAATATAVSLAQLGGPGRAGLGRQPPGGCVLSLGLLNPVAVPLDWARLPPPAPPGPSFLLPLAPGPQLLNPGTPVSPQERPPPYLAVPGHGEEYPVAGAHSSPPKARFLRVPSEHPYLTPSPESPEHWASPSPPSLSDWSESTPSPATATGAMATTTGALPAQPLPLSVPSSLAQAQTQLGPQPEVTPKRQVLA
SEQ ID NO：46：hNotch4
氨基酸1至1444胞外域(加下划线)
氨基酸392至434EGF重复10(双下划线并且斜体)
MQPPSLLLLLLLLLLLCVSVVRPRGLLCGSFPEPCANGGTCLSLSLGQGTCQCAPGFLGETCQFPDPCQNA QLCQNGGSCQALLPAPLGLPSSPSPLTPSFLCTCLPGFTGERCQAKLEDPCPPSFCSKRGRCHIQASGRPQ CSCMPGWTGEQCQLRDFCSANPCVNGGVCLATYPQIQCHCPPGFEGHACERDVNECFQDPGPCPKGTSCHN TLGSFQCLCPVGQEGPRCELRAGPCPPRGCSNGGTCQLMPEKDSTFHLCLCPPGFIGPDCEVNPDNCVSHQ CQNGGTCQDGLDTYTCLCPETWTGWDCSEDVDECETQGPPHCRNGGTCQNSAGSFHCVCVSGWGGTSCEEN LDDCIAATCAPGSTCIDRVGSFSCLCPPGRTGLLCH ECLMAQQGPSPCEHGGSCLNTPGSFNCLCPPGYTGSRCEADHNECLSQPCHPGSTCLDLLATF HCLCPPGLEGQLCEVETNECASAPCLNHADCHDLLNGFQCICLPGFSGTRCEEDIDECRSSPCANGGQCQD QPGAFHCKCLPGFEGPRCQTEVDECLSDPCPVGASCLDLPGAFFCLCPSGFTGQLCEVPLCAPNLCQPKQI CKDQKDKANCLCPDGSPGCAPPEDNCTCHHGHCQRSSCVCDVGWTGPECEAELGGCISAPCAHGGTCYPQP SGYNCTCPTGYTGPTCSEEMTACHSGPCLNGGSCNPSPGGYYCTCPPSHTGPQCQTSTDYCVSAPCFNGGT CVNRPGTFSCLCAMGFQGPRCEGKLRPSCADSPCRNRATCQDSPQGPRCLCPTGYTGGSCQTLMDLCAQKP CPRNSHCLQTGPSFHCLCLQGWTGPLCNLPLSSCQKAALSQGIDVSSLCHNGGLCVDSGPSYFCHCPPGFQ GSLCQDHVNPCESRPCQNGATCMAQPSGYLCQCAPGYDGQNCSKELDACQSQPCHNHGTCTPKPGGFHCAC PPGFVGLRCEGDVDECLDQPCHPTGTAACHSLANAFYCQCLPGHTGQWCEVEIDPCHSQPCFHGGTCEATA GSPLGFICHCPKGFEGPTCSHRAPSCGFHHCHHGGLCLPSPKPGFPPRCACLSGYGGPDCLTPPAPKGCGP PSPCLYNGSCSETTGLGGPGFRCSCPHSSPGPRCQKPGAKGCEGRSGDGACDAGCSGPGGNWDGGDCSLGV PDPWKGCPSHSRCWLLFRDGQCHPQCDSEECLFDGYDCETPPACTPAYDQYCHDHFHNGHCEKGCNTAECG WDGGDCRPEDGDPEWGPSLALLVVLSPPALDQQLFALARVLSLTLRVGLWVRKDRDGRDMVYPYPGARAEE KLGGTRDPTYQERAAPQTQPLGKETDSLSAGFVVVMGVDLSRCGPDHPASRCPWDPGLLLRFLAAMAAVGA LEPLLPGPLLAVHPHAGTAPPANQLPWPVLCSPVAGVILLALGALLVLQLIRRRRREHGALWLPPGFTRRPRTQSAPHRRRPPLGEDSIGLKALKPKAEVDEDGVVMCSGPEEGEEVGQAEETGPPSTCQLWSLSGGCGALPQAAMLTPPQESEMEAPDLDTRGPDGVTPLMSAVCCGEVQSGTFQGAWLGCPEPWEPLLDGGACPQAHTVGTGETPLHLAARFSRPTAARRLLEAGANPNQPDRAGRTPLHAAVAADAREVCQLLLRSRQTAVDARTEDGTTPLMLAARLAVEDLVEELIAAQADVGARDKWGKTALHWAAAVNNARAARSLLQAGADKDAQDNREQTPLFLAAREGAVEVAQLLLGLGAARELRDQAGLAPADVAHQRNHWDLLTLLEGAGPPEARHKATPGREAGPFPRARTVSVSVPPHGGGALPRCRTLSAGAGPRGGGACLQARTWSVDLAARGGGAYSHCRSLSGVGAGGGPTPRGRRFSAGMRGPRPNPAIMRGRYGVAAGRGGRVSTDDWPCDWVALGACGSASNIPIPPPCLTPSPERGSPQLDCGPPALQEMPINQGGEGKK
SEQ ID NO：33：编码人类Notch2EGF 1-12的多核苷酸序列
ATGCCCGCCCTGCGCCCCGCTCTGCTGTGGGCGCTGCTGGCGCTCTGGCTGTGCTGCGCGGCCCCCGCGCATGCATTGCAGTGTCGAGATGGCTATGAACCCTGTGTAAATGAAGGAATGTGTGTTACCTACCACAATGGCACAGGATACTGCAAATGTCCAGAAGGCTTCTTGGGGGAATATTGTCAACATCGAGACCCCTGTGAGAAGAACCGCTGCCAGAATGGTGGGACTTGTGTGGCCCAGGCCATGCTGGGGAAAGCCACGTGCCGATGTGCCTCAGGGTTTACAGGAGAGGACTGCCAGTACTCAACATCTCATCCATGCTTTGTGTCTCGACCCTGCCTGAATGGCGGCACATGCCATATGCTCAGCCGGGATACCTATGAGTGCACCTGTCAAGTCGGGTTTACAGGTAAGGAGTGCCAATGGACGGATGCCTGCCTGTCTCATCCCTGTGCAAATGGAAGTACCTGTACCACTGTGGCCAACCAGTTCTCCTGCAAATGCCTCACAGGCTTCACAGGGCAGAAATGTGAGACTGATGTCAATGAGTGTGACATTC CAGGACACTGCCAGCATGGTGGCAC CTGCCTCAACCTGCCTGGTTCCTACCAGTGCCAGTGCCCTCAGGGCTTCACAGGCCAGTACTGTGACAGCCTGTATGTGCCCTGTGCACCCTCACCTTGTGTCAATGGAGGCACCTGTCGGCAGACTGGTGACTTCACTTTTGAGTGCAACTGCCTTCCAGGTTTTGAAGGGAGCACCTGTGAGAGGAATATTGATGACTGCCCTAACCACAGGTGTCAGAATGGAGGGGTTTGTGTGGATGGGGTCAACACTTACAACTGCCGCTGTCCCCCACAATGGACAGGACAGTTCTGCACAGAGGATGTGGATGAATGCCTGCTGCAGCCCAATGCCTGTCAAAATGGGGGCACCTGTGCCAACCGCAATGGAGGCTATGGCTGTGTATGTGTCAACGGCTGGAGTGGAGATGACTGCAGTGAGAACATTGATGATTGTGCCTTCGCCTCCTGTACTCCAGGCTCCACCTGCATCGACCGTGTGGCCTCCTTCTCTTGCATGTGCCCAGAGGGGAAGGCAGGTCTCCTGTGTCATCTGGATGATGCATGCATCAGCAATCCTTGCCACAAGGGGGCACTGTGTGACACCAACCCCCTAAATGGGCAATATATTTGCACCTGCCCACAAGGCTACAAAGGGGCTGACTGCACAGAAGATGTGGATGAATGTGCCATGGCCAATAGCAATCCTTGTGAGCATGCAGGAAAATGTGTGAACACGGATGGCGCCTTCCACTGTGAGTGTCTGAAGGGTTATGCAGGACCTCGTTGTGAGATGGACATCAATGAGTGCCATTCAGACCCCTGCCAGAATGATGCTACCTGTCTGGATAAGATTGGAGGCTTCACATGTCTGTGCATGCCAGGTTTCAAAGGTGTGCATTGTGAATTA
SEQ ID NO：34：人类Notch2EGF 1-12多肽序列
MPALRPALLWALLALWLCCAAPAHALQCRDGYEPCVNEGMCVTYHNGTGYCKCPEGFLGEYCQHRDPCEKNRCQNGGTCVAQAMLGKATCRCASGFTGEDCQYSTSHPCFVSRPCLNGGTCHMLSRDTYECTCQVGFTGKECQWTDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCETDVNECDIPGHCQHGGTCLNLPGSYQCQCPQGFTGQYCDSLYVPCAPSPCVNGGTCRQTGDFTFECNCLPGFEGSTCERNIDDCPNHRCQNGGVCVDGVNTYNCRCPPQWTGQFCTEDVIECLLQPNACQNGGTCANRNGGYGCVCVNGWSGDDCSENIDDCAFASCTPGSTCIDRVASFSCMCPEGKAGLLCHLDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVDECAMANSNPCEHAGKCVNTDGAFHCECLKGYAGPRCEMDINECHSDPCQNDATCLDKIGGFTCLCMPGFKGVHCEL
SEQ ID NO：35：人类Notch1EGF10
LNDACISNPCNEGSNCDTNPVNGKAICTCPSGYTGPACSQDVD
SEQ ID NO：36：人类Notch2EGF10
LDDACISNPCHKGALCDTNPLNGQYICTCPQGYKGADCTEDVD
SEQ ID NO：37：人类Notch3EGF9(EGF9是人类Notch3中的EGF，其对应于包括Notch2在内的其它Notch受体的EGF10)
LDDACVSNPCHEDAICDTNPVNGRAICTCPPGFTGGACDQDVD
SEQ ID NO：38：人类Notch4EGF10
LEDMCLSQPCHGDAQCSTNPLTGSTLCLCQPGYSGPTCHQDLD
SEQ ID NO：41：Notch1EGF重复4
QADPCASNPCANGGQCLPFEASYICHCPPSFHGPTCRQ
SEQ ID NO：42：Notch2EGF重复4
TDACLSHPCANGSTCTTVANQFSCKCLTGFTGQKCET
SEQ ID NO：43：Notch3EGF重复4
SDVDECRVGEPCRHGGTCLNTPGSFRCQCPAGYTGPLCEN
SEQ ID NO：44：Notch4EGF重复4
RDFCSANPCVNGGVCLATYPQIQCHCPPGFEGHACER
申请人或代理人档案号2293.049PC03 国际申请号PCT/US2009/003994
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
澳大利亚
申请人在此提醒，在授予专利权之前、或者本申请失效、被驳回或撤回之前，只向与本发明无利益关联的本领域收信人提供微生物样品(澳大利亚专利细则的细则3.25(3))。
加拿大
申请人在此要求，在已经基于本申请授予加拿大专利权，或本申请被驳回、或放弃并且不再进行恢复，或撤回之前，只向专利委员会指定的独立专家提供本申请涉及的保藏的生物材料样品。
克罗地亚
申请人在此要求，在本申请公开和授予专利权之前，应该只对独立专家提供本申请涉及的保藏的生物材料样品。只有请求所保藏生物材料样品的人承诺以下条款，才能够获得该样品：在专利有效期间，不得将该生物材料或从其衍生的任何材料提供给第三方、不得将该生物材料或从其衍生的任何材料用于实验目的或研究目的之外，除非适用时申请人或专利权人明确放弃该承诺。
丹麦
申请人在此要求，除非本申请已经对公众查阅(通过丹麦专利局)公开，或由丹麦专利局最终决定不对公众查阅公开，只对本领域专家提供该样品。第三方提出的供应样品的任何请求应该指定要使用的专家。该专家可以是进入丹麦专利局起草承认的专家名单中的任何人，或在个案中申请人批准的任何人。
芬兰
申请人在此要求，除非已经由芬兰国家专利与注册委员会授予专利权公开，或如果芬兰国家专利与注册委员会最终决定不对本申请授予专利权则从申请日起20年，只对本领域专家提供该样品。第三方提出的供应样品的任何请求应该指定要使用的专家。该专家可以是进入芬兰国家专利与注册委员会起草承认的专家名单中的任何人，或在个案中申请人批准的任何人。
德国
申请人在此要求，除非授予专利权或如果本申请被驳回或撤回则从申请日起20年，只对申请人指定的独立专家提供样品。
冰岛
申请人在此要求，除非授予专利权或冰岛专利局作出最终决定本申请不授予专利权，只对本领域专家提供样品。第三方提出的供应样品的任何请求应该指定要使用的专家。该专家可以是进入冰岛专利局起草承认的专家名单中的任何人，或在个案中申请人批准的任何人。
挪威
申请人在此要求，除非本申请已经对公众查阅(通过挪威专利局)公开，或由挪威专利局最终决定不对公众查阅公开，只对本领域专家提供该样品。第三方提出的供应样品的任何请求应该指定要使用的专家。该专家可以是进入挪威专利局起草承认的专家名单中的任何人，或在个案中申请人批准的任何人。
新加坡
申请人在此要求，只对专家提供微生物样品。
西班牙
申请人在此要求，除非授予西班牙专利权公开或如果本申请被驳回或撤回则从申请日起20年，关于样品问题，按照西班牙专利法第45条的规定只对独立专家提供生物材料。
瑞典
申请人在此要求，除非由瑞典专利和注册局授予专利权或作出最终决定本申请不授予专利权，只对本领域专家提供样品。同样情况还适用于从申请日起20年内本申请被驳回或撤回。
瑞士
申请人在此要求，对第三方提供样品必须满足条件该第三方向保藏机构表明其名称和向保藏人信息目的的地址，并且承诺：(a)不得将保藏的培养物或从其衍生的培养物提供给第三方；(b)不得非法使用培养物；(c)如有争议，提出未违反条款(a)和(b)的义务的证据。
前南斯拉夫马其顿共和国
申请人在此要求，对第三方提供样品必须满足条件该第三方：(a)具有要求提供活生物或微生物材料样品的权利；(b)承诺保证在指定的专利有效期过期之前，未经申请人批准，不得将活生物或微生物材料样品提供给第三方。
联合王国
申请人在此要求，只对本领域专家提供微生物样品。
欧洲专利局
申请人在此要求，除非授予欧洲专利权公开或如果本申请被驳回或撤回则从申请日起20年，关于样品的问题，根据EPC细则28(3)的规定，只对请求方指定的专家提供生物材料(EPC细则28(4))。

Claims (1)

1.一种分离的抗体，所述分离的抗体与人类Notch2的胞外域的非配体结合区特异性结合，其中所述抗体与人类Notch2的EGF重复10特异性结合。
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