KR20110028621A - Ｎｏｔｃｈ１ 수용체 결합제 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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티모시 찰스 호이
모린 피치 브룬스
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Abstract

암 줄기 세포를 특이적으로 표적화하는 암의 진단, 특성화, 예후 및 치료를 위한 수단 및 방법이 개시된다. 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다.

Description

ＮＯＴＣＨ１ 수용체 결합제 및 그의 사용 방법 {NOTCH1 RECEPTOR BINDING AGENTS AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 인간 Notch 수용체에 결합하는 작용제를 포함하는 조성물, 및 암 및 다른 질환을 특성화, 진단 및 치료하기 위한 조성물의 사용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다.
암은 선진국에서의 주요 사망 원인 중 하나로, 미국에서만 년간 500,000 초과의 사망이 일어난다. 미국에서 매해 100만명 초과의 사람들이 암으로 진단되고, 전체적으로 3명 중 1명 초과의 사람이 그의 일생동안 몇몇 형태의 암을 발달시킬 것이라고 추정된다. 200가지가 넘는 상이한 유형의 암이 존재하지만, 이중 4가지, 즉 유방암, 폐암, 결장직장암 및 전립선암이 모든 신규 사례의 절반 이상을 차지한다 (문헌 [Jemal et al.,2003, Cancer J. Clin. 53:5-26] 참조).
암은 정상 조직 발달 및 유지를 제어하는 메카니즘의 조절이상으로부터 발생하며, 점점 더 줄기 세포가 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다 (문헌 [Beachy et al., 2004, Nature 432:324] 참조). 정상적인 동물 발달 동안, 대부분 또는 모든 조직의 세포는 줄기 세포라 불리우는 통상의 전구체로부터 유래된다 (문헌 [Morrison et al., 1997, Cell 88:287-98]; [Morrison et al., 1997, Curr. Opin. Immunol. 9:216-21]; [Morrison et al., 1995, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 11:35-71] 참조). 줄기 세포는 (1) 광범위한 증식 능력을 갖고; (2) 감소된 증식 및/또는 발달 잠재력을 갖는 하나 이상의 자손(progeny)을 생성하는 비대칭 세포 분할이 가능하며; (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위한 대칭 세포 분열이 가능한 세포이다. 줄기 세포의 분화에 의한 성체 세포 재생의 가장 널리 알려진 예는, 발달적으로 미성숙한 전구체 (조혈 줄기 및 전구(progenitor) 세포)가 분자 신호에 반응하여 다양한 혈액 및 림프 세포 유형을 형성하는 조혈기관계이다. 위, 유방관계 및 피부의 세포를 비롯한 다른 세포는 각 조직에서 소집단의 줄기 세포로부터 일정하게 채워지며, 최근의 연구는 뇌를 비롯한 대부분의 다른 성체 조직도 줄기 세포를 보유하고 있음을 제시한다.
고형 종양은 이종 세포 집단으로 구성되어 있다. 예를 들어, 유방암은 간엽 (기질) 세포, 염증 세포 및 내피 세포를 비롯한 정상 세포와 암 세포의 혼합물이다. 암의 전형적인 모델은 표현형상 상이한 암 세포 집단 모두가 증식하여 신규 종양을 발생시키는 능력을 가지고 있음을 제시한다. 전형적인 모델에서, 종양 세포 이종성은 환경적인 요인 뿐만 아니라 암 세포 내에 진행중인 돌연변이로부터 초래되어 다양한 집단의 종양형성 세포를 생성한다. 이러한 모델은 모든 집단의 종양 세포가 어느 정도의 종양형성 잠재력을 가질 것이라는 생각에 근거한다 (문헌 [Pandis et al., 1998, Genes, Chromosomes ＆ Cancer 12:122-129]; [Kuukasjrvi et al., 1997, Cancer Res. 57:1597-1604]; [Bonsing et al., 1993, Cancer 71:382-391]; [Bonsing et al., 2000, Genes Chromosomes ＆ Cancer 82: 173-183]; [Beerman H et al., 1991, Cytometry 12:147-54]; [Aubele M ＆ Werner M, 1999, Analyt. Cell. Path. 19:53]; [Shen L et al., 2000, Cancer Res. 60:3884] 참조).
관찰된 고형 종양 세포 이종성에 대한 다른 모델은, 고형 종양이 나중에 대칭 및 비대칭 세포 분열 둘 다를 통해 혼란한 발달을 겪는 "고형 종양 줄기 세포" (또는 고형 종양으로부터의 "암 줄기 세포")로부터 초래된다는 것이다. 이러한 줄기 세포 모델에서, 고형 종양은 이들이 광범위하게 증식하고 효율적으로 추가의 고형 종양 줄기 세포를 발생시키며 (자가-재생) 및 종양형성 잠재력이 결핍된 고형 종양의 대다수의 종양 세포를 발생시킨다는 점에서, 정상 "줄기 세포"의 특성을 공유하는 상이하고도 제한적인 (아마도 훨씬 드문) 하위셋트의 세포를 함유한다. 실제로, 긴-수명의 줄기 세포 집단 내의 돌연변이는 종양의 성장 및 유지에 기초가 되는 암 줄기 세포의 형성을 개시할 수 있으며, 그의 존재가 현행 치료 접근법의 실패 원인이다.
암의 줄기 세포 성질은 혈액암인 급성 골수성 백혈병 (AML)에서 최초로 밝혀졌다 (문헌 [Lapidot et al., 1994, Nature 367:645-8] 참조). 보다 최근에, 악성 인간 유방 종양은 유사하게도 면역결핍 마우스에서 종양을 형성하는 능력이 풍부한 다른 소집단의 암 줄기 세포를 보유한다는 것이 증명되었다. ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-세포 집단은 미분획화 종양 세포에 비해 종양형성 세포가 50배 풍부하다고 밝혀졌다 (문헌 [Al-Hajj et al., 2003, PNAS 100:3983-8] 참조). 종양형성 암 세포를 가망있게 단리하는 능력은, 이들 세포에서의 종양형성 가능성에 기초하는 중요한 생물학적 경로를 조사할 수 있게 하여, 암 환자에 대한 보다 나은 진단 및 검정 및 치료제의 발달을 약속한다. 본 발명은 이러한 목적을 지향한다.
정상 줄기 세포 및 암 줄기 세포는 증식 및 자가-재생 능력을 공유하므로, 정상 줄기 세포 발달을 조절하는 다수의 유전자가 종양형성에 기여한다는 것은 놀라운 일이 아니다 (문헌 [Reya et al., 2001, Nature 414:105-111] 및 [Taipale ＆ Beachy, 2001, Nature 411:349-354]에서 검토됨). 본 발명은 암 줄기 세포의 유지에 있어서 Notch 신호전달 경로를 암시하는 암 줄기 세포의 마커로서, 그리고 상기 종양형성 세포의 제거를 통해 암을 치료하기 위한 표적으로서 Notch 수용체, 예를 들어, Notch1을 확인한다.
Notch 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 후배 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 중요 조절자들 중 하나이다. 보다 구체적으로, Notch 신호전달은 인접 세포 운명간 횡억제 과정에 관여하며, 비대칭 세포 분열 동안 세포 운명 결정에서 중요한 역할을 한다. 비조절성 Notch 신호전달은 수많은 인간 암과 연관되어 있으며, 여기서 상기 신호전달은 종양 세포의 발생 운명을 변화시켜 이들 종양 세포를 미분화 및 증식 상태로 유지시킬 수 있다 (문헌 [Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]). 따라서, 암종형성은, 줄기 세포 집단에 의한 정상적인 발생 및 조직 회복을 제어하는 항상성 메카니즘의 와해를 통해 진행될 수 있다 (문헌 [Beachy et al., 2004, Nature 432:324]).
Notch 수용체는 날개 가장자리에 톱니무늬 (notch)를 생성하는 유전자 단배수 결손 (haploinsufficiency)을 갖는 초파리 돌연변이체에서 처음으로 확인되었고, 한편 기능 소실은 상피 세포의 그 운명이 신경 조직으로 변화되는 배아 치명적 "신경성 (neurogenic)" 표현형을 생성한다 (문헌 [Moohr, 1919, Genet. 4:252]; [Poulson, 1937, PNAS 23:133]; [Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271]). Notch 수용체는 거대한 세포외 도메인 내에 다수의 직렬 상피 성장 인자 (EGF)-유사 반복부 및 3개의 시스테인-풍부 Notch/LIN-12 반복부 (LNR)를 함유하는 단일-통과(single-pass) 횡단막 수용체이다 (문헌 [Wharton et al., 1985, Cell 43:567]; [Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094]; [Artavanis et al., 1999, Science 284:770] (검토)). LNR 및 세포외 도메인의 대략 103개 아미노산의 추가 C-말단 테일은 본원에서 "멤브레인 인접 영역"으로 지칭된다. 이러한 영역은 또한 Notch 음성 조절 영역 (NRR)으로 알려져 있으며 그로 지칭된다.
포유동물 Notch 수용체는 절단되어 성숙한 수용체 및 하기 리간드 결합을 형성하여 하류 신호전달을 활성화시킨다. 퓨린(furin)-유사 프로테아제는 성숙 동안 Notch 수용체 전구체를 절단하여, 비공유적으로 연관된 세포외 서브유닛 및 자가-억제 상태에서 서로 결합하는 횡단막을 포함하는 근접막(juxtamembrane) 이종이량체를 생성한다. 리간드 결합은 이러한 억제를 경감시키고, ADAM-형 메탈로프로테아제 및 감마-세크레타제에 의한 Notch 수용체의 절단을 유도하며, 감마-세크레타제는 세포내 도메인 (ICD)을 세포질로 방출하여 핵 내로 전위시킴으로써 유전자 전사를 활성화시킨다. ADAM에 의한 절단은 근접막 음성 조절 영역 (NRR) 내의 비-리간드 결합 절단 도메인 내에서 일어난다 (도 1A 참조). Notch1 수용체에서, 이러한 영역은 약 1427개 아미노산 내지 약 1732개 아미노산을 포함한다.
4개의 포유동물 Notch 단백질 (Notch1, Notch2, Notch3, 및 Notch4)이 확인되었으며, 이들 수용체에서의 돌연변이는 하기에서 상세히 기재된 바와 같은 여러 암들을 포함한 발달 이상 및 인간 병리를 초래한다 (문헌 [Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103]; [Joutel ＆ Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25] 참조).
Notch 수용체는 Delta, Serrated, Lag-2 (DSL) 족의 단일-통과 횡단막 리간드에 의해 활성화된다. 포유동물에는 5종의 공지된 Notch 리간드가 있다: 세포외 도메인 내에 DSL 도메인 및 직렬 EGF-유사 반복부가 있는 것을 특징으로 하는 Delta-like 1 (DLL1), Delta-like 3 (DLL3), Delta-like 4 (DLL4), Jagged 1 및 Jagged 2. Notch 수용체의 세포외 도메인은, 전형적으로는 인접한 세포 상에 있는 리간드와 상호작용하여, 2개의 Notch 단백질 절단, ADAM (A Disintegrin And Metallopeptidase) 프로테아제에 의해 매개된 세포외 절단 (1개), 및 감마 세크레타제에 의해 매개된 횡단막 도메인내 절단 (1개)을 일으킨다. 후자 절단은 Notch 세포내 도메인 (ICD)을 생성하고, 이어서 이는 핵에 진입하여 Hairy and Enhancer of Split [E(spl)] 족의 핵 염기성 나선-루프-나선 전사 인자의 전사를 증가시키는 주요 하류 이펙터인 CBF1, Su(H) (Suppressor of Hairless), Lag-2 (CSL) 족의 전사 인자들을 활성화시킨다 (문헌 [Artavanis et al., 1999, Science 284:770]; [Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543]). 또한, 초파리에서 확인된 세포질 단백질 Deltex를 포함하는 또다른 세포내 경로가 포유동물에 존재할 수 있고 (문헌 [Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33]), 이러한 Deltex-의존적 경로는 Wnt 표적 유전자의 발현을 저해하는 작용을 할 수 있다 (문헌 [Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710]; [Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85]).
조혈 줄기 세포 (HSC)는 신체에서 가장 잘 알려져 있는 줄기 세포이고, Notch 신호전달은 상기 세포의 정상적인 유지 및 백혈병 전환에 관여한다 (문헌 [Kopper ＆ Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]). HSC는 성인 골수 내의 기질 함요부에 있는 희귀 세포 집단이다. 이들 세포는 독특한 유전자 발현 프로파일, 및 보다 분화된 전구 세포들을 연속적으로 생성하여 전체 조혈계를 재구성할 수 있는 능력을 특징으로 한다. HSC 및 전구 세포에서 Notch1 신호전달의 구성적 활성화는 시험관내에서 및 장기적 재구성 검정에서 림프 및 골수 세포를 생성하는 불멸화 세포주를 조성하고 (문헌 [Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81]), Jagged1의 존재는 HSC가 풍부화된 인간 골수 세포 집단의 생착을 증가시킨다 (문헌 [Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72]). 보다 최근에는, Notch 신호전달이 생체내 HSC에서 연구되었고, HSC 분화의 억제에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, Notch 신호전달은 Wnt-매개된 HSC 자가-재생에 필수적인 것으로 보인다 (문헌 [Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314]).
또한, Notch 신호전달 경로는 신경 줄기 세포의 유지에 있어서 중추적 역할을 수행하며, 상기 세포의 정상적인 유지뿐만 아니라 뇌암에도 모두 관여한다 (문헌 [Kopper ＆ Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]; [Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63]; [Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800]). 신경 줄기 세포는 발생 동안 포유동물 신경계의 모든 뉴런 및 아교 세포를 생성하고, 보다 최근에는 성인 뇌에서 확인되었다 (문헌 [Gage, 2000, Science 287:1433-8]). Notch1; Notch 표적 유전자인 Hes1, 3 및 5; 및 Notch 신호전달 PS1 (presenilin1) 조절자가 결핍된 마우스의 경우, 배아 신경 줄기 세포의 수가 감소된 것으로 나타난다. 또한, 성인 신경 줄기 세포는 PS1 동형접합체 마우스의 뇌에서 감소된다 (문헌 [Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93]; [Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58]). 신경 줄기 세포의 감소는 이들 세포가 뉴런으로 미성숙 분화됨에 따라 발생하는 것으로 보이며 (문헌 [Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50]), 이는 Notch 신호전달이 신경 줄기 세포 분화 및 자가-재생을 조절함을 시사한다.
이상 Notch 신호전달은 수많은 인간 암에 관여한다. 인간의 Notch1 유전자는 T-세포 급성 림프모세포성 백혈병 아류에서 Notch 경로의 활성화를 일으키는 전위된 좌위로서 최초 확인되었다 (문헌 [Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61]). 마우스 모델에서, T-세포에서의 Notch1 신호전달의 구성적 활성화는 T-세포 림프종을 유사하게 생성한다 (원인적 역할을 시사함) (문헌 [Robey et al., 1996, Cell 87:483-92]; [Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91]; [Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9]; [Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48]). 최근에, 이상 Notch1 신호전달을 생성하는 Notch1 지점 돌연변이, 삽입 및 결실은 유년기 및 성인 T-세포 급성 림프모세포성 백혈병/림프종 둘 다에서 빈빈하게 존재하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Pear ＆ Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33]).
유두 종양에서 마우스 유두 종양 바이러스가 Notch1 및 Notch4 좌위로 빈번하게 삽입되는 것 및 이에 따른 활성화된 Notch 단백질 단편은 우선, 유방암에서의 Notch 신호전달에 관여하였다 (문헌 [Gallahan ＆ Callahan, 1987, J. Virol. 61:66-74]; [Brennan ＆ Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 트랜스제닉 마우스에서의 추가 연구에서는, 정상적인 유선 발생 동안 유관 가지형성에서 Notch의 역할이 확인되었고, 유두 상피 세포에서 구성적 활성화 형태의 Notch4는 상피 분화를 억제하여 종양형성을 일으킨다 (문헌 [Jhappan et al., 1992, Genes ＆ Dev. 6:345-5]; [Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85]; [Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77]; [Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9]; [Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol. 196:204-17]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 현재 인간 유방암에서 Notch의 역할에 관한 증거는, 유방 암종에서의 Notch 수용체 발현 및 이들과 임상 결과와의 상호관련성에 제한된다 (문헌 [Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86]; [Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86]). 또한, Notch 경로의 과다발현이 자궁경부암 (문헌 [Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8]), 신장 세포 암종 (문헌 [Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32]), 두경부 편평 세포 암종 (문헌 [Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4]), 자궁내막암 (문헌 [Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9)] 및 신경모세포종 (문헌 [van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8])에서 관측되었으며, 이들은 수많은 신생물의 발생에 있어서 Notch의 잠재적 역할을 시사한다. 흥미롭게도, Notch 신호전달은 결장의 Apc-돌연변이체 신생물 세포의 미분화 상태 유지에 있어서 소정의 역할을 할 수 있다 (문헌 [van Es ＆ Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496-502]).
Notch 경로는 또한, 증식, 이동, 평활근 분화, 혈관형성 및 동정맥 분화를 비롯한 혈관 발생의 여러 측면에 관여한다 (문헌 [Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543]). 예를 들어, Notch1/4 및 Jagged1에서의 동형접합 널 (null) 돌연변이, 및 DLL4의 이형접합성 소실은 동맥 발생 및 난황 sac 혈관신생에서 심각하고 곤란한 각종 결함을 일으킨다. 또한, DLL1-결핍 및 Notch-2-하이포모픽 (hypomorphic) 마우스 배아의 경우, 아마도 불량한 혈관 구조 발생으로 인한 출혈이 나타난다 (문헌 [Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54]; [Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52]; [Xue et al., 1999, Hum. Mel Genet. 8:723-30]; [Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21]; [McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502]). 인간의 경우, Jagged1에서의 돌연변이는 알라질 증후군 (Alagille syndrome), 즉 혈관 결함을 포함하는 발생 장애와 연관되어 있고, Notch3에서의 돌연변이는 혈관 항상성에 결함이 있는 유전성 혈관 치매 (카다실)의 원인이 된다 (문헌 [Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10]).
정상 유방 상피에 비해 암 줄기 세포에서 발현된 유전자로서의 Notch1, Notch4, DLL1 및 DLL4의 확인은, Notch 경로를 표적화하는 것이 대다수의 비종양형성 암 세포 뿐만 아니라 고형 종양의 형성 및 재발의 원인이 되는 종양형성 세포를 제거하는데 도움을 줄 수 있음을 제시한다. 또한, 종양 형성 및 유지에 있어서 혈관신생의 현저한 역할 때문에, Notch 경로를 표적화하는 것은 또한 혈관신생을 효과적으로 억제하여, 암으로부터 영양분을 빼앗고 암의 제거에 기여할 수 있다.
항-Notch 항체 및 항암 치료제로서 그의 가능한 용도가 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2008/0131434호 및 동 제2009/0081238호 (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또한, 국제 공보 제WO 2008/057144호, 제WO 2008/076960호, 및 제WO 2008/50525호를 참조한다.
본 발명은 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하는 작용제, 및 상기 작용제를 포함하는 제약 조성물과 같은 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 암 줄기 세포를 상기 작용제로 표적화하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수를 감소시키고/거나, 종양의 종양형성 가능성을 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 암의 치료 및/또는 종양 성장의 억제에서 상기 작용제를 사용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 Notch1 수용체 (예를 들어, 인간 Notch1)의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, Notch1 수용체의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역은 인간 Notch1 수용체의 약 1427개 아미노산 내지 약 1732개 아미노산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Notch1 수용체의 멤브레인 인접 영역은 서열 2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 추가의 Notch 수용체 군 구성원의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1의 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1 수용체 또는 Notch1 수용체의 활성화에 의해 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1 활성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 멤브레인 인접 영역 내의 절단을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch1 수용체의 절단 (예를 들어, S2 부위에서 메탈로프로테아제에 의한 절단)을 억제하고/거나 리간드 결합에 의해 Notch1 수용체의 활성화를 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1의 세포내 도메인 (ICD)의 방출 또는 형성을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 종양 성장을 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하며, (a) RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 (a) RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (c) FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 (a) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (c) ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다 (또는 추가로 포함한다). 몇몇 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 2008년 8월 7일에 부다페스트 조약의 조건하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (미국 버지니아주 매나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재)에 기탁되고 기탁 번호 PTA-9405가 부여된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체 52M51을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 2008년 10월 15일에 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 기탁되고 기탁 번호 PTA-9549가 부여된 DNA에 의해 코딩된 인간화 버젼의 항체 52M51, 52M51H4L3을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 항체 52M51이 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하는 항체를 제공하며, 상기 항체는 2008년 10월 15일에 부다페스트 조약의 조건하에 ATCC에 기탁되고 기탁 번호 PTA-9548이 부여된 DNA에 의해 코딩된 항체 "52R43"을 포함하거나, 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에의 특이적 결합에 대해 52R43과 경쟁하는 항체를 제공한다. 52R43을 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 52R43 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 (예를 들어 경쟁적 결합 검정에서) 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에의 특이적 결합에 대해, 상기에 언급된 실시양태 및/또는 측면 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면/실시양태에 기재되어 있는 항체 중 임의의 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 본원에 기재된 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
상기에 언급된 측면 또는 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 1가, 단일특이적, 2가, 이중특이적, 또는 다중특이적이다. 특정 실시양태에서, 항체는 세포독성 잔기에 접합된다. 특정 실시양태에서, 항체는 단리된다. 다른 추가의 실시양태에서, 항체는 실질적으로 순수하다.
본원에 기재된 항체를 포함하는 제약 조성물 및 본원에 기재된 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 폴리펩티드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 (예를 들어, Notch1에 특이적으로 결합하는 항체), 항체의 중쇄 또는 경쇄, 및/또는 항체의 단편이다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 8, 서열 14, 서열 24, 서열 28 또는 서열 32의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 14 또는 서열 24의 아미노산 서열 및/또는 서열 8, 서열 28 또는 서열 32의 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14 또는 서열 24의 아미노산 서열의 적어도 일부분, 및/또는 서열 8, 서열 28 또는 서열 32의 아미노산 서열의 적어도 일부분을 포함한다. 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 비히클 둘 다를 포함하는 제약 조성물이 추가로 제공되며, 폴리펩티드를 생산하는 세포주도 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 (a) 서열 14 또는 서열 24에 대해 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 (b) 서열 8, 서열 28 또는 서열 32에 대해 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 (예를 들어, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체)이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 24, 서열 8, 서열 28 또는 서열 32에 대해 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상, 또는 약 100％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 52M51 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간화 52M51 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체 52R43의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 측면 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면/실시양태의 임의의 항체 및/또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 숙주 세포는 발현 벡터를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 세포주 또는 하이브리도마 세포주이다. 특정 실시양태에서, 하이브리도마 세포주는 52M51 항체 또는 인간화 52M51 항체를 생산한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 측면 및 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면/실시양태에 기재된 유효량의 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch1의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상기 언급된 측면 및 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면/실시양태에 기재된 치료적 유효량의 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 암 줄기 세포를 항체로 표적화하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수를 감소시키고/거나, 종양의 종양형성 가능성을 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 Notch1 수용체의 활성을 억제하고/거나 종양의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 유방 종양, 결장직장 종양, 간 종양, 신장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 상기 언급된 측면 및/또는 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면/실시양태에 기재된 치료적 유효량의 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료될 암은 유방암, 결장직장암, 간암(hepatic cancer), 신장암, 간암(liver cancer), 폐암, 췌장암, 위장암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 교아세포종 및 두경부암이다. 상기 언급된 측면 또는 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면 및/또는 실시양태의 각각의 특정 실시양태에서, 암의 치료 방법은 종양 성장의 억제를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 결합이 Notch1의 활성을 억제하는 것인, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 Notch1의 활성을 억제하는 유효량의 항체를 종양과 접촉시키는 것을 포함하는, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도 또는 수를 감소시킴으로써 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 언급된 측면 및/또는 실시양태 뿐만 아니라 본원에 언급된 다른 측면 또는 실시양태의 각각의 특정 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 추가의 항암제 및/또는 치료제를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함한다. 상기 언급된 측면 또는 실시양태 뿐만 아니라 그밖에 본원에 언급된 다른 측면 및/또는 실시양태의 각각의 특정 실시양태에서, 항체는 암을 위한 추가의 치료와 조합되어 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 암을 위한 추가의 치료는 방사선 요법, 화학요법, 및/또는 추가의 항체 치료제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학요법은 탁솔, 이리노테칸, 젬시타빈 및/또는 옥살리플라틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 항체 치료제는 제2 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2) 또는 인간 Notch 수용체 리간드 (예를 들어, DLL4 또는 JAG1)에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 항체 치료제는 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 대상체는 인간이다.
본 발명은 또한 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 결합하며 Notch1 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 치료적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 암 줄기 세포를 포함하는 암 (하나 이상의 Notch 수용체의 암 줄기 세포에 의한 과다발현을 특징으로 하지 않음)을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인간에게 (a) Notch1 수용체에 결합하며 Notch 수용체를 과다발현하는 암 줄기 세포의 성장을 억제하는 제1 항체; 및 (b) Notch 수용체에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 제2 항체의 치료적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 Notch1 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 유방암, 결장암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 직장암 및 결장직장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 또다른 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 Notch1에 결합하며 Notch1 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 인간화 항체; 상기 인간화 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물; 및 세포독성제와 접합된 인간화 항체를 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다.
또한, 본 발명은 인간화 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 핵산을 포함하는 벡터; 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 뿐만 아니라 핵산이 발현되도록 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로는 숙주 세포 배양으로부터 (예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 인간화 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 인간화 항체의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 칼리키마이신 분자에 접합된 Notch에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체, 및 암 (예를 들어, 암 줄기 세포가 Notch를 과다발현하는 암)을 발현하는 Notch의 치료를 위한 상기 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 치료 조성물, 예를 들어 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 결합하는 항체를 사용하여 치료될 수 있는 고형 종양의 예에는, 육종 및 암종, 예컨대 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프혈관육종, 림프혈관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉(Ewing's) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름(Wilms') 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수질아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아세포이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대안들의 그룹화의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 그룹 뿐만 아니라 그룹의 개별적 각 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹, 또한 하나 이상의 그룹 구성원이 부재한 주요 그룹을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다.
도 1: Notch 신호전달을 억제하는 Notch의 멤브레인 인접 영역을 표적화하는 항체의 확인
(A) Notch 수용체 및 52M 항원 영역의 개략도. 52M 항원은 수용체의 성숙 동안 퓨린에 의해 절단되고 리간드 결합 후 ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease)에 의해 절단되는 Notch1 수용체의 영역을 포함한다. 감마-세크레타제에 의한 이후의 처리는 Notch의 세포내 도메인 (ICD)의 방출을 일으켜 핵에서 유전자 전사를 활성화시킨다. (B) 가용성 Notch 리간드 (hDLL4-fc) 및 Notch1 수용체 항체의 존재하에 배양된 Notch1-Hela 세포로부터 유래된 루시페라제 수준 (y-축). hDLL4-Fc의 존재 및 부재하에 비-형질감염된 (NT) 세포로부터 초래된 결과는 x-축의 맨 좌측에 도시되어 있다. 52M Notch1 수용체 항체는 x-축을 따라 도시되고, DBZ, Notch 감마-세크레타제 억제제 (GSI), 및 21M18, 항-DLL4 항체와 비교된다. Notch1 수용체 항체 52M51, 52M63, 52M74 및 52M80은 모두 루시페라제 활성의 감소에 의해 나타난 바와 같이 Notch 신호전달을 유의하게 억제하였다. (C) 가용성 Notch 리간드 (hDLL4-fc) 및 Notch1 수용체 항체의 존재하에 배양된 Notch1-Hela 세포로부터 유래된 루시페라제 수준 (y-축). hDLL4-Fc의 존재 및 부재하에 비-형질감염된 (NT) 세포로부터 초래된 결과는 x-축의 맨 좌측에 도시되어 있다. 52M51 뮤린 하이브리도마 유래된 항체 및 인간화 변이체 52M51-H4/L3은 나타낸 바와 같은 다양한 농도에서 x-축을 따라 도시되어 있다. 모 뮤린 항체 52M51 및 인간화 변이체 둘 다 루시페라제 활성의 감소에 의해 나타난 바와 같이 Notch 신호전달을 유의하게 억제하였다. (D) Notch1 발현 Hela 세포의 리간드-매개된 자극 후의 ICD 형성의 웨스턴 블롯 분석. 최소의 ICD는 DLL4 리간드의 부재하에 (-DLL4) 생산되지만, 형성은 DLL4의 존재에 의해 자극된다. 항체 52M51, 52M63, 52M74, 및 52M80은 DLL4의 존재에도 불구하고 ICD 형성을 배경(background) 수준으로 감소시킨다.
도 2: Notch1 수용체 항체 52M51은 생체내 종양 형성을 억제한다.
(A) C8 결장 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch1 항체 52M51 (삼각형)으로 처리하고, 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. 52M51 항체로의 처리는 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 (p=0.0006) 억제하였다. (B) 대조군 (좌측) 대 52M51 (우측) 처리된 마우스에 대해 48일 및 55일에 측정된, (A)에서의 동물들로부터의 개별 종양 부피 측정. 선은 각 실험군의 평균을 구분한다. (C) PE13 유방 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (흑색 사각형) 또는 도 1B에 도시된 바와 같은 Notch 신호전달을 억제하지 않는 항-Notch1 항체, 52M1 (흑색 삼각형) 및 52M2 (회색 원형)로 처리하였다. 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. 52M1 및 52M2로의 처리는 대조군 처리된 동물과 비교하였을 때 종양 성장을 효과를 나타내지 않았다. (D) PE13 유방 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형) 또는 도 1B에 도시된 바와 같은 Notch 신호전달을 억제하지 않는 항-Notch1 항체 52M8 (삼각형)으로 처리하였다. 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. 52M8로의 처리는 대조군 처리된 동물과 비교하였을 때 종양 성장 효과를 나타내지 않았다.
도 3: 항-Notch1 수용체 항체 52R43은 생체내 종양 성장을 억제한다.
M2 흑색종 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch1 항체 52R43 (원형)으로 처리하고, 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. (B) Lu24 폐 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch1 항체 52R43 (원형)으로 처리하고, 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. (C) PN8 췌장 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch1 항체 52R43 (원형)으로 처리하고, 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다. (D) T1 유방 종양 세포를 주입한 NOD/SCID 마우스를 대조군 항체 (사각형), 항-Notch1 항체 52R43 (폐쇄 원형), 탁솔 (삼각형) 또는 52R43 및 탁솔 (개방 원형)으로 처리하고, 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간 (x-축, 일)에 따라 측정하였다.
본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체에 결합하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 (이에 제한되지 않음)를 비롯한 신규 작용제를 제공한다. Notch-결합제는 인간 Notch 수용체(들)의 길항제를 포함한다. 관련 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, Notch-결합제를 포함하는 조성물, 및 Notch-결합제를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 신규 Notch-결합제를 사용하는 방법, 예컨대 종양 성장을 억제하는 방법 및/또는 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하며 생체내 종양 성장을 억제하는 분자 (예를 들어, 항체)를 확인한다. 리간드 결합에 필요하며 충분한 Notch의 리간드 결합 영역이 EGF 반복부 11 및 12로 확인되었으며, 이는 Notch 수용체의 상기 영역이 Notch 신호전달 및 종양형성에 중요하다는 것을 뒷받침한다 (문헌 [Rebay et al., 1991, Cell 67:687]; [Lei et al., 2003, Dev. 130:6411]; [Hambleton et al., 2004, Structure 12:2173]). 뜻밖에도, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 리간드 결합 도메인 외부에 결합하는 항체가 생체내에서 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 공개공보 제2008/0131434호 참조, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 인간 Notch 수용체-Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4 중 하나 이상의 세포외 도메인의 리간드 결합 도메인 외부에 결합하는 항체는 잠재적인 암 치료제로서의 가치가 있다.
모노클로날 항체 52M51을 비롯한, Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 본 발명에 이르러 확인되었다 (실시예 1). 또한, 인간화 52M51 항체도 생성되었다 (실시예 2). 52M51 및 52M51의 인간화 변이체를 비롯한 여러 항체는, 리간드-결합 영역의 외부 영역에서 Notch1에 대한 결합에도 불구하고, 리간드-유도된 Notch1 신호전달을 억제한다 (실시예 3 및 도 1B 및 1C). 또한, 본 발명에 이르러 Notch 세포내 도메인 (ICD)의 형성을 억제하는 여러 항체의 능력이 입증되었다 (실시예 3 및 도 1D). 52M51은 이종이식 모델에서 생체내 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 5 및 도 2A 및 2B). 또한, 또다른 항체 52R43은 다수의 이종이식 모델에서 생체내 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 7 및 도 3A 내지 3D).
정의
본원에 사용된 Notch 수용체의 "길항제"는 Notch 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함하는 용어이다. 적합한 길항제 분자는 특이적으로 길항제 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 용어 "길항제"는 Notch 수용체의 발현을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 임의의 분자를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합 등을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미하도록 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 (2개 이상의 무손상 항체로부터 생성됨), 1가 또는 단일특이적 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원 결정 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티에 기초하여 면역글로불린의 5 가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 어느 하나일 수 있다. 다른 면역글로불린 부류는 상이하며 잘 알려진 서브유닛 구조 및 3차원 배열을 갖는다. 항체는 네이키드(naked) 상태이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성 동위원소 등에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 나타내고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 다중특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨) 등을 포함한다.
"Fv 항체"는 2-쇄 (하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 비-공유 이량체를 형성함) 또는 단일-쇄 (scFv) (하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 가요성 펩티드 링커로 공유결합에 의해 연결되어 2개의 쇄가 유사한 이량체 구조로 연관됨)로서 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 나타낸다. 이러한 배열에서, 각각의 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)은 상호작용하여 Fv 이량체의 항원-결합 특이성을 지정한다. 다르게는, 단일 가변 도메인 (또는 Fv의 절반)은 일반적으로 보다 낮은 친화도를 갖기는 하지만 항원을 인식하여 결합하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도의 특이적인 인식 및 결합과 관련된 동종 항체 집단을 나타낸다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 모두 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물 (이에 제한되지 않음)을 비롯한 임의의 수의 방식으로 제조된 상기 항체를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 특이적인 면역글로불린 쇄, 키메릭 면역글로불린 또는 그의 단편 (최소 비-인간 서열 함유)인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 나타낸다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가의 잔기의 치환에 의해 변형되어 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선 및 최적화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 하나 이상, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 함께 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 또한 초가변 영역으로 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서의 CDR은 FR에 의해 함께 매우 가까이 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 2가지 이상의 CDR 결정 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948]). 또한, 이들 두 접근법이 함께 당업계에서 CDR 결정에 사용되기도 한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조되는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 무손상 또는 전장 항체, 그의 단편 및/또는 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
용어 "키메릭 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2종 이상의 종으로부터 유래된 항체를 나타낸다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 둘 모두 원하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 일으키는 것을 방지한다. 용어 키메릭 항체는 1가, 2가 및 다가 항체를 포함한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 나타낸다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬 배치된 비-근접 아미노산 및 근접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 근접 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시 유지되는 한편, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형 에피토프로도 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 3개 이상, 보다 일반적으로 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 독특한 공간적 배열로 포함한다.
에피토프 또는 수용체에 "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 항체는 항체가 관련되지 않은 단백질을 비롯한 다른 물질보다 에피토프 또는 수용체에 대해, 보다 빈번하게, 보다 빠르게, 보다 오래, 보다 높은 친화도로, 또는 일부 이들이 조합되어 나타나면서, 반응하거나 연관된다는 것을 의미한다. "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 예를 들어 항체가 단백질에 약 0.1 mM 이하, 때로는 약 1 μM 이하, 때로는 약 0.1 μM 이하, 때로는 약 0.01 μM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 종에서 Notch 수용체를 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 잔기는 제2 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합"은 독점적인 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있으나) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
항체 사이의 경쟁은, 연구중인 면역글로불린이 통상적인 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 측정된다. 많은 유형의 경쟁적 결합 검정이 알려져 있다, 예를 들어 고체상 직접 또는 간접 방사면역검정 (RIA), 고체상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986)] 참조); 고체상 직접 표지 검정, 고체상 직접 표지된 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Press (1988)] 참조); 125I 표지를 사용하는 고체상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)] 참조); 고체상 직접 비오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990)]); 및 직접 표지된 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)]). 전형적으로, 이러한 검정은 고체 표면에 결합된 정제된 항원 또는 이들을 수반하는 세포, 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정함으로써 측정된다. 통상, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. (항체와 경쟁하는) 경쟁 검정에 의해 확인된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체적 방해가 일어나도록 참조 항체에 의해 결합되는 에피토프와 충분히 인접하는 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 통상, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 그 항체는 통상적인 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50％ 또는 75％ 억제할 것이다.
용어 "단리된" 또는 "정제된"은 보통 자연적인 상태에서 동반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 나타낸다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. 제조시 우세하게 존재하는 종인 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 핵산이 실질적으로 정제된다. 특히, 몇몇 실시양태에서, 유전자를 포함하는 단리된 핵산은 유전자를 자연적으로 플랭킹시켜 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 아닌 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 단리된 항체는 다른 비-면역글로불린 단백질 및 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 다른 면역글로불린 단백질로부터 분리된다. 이는 또한 핵산 또는 단백질이 85％ 이상 순수하고, 95％ 이상 순수하고, 몇몇 실시양태에서, 99％ 이상 순수하다는 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물에서의 병적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부 암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 여러 유형의 두경부암이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 "종양" 및 "신생물"은 양성 (비암성) 또는 악성 (암성) (전-암성 병소 포함)의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 초래되는 조직의 임의의 덩어리를 나타낸다.
용어 "증식성 장애" 및 "증식성 질환"은 암과 같은 이상 세포 증식과 관련된 장애를 지칭한다.
본원에 사용된 "전이"는 원래 부위로부터 새로운 위치에서 유사한 암성 병소가 발생한 신체의 다른 영역으로 암이 확산되거나 이동하는 과정을 나타낸다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃하는 세포와 부착된 상태로 접촉하지 않고, 질환의 원발성 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하여 이웃하는 신체 구조를 침범한 것이다.
용어 "암 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포" 또는 "고형 종양 줄기 세포"는 본원에서 교환가능하게 사용되며, (1) 대규모 증식 용량을 갖고; 2) 비대칭 세포 분열이 가능하여 감소된 증식 또는 발생 잠재성을 갖는 하나 이상의 종류의 분화된 자손을 생성하고; (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위해 대칭적 세포 분열이 가능한 고형 종양으로부터의 세포의 집단을 나타낸다. "암 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포" 또는 "고형 종양 줄기 세포"의 이러한 특성은 상기 암 줄기 세포에, 종양 형성에 실패한 대부분의 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스로의 일련의 이식시에 감지할 수 있는 종양을 형성하는 능력을 부여한다. 암 줄기 세포는 무질서 방식으로 자가-재생 대 분화를 거쳐 돌연변이가 발생하는 시간에 따라 변화할 수 있는 비정상적인 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 비-종양형성 세포 (종양 세포 집단 덩어리를 포함) 및 종양형성 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 모두를 포함하는 종양으로부터 유래된 세포의 전체 집단을 나타낸다.
본원에 사용된 "종양형성"은 고형 종양 줄기 세포가 종양을 형성하도록 하는, 자가-재생 (추가의 종양형성 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 (분화가 발생하고, 이에 따라 비-종양형성 종양 세포를 발생시킴)의 특성을 비롯한, 고형 종양 줄기 세포의 기능적 특성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 종양의 "종양형성 가능성"은 종양으로부터의 세포의 무작위적인 샘플의, 면역손상된 마우스로의 일련의 이식시에 감지할 수 있는 종양을 형성하는 능력을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포 암 마커" 또는 "암 줄기 세포 마커" 또는 "종양 줄기 세포 마커" 또는 "고형 종양 줄기 세포 마커"는 발현 수준이 단독으로 또는 다른 유전자와 함께 비-종양형성 세포에 비해 종양형성 암 세포의 존재와 서로 관련된 유전자 또는 유전자들, 또는 이들 유전자 또는 유전자들에 의해 발현되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 나타낸다. 이러한 관련성은 유전자의 증가 또는 감소된 발현 (예를 들어, 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 펩티드의 증가 또는 감소된 수준)과 관련될 수 있다.
용어 "암 줄기 세포 유전자 시그너쳐" 또는 "종양 줄기 세포 유전자 시그너쳐" 또는 "암 줄기 세포 시그너쳐"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 다른 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 정상적인 유방 상피 조직에 비해 암 줄기 세포에서 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 유전자 시그너쳐는 정상적인 유방 상피에 비해 암 줄기 세포에서 배수 변화된 수준으로 차등적으로 발현 (예를 들어, 2배 감소된 및/또는 상승된 발현, 이는 또한 통계학적 분석, 예를 들어 다중 샘플에 대한 t-시험의 P 값을 이용하여 한정됨)되는 유전자를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 암 줄기 세포에서 차등적으로 발현되는 유전자는 발현 변화의 배수 또는 백분율과 함께 선택된 유전자와 이들의 발현 사이의 관련성에 기초하여 암 줄기 세포 유전자 시그너쳐로 분류된다. 암 줄기 세포 시그너쳐는 전이 및 사망 등을 비롯한 임상적 가변성의 측면을 과거 또는 장래 둘 모두에 대해 예측한다.
본원에 사용된 용어 "유전자 시험"은 환자 또는 환자 종양 샘플의 유전자 구성을 분석하는 절차를 나타낸다. 이 분석은 임상 목적에 있어서 유전성 또는 체성 질환-관련 유전자형 또는 핵형을 검출하기 위한 DNA, RNA, 염색체, 단백질 또는 대사물질의 검출을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생검" 또는 "생검 조직"은 샘플이 암성 조직을 함유하는지 결정하기 위한 목적으로 대상체로부터 분리되는 조직 또는 체액의 샘플을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 생검 조직 또는 체액은 대상체가 암에 걸린 것으로 의심되기 때문에 수득한다. 이후에, 생검 조직 또는 체액을 암의 존재 또는 부재에 대해 시험한다.
본원에 사용된, 용어 "대상체"는 특정 치료의 수용자가 될 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등 (이에 제한되지 않음)을 비롯한 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체를 참조로 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
"제약상 허용되는"은 인간을 비롯한 동물에서의 사용을 위해 연방 정부나 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능한 것 또는 미국 약전 또는 일반적으로 인식되는 다른 약전에 나열된 것을 지칭한다.
"제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 보조제" 또는 "허용되는 제약 담체"는, 본 개시내용의 1종 이상의 항체와 함께 대상체에 투여될 수 있고, 치료량의 항체를 전달하기에 충분한 투여량으로 투여될 경우 약리 활성을 파괴하지 않으며 비독성인 부형제, 담체 또는 보조제를 지칭한다. 또한, "제약상 허용되는 담체"는 수용 대상체에서 면역 반응을 일으키지 않는다. 예로는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충된 식염수 용액, 물, 및 다양한 오일/물 유화액이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 몇몇 희석제는 포스페이트 완충된 식염수 또는 통상의 (0.9％) 식염수이다.
"제약상 허용되는 비히클"은 본 개시내용의 1종 이상의 항체와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량(therapeutically effective amount/therapeutic effect)"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 소 유기 분자 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 치료 효과를 가지므로, 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양형성 가능성, 종양형성 빈도 또는 종양형성 능력을 감소시킬 수 있거나; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 주변 기관으로의 암 세포 침투, 예를 들어 연조직 및 연골 내로의 암 전파를 억제 또는 중단시킬 수 있거나; 종양 전이를 억제 및 중단시킬 수 있거나; 종양 성장을 억제 및 중단시킬 수 있거나; 암과 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시킬 수 있거나; 이환률(morbidity) 및 사망률(mortality)을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선시킬 수 있거나; 또는 이들의 조합 효과를 나타낼 수 있다. 작용제, 예를 들어 항체가 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/하거나 살생하는 한, 세포증식 억제제 및/또는 세포독성제로서 지칭될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 지연시키고/거나, 증상을 경감시키고/거나 진행을 중단시키는 치료적 수단 및 2) 목적하는 병적 상태 또는 장애의 발생을 예방하거나 지연시키는 예방 또는 방지적 수단을 모두 나타낸다. 따라서, 치료가 필요한 대상은 이미 장애를 앓고 있는 대상; 장애를 갖기 쉬운 대상; 및 장애를 예방해야 하는 대상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 환자가 다음 중 하나 이상을 보일 경우 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된다: 암 세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연조직 및 연골로의 확산을 비롯한 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환률 및 사망률; 및 삶의 질 개선; 종양형성 가능성의 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소; 또는 이들 효과들의 몇몇 조합.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 DNA 또는 RNA (이에 제한되지 않음)를 비롯한, 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 다수의 뉴클레오티드 유닛 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 관련 구조적 변이체)으로 구성된 중합체를 나타낸다. 이 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다
용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체 또는 RNA (예를 들어, rRNA, tRNA)의 생산에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA) 서열을 나타낸다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 전장 폴리펩티드 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 특성 (예를 들어, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 유지되는 한 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다. 이 용어는 또한 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록, 어느 한쪽 말단 상에서 약 1 kb 이상의 거리에 대해 5' 및 3' 말단 둘 모두 상에서 코딩 영역에 인접하여 위치하는 서열 및 구조적 유전자의 코딩 영역을 포함한다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 둘 모두를 포함한다.
용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대한 언급에 사용되는 경우 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 변형되거나, 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래된 것인 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터를 나타낸다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 과다발현되거나 또는 다르게 비정상적으로 발현되는, 예를 들어 비-천연 발생 단편 또는 스플라이싱 변이체로 발현되는 천연 유전자를 발현한다. 본원에서 용어 "재조합 핵산"은 일반적으로 예를 들어 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 사용하여 핵산을 조작함으로써 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태로 본래 시험관내에서 형성되는 핵산을 의미한다. 이러한 방식으로, 상이한 서열의 작동가능한 연결이 달성된다. 따라서, 선형 형태로 단리된 핵산 또는 정상적으로는 연결되지 않는 DNA 분자를 라이게이션시켜 시험관내에서 형성된 발현 벡터는 둘 모두 본 발명의 목적에 있어 재조합된 것으로 여겨진다. 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 유기체에 도입되면, 이는 비-재조합적으로, 즉 시험관내 조작보다는 숙주 세포의 생체내 세포 기작을 이용하여 복제될 것이나, 이러한 핵산은 재조합적으로 생산되면 이후에 비-재조합적으로 복제된다고 하더라도 여전히 본 발명의 목적에 있어 재조합된 것으로 여기는 것으로 이해된다. 이와 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 즉 상기 설명된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 하나의 세포로부터 또다른 세포로 DNA 세그먼트(들)을 전달하는 핵산 분자를 나타내는데 사용된다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파지, 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 발현"은 유전자의 "전사"를 통해 (예를 들어, RNA 폴리머라제의 효소 작용을 통해) RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로, 및 단백질 코딩 유전자의 경우 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로, 유전자에 코딩된 유전 정보를 전환시키는 과정을 나타낸다. 유전자 발현은 이 과정의 다수의 단계에서 조절될 수 있다. "상향-조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 생성물(예를 들어, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 나타내는 한편, "하향-조절" 또는 "저해"는 생산을 감소시키는 조절을 나타낸다. 상향-조절 또는 하향-조절에 연관되는 분자 (예를 들어, 전사 인자)는 각각 "활성화제" 및 "저해제"로 지칭되기도 한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드" 또는 "단백질" 또는 "단백질 단편"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 나탄내다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들어 수소에 결합된 알파 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 나타낸다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가질 수 있으나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. "아미노산 모방체"는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. "아미노산 변이체"는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 또는 연관된 (예를 들어, 천연적으로 인접한) 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 대부분의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 명시된 모든 위치에서, 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서도, 코돈을 기재된 상응하는 코돈 중 또다른 것으로 변경할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 한 종류인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 침묵 변이를 기술한다. 특정 문맥에서 핵산 내 각각의 코돈을 변형시켜 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외) 기능적으로 동일한 분자를 획득할 수 있음을 인식한다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 침묵 변이는 발현 생성물과 관련하여 기재된 서열 내에 내재되어 있지만, 실제 프로브 서열에 관련해서는 그렇지 않다.
아미노산 서열에 관하여, 코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 낮은 비율(％)의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가는, 상기 변경이 화학적으로 유사한 아미노산을 갖는 아미노산의 치환을 생성하는 경우를 포함하는 "보존적으로 변형된 변이체"라고 인식될 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 널리 알려져 있다 (예를 들어, 하기 표 1 참조). 아미노산 변화가 표현형상 침묵할 가능성이 있는 경우에 관한 지침은 또한 문헌 [Bowie et al., 1990, Science 247:1306 1310]에서 찾을 수 있다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 본 발명의 대립유전자에 이외의 것이며, 이들을 배제하지 않는다. 전형적으로 보존적 치환은 다음을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). 나타낸 바와 같이, 변화는 전형적으로 부차적인 성질을 가지며, 예컨대 단백질 폴딩 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환이다.
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본 개시내용 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 부정관사 ("a", "an") 및 정관사 ("the")는 문맥에서 달리 명확히 기술되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
실시양태가 언어 "포함하는"으로 본원에 기재되는 경우, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"의 견지에서 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공된 것으로 이해된다.
본 발명의 특정 실시양태
본 발명은 암을 연구, 진단, 특성화 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 특정 실시양태에서, 본 발명은 Notch 수용체에 결합하는 길항제를 비롯한 작용제, 및 인간 환자에서 종양 성장을 억제하고 암 또는 다른 질환을 치료하는 작용제 또는 길항체를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 약 1427개 아미노산 내지 약 1732개 아미노산을 포함하는 인간 Notch1의 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 2를 포함하는 영역에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 추가 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합한다.
몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch1의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch1 경로의 리간드-유도된 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1의 활성을 억제한다. 다른 실시양태에서, 항체는 Notch1 수용체의 절단을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역 내의 부위에서 Notch1의 절단을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch1의 세포내 도메인 (ICD)의 방출 또는 형성을 억제한다. 다른 실시양태에서, 항체는 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 항체는 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 성장을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 종양의 성장을 억제한다.
특정 실시양태에서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 키메릭 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 단편, 또는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 항체로 암 줄기 세포를 표적화하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 치료적 유효량의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 치료적 유효량의 키메릭 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 치료적 유효량의 인간화 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 치료적 유효량의 인간 항체를 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수를 감소시키고/거나, 종양의 종양형성 가능성을 감소시키고/거나, 종양에서 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킴으로써 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 Notch1 수용체의 활성을 억제하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 유방 종양, 결장직장 종양, 간 종양, 신장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양 및 두경부 종양을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 암의 치료가 필요한 대상체에서 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 키메릭 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 인간화 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료적 유효량의 인간 항체를 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는, 세포독성 잔기에 접합된 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 임의의 측면 및/또는 실시양태 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 항체 치료적 유효량을 방사선 요법과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 임의의 측면 및/또는 실시양태 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태의 항체 치료적 유효량을 화학요법과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 유방 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양, 또는 두경부 종양 (이에 제한되지 않음)을 포함하는 종양으로부터 선택된 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 유전자 시험을 이용하여 치료가 필요한 환자를 확인하고, 상기 환자에게 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 암 줄기 세포 시그너쳐를 검출하는 유전자 시험을 이용하여 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 치료가 필요한 환자를 확인하고, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 i) 분자를 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) 분자가 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 서열 2를 포함하는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) 분자가 서열 2를 포함하는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체의 제조 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
특정 실시양태에서, Notch 수용체, 예컨대 Notch1에 대한 길항제는 세포외적으로 작용하여 Notch 수용체의 기능에 영향을 미치거나 Notch 수용체의 기능을 억제한다. 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 단백질성이다. 몇몇 실시양태에서, Notch1 수용체의 단백질성 길항제는 Notch1 수용체의 세포외 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. Notch1 수용체에 대한 길항제의 세포외 결합은 Notch1 수용체의 고유 활성화 (예를 들어 키나제 활성)를 억제하고/거나 예를 들어 Notch 수용체와 그의 리간드 중 하나의 상호작용을 입체적으로 억제함으로써 Notch 수용체의 신호전달을 억제할 수 있다. 또한, Notch 수용체에 대한 길항제의 세포외 결합은, 예를 들어 Notch 수용체의 내재화 및/또는 Notch 수용체의 세포 표면 트래피킹(trafficking)의 감소에 의해 Notch 수용체의 세포-표면 발현을 하향조절할 수 있다. Notch 수용체에 대한 길항제의 세포외 결합은 Notch 수용체의 절단을 억제하고 Notch의 ICD의 방출을 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시양태에서, Notch 수용체에 대한 길항제는 Notch 수용체에 결합하여, 종양 세포의 증식을 억제하거나, 종양 세포에서 직접적으로 세포 사멸을 일으키거나, 종양 세포의 전이를 방지하는 효과 중 하나 이상을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 접합된 독소, 화학치료제, 방사성 동위원소, 또는 다른 상기 작용제를 통해 세포 사멸을 일으킨다. 예를 들어, Notch 수용체에 대한 항체는 독소에 접합되어, Notch 수용체를 발현하는 종양 세포에서 단백질 내재화에 의해 활성화된다. 다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 통해 Notch 수용체를 발현하는 세포의 세포 사멸을 매개한다. ADCC는 항체의 Fc 부분을 인식하는 작동체 세포에 의해 세포 용해에 관여한다. 다수의 림프구, 단핵구, 조직 마크로파지, 과립구 및 호산구는 예를 들어 Fc 수용체를 가지며 세포용해를 매개할 수 있다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497] 참조). 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 Notch 수용체를 발현하는 세포의 세포 사멸을 일으키는 항체이다. CDC는 항체의 Fc 부분에 대한 혈청 보체의 결합 및 이후의 보체 단백질 캐스케이드의 활성화에 관여하여 세포막 손상 및 최후의 세포 사멸을 초래한다. 항체의 생물학적 활성은 항체 분자의 불변 도메인 또는 Fc 영역에 의해 상당 부분 측정되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams ＆ Wilkins, p. 218 (1984)] 참조). 상이한 부류 및 하위부류의 항체는 이에 대해 상이하며, 동일한 하위부류지만 상이한 종의 항체의 경우도 마찬가지이다. 인간 항체 중에서, IgM은 보체에 결합하는 항체의 가장 효율적인 부류이며, 이어서 IgG1, IgG3, 및 IgG2인 반면, IgG4는 보체 캐스케이드를 활성화하는데 꽤 부족한 것으로 보인다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]; [Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76] 참조). 본 발명에 따라, 목적하는 생물학적 활성을 갖는 상기 부류의 항체가 제조된다.
보체 활성화 및/또는 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는, Notch 수용체에 대한 임의의 특정 항체의 능력이 검정될 수 있다. 관심 세포를 시험관내에서 성장시키고, 표지하고, 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 면역 세포 또는 혈청 보체와 함께 항체를 세포 배양물에 첨가한다. 표적 세포의 세포용해는 예를 들어 용해된 세포로부터의 표지 방출에 의해 검출한다. 사실상, 항체는 보체 및/또는 면역 세포의 공급원으로서 환자 자신의 혈청을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 시험관내 시험에서 보체를 활성화시키거나 ADCC를 매개할 수 있는 항체는 이후 상기 특정 환자에서 치료적으로 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 하나 이상의 작동체 기능을 갖지 않는 항체이다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 항체는 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 활성, 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 작동체 기능을 갖지 않는다.
다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 혈관신생을 억제함으로써 간접적으로 세포 사멸을 일으킬 수 있다. 혈관신생은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정이며, 통상의 성장, 예를 들어 배아 발달, 상처 치유 동안 및 배란에 반응하여 필요한 기초 과정이다. 1 내지 2 mm2 보다 큰 고형 종양 성장은 또한 혈관신생이 종양 세포를 죽이지 않으면서 영양분 및 산소를 공급할 것을 요구한다. 따라서, 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 예를 들어 내피 세포, 평활근 세포, 또는 혈관 집합에 필요한 세포외 매트릭스의 성분을 포함하는, Notch 수용체를 발현하는 혈관 세포를 표적화한다. 다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 혈관 세포 동원, 집합, 유지 또는 생존에 필요한 성장 인자 신호전달을 억제한다.
본 발명은 항체 및 항체 단편 (이에 제한되지 않음)을 비롯한 다양한 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 단리된다. 다른 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 서열 8, 서열 14, 서열 24, 서열 28 또는 서열 32 (나타낸 신호 서열을 갖거나 갖지 않음)의 서열을 포함하는 합성 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명은 각각 서열 10 및/또는 서열 4 (나타낸 추정상의 신호 서열을 갖거나 갖지 않음)로 제공되는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 또한 서열 8, 서열 28 또는 서열 32, 및/또는 서열 14 또는 서열 24를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 8을 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열 14를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 28을 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열 24를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 32를 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열 24를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능의 유의한 효과없이 변화될 수 있다는 것은 당업계에서 인식될 것이다. 이러한 서열 상이함이 고려되는 경우, 단백질 상에 활성을 결정하는 중요한 영역이 존재할 것임을 기억해야 한다. 따라서, 본 발명은 실질적인 활성을 나타내는 폴리펩티드의 변이를 추가로 포함한다. 이러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 유형 치환을 포함한다. 아미노산 변화가 표현형상 침묵할 가능성이 있는 경우에 관한 지침은 문헌 [Bowie, J.U., et al., "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 1990, 247:1306-1310]에서 찾을 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는 (i) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존 또는 비-보존된 아미노산 잔기 (종종 보존된 아미노산 잔기)로 치환되고, 이러한 치환된 아미노산 잔기가 유전 코드에 의해 코딩된 것일 수 있거나 아닐 수 있는 것; 또는 (ii) 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예컨대 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 것; 또는 (iv) 추가의 아미노산이 성숙한 폴리펩티드, 예컨대 리더 서열 또는 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩티드 또는 프로단백질 서열의 정제에 사용되는 서열에 융합되는 것일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 유사체는 본원의 교시 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
하전된 아미노산을 또다른 하전된 아미노산 및 중성 또는 음전하 아미노산으로 치환하는 것은 특히 관심의 대상이다. 후자의 경우 양전하가 감소된 단백질이 생성된다. 응집의 방지는 매우 바람직하다. 단백질의 응집은 활성의 상실을 초래할 뿐만 아니라 제약 제제를 제조할 경우 단백질이 면역성일 수 있기 때문에 문제될 수 있다 (문헌 [Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 1967, 2:331-340]; [Robbins et al., Diabetes 1987, 36:838-845]; [Cleland et al. Crit. Rev. Therapeutic Drug Carreir Systems 1993, 10:307-377] 참조).
물론, 만들어진 아미노산 치환의 수는 본원에 기재된 인자를 비롯한 다수의 인자에 의존한다. 특정 실시양태에서, 임의의 주어진 폴리펩티드에 대한 치환의 수는 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10 또는 3 초과일 것이다..
본 발명의 폴리펩티드는 서열 14의 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열 14의 폴리펩티드에 대해 90％ 이상의 유사성 (어떤 때에는 90％ 이상의 서열 동일성) 및 서열 14의 폴리펩티드에 대해 95％ 이상의 유사성 (어떤 때에는 95％ 이상의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드, 및 또다른 실시양태에서, 서열 14의 폴리펩티드에 대해 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 유사성 (어떤 때에는 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩티드는 서열 8의 폴리펩티드 뿐만 아니라 서열 8의 폴리펩티드에 대해 90％ 이상의 유사성 (어떤 때에는 90％ 이상의 서열 동일성) 및 서열 8의 폴리펩티드에 대해 95％ 이상의 유사성 (어떤 때에는 95％ 이상의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드, 및 또다른 실시양태에서, 서열 8의 폴리펩티드에 대해 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 유사성 (어떤 때에는 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 2개의 폴리펩티드 사이의 "유사성"은 한 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존된 아미노산 치환을 제2의 폴리펩티드의 서열과 비교하여 결정된다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 상응하는 전장 폴리펩티드를 펩티드 합성에 의해 생산하는데 이용될 수 있으며, 따라서, 이 단편은 전장 폴리펩티드의 생산에 있어서 중간체로서 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 단편은 Notch1 수용체 단백질에 결합할 수 있는 단백질의 부분 또는 전부이다. 이 단편은 Notch 수용체 또는 Notch1 수용체의 리간드에 대해 높은 친화도를 갖는다. 특정 융합 단백질의 단편은 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 융합된 폴리펩티드 작용제 또는 길항제의 Notch 결합 도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질 단편이다. 이 친화도는 전형적으로 약 10-11 내지 10-12 M 범위이지만, 이 친화도는 크기가 상이한 단편에 따라 10-7 내지 10-13 M 범위로 상당히 달라질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이 단편은 길이가 약 10 내지 110개 아미노산이며, 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 폴리펩티드 작용제 또는 길항제의 Notch 결합 도메인을 포함한다.
이들 폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로는 해당 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 모이어티는 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 이들 모이어티는 또한 단백질의 임의의 바람직하지 않은 부작용 등을 감소 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티에 대한 개관은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 제조가능하다. 그러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 방법까지 다양하다.
재조합 방법의 몇몇 실시양태에서, DNA 서열은 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성하여 구축한다. 임의로는, 이 서열에 대해 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이를 일으켜, 그의 기능적 유사체를 생성할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Zoeller et al., Proc.-Nat Acad. Sci. USA 1984, 81:5662-5066] 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조하라. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 또다른 방법은 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 이용하는 화학적 합성에 의한 방법일 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드의 설계는, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하고 관심 재조합 폴리펩티드를 생성하도록 할 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 할 수 있다.
단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해서 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 나아가, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 여러 개의 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 이들을 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 함유한다.
일단 (합성, 부위 지정 돌연변이유발, 또는 또다른 방법에 의해) 조립되면, 관심 대상의 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이체 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 목적하는 숙주에서의 단백질 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시킬 것이다. 조립의 적절성에 대해서는 뉴클레오티드 서열분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인가능하다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위해서, 이 유전자를, 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시킨다.
본 발명은 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대한 단리된 항체를 제공한다. 이 항체, 또는 항체 단편은 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역을 특이적으로 인식하는 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 단편을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 이 모노클로날 항체, 또는 그의 단편은 본원에 기재된 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 키메릭 또는 인간화 항체이다. 다른 실시양태에서, 이 모노클로날 항체, 또는 그의 단편은 본원에 기재된 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 인간 항체이다.
이 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체는 본원에 기재된 실험, 진단 및 치료 방법에서 용도가 발견된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 환자 조직 생검, 흉막 삼출물, 또는 혈액 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 Notch1 수용체의 발현을 검출하는데 사용된다. 조직 생검을 절편화한 후, 예를 들어, 면역형광법 또는 면역조직화학을 이용하여, 단백질을 검출할 수 있다. 다르게는, 샘플로부터의 개별 세포를 단리 후, 고정된 세포 또는 살아있는 세포에 대해 FACS 분석으로 단백질 발현을 검출한다. 나아가, 상기 항체를 단백질 어레이 상에서 사용하여, 예를 들어, 종양 세포 상에서, 세포 용해물에서, 또는 여타의 단백질 샘플에서의 Notch1 수용체의 발현을 검출할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 상기 항체를 시험관내 세포 기반 검정 또는 생체내 동물 모델 중 하나에서 종양 세포와 접촉시켜 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 항체는, 치료적 유효량의 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 투여함으로써 인간 환자에서 암을 치료하는데 사용된다.
폴리클로날 항체는 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 멸균 염수 중에 희석 후 항원보강제 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제)와 조합시켜 안정한 에멀젼을 형성하게 한 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin; KLH), 혈청 알부민 등에 임의로 접합시킨 관련 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)을 피하 또는 복강내로 다수회 주사하여 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 염소, 당나귀 등)을 면역화하여 폴리클로날 항체를 일으킨다. 그런 다음, 그렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 상기 폴리클로날 항체를 회수한다. 수집된 혈액을 응고시키고, 혈청을 따라버린 후, 원심분리로 맑게 하고, 항체 역가에 대해 검정한다. 상기 폴리클로날 항체는, 친화도 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있디. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 여타의 적절한 숙주 동물을 상기 기재한 바와 같이 면역화하여, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 림프구에 의한 항체의 생성을 이끌어낸다. 다르게는, 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시키고, 그런 다음 이 세포를 비-융합 림프구 및 골수종 세포로부터 선별할 수 있다. 그런 다음, 면역침전 또는 면역블로팅에 의해, 또는 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 측정되는 선택된 항원에 대한 특이적으로 유도되는 모노 클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 표준 방법 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 이용한 시험관내 배양으로 또는 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 그런 다음, 상기에서 폴리클로날 항체에 대해 기재된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 14에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 8에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 14에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 8에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체 또는 항체 단편이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 결합시키고 RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및 RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 (a) RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체; (b) QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체; 및/또는 (c) FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 (a) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체; (b) GTNNRAP(서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체; 및/또는 (c) ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 이들의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 2008년 8월 7일자로 부다페스트 조약 규정하에 ATCC에 기탁되고 번호 PTA-9405가 부여된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체 52M51을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 52M51의 인간화 버전이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 2008년 10월 15일자로 부다페스트 조약 규정하에 ATCC에 기탁되고 번호 PTA-9549가 부여된 DNA에 의해 코딩된 52M51의 인간화 버전인 "52M51H4L3"이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 52M51의 인간화 버전인 "52M51H4L4"이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 항체 52M51이 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합허가 위해, 상기 언급한 실시양태 및/또는 양태, 및 본원의 다른곳에 기재된 다른 양태/실시양태에 기재된 항체 중 임의의 것과 경쟁하는 항체를 제공한다. 상기 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법도 또한 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 2008년 10월 15일자로 부다페스트 조약 규정하에 ATCC에 기탁되고 번호 PTA-9548이 부여된 DNA에 의해 코딩된 항체 52R43을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 항체 52R43이 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 52R43의 CDR 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 및/또는 6개를 포함하는 항체를 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 52R43과 경쟁하는 항체를 제공한다. 상기 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법도 또한 제공한다.
다르게는, 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해, 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리시키고, 통상적인 절차를 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서, 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이어서, 다르게는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이(E. Coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시킨다. 모노클로날 항체 생성을 위해 숙주 세포를 스크리닝하고 목적하는 특이성을 갖는 항체를 선별한다. 또한, 본원에 기재된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 목적하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 단리시킬 수도 있다 (문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554]; [Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]).
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 이용하여 수많은 상이한 방식으로 추가로 변형시켜, 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을, 예를 들어, 1) 인간 항체의 그러한 영역으로 대체시켜 키메릭 항체를 생성하거나 또는 2) 비-면역글로불린 폴리펩티드로 대체시켜 융합 항체를 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 상기 불변 영역을 절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 나아가, 가변 영역에 대한 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 이용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
보다 일반적으로는, 임의의 항체로부터 본 발명에 유용한 변형된 항체를 수득 또는 유도시킬 수 있다. 나아가, 개시된 변형 항체를 생성하는데 사용되는 부모 또는 전구체 항체, 또는 그의 단편은 뮤린, 인간, 키메릭, 인간화, 비-인간 영장류 또는 영장류화된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서 본 발명의 변형된 항체는 본원에 기재된 바와 같이 변화된 불변 도메인을 갖는 단일 쇄 항체 구축물 (예컨대 미국 특허 제5,892,019호 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것)을 포함할 수 있다. 따라서, 본원의 교시내용에 따라 변형된 이들 유형의 항체 중 임의의 항체는 본 발명에서 상용성 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 단일-쇄 항체의 생성을 위해 기술들을 적합하게 개조할 수 있다 (미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, Notch 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인할 수 있게 하는 Fab 발현 라이브러리의 구축을 위해 방법들을 적합하게 개조할 수 있다 (문헌 [Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281]). 당업계의 기술을 이용하여, (a) 항체 분자의 펩신 소화로 제조된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술파이드 가교를 환원시켜 생성한 Fab 단편, (c) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성한 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 비롯한 (이에 제한되는 것은 아님) 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이디오타입(idiotype)을 함유하는 항체 단편을 제조할 수 있다.
이중특이적 항체 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체인 모노클로날 항체이다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 경우에서, 이 결합 특이성 중 하나는 본 발명의 항원성 폴리펩티드 (Notch1 또는 그의 단편)에 대한 것이고, 제2 결합 표적은 임의의 여타의 항원으로서, 유리하게는 세포 표면 단백질, 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 이중특이적 항체의 재조합적 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 1983, 305:537-539]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열(random assortment)로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 가능성 있는 10개의 상이한 항체 분자의 혼합물을 생성하며, 이 중 오로지 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 이 올바른 분자는 보통 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.
목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합체는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합체 중 적어도 하나에는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 존재할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가 상세사항은 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology 1986, 121:210]에서 찾아볼 수 있다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 또한, 문헌 [Brennan et al., Science 1985, 229:81]에는 무손상 항체를 단백질 분해 방법으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다.
부가적으로, Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하여 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다 (문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med. 1992, 175:217-225]). 이러한 방법은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성에 사용될 수 있다.
또한, 2개 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60]).
본 발명은 또한 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역을 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 2종 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 (예를 들어 동일한 Notch1) 내에 있거나 또는 예를 들어 두 항체가 모두 Notch1 수용체, 및 예를 들어, 1) 백혈구 상의 작동체 분자, 예컨대 T-세포 수용체 (예를 들어 CD3) 또는 Fc 수용체 (예를 들어 CD64, CD32, 또는 CD16) 또는 2) 하기 상세히 기재된 세포독성제를 특이적으로 인식하여 결합할 수 있도록 상이한 분자 상에 있을 수 있다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 일반적이다 (문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]; [Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol., 121:120]; [Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152:5368]; 및 미국 특허 제5,731,168호).
예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이들 중 적어도 하나는 본 발명의 폴리펩티드에서 유래한다. 다르게는, 면역글로불린 분자의 항-항원 아암(arm)을 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체와 결합하는 아암과 조합하여 세포 방어 메카니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포로 지정하는 데 사용될 수 있다. 상기 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA를 결합하는 아암을 보유한다.
이형접합 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이형접합 항체는 2개의 공유 결합 항체로 이루어져 있다. 상기 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 표적 면역 세포로 제안된 바 있다 (미국 특허 제4,676,980호). 항체는, 가교제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 항체와 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역의 결합을 제공하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은, 체액 반응 개시 및 목적하는 종양-연관 항원에 대한 면역글로불린 생성을 유도할 수 있는 임의 유형의 포유동물을 포함하거나 이로부터 유래할 수 있다. 따라서, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 마카크(macaque) 등) 또는 늑대 기원의 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 면역글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간이다. 다른 실시양태에서, 적합한 항체 (통상 비-인간 공급원으로부터 유래됨)의 가변 영역은 결합 특성을 개선시키거나 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 조작되거나 또는 특이적으로 맞추어질 수 있다. 이런 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나, 또는 다르게는 개입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 가변 영역 내부에 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 최소 서열을 함유한 항체이다. 상기 항체를 치료적으로 사용하여 인간 대상체에게 투여하는 경우 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킬 수 있다. 사실상, 인간화 항체는 통상 비-인간 서열이 최소이거나 없는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생성된 항체, 또는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 항체는 인간 항체의 CDR 대신 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR을 사용하여 인간화할 수 있다 (문헌 [Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525]; [Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327]; [Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536]). 인간화 항체를 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형시켜, 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선 및 최적화할 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합한 인간화 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 24에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 서열 28 또는 서열 32에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 서열 24에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역, 및/또는 서열 28 또는 서열 32에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 24의 중쇄 가변 영역 및 서열 28의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 인간화 항체는 서열 24의 중쇄 가변 영역 및 서열 32의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기법을 사용하여 바로 제조할 수 있다. 시험관내 면역화되거나 표적 항원에 대해 유도된 항체를 생산하는 면역화 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)]; [Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 및 미국 특허 제5,750,373호 참조). 또한, 인간 항체는 인간 항체를 발현시키는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (문헌 [Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381]; [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581]). 인간화 항체는 또한 면역화 시, 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 충분한 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 좌위를 함유하는 형질전환 마우스에서 제조할 수 있다. 예를 들어, 키메릭 및 생식-계열 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제시킨다는 것이 기술된 바 있다. 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 상기 생식-계열 돌연변이체 마우스로의 이동은 항원 투여시 인간 항체를 생산할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551]; [Jakobovits et al., 1993, Nature, 362:255-258]; [Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33]; 미국 특허 제5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016호 참조).
다르게는, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산할 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이한다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하므로, 항체의 기능 특성에 기초한 선별은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 야기한다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 단리되었다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리를 구축할 수 있고, 항원 (자가-항원 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체를 단리할 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 인간 항체는 또한 시험관내 활성화 B 세포에 의해 생성될 수 있다 (미국 특허 제5,567,610 및 5,229,275호 참조).
전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역 상에 그래프팅하는 것이 "클래식" 키메릭 항체를 생산할 것임을 알 것이다. 본 출원의 맥락에서, 용어 "키메릭 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득 또는 유도되고 불변 영역 (본 발명에 따라 무손상, 일부 또는 변형될 수 있음)이 제2 종으로부터 수득되는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항원 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스)으로부터일 것이며, 불변 영역은 인간이다. 가변 영역의 면역원성 특이성은 일반적으로 그의 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간 불변 영역은 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다는 인간 대상체로부터 면역 반응을 덜 유발하는 경향이 있다.
중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분 대체에 의해서, 및 필요한 경우, 일부 프레임워크 영역 대체 및 서열 변형에 의해서 변경된다. CDR이 프레임워크 영역을 유도하는 항체로서 동일한 부류 또는 심지어는 아부류의 항체로부터 유도될 수 있지만, CDR은 다양한 부류의 항체로부터, 및 바람직하게는 다양한 종의 항체로부터 유도될 것으로 예상된다. 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 완전 CDR로 대체하여 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또다른 가변 도메인으로 이동시키는 것이 필요하지 않을 수 있다는 것이 강조되어야 한다. 오히려, 항원 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 이들 잔기를 이동시키는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 제5,585,089; 5,693,761; 및 5,693,762호에 설명이 제시되어 있음을 고려하여, 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 통상적인 실험 수행 또는 시행 착오 시험에 의해 당업계에서 정통할 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 본 발명의 변형된 항체는, 적어도 불변 영역 도메인의 하나 이상의 부분이 결실되거나 또는 다르게는 변경되어 목적하는 생화학적 특성 (예컨대, 천연의 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체에 비해 증가된 종양 편재화 또는 감소된 혈청 반감기)을 제공하는 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함할 것임을 알 것이다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3종의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 도메인이 일부 또는 전부 결실된 변형된 불변 영역이 고려된다. 다른 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 또다른 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재한 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)에 의해 대체될 것이다.
이들의 배열 외에도, 불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용균에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증성 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 추가로, 항체는, 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)와 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위를 이용하여, Fc 영역을 통해 세포와 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)를 비롯한 다양한 부류의 항체에 대해 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포 (항체-의존적 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC라 칭함)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해, 염증 매개자의 방출, 태반 이동, 및 면역글로불린 생산의 제어를 포함한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다. 다양한 Fc 수용체 및 수용체 부위가 특정 범위로 연구되었지만, 그의 위치, 구조 및 기능에 관한 알려지지 않은 것들이 여전히 많이 존재한다.
본 발명의 범주를 제한하지는 않지만, 본원에 기재된 바와 같이 변형된 불변 영역을 포함하는 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하고, 이에 따라 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다고 여겨진다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 방법을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 편재화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시켜 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또다른 변형을 이용하여, 항원 특이성 또는 항체 가요성 증가로 인한 편재성 증진을 가능하게 하는 디술파이드 연결 또는 올리고당 모이어티를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 널리 공지된 생화학 또는 분자 공학 기술을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
변형된 항체를 조작하여 CH3 도메인을 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 융합시킬 수 있다는 것을 주목할 것이다. 다른 구축물에서, 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남은 CH3 도메인 (변형되거나 변형되지 않음)이 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 이용하여 힌지 영역에 결합한 적합한 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소를 자유롭고 접근가능하게 하거나, 또는 힌지 영역을 가요성이게 할 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서는 일부 경우에 면역원성으로 판명되며, 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있음을 알아야 한다. 따라서, 구축물에 첨가되는 임의의 스페이서는 비교적 비-면역원성이거나, 또는 심지어 변형된 항체의 목적하는 생화학적 양이 유지될 수 있는 경우에는 완전히 생략되어야 한다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본 발명의 항체는 소수의 또는 심지어는 단일 아미노산의 부분 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시키기에 충분할 수 있고, 이에 따라 종양 편재화가 증가한다. 유사하게, 조절되어야 할 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 CLQ 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능을 남기면서 항체의 선택된 특성 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 게다가, 상술한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역을 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 배열 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위 (예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 파괴하는 것이 가능할 수 있다. 다른 실시양태는 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 바람직한 특성, 예컨대 이펙터 기능을 증진시키거나, 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 예를 들어 종양 침투를 증가시키 위해서는 무손상 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질가수분해 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117] 및 [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 그러나, 이들 단편은 오늘날 통상적으로 상기 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의해 바로 생산된다. 따라서, Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되어 이들로부터 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 대량 생산이 가능하다. 다르게는, 상기 항체 단편은 본원에 개시된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수 있고, 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 당업자에게 명백할 것이다.
특히 항체 단편의 경우, 항체를 변형시켜 그의 혈청 반감기를 증가시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한, 재이용 수용체 결합 에피토프의 항체 단편으로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그로의 혼입, 및 그에 이은 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 이루어질 수 있다
본 발명은 본원에 기재된 키메릭, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또다른 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환이 의미하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 세포독성제에 접합시킨 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 세포독성제로는 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 등을 들 수 있다. 상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법 작용제로는, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 독소루비신, 멜파란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 작용제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 체인 (디프테리아 독소의 비결합 활성 단편), 외독소 A 체인, 리신 A 체인, 아브린 A 체인, 모데신 A 체인, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 다수의 널리 공지된 킬레이터 또는 직접 표지 중 어느 하나를 이용하여 상기 항체를 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re를 비롯한 방사성동위원소에 접합시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 조성물은 약물, 전구약물, 또는 림포카인, 예컨대 인터페론에 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 생성된다. 항체, 및 하나 이상의 소분자 독소 (예컨대, 칼리키마이신, 마이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065) 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 항체는 다른 면역학적 활성 리간드 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)와 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 생성된 분자는 신생물 세포 및 이펙터 세포, 예컨대 T 세포 둘 모두에 결합한다.
유용한 양이 얼마나 얻어졌는지에 관계없이, 본 발명의 항체는 다수의 접합 (즉, 면역접합) 또는 비접합 형태 중 어느 하나로 사용할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 항체는 비접합 또는 "그대로의" 형태로 사용하여 보체 의존 세포독성 (CDC) 및 항체 의존 세포독성 (ADCC)을 포함한 메카니즘을 방어하는 대상체의 특성을 이용하여 악성세포를 제거할 수 있다. 사용시 변형된 접합 또는 비접한 항체의 선별은 암의 유형 및 단계, 보조 요법의 사용 (예를 들어, 화학요법 또는 외부 방사선), 및 환자 상태에 따라 달라질 것이다. 본원에 교시된 내용을 고려하여 이러한 선별이 용이하게 이루어질 수 있음을 알 것이다.
경쟁 검정을 사용하여 두 항체가 동일하거나 입체 구조적으로 겹치는 에피토프를 인식하여 동일한 에피토프를 결합시키는지를 측정할 수 있다. 경쟁적 결합을 측정하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법 (예를 들어, 본원의 다른곳에 기재된 면역검정)을 사용할 수 있다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 이용될 수 있는 면역검정으로는, 이들로 한정되지는 않지만, 비아코어 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블로팅(Western blot) 분석, 방사선면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-고정 검정, 면역방사능 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 들 수 있다. 이러한 검정은 통상적이며, 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
본 발명의 몇몇 실시양태에서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체의 면역특이성은 ELISA를 이용하여 측정된다. ELISA 검정은 항원을 제조하고, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 호스래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제)에 접합시킨 암 줄기 세포 마커에 대한 항체를 웰에 첨가하고, 소정의 기간 동안 인큐베이션하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 다르게는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 검출가능한 화합물에 접합시키지 않고, 대신에 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 인식하는 제2 접합된 항체를 웰에 첨가한다. 추가로, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 웰에 코팅할 수 있고, 검출가능한 화합물에 접합시킨 제2 항체를 코팅된 웰에 첨가한 후, 항원을 첨가할 수 있다. 검출된 신호를 증가시키기 위해 어떠한 파라미터를 변형시킬 수 있는지 뿐만 아니라, 당업계의 공지된 ELISA의 기타 변수도 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York at 11.2.1] 참조).
Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-레이트(off-rate)를 경쟁적 결합 검정으로 측정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예로는, 표지된 항원 (예를 들어, 3H 또는 125I), 또는 그의 단편 또는 변이체를 표지되지 않은 항원의 증가량의 존재하에 관심 항체와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사선면역검정이다. 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체의 친화도 및 결합 오프-레이트를 스캐차드 플롯(Scatchard plot) 분석에 의한 데이터로부터 측정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 비아코어 역학 분석을 이용하여 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체의 결합 온 및 오프 레이트를 측정한다. 비아코어 역학 분석은 그의 표면 상에서 고정된 항원, 예를 들어, Notch1 수용체를 갖는 칩으로부터 항체의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 폴리펩티드를 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대해 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있으며, 여기서 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 포함되고, DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있으며, 단일-가닥인 경우에 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다.
추가로, 본 발명은 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 대립유전자 변이체이거나 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 발생 변이체일 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리펩티드의 코딩 서열의 천연 발생 대립유전자 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열의 또다른 형태이다.
본 발명은 또한, 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 상기 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 서열과 동일한 리딩 프레임에서 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 프리단백질(preprotein)이며, 리더 서열은 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 및 추가 5' 아미노산 잔기인 프로단백질(proprotein)을 코딩할 수 있다. 프로서열(prosequence)을 갖는 성숙한 단백질은 프로단백질이며, 이는 단백질의 불활성화 형태이다. 프로서열이 절단되면, 성숙한 활성 단백질이 남는다. 따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질, 또는 프로서열을 갖는 단백질, 또는 프로서열 및 프리서열(presequence) (리더 서열) 둘 다를 갖는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 가능케 하는 마커 서열에 대한 프레임에서 융합된 코딩 서열을 가질 수 있다. 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는, 예를 들어, 포유류 숙주, 예를 들어 COS-7 세포가 사용되는 경우, 마커 서열은 적혈구응집소 (HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 적혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다 (문헌 [Wilson et al., 1984, Cell 37:767]).
본 발명의 추가 실시양태는 개시된 서열에 대해 90％ 이상의 동일성, 95％ 이상의 동일성, 몇몇 실시양태에서는, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 또는 29에 대해 90％ 이상 동일성인 뉴클레오티드 서열을 가진다 (시그널 서열 있거나 없음). 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 7 또는 13에 대해 90％ 이상 동일성인 뉴클레오티드 서열을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 서열 4, 6, 8, 10, 12, 14, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 30, 31, 또는 32의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 25 또는 29의 폴리뉴클레오티드로 혼성화된다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건하에 혼성화된다.
본원에 사용된 어구 "혼성화하다" 또는 "선별적으로 혼성화하다" 또는 "특이적으로 혼성화하다"는, 서열이 복잡한 혼합물 (예를 들어, DNA 또는 RNA의 라이브러리)로 존재하는 경우에 엄격한 혼성화 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자가 결합 또는 이중화되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization Wiley]을 참조한다.
본원에 사용된 어구 "엄격한 혼성화 조건"은, 프로브가 전형적으로 핵산의 복잡한 혼합물 중에서 그의 표적 하위서열과 혼성화하지만, 다른 서열과는 혼성화하지 않을 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 이는 여러 환경에서 다양할 것이다. 보다 긴 서열이 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도에서 특정 서열에 대한 열융점 (Tm) 보다 약 5 내지 10℃ 낮도록 선택된다. Tm은 표적과 상보적인 프로브의 50％가 평형 상태에서 표적 서열과 혼성화하는 (규정된 이온 강도, pH 및 핵 농도 하에서의) 온도이다 (Tm에서 표적 서열이 과량 존재하는 경우, 프로브의 50％가 평형 상태에서 사용됨). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 나트륨 이온 농도 미만, 통상 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해서는 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대해서는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 고 엄격 혼성화의 경우, 양성 신호는 적어도 2회의 백그라운드 또는 10회의 백그라운드 혼성화이다. 예시적인 고 엄격 또는 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50％ 포름아미드, 5x SSC 및 1％ SDS, 42℃에서 인큐베이션됨, 또는 5x SSC 및 1％ SDS, 65℃에서 인큐베이션됨, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1％ SDS 내 세척. PCR의 경우, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 약 48℃로 다양할 수 있지만, 저 엄격 증폭에 대해서는 약 36℃의 온도가 통상적이다. 고 엄격 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃의 범위일 수 있지만, 고 엄격 PCR 증폭에 대해서는 약 62℃의 온도가 통상적이다. 고 및 저 엄격 증폭 둘 모두에 대한 통상적인 주기 조건은 30 내지 120초 동안 90℃ 내지 95℃의 변성 단계, 30 내지 120초 지속되는 어닐링 단계, 및 1 내지 2분 동안 약 72℃의 연장 단계를 포함한다.
참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95％ "동일성인" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것이 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 95％ 이상 동일성인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 5％ 이하가 결실되거나 또다른 뉴클레오티드와 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 내 총 뉴클레오티드의 최대 5％의 뉴클레오티드가 참조 서열로 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이의 모든 곳 (참조 서열 또는 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 산재됨)에서 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 참조 서열과 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상 동일성인지 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스(Unix)용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재))을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 베스트핏은 문헌 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열 간의 최고의 상동성 세그먼트를 찾는다. 특정 서열이 본 발명에 따른 참조 서열과 예를 들어 95％ 동일성인지 여부를 결정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는 물론, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 수의 5％ 이하의 상동성 차이가 허용되도록 설정된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 변경을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 잠재적 치환, 부가 또는 결실을 생성하는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 활성을 변경하지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 동의성(degeneracy)으로 인한 잠재적 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로 생성되어 (인간 mRNA의 코돈을 이. 콜라이와 같은 박테리아 숙주에 의해 바람직한 코돈으로 변화시킴) 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대한 항체 또는 항체 단편을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열이 단백질의 구조 또는 기능의 현저한 영향 없이 변경될 수 있다는 것은 당업게에 인지될 것이다. 따라서, 본 발명은 실질적인 활성을 나타내거나 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체 또는 항체 단편의 영역을 포함하는 폴리펩티드의 변이체를 추가로 포함한다. 이러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복 및 유형 치환을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 단리된 형태로 제공되고, 때때로 균일하게 정제된다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 생산할 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법에서 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하고 적합한 형질전환 숙주에서 이러한 서열을 발현시키는 DNA 서열의 구축에 이른다. 예를 들어, cDNA는 폴리펩티드 (예를 들어, 뉴클레오티드 서열 1)를 코딩하고 방사선 사진 촬영술에 의해 양성 클론을 확인하는 표지된 DNA 단편으로 인간 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 얻을 수 있다. 플라크(plaque) 정제 및 혼성화의 추가 과정은 통상적인 방법을 사용하여 실행한다.
재조합 방법의 몇몇 실시양태에서, DNA 서열은 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리하거나 합성하여 구축한다. 임의로는, 상기 서열은 부위-특이적 돌연변이생성에 의해 돌연변이를 일으켜 이들의 기능적 유사체를 제공할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Zoeller et al., 1984, Proc.-Nat Acad. Sci. USA, 81:5662-5066] 및 미국 특허 제4,588,585호 참조). 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 또 다른 방법은 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 사용하는 화학적 합성에 의한 것일 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기재로 하고 숙주 세포에서 선호되는 그러한 코돈을 선택하도록 설계될 수 있으며, 이는 관심 재조합 폴리펩티드를 생산할 것이다.
표준 방법을 적용하여 관심 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정 단리된 폴리펩티를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 몇몇의 작은 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 이들을 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보성 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 함유한다.
일단 (합성, 부위-지정 돌연변이생성 또는 또 다른 방법)에 의해 조립되면, 관심있는 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 변이체 DNA 서열은 발현 벡터에 삽입되고 목적하는 숙주에서의 단백질의 발현에 적절한 발현 제어 서열을 작동가능하게 연결할 것이다. 적절한 조립체는 뉴클레오티드 서열분석, 제한 매핑(mapping) 및 적합한 숙주에서 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 숙주 내에서 높은 발현 수준의 형질감염 유전자를 얻기 위해서, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능하는 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다.
암 줄기 세포 마커 폴리펩티드 융합체를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시키기 위해 재조합 발현 벡터를 사용한다. 재조합 발현 벡터는 포유류, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래한 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 암 줄기 세포 마커 폴리펩티드 융합체 또는 생물학적으로 동등한 유사체를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유도 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물이다. 하기 상세히 기재된 바와 같이, 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 수행하는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 이러한 조절 요소는 전사를 제어하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 보통 복제 원점에 의해 수여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하기 위한 유전자의 선택을 추가로 혼입할 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 관련되어 있을 때 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 시그널 펩티드 (분비 리더)의 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터가 서열의 전사를 제어하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위가 번역을 허용하도록 위치하는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동적으로 연결된다는 것은 접해있는 것을 의미하고, 분비 리더의 경우에는, 접해있고 리딩프레임 내에 있는 것을 의미한다. 효모 발현 시스템에 사용하고자 하는 구조 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다르게는, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 상기 잔기는 임의로는 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 따라 좌우될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합을 이용할 수 있다. 진핵세포 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, SV40, 보빈 파필로마 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 포함한 에스케리키아 콜라이(Esherichia coli)로부터의 플라스미드, 및 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 섬유상 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다.
암 줄기 세포 마커 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 원핵세포, 효모, 곤충 또는 고등 진핵세포를 포함한다. 원핵세포는 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스를 포함한다. 고등 진핵세포는 하기 기재된 포유류 기원의 확립 세포주를 포함한다. 세포-무함유 번역 시스템을 또한 이용할 수 있다. 박테리아, 균, 효모, 및 포유류 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 파월스(Pouwels) 등에 의해 기재되어 있으며 (문헌 [Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985]), 그의 관련 개시는 본원에 참조로 인용한다.
다양한 포유류 또는 곤충 세포 배양 시스템을 또한 유리하게 이용하여 재조합 단백질을 발현시킨다. 재조합 단백질은 일반적으로 올바르게 접혀지고, 적절히 변경되고, 완전하게 기능하기 때문에, 포유류 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 실시될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예는 문헌 [Gluzman, 1981, Cell, 23:175]에 기재된 COS-7 계통의 원숭이 신장 세포주, 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 포함한 적절한 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주를 포함한다. 포유류 발현 벡터는 비전사 요소, 예컨대 복제 원점, 발현시키고자 하는 유전자에 연결된 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 기타 5' 또는 3' 플랭킹(flanking) 비전사 서열, 및 5' 또는 3' 비번역 서열, 예컨대 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스(splice) 공여 및 수용 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47]에 의해 개괄되어 있다.
형질전환 숙주에 의해 생산되는 단백질은 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 이러한 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기법에 의한 것을 포함한다. 친화도 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착하여 적절한 친화도 컬럼을 통과시켜 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질 분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기법을 사용하여 물리적으로 특성화할 수 있다.
예를 들어, 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용하여 재조합 단백질을 배양 매질로 분비하는 시스템으로부터의 상청액을 먼저 농축시킬 수 있다. 농축 단계에 이어, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 다르게는, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 펜던트형 디에틸아미노에틸 (DEAE)기를 갖는 매트릭스 또는 기질을 이용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로오스 또는 단백질 정제에 보통 이용되는 다른 유형일 수 있다. 다르게는, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환제는 술포프로필기 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 마지막으로, 소수성 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 매질, 예를 들어, 펜던트형 메틸기 또는 기타 지방족 기를 갖는 실리카겔을 이용하는 하나 이상의 RP-HPLC 단계를 이용하여 재조합 단백질 또는 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 상기 정제 단계 중 전부 또는 일부를 또한 다양한 조합으로 이용하여 균일한 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
박테리아 배양에서 생산되는 재조합 단백질은 보통 세포 펠렛으로부터의 초기 추출에 의해 단리한 후, 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 사이즈 배제 크로마토그래피 단계를 거친다. 마지막 정제 단계를 위해 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용할 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용을 포함한 임의의 통상적인 방법으로 파괴시킬 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 암 줄기 세포 마커의 길항제를 사용하여 암 줄기 세포 마커를 발현시키는 종양형성 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커, 예를 들어 Notch1 수용체를 발현시키는 종양형성 세포의 성장 억제 방법은 세포를 암 줄기 세포 마커에 대한 길항제와 시험관내 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커를 발현시키는 불멸화 세포주 또는 암 세포주를 세포 성장을 억제하기 위해 발현된 암 줄기 세포 마커의 길항체가 첨가된 배지내에 배양한다. 몇몇 실시양태에서, 종양 줄기 세포를 포함하는 종양 세포를 환자 샘플 예를 들어, 조직 생검, 흉막 삼출물, 또는 혈액 샘플로부터 단리하고 세포 성장을 억제하기 위해 암 줄기 세포 마커의 길항제가 첨가된 배지에 배양한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 암 줄기 세포 마커 단백질의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체이다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커 단백질에 대한 항체는 세포 성장을 억제하기 위해 단리된 암 줄기 세포의 배양 배지에 첨가할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커를 발현시키는 종양형성 세포의 성장 억제 방법은 세포를 암 줄기 세포 마커에 대한 길항제와 생체내 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Notch1을 발현시키는 종양형성 세포의 성장 억제 방법은 세포를 인간 Notch1 수용체의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합된 항체와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1의 활성을 억제하여 종양형성 세포의 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 리간드-유도 Notch1 신호전달을 억제하여 종양형성 세포의 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1의 절단을 억제하여 종양형성 세포의 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 종양 내 암 줄기 세포의 빈도 또는 개수를 감소시켜 종양형성 세포의 성장을 억제한다.
특정 실시양태에서, 종양형성 세포를 암 줄기 세포 마커에 대한 길항제와 접촉시키는 것은 동물 모델에서 착수한다. 예를 들어, 암 줄기 세포 마커를 발현시키는 이종이식은, 암 줄기 세포 마커에 대한 길항제를 투여한, 면역력이 약화된 마우스 (예를 들어 NOD/SCID 마우스)에서 성장시켜 종양 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커를 발현시키는 암 줄기 세포는 환자 샘플, 예를 들어, 조직 생검, 흉막 삼출물, 또는 혈액 샘플로부터 단리되고 면역력이 약화된 마우스에 주사한 후, 암 줄기 세포 마커에 대한 길항제를 투여하여 종양 세포 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커의 길항제는 종양형성 세포의 동물로의 도입과 동시에 또는 그 직후에 투여하여 종양 성장을 억제한다. 다른 실시양태에서, 암 줄기 세포 마커에 대한 항체는 종양형성 세포가 지정된 크기로 성장한 후에 치료제로서 투여한다.
본 발명은 암 줄기 세포 마커를 표적화한 항체, 폴리펩티드 또는 기타 작용제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 이들 제약 조성물은 종양 성장, 종양 세포 성장을 억제하고, 인간 환자에서 암을 치료하는 데 사용되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 정제된 길항제 (예를 들어, 항체)를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체, 부형제 등)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위한 제형을 제조한다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000]). 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 염, 예컨대 나트륨 클로라이드; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체, 예컨대 Zn-단백질 착체; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 예컨대 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액제 및 산제를 이용한 (예컨대, 질 및 직장 전달을 포함한 점막으로의) 국부 투여; 예컨대 산제 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의한 (예를 들어, 네뷸라이저에 의한 것을 포함함) 폐투여, 기관내, 비내, 상피 및 경피 투여; 경구 투여; 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복강내, 또는 근육내 주사 또는 투입을 포함한 비경구 투여; 또는 두개내, 예컨대 경막내 또는 뇌실내 투여일 수 있다.
치료 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형으로는 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 투여용 정제, 환제, 캡슐, 산제, 입제, 물 또는 비-수성 매질 내 액제 또는 현탁액제, 또는 좌제를 들 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주 활성 성분을 제약 담체와 혼합한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유한 고체 사전-제형화(preformulation) 조성물을 형성하는 통상적인 정제화 성분으로는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 기타 희석제 (예를 들어, 물)를 들 수 있다. 이어서, 상기 고체 사전-제형화 조성물을 본원에 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분화한다. 신규 조성물의 정제, 환제 등을 코팅하거나 다르게는 배합하여 지속 작용의 이점을 주는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 두 성분을, 붕해에 내성이 있어 내부 성분이 손상 없이 위를 통과하게 하거나, 또는 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층(enteric layer)에 의해 분리할 수 있다. 다양한 물질을 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용할 수 있고, 이러한 물질로는 다수의 중합체 산, 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 들 수 있다.
제약 제형에는 리포솜과 복합체를 형성한 본 발명의 항체가 포함된다 (문헌 [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030]; 및 미국 특허 제4,485,045 및 4,544,545호). 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 제 5,013,556호에 개시되어 있다. 몇몇 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 규정된 공극 크기의 필터를 통해 추출하여 목적하는 직경을 가진 리포솜을 생성한다.
항체는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 기재된 바와 같은 매크로에멀젼에서 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된다.
또한, 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예로는 항체를 함유한 고형 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 들 수 있고, 여기서 상기 매트릭스는 성형품의 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 지속-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올), 폴리액티드 (미국 특허 제 3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포 TM(LUPRON DEPOT TM) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사용 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다. 몇몇의 실시양태에서, 항체는 암 줄기 세포 마커에 대한 세포의 발현 및/또는 증가된 반응성을 특징으로 하는 다양한 상태를 치료하는데 사용될 수 있을 것이다. 특히, 암 줄기 세포 마커, 예를 들어 Notch1에 대한 항체는 신장, 간, 방광, 유방, 위, 난소, 결장, 직장, 전립선, 폐, 외음부, 갑상선, 두경부, 뇌의 양성 및 악성 종양 (교모세포종, 성상세포종, 수모세포종 등), 혈액 및 림프의 양성 및 악성 종양 (백혈병 및 림프종)을 포함하나 이에 제한되지 않는 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있을 것이다.
몇몇 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체 또는 기타 작용제 및 화학요법제 또는 다수의 상이한 화학요법제들의 칵테일의 조합 투여를 포함한다. 항체로의 치료는 화학요법제의 투여 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 일어날 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 화학요법제는 당업계에 공지되고 상업적으로 입수가능한 화학 물질 및 약물, 예컨대 독소루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜파란, 빈블라스틴 및 카르보플라틴을 포함한다. 조합 투여는 단일 제약 제형물로의 또는 별도의 제형물들을 사용하는 공투여, 또는 임의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성 작용제들이 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있는 시간 내인 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투여 스케줄은 제조업자의 지시 또는 경험적으로 결정된 바에 따라 사용될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법을 위한 제제 및 투여 스케줄은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, Md. (1992)]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (사이톡산); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포프아민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology; 미국 뉴저지주 프린스턴 소재)) 및 독세탁셀 (탁소테르(Taxotere), 론-폴렝 로레르(Rhone-Poulenc Rorer; 프랑스 안토니 소재)); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플로오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 화학요법제는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케톡시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(Fareston))을 비롯한 항-에스트로겐; 및 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린을 비롯한 항-안드로겐; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCL, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCL, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물질이다. 항대사물질은 정상적인 생화학 반응에 요구되는 대사물질과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물질은 젬시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 사이토신 아라비노시드, 티오구아닌(글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline)), 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 및 또한 임의의 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체 또는 다른 작용제 및 방사선 요법의 조합 투여를 포함한다. 항체로의 치료는 방사선 요법의 적용 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 일어날 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대해, 숙련된 전문가에 의해 결정된 임의의 투여 스케줄이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체와, EGF 수용체 (EGFR) (에르비툭스(Erbitux)®), erbB2 수용체 (HER2) (헤르셉틴(Herceptin)®) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (아바스틴(Avastin)®)에 결합하는 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 종양 연관 항원에 대한 다른 항체의 조합 투여를 포함할 수 있다. 또한, 치료는 하나 이상의 사이토카인의 투여를 포함할 수 있고, 암 세포의 외과적 제거 및/또는 치료의에 의해 필요한 것으로 여겨지는 임의의 다른 치료법이 동반될 수 있다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 항체 또는 기타 작용제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 종류, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 항체가 치료를 위해 투여되는지 아니면 예방 목적을 위해 투여되는지, 이전 요법 및 환자의 임상 이력 등에 따라 좌우되지만, 이들 모두는 치료의의 판단에 따른다. 항체 또는 작용제는 한번에, 또는 수 일 내지 수 개월 동안 지속하는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유되거나 질환 상태의 축소(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케줄은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있으며, 개별 길항제의 상대 역가에 따라 변화할 것이다. 투여의는 최적의 투여량, 투여 방법론 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 kg당 0.01 μg 내지 100 mg이며, 매일, 매주, 매달 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 치료의는 체액 또는 체조직 내에서의 항체 또는 작용제의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여를 위한 반복 속도를 추정할 수 있다.
본 발명은 본원에 기재된 항체를 포함하고 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 암 줄기 세포 마커에 대한 하나 이상의 정제된 항체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대한 하나 이상의 정제된 항체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 항체 52M51 또는 52M51의 인간화 변이체를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 항체 52R43을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는, 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 분석 및 결과의 표시를 위한 임의의 분석용 소프트웨어를 비롯한, 검출 검정을 수행하기 위해 필수이고/이거나 충분한 성분을 함유한다. 당업자는 개시되어 있는 본 발명의 항체가 당업계에 잘 알려져 있는 설정된 키트 포맷들 중 하나 내에 용이하게 도입될 수 있음을 잘 알 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역과 함께 인큐베이션하고, ii) 분자가 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 결합하고 있는지를 측정하고, iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지를 측정하는 것을 포함하는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 결합하고 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자는, 폴리펩티드 및 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 스크리닝은 시험관내에서 수행된다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 발현하는 세포를 표지된 분자와 함께 인큐베이션하고, FACS 분석에 의해 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 표지된 분자의 특이적 결합을 측정한다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 파지 디스플레이에 의해 발현시키고, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 확인한다. 인간 Notch1 수용체의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 확인하는 다른 적합한 방법은, ELISA, 웨스턴 (또는 면역) 블로팅 및 효모 2 잡종법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이어서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 종양 세포 성장의 억제에 대해 시험된다. 시험은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 시험관내에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 배양물 중 종양 세포와 함께 인큐베이션하고, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자의 존재하의 종양 세포의 증식을 측정하고, 비-결합 대조군 분자와 인큐베이션한 종양 세포와 비교한다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 생체내에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서는, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 동물 이종이식 모델에 주사하고, 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 분자로 처리된 동물 내의 종양의 성장을 측정하고, 비-결합 대조군 분자로 처리된 동물과 비교한다.
실시예
실시예 1
Notch1의 비-리간드 결합 영역, 구체적으로 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 생성하였다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch1 세포외 도메인의 재조합 폴리펩티드 단편을 항체 생성을 위한 항원으로서 생성하였다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 Notch1 아미노산 1427-1732의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 1)를 단리하였다. 상기 폴리뉴클레오티드를 인-프레임 N-말단이 인간 Fc-tag 및 히스티딘-tag에 개별적으로 라이게이션하고, 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 중재 발현을 위해 전달 플라스미드 벡터로 클로닝하였다. 표준 형질감염, 감염 및 세포 배양 프로토콜을 이용하여 아미노산 1427-1732를 포함하는 멤브레인 인접 영역에 상응하는 Notch1 폴리펩티드 (서열 2)를 발현하는 재조합 곤충 세포를 생산하였다 (문헌 [O'Reilly et al., 1994, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press]).
Notch1 멤브레인 인접 영역 (Notch1 아미노산 1472-1732) 폴리펩티드를 당업자에게 공지된 단백질 A 및 Ni++-킬레이트 친화도 크로마토그래피를 사용하여 곤충 세포 용해물로부터 정제하였다. 정제된 Notch1 멤브레인 인접 영역 폴리펩티드를 PBS (pH=7)에 대하여 투석하고, 대략 1 mg/ml로 농축하고, 면역화의 준비로 멸균 여과하였다.
마우스 (n=3)를 표준 기술을 이용하여 정제된 Notch1 항원 단백질 (안티바디 솔루션즈(Antibody Solutions; 미국 캘리포니아 마운틴 뷰 소재))로 면역화하였다. 개별 마우스로부터의 혈액을 ELISA 및 FACS 분석 (본원에 상세히 기재함)을 이용하여 항원 인식을 위한 최초 면역화 이후 대략 70일 동안 스크리닝하였다. 가장 높은 항체 역가를 갖는 동물 2마리를 최종 항원 부스트를 위해 선별하고, 그 후, 비장 세포를 하이브리도마 생성을 위하여 단리하였다. 하이브리도마 세포를 96 웰 플레이트에서 웰 당 1개 세포로 플레이팅하고, 각 웰로부터의 상청액을 Notch1 멤브레인 인접 영역 폴리펩티드에 대한 ELISA 및 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다. 고 항체 역가를 갖는 몇몇 하이브리도마를 선별하고, 정적 플라스크 배양으로 규모를 증대하였다. 항체를 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 상청액으로부터 정제하였다. 정제된 모노클로날 항체를 본원이 기재된 바와 같이 다시 FACS에 의해 시험하였다. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역을 인식하는 몇몇의 항체를 단리하였다. 항체 52M51을 발현시키는 하이브리도마 세포주는 2008년 8월 7일자로 부다페스트 조약 규정하에 ATTC에 기탁되고 ATCC 특허 기탁 지정번호 PTA-9405가 부여되었다. 뉴클레오티드 및 항체 52M51의 중쇄 (서열 9 및 10) 및 경쇄 (서열 3 및 4) 둘 다의 예측된 단백질 서열을 측정하였다.
인간 항체
별법의 실시양태에서, Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 특이적으로 인식하는 인간 항체는 파지 디스플레이 기법을 사용하여 단리한다. 특정 실시양태에서, 인간 항체 가변 도메인을 함유하는 합성 항체 라이브러리는 본원에 기재된 Notch 수용체 항원의 특이적이고 고 친화도 인식을 위해 스크리닝한다. 특정 실시양태에서, 인간 Fab 파지 디스플레이 라이브러리는 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 포함하는 일련의 재조합 단백질을 사용하여 스크리닝한다. 간략하게, 1회차에 2x1013개의 Fab 디스플레이 파지 입자를 (수동적으로 고정화된) 재조합 단백질과 함께 인큐베이션하고, 비-특이적 파지를 세척 제거한 후, 특이적 파지를 저 pH (세포) 또는 DTT (재조합 단백질)로 용리시켰다. 용리된 방출물을 사용하여 TG1 F+ 박테리아로 감염시키고, 헬퍼 파지로 구제한 후, IPTG (0.25 mM)로 Fab 디스플레이를 유도하였다. 상기 과정을 2번의 추가 회차 동안 반복한 후, 3회차는 수동적으로 고정화된 항원 (5 μg/ml)에 대해 ELISA로 스크리닝한다.
라이브러리 내의 CDR 카세트는 항체 최적화를 위한 독특한 플랭킹 제한 부위를 통해 특이적으로 교환한다. 이어서, 최적화된 인간 가변 영역을 CHO 세포 내의 인간 항체의 발현을 위한 인간 IgG1 중사슬 및 카파 경사슬을 함유하는 Ig 발현 벡터로 클로닝한다.
에피토프 매핑
Notch1 수용체 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역을 특이적으로 인식하는 항체를 확인하기 위하여, 에피토프 매핑을 실행한다. 특정 실시양태에서, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 세포외 Notch1 도메인의 단편을 Fc 융합 단백질로 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 CMV 프로모터 상단부를 포함하는 포유류 발현 플라스미드 벡터를 생성한다. 특정 실시양태에서, 비-리간드 결합 영역 항체의 52M 시리즈의 에피토프 매핑은 일련의 융합 단백질 및 약 아미노산 1427 내지 약 아미노산 1732의 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역의 결실을 사용하여 수행한다. 상기 재조합 융합 단백질은 일시적으로 형질감염된 HEK 293 세포에서 발현시키고, ELISA를 위해 이로부터 제어된 배지를 형질감염 후 24시간 내지 48시간 수집한다.
특정 실시양태에서, 각각의 항-Notch 항체에 의해 인식되는 도메인을 검출하기 위해 Notch1 융합 단백질 단편을 SDS-PAGE 겔 상에 분리하고 항-Fc 항체 둘 다로 프로브하여 항-Notch1 항체에 대한 모든 융합 단백질의 존재를 검출한다.
Notch1에 대한 항체에 의해 인식되는 세포외 도메인 내의 특이적 에피토프를 확인하기 위해, SPOT 시스템을 사용한다 (시그마 지노시스(Sigma Genosys; 미국 텍사스주 더 우드랜즈 소재)). 하나의 아미노산에 의해 중복되고 전체 Notch1 세포외 도메인을 포함하는 일련의 10-잔기 선형 펩티드를 SPOT 합성 기법에 의해 합성하고 셀룰로오스 멤브레인에 공유 결합시킨다. 멤브레인은 완충제를 차단하면서 실온에서 8시간 동안 사전 인큐베이션하고 4℃에서 밤새 항체와 혼성화한다. 이어서, 멤브레인을 세척하고, 양고추냉이 과산화효소 (HRP) (아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재))에 접합된 2차 항체와 함께 인큐베이션하고, 재세척하고, 3-아미노-9-에틸카르바졸 함유 신호 발생 용액으로 가시화한다. 이에 따라, 항체에 의해 인식되는 특이적 에피토프를 측정한다.
키메릭 항체
Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 도메인을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 확인한 후, 상기 항체를 설치류 항체가 치료제로서 사용되는 경우의 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 면역 반응을 극복하기 위하여 변경하였다. 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 하이브리도마 세포로부터 RT-PCR에 의해 단리하고, 포유동물 발현 벡터에서 각각 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 인-프레임 라이게이션하였다. 다르게는, 동일한 플라스미드 상에 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 함유하는 인간 Ig 발현 벡터, 예컨대 TCAE 5.3을 사용하였다 (문헌 [Preston et al., 1998, Infection ＆ Immunity 66:4137-42]). 이어서, 키메릭 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 키메릭 항체 생성을 위하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로 공동-형질감염시켰다. 키메릭 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 부모의 뮤린 항체와 비교하였다.
인간화 항체
키메릭 항체 치료제가 여전히 빈번히 항원성이어서 인간 항-키메릭 항체 (HACA) 면역 반응을 생성하기 때문에, Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 대한 키메릭 항체는 추가의 인간화를 요구할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위하여, 상기 기재된 키메릭 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 3개의 짧은 초가변 서열 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각 인간 중쇄 및 경쇄 서열의 가변 도메인 프레임워크로 조작한 후, CHO 세포에서의 발현를 위한 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 인간화 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 부모의 키메릭 항체와 비교하였다. 추가로, 인간화 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하기 위하여 가변 영역의 위치-지정 또는 고-밀도 돌연변이유발을 이용할 수 있다.
실시예 2
인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 인간화 항체를 생성하였다. 문헌 [Larrick, J.M., et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160: 1250] 및 [Jones, S.T. & Bendig, M.M., 1991, Bio/Technology 9: 88]에 기재된 바와 같이 뮤린 모노클로날 항체 52M51의 가변 도메인을 단리하고 본질적으로 퇴화된 PCR을 사용하여 하이브리도마주로부터 서열분석하였다. 이어서, 모 52M51 항체 아미노산 서열과 구조적으로 유사할 가능성이 있는 인간 중쇄 및 경쇄 가변 프레임워크 영역을 기준 인간 프레임워크 영역으로 고려하여 신규한 합성 프레임워크의 설계를 안내하도록 도왔다. 52M51 뮤린 프레임워크와 유사성을 갖는 인간 프레임워크 영역을 확인하기 위해, 52M51의 VH 및 VL 뮤린 가변 도메인에 의해 코딩된 예측된 단백질 서열을 젠뱅크(Genbank)에 기탁된 인간 서열에 대해 블라스트(BLAST) 검색을 사용하여 발현된 인간 cDNA에 의해 코딩된 인간 항체 서열과 비교하였다. 상기 방법을 사용하여, 중쇄 프레임워크 설계에서의 추가 분석을 위해 발현된 인간 cDNA 서열 (예를 들어 젠뱅크 DA975021, DB242412) 및 배선 Vh 도메인 (예를 들어 IGHV1-24)을 선별하였다. 유사하게, 발현된 인간 cDNA 서열 (예를 들어 젠뱅크 CD709370, CD707373) 및 배선 Vl (예를 들어 IGLV7-46, IGLV8-61)을 경쇄 플레임워크 설계에서 고려하였다.
후보 인간화 프레임워크 중쇄와 모 뮤린 모노클로날 항체 52M51 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인 사이의 아미노산 차이는 중요한 것으로 평가되었고, 각각의 위치의 차이가 적절한 접힘 및 가변 도메인의 기능에 기여하는지 여부를 판단하였다. 이러한 분석은 다른 항체 단편의 해석 결정 구조의 시험에 따랐다 (예를 들어, 문헌 [Trakhanov et al, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 1999, 55:122-28]에 기재된 Fab 2E8의 구조, 및 다른 단백질 결정 구조 (예를 들어, 단백질 데이터 은행 구조 1ADQ 및 1GIG)). Jmol, quick PDB, 및 Pymol을 포함한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 구조를 모델링하였다. β-시트 프레임워크의 패킹에 대한 주어진 위치에서의 아미노산의 잠재적 영향, 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인 사이의 상호작용, 아미노산 측쇄의 용매 노출 정도, 및 아미노산이 CDR 루프 위치에 영향을 줄 가능성을 고려하였다. 이러한 분석으로부터, 인간 IgG2 불변 영역에 대한 인-프레임 융합된 9개의 후보 VH 사슬 및 인간 IgLC1 불변 영역을 갖는 인-프레임 융합된 8개의 후보 Vl 사슬을 고려하여 화학적으로 합성하였다. 후보 중쇄는 i) 천연 인간 프레임워크를 닮도록 설계된 합성 프레임워크 및 ii) 모 52M51 뮤린 항체 CDR을 포함한다.
각 후보 변이체 인간화 중쇄 및 경쇄의 기능성을 포유류 세포로의 혼합형질감염에 의해 시험하였다. 상기 기재된 9개의 후보 인간화 52M51 중쇄 각각을 뮤린 52M51 경쇄 cDNA로 HEK 293 세포로 혼합형질감염시키고, 제어 매질을 Notch1 결합 활성에 대해 ELISA로 검정하였다. 가장 확고한 결합을 나타내는 52M51 중쇄 변이체를 선별하였다. 상기 변이체 "52M51-H4" (서열 22)는 예를 들어 인간 프레임워크 (예를 들어 IGHV1-24)와 비교하여 Vh 프레임워크 내의 3 프레임워크 위치, 카밧(Kabat) 위치 20, 48 및 71에서, 뮤린 CDR 이외에 변이를 함유한다. 이어서, 52M51-H4 인간화 중쇄를 8개의 후보 인간화 경쇄 각각으로 HEK293 세포로 혼합형질감염시키고, 제어 매질을 항원 결합에 대해 다시 ELISA로 검정하였다. 2개의 경쇄 변이체 "2M51 L3" (서열 26) 및 "52M51 L4" (서열 30)가 다른 후보들보다 양호한 결합을 나타내는 것으로 발견되었고, 추후 연구를 위해 이들을 선별하였다. 변이체 52M51-L3은 예를 들어 인간 프레임워크 (예를 들어, IGLV7-46)와 비교하여 1 프레임워크 위치에서 카밧 위치 49에서 뮤린 CDR 이외에 변이를 함유한다. 2개의 인간화 변이체 항체 52M51H4L3 및 52M51H4L4가 생성되었다. 52M51H4L3은 2008년 10월 15일자로 부다페스트 조약 규정하에 ATCC에 기탁되고 지정 번호 PTA-9549가 부여된 DNA로 코딩되었다.
인간 및 마우스 Notch1에 대한 친화력을 비아코어(Biacore) 2000 기계를 사용하여 측정하였다. 간략하게, 재조합 인간 및 마우스 Notch1 단백질을 표준 아민 기재 화학반응 (NHS/EDC)을 사용하여 CM5 칩상에 고정화하였다. 상이한 항체 농도를 단백질 표면 위에 주사하고 동역학 데이터를 시간에 걸쳐 수집하였다. 상기 데이터를 전체 피팅 연립 방정식을 사용하여 피팅하여 각 Notch1에 대한 해리 상수 (KD, nM)를 수득하였다 (표 2).
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실시예 3
Notch 수용체 신호전달
특정 실시양태에서, Notch1 수용체 항체의 리간드-메개된 Notch 신호전달을 차단하는 능력을 측정하였다. 특정 실시양태에서, DMEM에서 배양된 과발현 Notch1 (Notch1-Hela)을 유전자조작한 HeLa 세포를 항생 물질로 보충하고 10％ FCS를 1) DLL4 리간드에 반응하는 Notch 신호전달 수준을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 Notch 반응성 프로모터 상단부를 함유하는 pGL4 8X CBS 반딧불이 루시페라제; 및 2) 형질감염율의 내부 대조군으로서의 레닐라(Renilla) 루시페라제 리포터 (프로메가(Promega; 미국 위스콘신주 매디슨 소재))로 혼합형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 밤새 200 ng/well의 hDLL4-fc 단백질로 코팅된 배양 플레이트에 첨가한 후, Notch1에 대한 항체를 세포 배양 배지에 첨가하였다. 형질감염 48시간 후, 반딧물이 루시페라제 활성을 레닐라 루시페라제 활성으로 표준화한 이중 루시페라제 검정 키트 (프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨 소재))를 사용하여 반딧물이 루시페라제 활성을 측정하였다. 이에 따라, Notch1 경로 활성화를 억제하는 항체의 능력을 측정하였다. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역 (도 1A)에 대해 생성된 항체 52M51, 52M63, 52M74 및 52M80은 다른 Notch1 항체와 비교하여 루시페라제 활성이 현저히 감소하였고, 이는 감소된 Notch1 신호전달을 나타내었다 (도 1B). 또한, 항체 52M51의 인간화 변이체인 변이체 52M51 H4/L3은 루시페라제 활성의 감소에서 유사한 효력을 나타내었다 (도 1C).
Notch 수용체 활성화 및 ICD 형성
푸린, ADAM, 및 감마-세크리타제에 의한 Notch 수용체의 절단은 Notch 세포내 도메인 (ICD)을 형성하고, 이는 이어서 핵내 하단부의 Notch 신호전달을 촉발하는 한다. 특정 실시양태에서, 리간드-메개된 수용체 활성화를 차단하는 Notch1 수용체 항체의 능력은 웨스턴 블로팅 분석에 의해 측정하였다. Notch1-Hela 세포를 293-SMII 매질 (깁코(Gibco)) 중에서 현탁 배양으로 성장시켰다. 배양된 세포를 선별된 웰이 DMEM 중 인간 DLL4-fc 융합 단백질 (2 μg/ml) + 2％ FBS 및 1 μM MG132 (칼바이오켐(Calbiochem))으로 예비코팅된 96-웰 플레이트로 옮겼다. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대해 생성되는 항체를 세포 배양 배지에 첨가하고, 세포를 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 흡인하고 세포를 2X SDS 작동 완충액에 재현탁시켰다. 샘플을 실온에서 초음파 처리한 후, 제조자의 권고 (문헌 [Cell Signaling Technology])에 따라 절단된 Notch1 ICD에 대해 특이적인 항체를 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅 분석하였다. 52M51과 함께 52M63, 52M74 및 52M80은 모두 리간드 자극 후 ICD의 생성이 현저히 억제되었다 (도 1D).
실시예 4
비-리간드 결합 영역 항-Notch 수용체 항체를 사용한 종양 성장의 생체내 예방
마우스에서 이종이식물로 계대배양된 환자 샘플로부터의 종양 세포를 실험 동물에 주사하기 위해 제조하였다. 종양은 이전에 기재된 절차 (문헌 [Al-Hajj et al., 2003]; [Dalerba et al., 2007] 참조)에 충실하여 온코메드 파머수티칼스(OncoMed Pharmaceuticals)에 의해 확립되었고 UM-PE13 및 T3 (유방 암종 세포), OMP-C9, OMP-C8, OMP-C6, 및 Colo-205 (콜론 종양 세포); 및 OMP-PN4 (췌장 암종 세포)를 포함하였다. 종양 조직을 멸균 조건하에 제거하고, 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 효소 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 얻었다. 생성된 종양 조각을 배양 배지 중 초순수 콜라게나제 (mL 당 콜라게나제 200 내지 250 단위)와 혼합하고 15 내지 20분 마다 10 mL 피펫을 통해 위아래로 피페팅하면서 37℃에서 3 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다. 소화된 세포를 45 ㎕ 나일론 메시를 통해 여과하고, RPMI/20％ FBS로 세척하고, HBSS로 2회 세척하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 6 내지 8주에 NOD/SCID 마우스에 피하 주사하여 종양 성장을 유도하였다. UM-PE13 및 T3 유방 종양 세포의 경우, 100 ㎕ 중 50,000개의 세포를 우측 유방 지방 패드에 주사하고 또한 에스트로겐 펠렛을 이식하였다 (n=20). OMP-C9 콜론 종양 세포의 경우, 100 ㎕ 중 50,000개의 세포를 우측 플랭킹 영역에 주사하였다 (n=20). OMP-C8 콜론 종양 세포의 경우, 100 ㎕ 중 10,000개의 세포를 우측 플랭킹 영역에 주사하였다 (n=10). OMP-C6 콜론 종양 세포의 경우, 100 ㎕ 중 10,000개의 세포를 우측 플랭킹 영역에 주사하였다 (n=10). 모든 종양 세포를 1:1 비의 PBS (마그네슘 또는 칼슘 없음) 및 BD 매트리겔(Matrigel) (BD 바이오사이언스즈 (BD Biosciences))의 혼합물 중에 주사하였다.
종양 세포 주사 3일 후, 항체 치료를 시작하였다. 각 삽입 동물에 대조군으로서 10 mg/kg의 항-Notch1 항체 또는 PBS를 총 6 내지 8주 동안 주당 2회 복강내 (i.p.) 수여하였다. PE13 세포를 주사한 동물에 에스트로겐 펠렛 삽입물에 더하여 우측 상부 유방 지방 패드에 삽입물을 수여하였다. C9, C8 또는 C6 세포를 주사한 동물에 복부의 우측 하부 사분면에 삽입물을 수여하였다. 종양 크기는 주 2회 평가하였다.
특정 실시양태에서, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 대한 항체를 유방 종양형성에 대한 영향에 대해 시험하였다. PE13 유방 종양 세포 (주사 당 50,000개의 세포)를 유방 지방 패드에 피하 이식하였다. 세포 이식 2일 후, 대조 항체 또는 52M 항체인 52M1, 52M2 및 52M8 (항-Notch 신호전달 능력이 없었음, 도 1B 참조)을 10 mg/kg으로 주 2회 i.p. 투약하여 동물을 치료하였다. 비-Notch1 억제 항체로의 치료는 대조 치료 동물과 비교하여 종양 성장에 대한 효과가 없었다 (도 2C 및 2D). 특정 실시양태에서, 대조 항체 또는 52M51을 10 mg/kg으로 주 2회 i.p. 투약하여 PE13 유방 종양 세포를 주사한 동물을 치료하였다. 종양 부피는 매주 2회 측정하였고, 유방 종양 성장에 대한 52M51의 영향을 측정하였다.
별법의 실시양태에서, 해리된 종양 세포를 세포 표면 마커를 기준으로 먼저 종양형성 세포 및 비-종양형성 세포로 분류한 후 실험 동물에 주사하였다. 구체적으로, 상기 기재된 해리된 종양 세포를 2％ 열 불활성화 송아지 혈청 (HICS)을 함유하는 Hepes 완충형 염류 용액 (HBSS)으로 2회 세척하고 100 ㎕ 당 106개의 세포로 재현탁시켰다. 항체를 첨가하고 세포를 얼음상에서 20분 동안 인큐베이션 한 후 HBSS/2％ HICS로 2회 세척하였다. 항체는 항-ESA (바이오메다(Biomeda; 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)), 항-CD44, 항-CD24, 및 리니지(Lineage) 마커 항-CD2, 항-CD3, 항-CD10, 항-CD16, 항-CD18, 항-CD31, 항-CD64 및 항-CD140b (총체적으로 Lin으로 언급됨; 파밍겐(PharMingen; 미국 캘리포니아주 새너제이 소재))를 포함하였다. 항체를 형광 색소에 직접 접합시켜 상기 마커를 발현시키는 세포를 양성 또는 음성 선별하였다. 마우스 세포는 H2Kd+ 세포에 대해 선별하여 제거하고, 죽은 세포는 생존능 염료 7AAD를 사용하여 제거하였다. 유세포분석법을 FACS밴티지(FACSVantage) (벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson; 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)) 상에서 실행하였다. 측면 산란 및 전방 산란 프로파일을 사용하여 세포 덩어리를 제거하였다. 이어서, 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-종양형성 세포를 NOD/SCID 마우스에 피하 주사하여 종양 성장을 유도하였다.
실시예 5
항-Notch1 수용체 항체를 사용한 종양의 생체내 치료
마우스에서 이종이식물로 계대배양된 환자 샘플 (고형 종양 생검 또는 흉막 삼출물)로부터의 종양 세포를 실험 동물에 다시 통과시키기 위해 제조하였다. 종양 조직을 제거하고, 작은 조각으로 절단내고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 효소 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 해리된 종양 세포를 유방 조양의 경우, NOD/SCID 마우스의 유방 지방 패드에, 또는 비-유방 종양의 경우, NOD/SCID 마우스의 플랭크에 피하 주사하여 종양 성장을 유동하였다. 특정 실시양태에서, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-종양형성 종양 세포를 상기 상세히 기재한 바와 같이 단리하고 주사하였다.
특정 실시양태에서, 새로 단리된 C8 콜론 종양 세포 (동물 당 225개의 세포)를 NOD/SCID 마우스에 피하 이식하였다. 종양 세포 주사 후, 동물들을 종양 성장에 대해 모니터링하였다. 종양이 대략 210 mm3의 평균 크기에 도달하고 두 군으로 랜덤화 (군 당 n=10) 될 때까지 종양을 48일 동안 성장시켰다. 동물들을 인간 Notch1의 세포외 도메인의 멤브레인 인접 영역에 결합하는 항체 52M51 또는 대조 항체 (10 mg/kg)를 주 2회 i.p. 투여하여 치료하였다. 종양 크기는 55, 57 및 62일에 평가하였다. 52M51로 치료한 동물들은 대조 치료 동물과 비교하여 통계적으로 현저한 (p=0.0006) 종양 성장의 억제를 나타내었다 (도 2A 및 2B).
항체 치료의 종료 지점에서, 추가 분석을 위해 종양을 수확하였다. 몇몇 실시양태에서, 종양의 일부를 면역 형광법에 의해 분석하여 종양에의 항체 침투 및 종양 반응을 평가하였다. 항-Notch1 수용체 치료된 마우스 및 대조 항체 치료된 마우스로부터의 각 수확된 종양의 일부를 액체 질소에서 플래시-동결시키고, O.C.T.에 침지하고, 저온유지장치에서 10 ㎛ 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 다르게는, 각 종양의 일부분을 포르말린-고정시키고, 파라핀-침지시키고, 마이크로톰에서 10 ㎛ 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 단편을 후-고정시키고 주사된 항체를 특이적으로 인식하는 발색된 표지 항체와 함께 인큐베이션하여 종양 생검에 존재하는 항-NOTCH1 수용체 또는 대조 항체를 검출하였다. 또한, 상이한 종양 및 종양 모집 세포 유형을 검출하는 항체, 예를 들어, 혈관 내피 세포를 검출하기 위한 항-VE 캐드헤린 (CD144) 또는 항-PECAM-1 (CD31) 항체, 관상 평활근 세포를 검출하기 위한 항-평활근 알파-액틴 항체, 증식 세포를 검출하기 위한 항-Ki67 항체, 사멸 세포를 검출하기 위한 TUNEL 검정, 및 Notch 신호전달을 검출하기 위한 항-세포내 도메인 (ICD) Notch 단편 항체를 사용하여 혈관형성, 종양 성장 및 종양 형태에 대한 항체 치료의 영향을 평가할 수 있다.
종양 세포 유전자 발현에 대한 항-Notch1 수용체 항체 치료의 영향을 또한 평가하였다. 전체 RNA를 Notch1 항체 치료한 마우스 및 대조 항체 치료한 마우스로부터 각 수확된 종양의 일부분으로부터 추출하여 정량적 RT-PCR를 위해 사용하였다. Notch 신호전달 경로의 성분인 Notch1의 발현 수준, 및 예를 들어 CD44를 포함한 사전에 확인된 암 줄기 세포 마커의 첨가를, 내부 대조부로서 하우스-키핑 유전자 GAPDH에 대하여 분석하였다. 이에 따라, Notch1 수용체 항체 치료시 종양 세포 유전자 발현의 변화를 측정하였다.
또한, 종양 내 암 줄기 세포의 존재에 대한 항-Notch1 수용체 항체 치료의 영향을 평가하였다. 대조 항체 치료한 마우스에 대한 Notch1 항체 치료한 마우스로부터의 종양 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 효소 소화 및 기계적 파괴에 의해 단일 세포 현탁액을 얻었다. 이어서, 해리된 종양 세포를 상기 상세히 기재된 바와 같이 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-표면 세포 마커 발현을 바탕으로 하는 종양형성 암 줄기 세포의 존재에 대해 FACS 분석으로 분석하였다.
이어서, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-발현을 바탕으로 하는 단리된 세포의 종양형성 가능성에 이은 항-Notch1 항체 치료를 평가할 수 있다. 대조 항체 치료한 마우스에 대한 Notch1 항체 치료한 마우스로부터의 5,000개, 1,000개, 500개, 및 100개의 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-암 줄기 세포를 NOD/SCID 마우스의 유방 지방 패드에 피하 재주사하였다. 이에 따라, 일정한 종양형성을 위해 요구되는 주사된 세포의 수에 근거하여 암 줄기 세포의 종양형성 가능성을 측정하였다.
52M51의 생체내 효능과 반대로, 상기 기재된 콜론 이종이식 모델에서 Notch1 신호전달을 억제하는 항체, Notch 1의 멤브레인 인접 영역을 인식하지만, Notch 1 신호전달을 억제하지 않는 다른 특정 항체는 유방 이종이식 모델에서 생체내 항-종양 효능을 가지지 않음을 발견하였다. 각각이 Notch 신호전달을 상당히 억제하지 않음이 발견된 (실시예 3 및 도 1B) 항체 52M51, 52M2 및 52M8을 사전에 PE13 유방 종양 세포를 주사한 NOD/SCID 마우스에 주사하였다. 항체 52M1, 52M2 및 52M8 각각은 대조 치료한 동물에 대해 비교하였을 때 이종이식 모델에서 종양 성장을 초래하는데 실패하였다 (도 2C (52M1, 52M2) 및 도 2D (52M8)).
실시예 6
항-Notch 수용체 항체를 사용한 인간 암의 치료
본 실시예는 Notch 수용체 발현이 검출된 암 줄기 세포 및/또는 종양 세포를 포함하는 종양을 표적화하기 위하여 Notch 수용체에 대한 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 기재한다.
먼저 암 줄기 세포 마커 발현의 존재를 종양 생검으로부터 측정할 수 있다. 암으로 진단된 환자의 생검으로부터의 종양 세포를 멸균 조건하에서 제거하였다. 몇몇 실시양태에서, 조직 생검을 액체 질소 중에서 새롭게 동결하고, O.C.T.에 침지하고, 저온유지장치에서 10 ㎛ 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 다르게는, 조직 생검을 포르말린-고정시키고, 파라핀-침지시키고, 마이크로톰에서 10 ㎛ 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 단편을 Notch 수용체에 대한 항체와 인큐베이션하여 단백질 발현을 검출하였다. 추가로, 암 줄기 세포의 존재를 측정할 수 있다. 조직 생검 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 세포를 효소 소화 및 기계적 파괴시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이어서, 해리된 종양 세포를 항-ESA, -CD44, -CD24, -Lin, 및 -Notch1 항체와 함께 인큐베이션하여 암 줄기 세포를 검출하고, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin-, Notch+ 종양 줄기 세포의 존재를 상기 상세히 기재한 바와 같이 유세포분석에 의해 측정하였다.
종양이 Notch 수용체를 발현하는 것으로 진단된 암 환자를 항-Notch 수용체 항체로 처리하였다. 상기 기재한 바와 같이 생성된 인간화 또는 인간 모노클로날 항-Notch 수용체 항체를 정제하고, 주사용 PBS 중에서 적합한 제약 담체와 제형화하였다. 환자를 적어도 10 주 동안 주 1회 Notch 항체로 치료하였으나, 특정 경우에는 적어도 약 14 주 동안 주 1회 치료하였다. 각각의 항체 투여는 제약상 유효한 용량인 약 2 내지 약 100 mg/ml이고, 특정 경우에는 약 5 내지 약 40 mg/ml이어야 한다. 항체는 표준 방사능요법 레지멘 또는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 류코보린, 또는 스트렙토조신을 사용하는 화학요법 레지멘 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여할 수 있다. 환자를 모니터링하여, 이러한 처리가 예컨대 종양 퇴행을 바탕으로 하는 항-종양 반응, 신생 종양 발생의 감소, 종양 항원 발현 감소, 암 줄기 세포 수의 감소, 또는 질환 예후를 평가하는 다른 수단을 야기했는지를 측정한다.
실시예 7
항-Notch1 수용체 항체를 사용한 종양의 생체내 치료에 관한 추가 연구
한 실시양태에서, M2 흑색종 세포 (10,000개)를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 대략 110 mm3의 부피에 도달할 때까지 35일 동안 종양을 성장시켰다. 종양을 갖는 마우스를 두 군으로 랜덤화하고 (n=10) 대조 항체 또는 항-Notch1 항체 52R43으로 치료하였다. 항체를 주 2회 10 mg/kg으로 투약하였다. 종양 부피를 지시된 일자에 측정하였다. 도 3A에 나타낸 바와 같이, 52R43으로의 항-Notch1 치료는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시켰다 (p=0.02).
한 실시양태에서, Lu24 폐 종양 세포 (30,000개)를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 대략 205 mm3의 부피에 도달할 때까지 종양을 35일 동안 성장시켰다. 종양을 갖는 마우스를 두 군으로 랜덤화하고 (n=8) 대조 항체 또는 항-Notch1 항체 52R43으로 치료하였다. 항체를 주 2회 10 mg/kg으로 투약하였다. 종양 부피를 지시된 일자에 측정하였다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, 52R43으로의 항-Notch1 치료는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시켰다 (p=0.04).
한 실시양태에서, PN8 췌장 종양 세포 (50,000개)를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 대략 115 mm3의 부피에 도달할 때까지 종양을 27일 동안 성장시켰다. 종양을 갖는 마우스를 두 군으로 랜덤화하고 (n=8) 대조 항체 또는 항-Notch1 항체 52R43으로 치료하였다. 항체를 주 2회 10 mg/kg으로 투약하였다. 종양 부피를 지시된 일자에 측정하였다. 도 3C에 나타낸 바와 같이, 52R43으로의 항-Notch1 치료는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시켰다 (p=0.005).
한 실시양태에서, T1 유방 종양 세포 (300,000개)를 NOD-SCID 마우스에 피하 주사하였다. 종양이 대략 130 mm3의 부피에 도달할 때까지 종양을 27일 동안 성장시켰다. 종양을 갖는 마우스를 네 군으로 랜덤화하고 (n=10) 대조 항체, 항-Notch1 항체 52R43, 탁솔, 또는 52R43과 탁솔의 조합으로 치료하였다. 항체를 주 1회 15 mg/kg으로 투약하고 탁솔은 주 1회 12 mg/kg으로 투약하였다. 종양 부피를 지시된 일자에 측정하였다. 도 3D에 나타낸 바와 같이, 52R43으로의 항-Notch1 치료는 대조군에 비해 종양 성장을 감소시켰고 (p<0.0001), 조합군은 탁솔 단독에 비해 종양 성장을 감소시켰다 (p=0.001).
상기 설명에서 언급된 모든 공개공보 및 특허는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않는 한, 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 실시양태와 관련되어 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 지나치게 제한되어서는 안됨을 이해해야 한다. 사실상, 관련 업계의 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 하기 청구항의 범위 내에 포함된다고 의도된다.
서열
서열 1
Notch1 폴리뉴클레오티드 코딩 아미노산 1427-1732.
Figure pct00003
서열 2
Notch1 아미노산 1427-1732
Figure pct00004
마우스 항체 52 M51 서열:
서열 3
52M51 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00005
서열 4
52M51 경쇄 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00006
서열 5
52M51 경쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00007
서열 6
52M51 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00008
서열 7
52M51 경쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00009
서열 8
52M51 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00010
서열 9
52M51 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00011
서열 10
52M51 중쇄 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00012
서열 11
52M51 중쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00013
서열 12
52M51 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00014
서열 13
52M51 중쇄 가변 영역 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00015
서열 14
52M51 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00016
서열 15
52M51 중쇄 CDR1
Figure pct00017
서열 16
52M51 중쇄 CDR2
Figure pct00018
서열 17
52M51 중쇄 CDR3
Figure pct00019
서열 18
52M51 경쇄 CDR1
Figure pct00020
서열 19
52M51 경쇄 CDR2
Figure pct00021
서열 20
52M51 경쇄 CDR3
Figure pct00022
인간화 52 M51 서열:
서열 21
52M51-H4 중쇄 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00023
서열 22
52M51-H4 중쇄 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00024
서열 23
52M51-H4 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00025
서열 24
52M51-H4 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00026
서열 25
52M51-L3 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00027
서열 26
52M51-L3 경쇄 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00028
서열 27
52M51-L3 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00029
서열 28
52M51-L3 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00030
서열 29
52M51-L4 경쇄 폴리뉴클레오티드 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00031
서열 30
52M51-L4 경쇄 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00032
서열 31
52M51-L4 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열은 밑줄그음)
Figure pct00033
서열 32
52M51-L4 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (추정상의 신호 서열 없음)
Figure pct00034
ATCC PTA-9405 20080807 ATCC PTA-9547 20081015 ATCC PTA-9548 20081015 ATCC PTA-9549 20081015
SEQUENCE LISTING <110> Oncomed Pharmaceuticals, Inc. GURNEY, Austin L. BRUHNS, Maureen F. HOEY, Timothy C. AXELROD, Fumiko T. <120> Notch1 Receptor Binding Agents and Methods of Use Thereof <130> 2293.049PC04 <140> PCT/US2009/003995 <141> 2009-07-08 <150> US 61/112,701 <151> 2008-11-07 <150> US 61/112,699 <151> 2008-11-07 <150> US 61/079,095 <151> 2008-07-08 <160> 32 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 918 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacatcctgg actacagctt cgggggtggg gccgggcgcg acatcccccc gccgctgatc 60 gaggaggcgt gcgagctgcc cgagtgccag gaggacgcgg gcaacaaggt ctgcagcctg 120 cagtgcaaca accacgcgtg cggctgggac ggcggtgact gctccctcaa cttcaatgac 180 ccctggaaga actgcacgca gtctctgcag tgctggaagt acttcagtga cggccactgt 240 gacagccagt gcaactcagc cggctgcctc ttcgacggct ttgactgcca gcgtgcggaa 300 ggccagtgca accccctgta cgaccagtac tgcaaggacc acttcagcga cgggcactgc 360 gaccagggct gcaacagcgc ggagtgcgag tgggacgggc tggactgtgc ggagcatgta 420 cccgagaggc tggcggccgg cacgctggtg gtggtggtgc tgatgccgcc ggagcagctg 480 cgcaacagct ccttccactt cctgcgggag ctcagccgcg tgctgcacac caacgtggtc 540 ttcaagcgtg acgcacacgg ccagcagatg atcttcccct actacggccg cgaggaggag 600 ctgcgcaagc accccatcaa gcgtgccgcc gagggctggg ccgcacctga cgccctgctg 660 ggccaggtga aggcctcgct gctccctggt ggcagcgagg gtgggcggcg gcggagggag 720 ctggacccca tggacgtccg cggctccatc gtctacctgg agattgacaa ccggcagtgt 780 gtgcaggcct cctcgcagtg cttccagagt gccaccgacg tggccgcatt cctgggagcg 840 ctcgcctcgc tgggcagcct caacatcccc tacaagatcg aggccgtgca gagtgagacc 900 gtggagccgc ccccgccg 918 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Gly Gly Gly Ala Gly Arg Asp Ile Pro 1 5 10 15 Pro Pro Leu Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln Glu Asp 20 25 30 Ala Gly Asn Lys Val Cys Ser Leu Gln Cys Asn Asn His Ala Cys Gly 35 40 45 Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp Lys Asn 50 55 60 Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly His Cys 65 70 75 80 Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe Asp Cys 85 90 95 Gln Arg Ala Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr Cys Lys 100 105 110 Asp 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cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1140 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1200 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacac ctcccatgct ggactccgac 1260 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1320 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1380 tccctgtctc cgggtaaatg a 1401 <210> 22 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain 52M51 antibody <400> 22 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Arg Gly Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gln Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala 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305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 23 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain 52M51 antibody <400> 23 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu 35 40 45 Arg Gly Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Gln Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 130 135 140 <210> 24 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic heavy chain 52M51 antibody <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Leu Pro Gly Thr Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Asp Gly Asn Tyr Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 25 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 25 atgagcgtcc ctacaatggc ttggatgatg ctcctgctgg gactcctggc ttatggaagc 60 ggagtggata gccaggccgt cgtcacacag gaacctagcc tcaccgttag ccctggagga 120 acagtcacac tgacctgtag gagctccaca ggagctgtga caacaagcaa ttacgctaac 180 tggttccagc agaagcccgg tcaagcccct agaaccctca tcggcggcac caataacaga 240 gctcccggag tccccgccag gttctccggc tccctcctgg gtggcaaggc tgctctgaca 300 ctcagcggtg cccagccaga ggatgaagcg gagtactact gtgcactgtg gtacagcaac 360 cattgggttt tcggaggcgg aacaaagtta accgtcctcg ggcagcctaa ggctgctcct 420 agcgtcacac tgttcccccc atctagcgag gagctgcagg ctaacaaggc aaccctcgtc 480 tgcctggtta gcgacttcta ccctggcgct gtcacagtgg cctggaaagc tgacggctcc 540 cctgtgaaag ttggcgtcga aaccacaaag ccttctaagc agagcaataa taaatatgcc 600 gcaagctcct acctctccct gactcctgag cagtggaaaa gccataggag ctactcctgc 660 cgggtcacac acgaaggaag cacagtggaa aagacagtcg cccctgctga gtgtagctga 720 <210> 26 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 26 Met Ser Val Pro Thr Met Ala Trp Met Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Ser Gly Val Asp Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser 35 40 45 Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg 65 70 75 80 Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys 85 90 95 Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val 145 150 155 160 Cys Leu Val Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys 165 170 175 Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser 180 185 190 Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr 195 200 205 Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His 210 215 220 Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 27 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 27 Met Ser Val Pro Thr Met Ala Trp Met Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Ser Gly Val Asp Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro 20 25 30 Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser 35 40 45 Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln 50 55 60 Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg 65 70 75 80 Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys 85 90 95 Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Thr Val Leu Gly 130 <210> 28 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 28 Ser Gly Val Asp Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr 1 5 10 15 Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly 20 25 30 Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly 50 55 60 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu 65 70 75 80 Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly 115 <210> 29 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 29 atgagcgtcc ctacaatggc ttggatgatg ctcctgctgg gactcctggc ttatggaagc 60 ggagtggata gccagaccgt cgtcacacag gaacctagct tttccgttag ccctggagga 120 acagtcacac tgacctgtag gagctccaca ggagctgtga caacaagcaa ttacgctaac 180 tggtatcagc agactcccgg tcaagcccct agaaccctca tcggcggcac caataacaga 240 gctcccggag tccccgacag gttctccggc tccatcctgg gaaataaagc tgctctgaca 300 atcacaggtg cccaggctga cgatgaaagc gactactact gtgcactgtg gtacagcaac 360 cattgggttt tcggaggcgg aacaaagtta accgtcctcg ggcagcctaa ggctgctcct 420 agcgtcacac tgttcccccc atctagcgag gagctgcagg ctaacaaggc aaccctcgtc 480 tgcctggtta gcgacttcta ccctggcgct gtcacagtgg cctggaaagc tgacggctcc 540 cctgtgaaag ttggcgtcga aaccacaaag ccttctaagc agagcaataa taaatatgcc 600 gcaagctcct acctctccct gactcctgag cagtggaaaa gccataggag ctactcctgc 660 cgggtcacac acgaaggaag cacagtggaa aagacagtcg cccctgctga gtgtagctga 720 <210> 30 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic light chain 52M51 antibody <400> 30 Met Ser Val Pro Thr Met Ala Trp Met Met Leu Leu Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Ala Tyr Gly Ser Gly Val Asp Ser Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro 20 25 30 Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser 35 40 45 Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg 65 70 75 80 Ala Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys 85 90 95 Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr 115 120 125 Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu 130 135 140 Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val 145 150 155 160 Cys Leu Val Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys 165 170 175 Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Val Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser 180 185 190 Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr 195 200 205 Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His 210 215 220 Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Ala Glu Cys Ser 225 230 235 <210> 31 <211> 134 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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40 45 Gln Ala Pro Arg Thr Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly 50 55 60 Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu 65 70 75 80 Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 110 Val Leu Gly 115

Claims (84)

  1. 인간 Notch1 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 추가의 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Notch1의 길항제인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Notch1의 활성화를 억제하는 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 인접 영역 내의 절단을 억제하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 멤브레인 인접 영역 내의 S2 부위에서의 절단을 억제하는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Notch1의 세포내 도메인 (ICD)의 방출을 억제하는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체인 항체.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 항체인 항체.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IgG2 항체인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 키메릭 항체인 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편인 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 1가 항체인 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, Notch1 수용체의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역이 서열 2를 포함하는 것인 항체.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는 항체.
  19. 제18항에 있어서, RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는 항체.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체.
  21. RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  22. 제21항에 있어서, RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 추가로 포함하는 항체.
  23. RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  24. (a) RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는
    (b) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  25. (a) RGYWIE (서열 15)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) QILPGTGRTNYNEKFKG (서열 16)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및 (c) FDGNYGYYAMDY (서열 17)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  26. 제25항에 있어서, (a) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (c) ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  27. (a) RSSTGAVTTSNYAN (서열 18)을 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; (b) GTNNRAP (서열 19)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (c) ALWYSNHWVFGGGTKL (서열 20)을 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 치환이 보존적 아미노산 치환인 항체.
  29. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하며, ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9405로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체 52M51이 결합하는 에피토프와 동일한, 상기 멤브레인 인접 영역 내의 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  30. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하여 Notch1 ICD의 형성을 억제하며, 종양 성장을 억제하는 단리된 항체.
  31. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에의 특이적 결합에 대해 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  32. 경쟁적 결합 검정에서 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에의 특이적 결합에 대해 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  33. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에의 특이적 결합에 대해 항체 52M51과 경쟁하는 단리된 항체.
  34. (a) 서열 14 또는 서열 24에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 8, 서열 28 또는 서열 32에 대해 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  35. 제34항에 있어서, (a) 중쇄 가변 영역이 서열 14 또는 서열 24에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖고/거나 (b) 경쇄 가변 영역이 서열 8, 서열 28 또는 서열 32에 대해 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 것인 항체.
  36. (a) 서열 14 또는 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; 및/또는
    (b) 서열 8, 서열 28 또는 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드
    를 포함하는, 단리된 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서, 항체인 폴리펩티드.
  38. 제36항에 있어서, 서열 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  39. 제36항에 있어서, 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  40. 제36항에 있어서, 서열 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드.
  41. ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9549로서 기탁된 플라스미드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체.
  42. ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9405로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체.
  43. 제36항 또는 제37항의 폴리펩티드를 포함하는, 인간 Notch1에 특이적으로 결합하는 항체.
  44. 서열 14 또는 서열 24를 포함하는 폴리펩티드; 및
    서열 8, 서열 28 또는 서열 32를 포함하는 폴리펩티드
    를 포함하는, 인간 Notch1에 특이적으로 결합하는 항체.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드 및 1종 이상의 추가의 항암제를 포함하는 제약 조성물.
  47. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  48. 제47항의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터.
  49. 제48항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  50. 제47항의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 숙주 세포.
  51. ATCC 특허 기탁 번호 PTA-9405로서 기탁된 하이브리도마 세포주.
  52. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체를 생산하는 세포주.
  53. 세포를 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch1의 활성을 억제하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 세포가 종양 세포인 방법.
  55. 치료적 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법.
  56. 치료적 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도 또는 수가 상기 항체 또는 폴리펩티드의 투여에 의해 감소되는 것인, 대상체에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 방법.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 종양 또는 종양 세포가 유방 종양, 결장직장 종양, 간 종양, 신장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  58. 치료적 유효량의 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 폴리펩티드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 암이 유방암, 결장직장암, 간암(hepatic cancer), 신장암, 간암(liver cancer), 폐암, 췌장암, 위장암, 흑색종, 난소암, 전립선암, 자궁경부암, 방광암, 교아세포종, 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 항암제/치료제를 대상체에게 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 추가의 항암제가 탁솔, 이리노테칸, 젬시타빈, 및 옥살리플라틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 항암제가 추가의 항체 치료제인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 추가의 항체 치료제가 제2 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 추가의 항체 치료제가 VEGF에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 추가의 항체 치료제가 Notch 수용체 리간드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 방법.
  66. 제65항에 있어서, NOTCH 수용체 리간드가 DLL4인 방법.
  67. 제65항에 있어서, NOTCH 수용체 리간드가 JAG1인 방법.
  68. 제55항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포독성 잔기에 접합된 것인 방법.
  69. 제55항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 방사선 요법과 함께 투여되는 것인 방법.
  70. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 화학요법과 함께 투여되는 것인 방법.
  71. 인간 Notch1의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 멤브레인 인접 영역에 특이적으로 결합하는 항체의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 결합이 Notch1의 활성을 억제하는 것인, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 종양이 유방 종양, 결장직장 종양, 간 종양, 신장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  74. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 Notch1의 길항제인 방법.
  75. 제71항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG1 항체인 방법.
  76. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 IgG2 항체인 방법.
  77. 제71항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  78. 제71항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메릭 항체인 방법.
  79. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간화 항체인 방법.
  80. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 항체인 방법.
  81. 제71항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 항체 단편인 방법.
  82. 제71항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 세포독성제에 접합된 것인 방법.
  83. 제71항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 조합 요법을 수행하는데 적절한 1종 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
  84. Notch1의 활성을 억제하는 유효량의 항체와 종양을 접촉시키는 것을 포함하는, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도 또는 수를 감소시킴으로써 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 방법.
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