CN111334575A - Notch家族基因变异在预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 - Google Patents
Notch家族基因变异在预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及临床分子诊断学领域，具体而言，涉及NOTCH家族基因变异在预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用，以及预测实体瘤患者肿瘤突变负荷程度中的应用。该方法有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，且基因变异状态的检测更为可靠。
Description
技术领域
本发明涉及临床分子诊断学领域，具体而言，涉及NOTCH家族基因变异在预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗现已发展得如火如荼，其中免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitor,ICI)更是近年肿瘤治疗领域的“明星”药物，已进入肿瘤一线治疗。虽然免疫检查点抑制剂效果不错，但整体客观缓解率(Objective Response Rate，ORR)依然只有20％左右，所以如何精准筛选获益人群成为临床医生迫切需要解决的问题。
PD-L1，TMB(肿瘤突变负荷，tumor mutational burden)以及MSI(微卫星不稳定，microsatellite instability)是三个获得FDA认可或NCCN指南推荐的免疫治疗生物标志物(biomarker)，但是这三个生物标志物各有优缺点。PD-L1作为免疫治疗biomarker应用最为广泛，PD-L1 IHC检测也被FDA获准作为Pembrolizumab一线用药的伴随诊断。但是，多个临床试验结果显示PD-L1表达对免疫治疗疗效的预测能力并不一致，部分PD-L1阴性患者依然能从免疫治疗获益，且持续缓解时间并不逊于PD-L1阳性患者；TMB同样是推荐的免疫治疗biomarker，但是鉴于不同公司或实验室对于TMB算法的不同，TMB阈值难以建立共识；MSI已经作为肿瘤关键biomarker让FDA同意基于MSI状态，而不是组织病理类型，进行用药治疗，但是肿瘤中MSI-H比例太低，临床推广有一定局限性。最重要的一点就是现有研究(纳入11348例实体瘤)发现，PD-L1阳性、TMB高表达以及MSI-H三者重叠率仅为0.6％，提示任一biomarker单用都会遗漏很多潜在免疫治疗获益人群。所以需要进一步探索免疫治疗biomarker。
随着二代测序在肿瘤精准治疗中的开展日益广泛，特定基因的体细胞突变被发现可能影响肿瘤免疫功能或对免疫治疗的响应，即提示特定体细胞突变可能是潜在的免疫治疗预测因子。EGFR突变和ALK重排是ICI免疫治疗不良预后的潜在预测因子。一项回顾性分析发现，这些患者中只有3.6％对ICI免疫治疗有反应，而EGFR野生型和ALK阴性或未知患者的反应率为23.3％。以上这些基因突变作为biomarker依然不能覆盖所有潜在免疫治疗获益人群，本领域仍然需要更高效、更准确地鉴定适用于免疫检查点抑制剂治疗的实体瘤患者的方法和工具。此外，虽然大量随机对照研究和大样本真实世界研究都已证实TMB与免疫疗效之间的相关性，但是TMB依然只能反映肿瘤突变数量，而不能提示肿瘤微环境的状态，且TMB检测对技术平台要求较高，工作周期较长，成本较高都制约其临床应用。
发明内容
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是所述实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。
本发明还涉及NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是高肿瘤突变负荷的指征。
在本发明中，通过考虑NOTCH家族基因变异，能够准确预测实体瘤患者中对TMB程度，进而预测ICI敏感的群体，避免盲目用药，提高ICI治疗的经济性能。
本发明中筛选NOTCH家族基因变异作为预测实体瘤患者中对ICI敏感的群体的生物标志物，相对于其他基因组合的共突变而言，预测结果更精准；且本发明中采用的NOTCH家族基因变异在实际应用中可以作为独立预测风险因素，提高检测效率。该方法有利于简化检测内容，降低患者检测成本，加快检测报告出具时间，且相比PD-L1免疫组化方法需要人工判读免疫组化片子以及TMB需要人为确定阈值这两点来说，且基因突变状态的检测更为可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中NOTCH家族基因(NOTCH1/2/3/4)在各瘤种突变频率检测结果；
图2为本发明一个实施例中NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4在中国实体瘤中的突变比例；
图3为本发明一个实施例中NOTCH家族基因(NOTCH1/2/3/4)在各瘤种不同变异形式的突变频率；
图4为本发明一个实施例中Notch家族基因(NOTCH1/2/3/4)在全瘤种对TMB的影响；
图5为本发明一个实施例中NOTCH1/2/3/4基因变异在全瘤种对TMB的影响；
图6为本发明一个实施例中NOTCH1/2/3/4点突变或截短突变患者在全瘤种对TMB的影响；
图7为本发明一个实施例中NOTCH1-4基因突变位点分析；
图8为本发明一个实施例中NOTCH1-4基因变异与野生型患者接受使用免疫检查点抑制剂的免疫疗法的疗效比较；
图9为本发明一个实施例中Cox多因素分析提示NOTCH家族基因突变是免疫治疗独立预后风险因子；
图10为本发明一个实施例中NOTCH家族基因突变个数与TMB关系；
图11为本发明一个实施例中NOTCH家族变异基因数量与免疫治疗效果之间的关系；
图12为本发明一个实施例中Cox多因素分析NOTCH家族变异基因数量是免疫治疗独立预后风险因素。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是所述实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征。
本发明还涉及NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是高肿瘤突变负荷的指征。
在一些实施方式中，NOTCH家族基因种属为哺乳动物；
在一些实施方式中，NOTCH家族基因种属为灵长类动物；
在本发明中，若无特别强调，NOTCH家族选自NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4中的至少一种。在一些实施方式中，NOTCH家族基因种属为人；NOTCH1：Gene ID:4851；NM_017617.5；NOTCH2：Gene ID:4853；NM_024408.4；NOTCH3：Gene ID:4854；NM_000435.3；NOTCH4：Gene ID:4855；NM_004557.4。
如本文所用，术语“免疫检查点”是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路。机体在正常情况下，免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受，然而机体在受到肿瘤侵袭时，免疫检查点的激活会抑制自身免疫，有利于肿瘤细胞的生长和逃逸。通过使用免疫检查点抑制剂，可以恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制和清除肿瘤。
本发明所述免疫检查点包括但不限于程序性死亡受体1(PD1)、PD-L1、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)；也包括一些新发现的免疫检查点例如淋巴细胞活化基因3(LAG3)、CD160、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白-3(TIM-3)、T细胞活化的V结构域免疫球蛋白抑制剂(VISTA)、腺苷A2a受体(A2aR)等等。
优选的免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
所述PD1抑制剂进一步可以选择为Nivolumab(OPDIVO；BMS-936558)、Pembrolizumab(MK-3475)、Jembrolizumab、lambrolizumab、Pidilizumab(CT-011)特瑞普利单抗(JS001)以及Ipilimumab中的一种或多种。
所述PD-L1抑制剂进一步可以选择为Atezolizumab(MPDL3280A)、JS003、Durvalumab、Avelumab、BMS-936559、MEDI4736以及MSB0010718C中的一种或多种。
术语“突变负荷”、“突变负荷”、“突变负荷(mutation burden)”和“突变负荷(mutational burden)”在本文中可互换使用。在肿瘤的背景下，突变负荷在本文中又称为“肿瘤突变负荷”、“肿瘤突变负荷”或“TMB”。
在本发明中，基因变异可以包括点突变(point mutation)和片段突变(fragmentmutation)；点突变可以是单核苷酸多态性(SNP)、碱基取代，单碱基插入或碱基缺失，或沉默突变(例如，同义突变)；片段突变可以是插入突变，截短突变或者基因重排突变。
在一些实施方案中，所述基因变异包括点突变、截短突变、扩增变异以及融合/重排中的一种或多种；进一步优选为点突变和截短突变。
在一些实施方案中，所述突变位于NOTCH1的263～7930位核苷酸、NOTCH2的257～7672位核苷酸、NOTCH3的91～7056位核苷酸、NOTCH4的140～6151位核苷酸。
在一些实施方案中，评估NOTCH家族基因变异包括确定其基因(例如编码区)是否存在点突变/截短突变。
在一些实施方案中，在确定NOTCH家族基因编码区存在突变后，评估NOTCH家族基因表达，例如NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4中至少一种的蛋白表达水平。
在一些实施方式中，所述实体瘤患者的年龄为40～80岁，例如50、60或70岁。
在一些实施方式中，所述实体瘤包括骨、骨连接、肌肉、肺、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛门、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、耳、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、瘠髓、脑瘠液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处或多处病变生成的肿瘤。
在一些实施方式中，所述实体瘤包括肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌、肝细胞肝癌、食管肿瘤、乳腺癌、头颈癌、子宫内膜癌和皮肤鳞癌中的一种或多种。
鉴于NOTCH家族基因为一种能够编码蛋白质的基因，因而其基因的突变通常也会表现在转录水平和反应水平上，本领域技术人员可以从RNA和蛋白水平对其突变进行检测以间接反映其是否发生基因变异，这些都可以应用于本发明。
在一些实施方式中，所述检测剂于核酸水平进行检测。
核酸水平(DNA或RNA水平)的检测剂可选用本领域技术人员所公知的试剂，例如能够与该DNA或RNA杂交，且标记有荧光标记的核酸(通常为探针或引物)等。并且本领域技术人员也容易想到将mRNA反转录成cDNA后对cDNA进行检测，这些技术手段的常规置换不超出本发明的保护范围。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：
限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、聚合酶链反应、竞争性等位基因特异性PCR、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、核酸测序法、核酸分型芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法、Snapshot法、Taqman探针法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
在本发明的一些实施方式中，所述核酸测序法可以为转录组测序或基因组测序。在本发明另外一些实施方案中，所述核酸测序法是高通量测序，也称作二代测序(“NGS”)。二代测序在并行的测序过程中同时产生数千至数百万条序列。NGS区别于“Sanger测序”(一代测序)，后者是基于单个测序反应中的链终止产物的电泳分离。可用本发明的NGS的测序平台是商用可得的，包括但不限于Roche/454FLX、Illumina/Solexa GenomeAnalyzer和Applied Biosystems SOLID system等。转录组测序也可以通过二代测序平台快速全面地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因表达量、基因功能、结构、可变剪接和新转录本预测等。
在一些实施方式中，所述检测剂于蛋白水平进行检测。
在一些实施方式中，所述检测剂用于执行以下任一种方法：
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测的方法进一步可以为免疫沉淀、免疫共沉淀、免疫组化、ELISA以及Western Blot等。
在一些实施方式中，所述试剂盒还包括样品的处理试剂；进一步地，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述样品选自所述实体瘤患者的血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
在一些实施方式中，所述组织为癌组织或癌旁组织。
检测样品还可以为血液、血清、血浆，在一些实施方式中它们来自外周血。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种用于预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的方法，所述方法包括：
使用如上所述的检测剂测量NOTCH家族基因变异的存在与否。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且同100％灵敏度。相反地，可使用生化标志物(例如，NOTCH家族基因变异)来以某种可能性或预测值评估例如疾病的存在与否或严重性。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标志物来诊断、治疗和控制潜在的疾病。
在一些实施方式中，所述方法用于实体瘤患者在进行免疫检查点抑制剂疗法后的预后评估。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例
本发明实施例所采用的研究方法如下：
全面的基因组分析
研究了来自中国实体瘤患者的FFPE肿瘤样品和配对的外周全血对照样品。所有患者均提供书面知情同意书。在OrigiMed进行靶向捕获的下一代测序(NGS)，涉及包含450个癌症相关基因的组合。通过DNA FFPE Tissue Kit和DNA Mini试剂盒(QIAamp)分别从肿瘤含量不低于20％的全部未染色FFPE切片和全血中提取DNA，然后用dsDNA HS测定试剂盒(Qubit)定量。使用KAPA Hyper Prep Kit(KAPA Biosystems)将～250bp超声处理的DNA片段化构建文库，然后进行PCR扩增和定量。使用自定义组合进行杂交捕获，该组和覆盖了2.6Mb的人类基因组，靶向450个癌症相关基因和某些经常重排的内含子。将捕获后的文库混合、变性并稀释至1.5～1.8pM，随后按照制造商的方案在Illumina NextSeq 500上进行配对末端测序。
其中样品使用以下三组引物对扩增ACTIN基因来进行质量检测：
i)5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’和5’-CACGCTCGGTGAGGATCTTC-3’，
ii)5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’和5’-TCGAAGTCCAGGGCAACATAGC-3’，和
iii)5’-CACACTGTGCCCATCTATGAGG-3’和5’-AAGGCTGGAAGAGCGCCTCGGG-3’，其分别扩增100bp、200bp和300bp的片段。当三组引物均扩增到目的片段时判定组织样品质量合格。
基因组改变分析
评估了基因组改变，包括单碱基取代(SNV)、短和长插入缺失、拷贝数变异(CNV)和基因重排和融合。使用Burrows-Wheeler Aligner进行原始读段与人类基因组参考序列(hg19)的比对，然后使用Picard的MarkDuplicates算法进行PCR去重。读取深度小于30x，链偏好性(strand bias)大于10％或VAF<0.5％的变体被移除。定义为来自dbSNP数据库(版本147)的或频率超过外显子组测序项目6500(ESP6500)的1.5％的或超过1000基因组计划的1.5％的常见单核苷酸多态性(SNP)也被排除在外。
通过以下标准判断所鉴别的突变是否为真：
(1)对于点突变：
该点突变所在位置的测序覆盖深度>500次；包含该点突变的每个读段质量值>40,包含该点突变的每个读段上与该点突变相对应的碱基质量值>21；包含有该点突变的读段的条数≥5条；包含有该点突变的所有读段中正向的读段与反向的读段比例<1/6；和肿瘤组织的变异等位基因频率/对照组织的变异等位基因频率≥20；
(2)对于插入缺失(indel):
如果插入缺失中连续相同的碱基<5，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>600次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率/对照组织的变异等位基因频率≥20；
如果插入缺失中连续相同的碱基≥5且<7，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>60次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率/对照组织的变异等位基因频率>20；且所述肿瘤组织的变异等位基因频率≥10％；
如果插入缺失中连续相同的碱基≥7，则该插入缺失所在位置的测序覆盖深度>60次；包含该插入缺失的每个读段质量值>40；包含该插入缺失的每个读段上与该插入缺失突变相对应的碱基质量值>21；包含有该插入缺失的读段的条数≥5条；包含有该插入缺失的所有读段中正向的读长与反向的读长比例<1/6；所述肿瘤组织的变异等位基因频率/对照组织的变异等位基因频率>20；且所述肿瘤组织的变异等位基因频率≥20％。
(3)扩增突变
指基因拷贝数变异的变异类型。扩增就是拷贝数增多的CNV。CNV，即拷贝数变异，一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。
TMB计算
除了基因组改变的常规检测之外，TMB也通过基于NGS的算法确定。通过计数体细胞突变来估计TMB，所述体细胞突变包括所检查的编码区序列的每兆碱基的SNV和插入缺失。排除了dbSNP中的驱动基因突变和已知的种系改变。
免疫组化
如前所述进行免疫组织化学(IHC)染色程序。简而言之，进行脱蜡、再水化和靶标回收，然后与针对PD-L1的单克隆抗体(DAKO，克隆22C3和28-8)一起孵育。将载玻片与即用型显色试剂一起孵育，所述显色试剂由二抗分子和与葡聚糖聚合物主链偶联的辣根过氧化物酶(HRP)分子组成。随后加入发色团和增强剂进行的酶促转化导致可见反应产物在抗原位点沉淀。然后将样品用苏木精复染。
公共数据库队列数据获取
为了进一步验证NOTCH家族(NOTCH1～4)四变异对于免疫检查点抑制剂治疗的临床预测作用，我们在肿瘤基因组学数据库cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org/)中下载了一个纳入1661例实体瘤队列数据，包括患者临床基线资料、免疫检查点抑制剂治疗疗效评估数据以及患者基因组数据。
实施例1患者特征
总共有4596名中国实体瘤患者参与了这项研究。患者的瘤种分布为：4596患者中肺腺癌2859例(62.1％)，肺鳞癌406例(8.8％)，小细胞肺癌141例(3.1％)，肝细胞肝癌639例(14％)，食管肿瘤254例(5.5％)，乳腺癌174例(3.8％)，头颈癌74例(1.7％)，子宫内膜癌44例(1％)和皮肤鳞癌5例(0.1％)。
病人的特征如表1所示。大多数NOTCH家族基因突变患者为男性(73.2％vs57.7％，p＜0.001)，NOTCH家族基因突变患者诊断时的中位年龄为61岁。对4596例患者进行TMB检测。整体人群的TMB中位数为5.4muts/Mb。
表1患者表征
实施例2致病性NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因突变在中国实体瘤人群中的发生频率以及和免疫治疗生物标志物TMB之间的相关性
中国人群NOTCH家族基因(NOTCH1/2/3/4)总体的突变比例为9.6％(图1)。其中食管肿瘤(30.7％)，子宫内膜癌(20.5％)，小细胞肺癌(19.9％)，肺鳞癌(17.7％)和头颈部肿瘤(11.7％)的突变比例较高。
NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3和NOTCH4在中国实体瘤中的突变比例分别为4.6％，1.9％，2.2％和1.7％(图2)。
NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因主要变异形式的突变频率见图3：NOTCH1点突变2.6％、截短变异1.6％、扩增0.3％和融合/重排0.3％；NOTCH2点突变1.1％、截短变异0.3％、扩增0.5％；NOTCH3点突变1.5％、截短变异0.2％、扩增0.4％；NOTCH4点突变1.1％、截短变异0.3％、扩增0.1％和融合/重排0.1％；
全瘤种中，NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因变异患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：10vs.4.6，p<0.001)(图4A)；NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因点突变或截短突变患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：10.8vs.4.6，p<0.001)(图4B)。
全瘤种中，NOTCH1基因变异患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：9.2vs.4.6，p<0.001)；NOTCH2基因变异患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：11.65vs.4.7，p<0.001)；NOTCH3基因变异患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：13.1vs.5，p<0.001)；NOTCH4基因变异患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：11.6vs.5，p<0.001)；(图5)
NOTCH1基因点突变或截短突变患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：9.25vs.4.6，p<0.001)；NOTCH2基因点突变或截短突变患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：13.1vs.5，p<0.001)；NOTCH3基因点突变或截短突变患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：10.45vs.4.7，p<0.001)；NOTCH4基因点突变或截短突变患者的TMB显著高于野生型(中位TMB：13.1vs.5，p<0.001)；(图6)
NOTCH家族(NOTCH1-4)四突变位点比较分散，没有明显的热点突变区域(图7)。
实施例3 NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因变异作为免疫治疗biomarker的临床数据验证
为了进一步验证NOTCH家族(NOTCH1-4)四突变对于免疫检查点抑制剂(ICIs)治疗的预测价值，我们通过下载公共数据库队列信息进行外部验证。我们在cBioPortal网站(http://www.cbioportal.org/)下载了Robert M.Samstein等人上传的队列数据，RobertM.Samstein队列纳入了1661名接受抗PD-(L)1单药治疗或抗PD-(L)1+抗CTLA-4联合治疗方案的实体瘤癌患者，具体患者基线资料可参考文献(Samstein RM,Lee C-H,Shoushtari ANet al.Tumor mutational load predicts survival after immunotherapy acrossmultiple cancer types.Nature genetics 2019)。1661个患者中，NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因突变患者有296名(17.8％)，NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因变异组的患者接受免疫治疗后的中位总生存时间(median OS)较NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因野生型患者长(中位OS：32vs.16月，p<0.001)(图8)。Cox多因素分析结果进一步说明NOTCH家族(NOTCH1-4)四基因变异是免疫治疗预后的独立预测风险因素(HR:0.73,95％CI:0.6-0.89,p＝0.002)(图9)。
进一步分析NOTCH家族基因突变个数与免疫治疗疗效的相关性，RobertM.Samstein队列中1365例为NOTCH家族蛋白野生型(突变个数0)，217例有一个NOTCH家族基因突变(突变个数1)，59例有2个NOTCH家族基因突变(突变个数2)，16例有3个NOTCH家族基因突变(突变个数3)，4例有4个NOTCH家族基因突变(突变个数4)，随着NOTCH基因突变个数增加，TMB逐渐升高，突变个数3和4组的TMB显著高于其他三组(p<0.05)(图10)。同样生存分析结果也显示NOTCH基因突变个数大于等于3组的中位OS显著长于突变个数小于3以及没有NOTCH基因突变组(p<0.001)(图11)。NOTCH基因突变个数大于等于3组的中位OS为NA(95％CI：21-NA)，NOTCH基因突变个数小于3组的中位OS为31(95％CI：22-47)，NOTCH基因突变个数为0(野生型)组的中位OS为16(95％CI：15-19)。COX多因素回归分析进一步证实NOTCH家族基因突变个数是免疫治疗独立预测因素。NOTCH基因突变大于等于3组vs NOTCH基因突变个数为0(野生型)：HR:0.36,95％CI:0.13-0.95,p＝0.04；NOTCH基因突变个数小于3组vsNOTCH基因突变个数为0(野生型)：HR:0.76,95％CI:0.62-0.93,p＝0.007(图12)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (11)
1.NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是所述实体瘤患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感的指征；
所述NOTCH家族选自NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4中的至少一种。
2.NOTCH家族基因变异的检测剂在制备用于预测实体瘤患者肿瘤突变负荷程度的试剂盒中的应用，其中NOTCH家族基因变异的存在是高肿瘤突变负荷的指征；
所述NOTCH家族选自NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述免疫检查点抑制剂为PD1抑制剂和/或PD-L1抑制剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述基因变异包括点突变、截短突变、扩增变异以及融合/重排中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因变异包括点突变和截短突变。
6.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测剂于核酸水平进行检测。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行以下任一种方法：
限制性片段长度多态性法、单链构象多态性法、聚合酶链反应、竞争性等位基因特异性PCR、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、核酸测序法、核酸分型芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法、Snapshot法、Taqman探针法、原位杂交、生物质谱法以及HRM法。
8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述检测剂于蛋白水平进行检测。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于执行以下任一种方法：
生物质谱法、氨基酸测序法、电泳法以及用特异性针对突变位点所设计的抗体进行检测。
10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括样品的处理试剂，所述样品的处理试剂包括样品裂解试剂、样品纯化试剂以及样品核酸提取试剂中的至少一种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述样品选自所述实体瘤患者的血液、血清、血浆、脑脊髓液、组织或组织裂解液、细胞培养上清、精液以及唾液样品中的至少一种。
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