KR20110031315A - Ｎｏｔｃｈ-결합제 및 길항제 및 이들의 사용 방법 - Google Patents

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모린 피치 브룬스
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Abstract

본 발명은 Notch-결합제 및 Notch 길항제, 및 암과 같은 질환의 치료를 위해 상기 작용제 및/또는 길항제를 사용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체 (예컨대, Notch2 및/또는 Notch3)의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 인간 Notch 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.

Description

ＮＯＴＣＨ-결합제 및 길항제 및 이들의 사용 방법 {NOTCH-BINDING AGENTS AND ANTAGONISTS AND METHODS OF USE THEREOF}
본 발명은 인간 Notch 수용체에 결합하는 작용제를 포함하는 조성물, 및 암 및 여타 질환의 치료를 위해 상기 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 예를 들어, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 인간 Notch 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
Notch 신호전달 경로는 배아 패턴 형성, 후배 조직 유지 및 줄기 세포 생물학의 여러 중요 조절자들 중 하나이다. 보다 구체적으로, Notch 신호전달은 인접 세포 운명간 횡억제 과정에 관여하며, 비대칭 세포 분열 동안 세포 운명 결정에서 중요한 역할을 한다. 비조절성 Notch 신호전달은 수많은 인간 암과 연관되어 있으며, 여기서 상기 신호전달은 종양 세포의 발생 운명을 변화시켜 이들 종양 세포를 미분화 및 증식 상태로 유지시킬 수 있다 (문헌 [Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]). 따라서, 암종형성은, 줄기 세포 집단에 의한 정상적인 발생 및 조직 회복을 제어하는 항상성 메카니즘의 와해를 통해 진행될 수 있다 (문헌 [Beachy et al., 2004, Nature 432:324]).
Notch 수용체는 날개 가장자리에 톱니무늬 (notch)를 생성하는 유전자 단배수 결손 (haploinsufficiency)을 갖는 초파리 돌연변이체에서 처음으로 확인되었고, 한편 기능 소실은 상피 세포의 그 운명이 신경 조직으로 변화되는 배아 치명적 "신경성 (neurogenic)" 표현형을 생성한다 (문헌 [Moohr, 1919, Genet. 4:252]; [Poulson, 1937, PNAS 23:133]; [Poulson, 1940, J. Exp. Zool. 83:271]). Notch 수용체는 거대한 세포외 도메인 내에 다수의 직렬 상피 성장 인자 (EGF)-유사 반복부 및 3개의 시스테인-풍부 Notch/LIN-12 반복부를 함유하는 단일-통과(single-pass) 막횡단 수용체이다 (문헌 [Wharton et al., 1985, Cell 43:567]; [Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6:3094]; [Artavanis et al., 1999, Science 284:770] (검토)). 4종의 포유동물 Notch 단백질이 확인되었고 (Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4), 이들 수용체에서의 돌연변이는 항상 발생 이상 및 인간 병리 (아래 상술된 바와 같은 여러가지 암 포함)를 일으킨다 (문헌 [Gridley, 1997, Mol. Cell Neurosci. 9:103]; [Joutel ＆ Tournier-Lasserve, 1998, Semin. Cell Dev. Biol. 9:619-25]).
Notch 수용체는 Delta, Serrated, Lag-2 (DSL) 족의 단일-통과 막횡단 리간드에 의해 활성화된다. 포유동물에는 5종의 공지된 Notch 리간드가 있다: 세포외 도메인 내에 DSL 도메인 및 직렬 EGF-유사 반복부가 있는 것을 특징으로 하는 Delta-like 1 (DLL1), Delta-like 3 (DLL3), Delta-like 4 (DLL4), Jagged 1 (JAG1) 및 Jagged 2 (JAG2). Notch 수용체의 세포외 도메인은, 전형적으로는 인접한 세포 상에 있는 리간드와 상호작용하여, 2개의 Notch 단백질 절단, ADAM (A Disintegrin And Metallopeptidase) 프로테아제에 의해 매개된 세포외 절단 (1개), 및 감마 세크레타제에 의해 매개된 막횡단 도메인내 절단 (1개)을 일으킨다. 후자 절단은 Notch 세포내 도메인 (ICD)을 생성하고, 이어서 이는 핵에 진입하여 Hairy and Enhancer of Split [E(spl)] 족의 핵 염기성 나선-루프-나선 전사 인자의 전사를 증가시키는 주요 하류 이펙터인 CBF1, Su(H) (Suppressor of Hairless), Lag-2 (CSL) 족의 전사 인자들을 활성화시킨다 (문헌 [Artavanis et al., 1999, Science 284:770]; [Brennan and Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543]). 또한, 초파리에서 확인된 세포질 단백질 Deltex를 포함하는 또다른 세포내 경로가 포유동물에 존재할 수 있고 (문헌 [Martinez et al., 2002, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:524-33]), 이러한 Deltex-의존적 경로는 Wnt 표적 유전자의 발현을 저해하는 작용을 할 수 있다 (문헌 [Brennan et al., 1999, Curr. Biol. 9:707-710]; [Lawrence et al., 2001, Curr. Biol. 11:375-85]).
포유동물 Notch 수용체는 절단을 통해 성숙 수용체를 형성하고, 이어서 리간드 결합을 통해 하류 신호전달을 활성화시킨다. 푸린 (furin)-유사 프로테아제는 성숙 동안 Notch 수용체를 절단하여, 자기-억제 상태로 함께 고정된 비-공유결합적으로 결합된 세포외 서브유닛 및 막횡단 서브유닛을 포함하는 막근접 이종이량체를 생성한다. 리간드 결합은 이러한 억제를 감소시키며 ADAM형 메탈로프로테아제 및 감마-세크레타제에 의한 Notch 수용체 절단을 유도하고, 이때 감마-세크레타제는 세포내 도메인 (ICD)을 세포질 내로 방출함에 따라 ICD가 핵으로 전위되어 유전자 전사를 활성화시킬 수 있다. ADAM에 의한 절단은 막 근위부 음성 조절 영역 내에 있는 비-리간드 결합 절단 도메인 내에서 발생한다.
조혈 줄기 세포 (HSC)는 신체에서 가장 잘 알려져 있는 줄기 세포이고, Notch 신호전달은 상기 세포의 정상적인 유지 및 백혈병 전환에 관여한다 (문헌 [Kopper ＆ Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]). HSC는 성인 골수 내의 기질 함요부에 있는 희귀 세포 집단이다. 이들 세포는 독특한 유전자 발현 프로파일, 및 보다 분화된 전구 (progenitor) 세포들을 연속적으로 생성하여 전체 조혈계를 재구성할 수 있는 능력을 특징으로 한다. HSC 및 전구 세포에서 Notch1 신호전달의 구성적 활성화는 시험관내에서 및 장기적 재구성 검정에서 림프 및 골수 세포를 생성하는 불멸화 세포주를 조성하고 (문헌 [Varnum-Finney et al., 2000, Nat. Med. 6:1278-81]), Jagged1의 존재는 HSC가 풍부화된 인간 골수 세포 집단의 생착을 증가시킨다 (문헌 [Karanu et al., 2000, J. Exp. Med. 192:1365-72]). 보다 최근에는, Notch 신호전달이 생체내 HSC에서 연구되었고, HSC 분화의 억제에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, Notch 신호전달은 Wnt-매개된 HSC 자가-재생에 필수적인 것으로 보인다 (문헌 [Duncan et al., 2005, Nat. Immunol. 6:314]).
또한, Notch 신호전달 경로는 신경 줄기 세포의 유지에 있어서 중추적 역할을 수행하며, 상기 세포의 정상적인 유지뿐만 아니라 뇌암에도 관여한다 (문헌 [Kopper ＆ Hajdu, 2004, Pathol. Oncol. Res. 10:69-73]; [Purow et al., 2005, Cancer Res. 65:2353-63]; [Hallahan et al., 2004, Cancer Res. 64:7794-800]). 신경 줄기 세포는 발생 동안 포유동물 신경계의 모든 뉴런 및 아교 세포를 생성하고, 보다 최근에는 성인 뇌에서 확인되었다 (문헌 [Gage, 2000, Science 287:1433-8]). Notch1; Notch 표적 유전자인 Hes1, 3 및 5; 및 Notch 신호전달 PS1 (presenilin1) 조절자가 결핍된 마우스의 경우, 배아 신경 줄기 세포의 수가 감소된 것으로 나타난다. 또한, 성인 신경 줄기 세포는 PS1 동형접합체 마우스의 뇌에서 감소된다 (문헌 [Nakamura et al., 2000, J. Neurosci. 20:283-93]; [Hitoshi et al., 2002, Genes Dev. 16:846-58]). 신경 줄기 세포의 감소는 이들 세포가 뉴런으로 미성숙 분화됨에 따라 발생하는 것으로 보이며 (문헌 [Hatakeyama et al., 2004, Dev. 131:5539-50]), 이는 Notch 신호전달이 신경 줄기 세포 분화 및 자가-재생을 조절함을 시사한다.
이상 Notch 신호전달은 수많은 인간 암에 관여한다. 인간의 Notch1 유전자는 T-세포 급성 림프모세포성 백혈병 아류에서 Notch 경로의 활성화를 일으키는 전위된 좌위로서 최초 확인되었다 (문헌 [Ellisen et al., 1991, Cell 66:649-61]). 마우스 모델에서, T-세포에서의 Notch1 신호전달의 구성적 활성화는 T-세포 림프종을 유사하게 생성한다 (원인적 역할을 시사함) (문헌 [Robey et al., 1996, Cell 87:483-92]; [Pear et al., 1996, J. Exp. Med. 183:2283-91]; [Yan et al., 2001, Blood 98:3793-9]; [Bellavia et al., 2000, EMBO J. 19:3337-48]). 또한, 이상 Notch1 신호전달을 생성하는 Notch1 지점 돌연변이, 삽입 및 결실은 유년기 및 성인 T-세포 급성 림프모세포성 백혈병/림프종 둘 다에서 빈빈하게 존재하는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Pear ＆ Aster, 2004, Curr. Opin. Hematol. 11:416-33]).
유두 종양에서 마우스 유두 종양 바이러스가 Notch1 및 Notch4 좌위로 빈번하게 삽입되는 것 및 이에 따른 활성화된 Notch 단백질 단편은 우선, 유방암에서의 Notch 신호전달에 관여하였다 (문헌 [Gallahan ＆ Callahan, 1987, J. Virol. 61:66-74]; [Brennan ＆ Brown, 2003, Breast Cancer Res. 5:69]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 트랜스제닉 마우스에서의 추가 연구에서는, 정상적인 유선 발생 동안 유관 가지형성에서 Notch의 역할이 확인되었고, 유두 상피 세포에서 구성적 활성화 형태의 Notch4는 상피 분화를 억제하여 종양형성을 일으킨다 (문헌 [Jhappan et al., 1992, Genes ＆ Dev. 6:345-5]; [Gallahan et al., 1996, Cancer Res. 56:1775-85]; [Smith et al., 1995, Cell Growth Differ. 6:563-77]; [Soriano et al., 2000, Int. J. Cancer 86:652-9]; [Uyttendaele et al., 1998, Dev. Biol. 196:204-17]; [Politi et al., 2004, Semin. Cancer Biol. 14:341-7]). 인간 유방암에서 Notch의 역할에 관한 증거는, 유방 암종에서의 Notch 수용체 발현을 나타내는 데이터 및 이 데이터와 임상 결과와의 상호관련성에 의해 제공된다 (문헌 [Weijzen et al., 2002, Nat. Med. 8:979-86]; [Parr et al., 2004, Int. J. Mol. Med. 14:779-86]). 또한, Notch 경로의 과다발현이 자궁경부암 (문헌 [Zagouras et al., 1995, PNAS 92:6414-8]), 신장 세포 암종 (문헌 [Rae et al., 2000, Int. J. Cancer 88:726-32]), 두경부 편평 세포 암종 (문헌 [Leethanakul et al., 2000, Oncogene 19:3220-4]), 자궁내막암 (문헌 [Suzuki et al., 2000, Int. J. Oncol. 17:1131-9)] 및 신경모세포종 (문헌 [van Limpt et al., 2000, Med. Pediatr. Oncol. 35:554-8])에서 관측되었으며, 이들은 수많은 신생물의 발생에 있어서 Notch의 잠재적 역할을 시사한다. 흥미롭게도, Notch 신호전달은 결장의 Apc-돌연변이체 신생물 세포의 미분화 상태 유지에 있어서 소정의 역할을 할 수 있다 (문헌 [van Es ＆ Clevers, 2005, Trends in Mol. Med. 11:496-502]).
Notch 경로는 또한, 증식, 이동, 평활근 분화, 맥관형성 및 동정맥 분화를 비롯한 혈관 발생의 여러 측면에 관여한다 (문헌 [Iso et al., 2003, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23:543]). 예를 들어, Notch1/4 및 Jagged1에서의 동형접합 널 (null) 돌연변이, 및 DLL4의 이형접합성 소실은 동맥 발생 및 난황 sac 혈관신생에서 심각하고 곤란한 각종 결함을 일으킨다. 또한, DLL1-결핍 및 Notch2-하이포모픽 (hypomorphic) 마우스 배아의 경우, 아마도 불량한 혈관 구조 발생으로 인한 출혈이 나타난다 (문헌 [Gale et al., 2004, PNAS, 101:15949-54]; [Krebs et al., 2000, Genes Dev. 14:1343-52]; [Xue et al., 1999, Hum. Mel. Genet. 8:723-30]; [Hrabe de Angelis et al., 1997, Nature 386:717-21]; [McCright et al., 2001, Dev. 128:491-502]). 인간의 경우, Jagged1에서의 돌연변이는 알라질 증후군 (Alagille syndrome), 즉 혈관 결함을 포함하는 발생 장애와 연관되어 있고, Notch3에서의 돌연변이는 혈관 항상성에 결함이 있는 유전성 혈관 치매 (카다실)의 원인이 된다 (문헌 [Joutel et al., 1996, Nature 383:707-10]).
항-Notch 항체 및 항암 치료제로서의 그의 가능한 용도는 종래에 보고된 바 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0131434호 (그의 전문은 본원에 포함됨)를 참조한다. 또한, 국제 공개공보 제WO 2008/057144호 및 제WO 2008/076960호, 및 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0226621호, 제2008/0118520호 및 제2008/0131908호를 참조한다.
[발명의 요약]
본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체에 대한 신규 Notch-결합제 및 신규 길항제, 및 상기 작용제 및 길항제의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 신규 폴리펩티드, 예컨대 하나 이상의 인간 Notch 수용체에 결합하는 항체, 이러한 항체의 단편, 상기 항체와 관련된 다른 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3의 길항제, 예를 들어 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체 (이에 제한되지는 않음)를 제공한다. 본원에 사용된 어구 "Notch2 및/또는 Notch3"은 "Notch2", "Notch3" 또는 "Notch2 및 Notch3 둘 다"를 의미한다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 다른 길항제는 리간드-결합 도메인의 외부에 있는 Notch 수용체의 특정 영역 (예를 들어, Notch2의 EGF10 또는 Notch3의 EGF9)에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 인간 Notch3 둘 다에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다. 또한, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포가 제공된다. 또한, 신규 Notch 길항제를 포함하는 조성물 (예를 들어, 제약 조성물)이 제공된다. 또한, 상기 작용제 및 길항제의 사용 방법, 예컨대 Notch 길항제를 사용하여 종양 성장을 억제하고/거나, 종양의 종양형성 가능성 (tumorigenicity)을 감소시키고/거나, 맥관형성을 억제하고/거나, 맥관형성과 연관된 암 또는 여타 질환을 치료하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체의 EGF10 도메인 (또는 EGF10 도메인의 등가물)에 특이적으로 결합하는 작용제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2의 EGF10 및/또는 인간 Notch3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. EGF9는 다른 인간 Notch 수용체인 Notch1, Notch2 및 Notch4의 EGF10과 동등한 인간 Notch3 내에 있는 EGF이다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch 2의 EGF10에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch2의 EGF10 및 Notch3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 Notch2의 EGF10 내에 있는 서열 HKGAL (서열 28)의 적어도 일부에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch3의 EGF9 내에 있는 서열 HEDAI (서열 29)의 적어도 일부에 결합한다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 및 본원의 다른 부분에 기재된 여타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 작용제는 리간드와 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 결합을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 리간드와 인간 Notch2의 결합을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 리간드와 Notch2 및 Notch3의 결합을 억제한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 리간드와 Notch3의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 리간드는 DLL4, JAG1 또는 JAG2이다. 다른 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2의 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch2 및 Notch3의 신호전달을 억제한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 Notch3의 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, Notch2 및/또는 Notch3 신호전달은 DLL4, JAG1 또는 JAG2에 의해 유도된다. 또한, 상기 작용제를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 작용제를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 (G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N) (서열 30)을 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 SIFYPT (서열 22)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 SSSFFAS (서열 23)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체는 SSFYAS (서열 24)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 SSFFAT (서열 25)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 SIFYPS (서열 26)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 항체는 SSFFAN (서열 27)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 50, 서열 14, 서열 40, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57 또는 서열 20에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음) (예를 들어, 중쇄 가변 영역); 및/또는 (b) 서열 13, 서열 19 또는 서열 39에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음) (예를 들어, 경쇄 가변 영역)를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 Notch2에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리펩티드는 Notch2 및 Notch3에 결합한다. 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 Notch3에 결합한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 14, 서열 13 또는 서열 50에 대한 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 100％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 폴리펩티드를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 49, 서열 16 또는 서열 2에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음); 및/또는 (b) 서열 18 또는 서열 4에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음)를 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 39 또는 서열 40에 대한 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 100％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 치료적 유효량의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 50에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 13에 대한 약 80％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 항체, 또는 항체의 중쇄 또는 경쇄)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 서열 50 또는 서열 13에 대한 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 약 98％ 이상 또는 약 100％의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 결합하는 항체이다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 치료적 유효량의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 서열 16의 중쇄 및 서열 18의 경쇄를 포함하는 59R1 IgG2 항체 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음), 또는 부다페스트 조약의 규정 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, 미국 버지니아주 매사사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2008년 10월 15일자로 기탁된 DNA (지정 번호 PTA-9547이 부여됨)에 의해 코딩되는 59R1 IgG2 항체를 포함하거나, 상기 항체로 구성되거나, 상기 항체로 본질적으로 구성된 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 서열 49의 중쇄 및 서열 18의 경쇄를 포함하는 59R5 IgG2 항체 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음), 또는 ATCC에 2009년 7월 6일자로 기탁된 DNA (지정 번호가 부여됨)에 의해 코딩되는 59R5 IgG2 항체를 포함하거나, 상기 항체로 구성되거나, 상기 항체로 본질적으로 구성된 항체를 제공한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 Notch3과의 특이적 결합에 대해, 서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 특이적 결합에 대해, 서열 16의 중쇄 및 서열 18의 경쇄를 포함하는 59R1 IgG2 항체 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음), 또는 ATCC에 2008년 10월 15일자로 기탁된 DNA (지정 번호 PTA-9547이 부여됨)에 의해 코딩되는 59R1 IgG2 항체와 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2와의 결합에 대해 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 Notch3과의 결합에 대해 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3과의 결합에 대해 경쟁한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
또다른 측면에서, 항체는 인간 Notch2 및/또는 Notch3과의 특이적 결합에 대해, 서열 50을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 특이적 결합에 대해, 서열 49의 중쇄 및 서열 18의 경쇄를 포함하는 59R5 항체, 또는 ATCC에 2009년 7월 6일자로 기탁된 DNA (지정 번호가 부여됨)에 의해 코딩되는 59R5 항체와 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2와의 결합에 대해 경쟁한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 Notch3과의 결합에 대해 경쟁한다. 다른 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3과의 결합에 대해 경쟁한다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 맥관형성의 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양형성 가능성의 감소 및/또는 암의 치료와 같은 용도를 위해 상기 항체를 사용하는 방법이 제공된다.
다른 특정 측면에서, 본 발명은 서열 2, 서열 4, 서열 16, 서열 18, 서열 13, 서열 14, 서열 39, 서열 40, 서열 19, 서열 20, 서열 49, 서열 50, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56 및 서열 57로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드 (신호 서열을 포함하거나 포함하지 않음), 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 서열 1, 서열 3, 서열 15, 서열 17, 서열 47, 서열 48, 서열 58, 서열 59 및 서열 60으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 대상체에서 종양 또는 다른 이상 맥관형성의 부위)에서 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 작용제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 앞서 언급된 측면 및/또는 실시양태, 및 본원에 기재된 여타 측면 및/또는 실시양태 중 어느 하나에 기재된 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하며 인간 Notch3의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하면 맥관형성 및/또는 종양 성장이 억제된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 맥관형성 (예를 들어, 종양 맥관형성)을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 작용제의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2에 특이적으로 결합하며 인간 Notch2의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하며 인간 Notch3의 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 Notch2 및 Notch3 둘 다의 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 작용제는 앞서 언급된 측면 및/또는 실시양태, 및 본원에 기재된 여타 측면 및/또는 실시양태 중 어느 하나에 기재된 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 항체가 아니다. 몇몇 실시양태에서, 맥관형성의 억제 방법은 대상체에게 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF) 또는 VEGF 수용체의 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 방법은 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절함으로써 맥관형성을 억제하는 방법이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체에게 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3의 길항제의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch2에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch2 및 인간 Notch3 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 앞서 언급된 측면 및/또는 실시양태, 및 본원에 기재된 여타 측면 및/또는 실시양태 중 어느 하나에 기재된 항체이다. 특정 실시양태에서, 종양은 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 유전자에 결실 또는 다른 돌연변이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3 길항제의 처치를 위해 대상체를 선별하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 종양이 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 유전자에 결실 또는 돌연변이를 포함하는지 여부를 결정하고; (b) 종양이 결실 또는 돌연변이를 포함하는 경우, 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3 길항제의 처치를 위해 대상체를 선별하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 Notch2 길항제로 처치된다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 Notch2 및 Notch3의 길항제로 처치된다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 Notch3의 길항제로 처치된다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개의 Notch 수용체)의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 비-리간드 결합 영역은 인간 Notch 수용체의 EGF 반복부 10 (또는 EGF10의 등가물, 예컨대 인간 Notch3의 EGF9)을 포함하거나 이로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 종양 성장을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 리간드와 Notch 수용체의 결합을 억제한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch 수용체에 의한 신호전달을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체는 인간 Notch1, Notch2, Notch3 또는 Notch4 수용체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch2 (예를 들어, Notch2의 EGF10)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch2 및 하나 이상의 추가의 Notch 수용체에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 추가의 Notch 수용체는 Notch3이다. 또한, 상기 항체를 포함하는 제약 조성물, 및 치료적 유효량의 상기 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 제공된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 둘 이상 (즉, 적어도 둘 또는 둘, 셋 또는 넷)의 인간 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 둘 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체가 Notch1, Notch2 또는 Notch4를 포함하는 경우, 항체는 Notch1, Notch2 또는 Notch4의 EGF10에 결합하고, 둘 이상의 인간 Notch 수용체가 Notch3을 포함하는 경우, 항체는 Notch3의 EGF9에 결합한다. 특정 실시양태에서, 비-리간드 결합 영역은 EGF4가 아니다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체는 Notch2를 포함한다. 특정 실시양태에서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체는 Notch3을 포함한다. 또한 추가의 실시양태에서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체는 Notch2 및 Notch3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 둘 이상의 인간 Notch 수용체의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 항체는 종양 성장을 억제한다. 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch2 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체를 제공하고, 여기서 비-리간드 결합 영역은 인간 Notch2 수용체의 EGF 반복부 10 (예를 들어, 서열 36)을 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 EGF 반복부 10의 외부의 인간 Notch2의 임의의 영역에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 또한 하나 이상의 추가적 인간 Notch 수용체의 EGF 반복부 10 (또는 등가물) (예를 들어, Notch3의 EGF9)에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 EGF10 및 Notch3 EGF9에 결합한다. 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch3 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하며 종양 성장을 억제하는 단리된 항체를 제공하며, 여기서 비-리간드 결합 영역은 인간 Notch3 수용체의 EGF 반복부 9 (다른 Notch 수용체에서의 EGF10에 대한 등가물)를 포함하거나 이로 이루어진다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 EGF 반복부 9 외부의 인간 Notch3의 임의의 영역에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 또한 하나 이상의 추가적 인간 Notch 수용체의 EGF 반복부 10에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3 EGF9 및 Notch2 EGF10에 결합한다. 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다.
또한 추가적 측면에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하고 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체는 Notch2이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 수용체의 EGF10 및/또는 인간 Notch3 수용체의 EGF9에 결합한다. 추가의 측면에서, 본 발명은 경쟁적 결합 검정에서 Notch2의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다. 조성물을 투여하는 것을 포함하는 맥관형성의 억제 방법이 또한 제공된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하고 하기를 포함하는 항체를 제공한다: (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체는 Notch2이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 Notch3 수용체에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 수용체의 EGF10 및/또는 인간 Notch3 수용체의 EGF9에 결합한다. 또다른 실시양태에서, 본 발명은 경쟁적 결합 검정에서 Notch2의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 항체를 포함하는 제약 조성물 및 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법이 또한 제공된다. 조성물을 투여하는 것을 포함하는 맥관형성의 억제 방법이 또한 제공된다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2 및 인간 Notch3 둘 다에 특이적으로 결합한다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 1가, 2가 또는 다가이다. 특정 실시양태에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체의 개별 항원-결합 부위는 하나 초과의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2 및 Notch3)의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합한다 (또는 결합할 수 있다). 다른 특정 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 세포독성 잔기에 접합된다. 특정 실시양태에서, 항체는 단리된다. 또한 추가의 실시양태에서, 항체는 실질적으로 순수하다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 항체로 치료되는 암 또는 종양은 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 전립선 또는 두경부의 암 또는 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 흑색종이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 유방암 또는 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 결장직장암 또는 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 췌장암 또는 종양이다. 특정 실시양태에서, 암 또는 종양은 전립선암 또는 종양이다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 암의 치료 방법은 종양 성장을 억제하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암의 치료 방법은 (예를 들어, 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써) 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 것을 포함한다
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 길항제 또는 항체는 암에 대한 추가의 치료와 조합되어 대상체에 투여된다. 특정 실시양태에서, 암에 대한 추가의 치료는 방사선 요법, 화학요법 및/또는 추가의 항체 치료제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 암에 대한 추가의 치료는 화학요법 작용제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학요법은 파클리탁셀 (예를 들어, 탁솔), 이리노테칸, 젬시타빈 및/또는 옥살리플라틴을 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 항체 치료제는 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch1, 2, 3, 또는 4) 또는 인간 Notch 수용체 리간드 (예를 들어, DLL4 또는 JAG1)에 특이적으로 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 추가의 항체 치료제는 항-DLL4 항체이다. 다른 특정 실시양태에서, 추가의 항체 치료제는 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF)에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제가 VEGF 수용체에 결합한다.
앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태 각각의 특정 실시양태에서, 항체는 항-맥관형성 작용제인 제2 치료제와 조합되어 대상체에 투여된다.
본원에 기재된 항체 또는 기타 폴리펩티드를 포함하거나 생성하는 세포주 (예를 들어, 하이브리도마 세포주)가 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 벡터) (본원에 기재된 항체의 경쇄 가변 영역 또는 중쇄 가변 영역 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 포함)가 또한 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포주와 마찬가지로 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 Notch 수용체에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 암 줄기 세포를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 보다 특정한 측면에서, 본 발명은 대상체에게 하나 이상의 Notch 수용체 족 구성원에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 이들 Notch 수용체 족 구성원을 발현하는 줄기 세포를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인에 결합하며 암에 대하여 치료적으로 효과적인 항체를 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하고 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하고 종양 성장을 억제하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는 암의 치료 방법을 추가로 제공한다.
상기 암을 치료하기 위하여 Notch 수용체 족 구성원 또는 이들 Notch 수용체에 대한 리간드에 결합하는 항체를 이용하는 것의 다양한 장점이 본원에서 고려된다. 몇몇 실시양태에서, 특정 Notch 수용체는 특정 충실성 종양, 예를 들어 유방 및 결장에서 고도로 발현되고, 이는 Notch 수용체에 결합하는 활성 약물에 대한 싱크를 제공한다. 과다발현된 Notch 수용체에 결합하는 항체는 현재 이용가능한 화학요법 약물보다 더 우수한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 인간에게 Notch 수용체에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 암 줄기 세포를 포함하는 암 (하나 이상의 Notch 수용체의 암 줄기 세포에 의한 과다발현을 특징으로 하지 않음)의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 인간에게 (a) Notch 수용체에 결합하며 Notch 수용체를 과다발현하는 암 줄기 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 제1 항체; 및 (b) Notch 수용체에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 제2 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인간에서의 암의 치료 방법을 또한 제공한다.
본 발명은 또한 Notch에 결합하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 유방, 결장, 직장 및 결장직장의 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 유방, 결장, 췌장, 전립선, 폐, 직장 및 결장직장의 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 또다른 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 Notch에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 유방, 결장, 췌장, 전립선, 폐, 직장 및 결장직장의 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 또다른 치료 방법을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법에 (특히) 사용하기 위한 제조품을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 용기 및 그에 함유된 조성물 (여기서 조성물은 Notch에 결합하는 항체를 포함함)을 포함하며, 상기 조성물이 암 줄기 세포를 포함하는 암의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 제조품을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 용기 및 그에 함유된 조성물 (여기서 조성물은 Notch에 결합하는 항체를 포함함)을 포함하며, 상기 조성물이 하나 이상의 Notch 수용체를 발현하는 암 줄기 세포를 포함하는 암의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 제조품을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 추가로 용기 및 그에 함유된 조성물 (여기서 조성물은 Notch 수용체에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체를 포함함)을 포함하며, 상기 조성물이 Notch 수용체의 과다발현을 특징으로 하지 않는 암 줄기 세포를 포함하는 암의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 제조품에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, (a) 조성물을 함유하는 제1 용기 (여기서, 조성물은 Notch 수용체에 결합하며, Notch를 과다발현하는 암 줄기 세포를 포함하는 암 세포의 성장을 억제하는 제1 항체를 포함함); 및 (b) 조성물을 함유하는 제2 용기 (여기서, 조성물은 Notch에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 제2 항체를 포함함)를 포함하는 제조품이 제공된다.
몇몇 실시양태에서, 용기 및 그에 함유된 조성물 (여기서 조성물은 Notch에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체를 포함함)을 포함하고, 상기 조성물이 결장, 췌장, 전립선, 폐, 직장 및 결장직장의 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암의 치료에 사용될 수 있음을 나타내는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는 추가적 제조품이 제공된다.
본 발명은 Notch에 결합하며 Notch 수용체의 리간드 활성화를 차단하는 항체 (예를 들어, 인간 항체 또는 인간화 항체); 상기 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물; 및 세포독성 작용제와 접합된 항체를 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 앞서 언급된 측면 또는 실시양태 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기재된 기타 측면 및/또는 실시양태의 항체 또는 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 제공한다. 기타 실시양태에서, 항체의 제조 방법은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 것을 포함하며, 임의로 숙주 세포 배양물로부터 (예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
더욱이, 본 발명은 앞서 언급된 실시양태 또는 측면에 기재된 바와 같고 또한 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 인간화 또는 인간 항체를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드; 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포; 뿐만 아니라 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 배양하여 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 하는 것을 포함하며 임의로 숙주 세포 배양물로부터 (예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는, 항체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 칼리키마이신 분자에 접합된 Notch에 결합하는 항체를 포함하는 면역접합체, 및 암 (예를 들어, 암 줄기 세포가 Notch를 과다발현하는 암)을 발현하는 Notch의 치료를 위한 상기 접합체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 그룹 또는 다른 대안들의 그룹화 ("및/또는" 또는 "또는"에 의해 분리되는 대안들의 그룹이 포함되나, 이에 제한되지는 않음)의 관점에서 기재되는 경우, 본 발명은 전체로서 열거된 전체 그룹 뿐만 아니라 그룹의 개별적 각 구성원 및 주요 그룹의 모든 가능한 하위 그룹, 또한 하나 이상의 그룹 구성원이 부재한 주요 그룹을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에서 임의의 그룹 구성원 중 하나 이상의 명시적 배제를 고려한다. 예를 들어, "X 및/또는 Y"와 같은 표현은 개별적 "X", 개별적 "Y" 뿐만 아니라 동반적 "X" 및 "Y"를 포함한다.
도 1: 59R1 항체 및 변이체는 인간 Notch2에 결합하고 리간드 결합을 차단한다. (a) 59R1 Fab에 의한 인간 Notch2로의 결합의 FACS 분석. "클론 1"은 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 인간 Notch2에 결합하는 것으로 나타난 59R1 Fab이다. "클론 5"는 Notch2에 결합하지 않는 파지 라이브러리로부터 단리된 상이한 클론의 Fab이다. (b) 59R1 Fab에 의한 리간드 (JAG1) 결합의 차단의 FACS 분석. "클론 1"은 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 인간 Notch2로의 hJagged1 ECD-Fc 융합체의 결합을 차단하는 것으로 나타난 59R1 Fab이다. "클론 5"는 검정에서 리간드 결합을 차단하지 않는 파지 라이브러리로부터 단리된 상이한 클론의 Fab이다. (c) 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 인간 Notch2로의 59R1 IgG2 항체의 결합의 FACS 분석. 59R1 IgG2 항체는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 인간 Notch2에 결합하는 것으로 나타났다. (d) 59R1 IgG2 항체에 의한 리간드 (DLL4) 결합의 차단의 FACS 분석. 59R1 IgG2 항체는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 상에서 인간 Notch2로의 hDLL4 ECD-Fc 융합체의 결합을 차단하는 것으로 나타났다. (e) 59R1의 중쇄 CDR3에 대한 친화도 성숙 전략. 59R1의 중쇄 CDR3의 모 서열을 박스 표시하였다. 허용되는 잔기 변화가 도면에서 모 서열 아래에 표시된다. (f) JAG1 차단력에 대해 친화도 성숙된 59R1 서열의 스크리닝. 개선된 변이체가 화살표로 표시된다.
도 2: 네 개의 인간 Notch 동족체에 대한 59R1 IgG2 항체의 교차-반응성의 FACS 분석. 59R1은 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포 상에서 hNotch2 및 hNotch3에 결합하는 것으로 나타났지만, 동일한 세포 상에서 hNotch1 및 hNotch4에는 유의한 결합을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
도 3: 59R1 항체의 에피토프 맵핑. (a) 항-Notch2/3 항체 59R1은 인간 Notch2의 EGF 반복부 10에 결합한다. 1 내지 12 (x-축) 사이에 Notch2의 표시된 EGF 반복부를 갖는 재조합 Notch2-Fc 융합 단백질을 발현하는 HEK 293 세포로부터의 상층액을 항-Notch2/3 항체 59R1과 함께 ELISA에서 사용하였다. OD (y-축)는 EGF 반복부 10을 포함하는 Notch2 융합 단백질에만 결합하는 항체 (평행선음영 막대)를 나타낸다. (도면은 상단 및 하단 그래프에 별도로 나타낸 별도의 두 실험으로부터 수득된 데이터를 나타낸다.) (b) EGF 반복부 11 및 12는 전장 hNotch2로의 항-Notch2/3 항체 59R1 결합에 관여하지 않는다. 녹색 형광 단백질 (GFP) (x-축) 단독 (상단 좌측)으로 형질감염되거나, 또는 GFP와 무손상 전장 Notch2 또는 EGF 반복부 11 결여를 갖거나 (△EGF11) EGF 반복부 12 결여를 갖는 (△EGF12) 전장 Notch 2로 동시-형질감염된 HEK 293 세포의 FACS 분석. GFP-발현 세포에서 세 개의 모든 Notch2 단백질에 대한 59R1의 결합이 y-축 (PE)을 따라 표시된다. (c) EGF 반복부 10은 전장 hNotch2로의 항-Notch2/3 항체 59R1 결합에는 관여하지만, 리간드 결합에는 관여하지 않는다. hNotch2의 EGF1-4로 결합하는 항-Notch2 항체 59M70에 의한 결합은 "항-Notch2 결합"으로서 표시된다. DLL4에 의한 결합은 "리간드 결합"으로서 표시된다.
도 4: 항-Notch2/3 항체 59R1은 루시페라제 리포터 검정에서 Notch2 신호전달을 억제한다. (a) 59R1은 hDLL4-유도된 Notch2 리포터 활성을 차단한다. (b) 59R1은 hJAG1-유도된 Notch2 리포터 활성을 차단한다. (c) 59R1은 hJAG2-유도된 Notch2 리포터 활성을 차단한다.
도 5: Notch2/3 수용체 항체 59R1은 생체내 종양 형성 및 성장을 억제한다. (a) 항-Notch2/3 (59R1)은 PE13 유방 종양의 형성을 억제한다. PE13 유방 종양 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스를 세포 주사 이틀 후에 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (빈 삼각형)로 처리하고, 시간에 따라 (x-축, 세포 주사 후 일수) 종양 부피 (y-축, mm3)를 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 형성을 유의하게 억제하였다 (p < 0.001). (b) 항-Notch2/3 (59R1)은 T3 유방 종양의 형성을 억제한다. T3 유방 종양 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스를 세포 주사 이틀 후에 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (빈 삼각형)로 처리하고, 시간에 따라 (x-축, 세포 주사 후 일수) 종양 부피 (y-축, mm3)를 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 형성을 유의하게 억제하였다 (p < 0.001). (c) 항-Notch2/3 (59R1)은 Colo-205 결장 종양의 성장을 억제한다. Colo-205 결장 종양 세포가 주사된 스위스 CD-1 백그라운드 상의 6-8 주-령 면역결핍 bg/nu XID 암컷 마우스를 종양 부피가 65 내지 200 mm3의 크기에 도달된 후에 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (다이아몬드)로 처리하였다. 평균 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간에 따라 (x-축, 세포 주사 후 일수) 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 성장을 억제하였다 (40일 후 *** p < 0.001). (d) 항-Notch2/3 (59R1)은 PN4 췌장 종양의 성장을 억제한다. PN4 췌장 종양 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스를 종양 부피가 65 내지 200 mm3의 크기에 도달된 후에 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (다이아몬드)로 처리하였다. 평균 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간에 따라 (x-축, 세포 주사 후 일수) 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 성장을 억제하였다 (70일 후 *** p < 0.001). (e) 항-Notch2/3 (59R1)은 PE13 유방 종양의 성장을 억제한다. PE13 유방 종양 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스를 종양 부피가 65 내지 200 mm3의 크기에 도달된 후에 대조군 항체 (사각형) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (다이아몬드)로 처리하였다. 평균 종양 부피 (y-축, mm3)를 시간에 따라 (x-축, 세포 주사 후 일수) 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 성장을 억제하였다 (57일 후 * p < 0.05). (f) 항-Notch2/3 (59R1)은 T3 유방 종양의 성장을 억제한다. T3 유방 종양 세포가 주사된 NOD/SCID 마우스를 종양 부피가 65 내지 200 mm3의 크기에 도달된 후에 대조군 항체 (짙은 막대) 또는 항-Notch2/3 항체 59R1 (빈 막대)로 처리하였다. 평균 종양 부피를 세포 주사 후 18, 25, 39 및 42일 째에 측정하였다. 59R1 항체로의 처리는 대조군과 비교시 종양 성장을 억제하였다 (42일 째 *** p < 0.001).
도 6: 항-Notch2/3 항체 59R1은 파클리탁셀 처리 후 B51 유방 종양 재발을 지연시킨다.
도 7: 항-Notch2/3 항체 59R1은 B51 유방 종양에서 암 줄기 세포 빈도를 감소시킨다.
도 8: 젬시타빈과 함께, 항-Notch2/3 항체 59R1은 PN4 췌장 종양의 성장을 억제한다.
도 9: 항-Notch2/3 항체 59R1은 M4 흑색종 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제한다.
도 10: 항-Notch2/3 항체 59R1은 단독으로 및 이리노테칸과 함께 C28 결장 종양의 성장을 억제한다.
도 11: 59R1 IgG2 항체는 생체내 확립된 인간 종양 이종이식편의 종양 성장을 유의하게 억제한다. 확립된 Colo-205 (a), C8 (b), PN8 (c), B34 (d), B39 (e), B44 (f), PE-13 (g) 및 T1 (h) 종양 (s.c, 그룹 당 n=10)을 표시된 항체 (1B711, LZ-1 대조군 항체, 검정색 사각형; 59R1, 검정색 삼각형; 아바스틴, 검정색 원; 아바스틴 + 59R1, 검정색 다이아몬드)를 이용해 주 1회 15 mg/kg으로 처리하였다. 종양 부피 (x-축)를 시간에 따라 (y-축) 플로팅하였다. Colo-205 이종이식 모델에서, 59R1과 아바스틴의 조합 요법이 항체 단독 처리보다 더욱 유의하게 효과적이었다. 도 11b-11h에서 별표는 도시된 일자에서의 유의한 종양-성장 억제를 표시한다: *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001, 스튜던트 t-검정(Student's t-test); 기호, 평균; 막대, SEM.
도 12: 선택된 유전자의 상대적 발현 수준이 다양한 이종이식 종양 모델에서 59R1 처리에 의해 유의하게 조절된다. HEYL (a), Notch3 (b), RGS5 (c), ANGPT1 (d) 및 ANGPT2 (e)의 발현 수준을 미리 시험된 이종이식 모델로부터의 타크만(TaqMan, 등록상표) 분석에 의해 개별적으로 시험하였다. 현저하게, 에스트로겐 (ne)의 결핍은 T1 보유 마우스의 숙주 기질에서의 ANGPT1 및 ANGPT2 발현의 감소에 대한 59R1의 효과를 폐기한다. 빈 원은 분석된 개별 종양에 상응한다. 수평선, 평균.
도 13: 59R1이 항-종양 효능을 나타낸 수많은 유방 종양에서 종양 저해자 PTEN 유전자가 결실된다. PTEN 엑손, 어피매트릭스(Affymetrix) 프로브 분포, 및 염색체 10에서의 PTEN 유전자에서의 결실이 나타난다. 두껍고 얇은 회색-음영 막대는 각각 염색체 단편의 동형접합 및 이형접합 결실을 나타낸다.
도 14. 59R1 항체의 에피토프 맵핑. (a) 인간 Notch 동족체의 단백질 정렬. 정렬을 클론 매니저 소프트웨어(Clone Manager Software)에 의해 수행하였다. 인간 Notch1, Notch2 및 Notch4의 EGF 10 반복부, 및 인간 Notch3, EGF9에서의 등가물 EGF가 표시된 바와 같다. 박스 영역은 hNotch2 H385N AL 388-89 SN 돌연변이체 (도 14b) 및 382-386이 hNotch2 서열에 상응하도록 돌연변이된 hNotch1 구조체 (도 14c)로의 59R1 IgG2 항체의 FACS 결합에 의하여 한정되는 바와 같은 59R1 에피토프의 적어도 일부를 구성하는 하나 이상의 아미노산(들)을 함유하는 영역을 나타낸다. (b) 59R1 IgG2 항체는 hNotch2에 결합하지만 특정 EGF 10 잔기가 hNotch1 잔기로 돌연변이된 돌연변이체 hNotch2 (H385N AL 388-89 SN)에는 결합하지 않는다. (c) 59R1 IgG2 항체는 hNotch1에 결합하지 않지만, 특정 EGF 10 잔기 (aa 382-387)가 hNotch2 잔기 385-389에 매칭되도록 돌연변이된 돌연변이체 hNotch1에는 결합한다.
도 15. 59R5의 시험관내 특징화. (a) 도 15a는 항체 59R5가 Notch2 및 Notch3의 리간드-유도된 신호전달을 차단할 수 있음을 나타낸다. PC3 종양 세포는 인간 또는 마우스 Notch 수용체 (hN2, 인간 Notch2; mN2, 뮤린 Notch2; hN3, 인간 Notch3; mN3, 뮤린 Notch3) 및 GFP 유도가능한 리포터 구조체로 일시적으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포를 수동적으로 고정된 DLL4 Fc의 존재 하에 상이한 농도의 항체 59R1 및 59R5와 함께 인큐베이션하였다. (b) 도 15b는 59R5가 59R1과 유사한 에피토프에 결합하는 것을 나타낸다. HEK 293 세포는 인간 Notch2, 인간 Notch1, 또는 상응하는 인간 Notch2 잔기로 돌연변이된 잔기 382-386을 갖는 인간 Notch1을 코딩하는 발현 벡터로 일시적으로 형질감염되었다. 세포를 또한 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 플라스미드로 동시-형질감염시켜, 형질감염된 플라스미드를 수용하는 이들 세포를 마킹하였다. 세포를 59R1 또는 59R5 및 형광 2차 항체와 인큐베이션한 후, FACS로 검사하였다. 박스로 강조된 영역은 표시된 Notch 발현 벡터로 형질감염된 세포가 59R1 또는 59R5에 결합할 수 있음을 시사한다.
도 16. Notch 수용체 항체 59R5는 생체내 종양 형성 및 성장을 억제한다. 도 16a는 항체 59R5를 이용한 PE13 유방 종양 세포의 생체내 처리를 보여준다. 도 16b는 항체 59R5를 이용한 C28 결장 세포의 생체내 처리를 보여준다. 도 16c는 항체 59R5를 이용한 Colo205 결장 세포의 생체내 처리를 보여준다.
도 17. 조합 치료에서의 Notch2/3 항체 59R5를 이용한 종양의 생체내 처리. (a) 마우스에 PN8 췌장 종양 세포를 주사하였다. 종양의 평균 부피가 120 mm3에 도달되기까지 33일 동안 종양을 성장시켰다. 동물을 대조군 Ab (사각형), 59R1 (삼각형) 또는 59R5 (원)와 함께 4주 동안 주 1회 20 mg/kg의 젬시타빈으로 처리하였다. (b) 마우스에 PE13 유방 종양 세포를 주사하였다. 40일 동안 종양을 성장시킨 후 처리를 개시하였다. 대조군 항체 (사각형) 또는 59R5 (원)에 더하여 5주 동안 주 2회 15 mg/kg의 탁솔로 동물을 처리하였다. 5주 후, 탁솔 처리를 중지하였고, 항체 처리는 계속하였다.
도 18. 항체 59R5로의 처리 후 종양에서의 유전자 발현의 조절. 도 18은 59R1, 59R5 또는 대조군 항체로의 처리 후 PE13 종양 세포에서 선택된 인간 유전자 및 기질 세포에서 선택된 유전자의 발현 수준을 나타낸다.
도 19. 59R1에 의한 PE13 유방암 줄기 세포 빈도의 감소. (a) 확립된 종양을 대조군 항체, 탁솔 + 대조군 항체, 59R1, 또는 탁솔 + 59R1로 처리하였다. 종양을 처리 3주 후에 수확하고, 처리하고, 각각 네 개의 처리군으로부터의 인간 세포의 일련의 적정물을 새로운 세트의 마우스로 이식하였다 (세포 투여량 당 n=10). 75일 후에 종양 성장율을 측정하였다. L-계산 프로그램 (스템 셀 테크놀로지스, 인크.(Stem Cell Technologies, Inc.))을 사용하여 75일의 성장 후 종양 성장율을 이용해 CSC 빈도를 계산하였다. (b) 59R1 및/또는 탁솔로의 처리 후 PE13 유방 종양에서의 암 줄기 세포 빈도. (c) 59R1 및/또는 젬시타빈으로의 처리 후 PN4 췌장 종양에서의 암 줄기 세포 빈도. (d) 59R5 및/또는 탁솔로의 처리 후 PE13 유방 종양에서의 암 줄기 세포 빈도. 단일 별표는 대조군 항체 처리군에 비한 통계적으로 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타내고, 이중 별표는 탁솔 및 대조군 항체 처리군에 비한 유의한 차이를 나타낸다.
본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체, 예컨대 Notch2 및/또는 Notch3에 결합하는 폴리펩티드, 예컨대 항체 등을 비롯한 신규 작용제를 제공한다. Notch-결합제는 인간 Notch 수용체(들)의 길항제를 포함한다. 관련 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, Notch-결합제를 포함하는 조성물, 및 Notch-결합제를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 신규 Notch-결합제를 사용하는 방법, 예컨대 종양 성장을 억제하는 방법, 맥관형성을 억제하는 방법 및/또는 암 또는 다른 맥관형성-관련 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명은 또한 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하고, 생체내에서 종양 성장을 억제하는 분자 (예를 들어, 항체)를 동정한다. 리간드 결합에 필요하며 충분한 Notch의 리간드 결합 영역이 EGF 반복부 11 및 12로 동정되었으며, 이는 Notch 수용체의 상기 영역이 Notch 신호전달 및 종양형성에 중요하다는 것을 뒷받침한다 (문헌 [Rebay et al., 1991, Cell 67:687]; [Lei et al., 2003, Dev. 130:6411]; [Hambleton et al., 2004, Structure 12:2173]). 놀랍게도, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 리간드 결합 도메인 외부에 결합하는 항체가 생체내에서 종양 세포 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 공개공보 제2008/0131434호 참조, 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 따라서, 인간 Notch 수용체-Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4 중 하나 이상의 세포외 도메인의 리간드 결합 도메인 외부에 결합하는 항체는 잠재적인 암 요법으로서의 가치가 있다.
인간 Notch2의 EGF 반복부 10 내의 잔기를 함유하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체가 동정되었다 (실시예 1 및 3, 및 도 3a-3c). 항체, 59R1은 리간드-결합 영역의 외부 영역에서 Notch2에 결합하지만, Notch2에 대한 리간드의 결합을 억제하고 (실시예 1 및 도 1a-1d), 리간드-유도된 Notch2 신호전달을 억제한다 (실시예 4 및 도 4a-4c). 59R1은 또한 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다 (실시예 2 및 도 2). 이 항체는 여러 상이한 이종이식 모델에서 단독으로 또는 제2 항암제와 함께 생체내에서 종양 세포 성장을 방해하거나 또는 억제한다 (실시예 5, 6, 7 및 9 및 도 5a-f, 6, 8-10 및 11a-h). 항체는 또한 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켜 다중 이종이식 모델에서 생체내 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 것으로 나타났다 (실시예 8 및 23 및 도 7 및 19a-c). 또한, 59R1을 사용한 치료는 여러 종양의 기질에서 RGS5 (혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포에 대한 마커), Notch3 및 HeyL의 발현을 하향조절하고 (실시예 10 및 도 12a-e), 유방 및 결장 종양에서 저산소증을 상향조절하는 것으로 (실시예 11) 밝혀졌다. 이론에 한정되지 않고, 이들 데이터는 59R1 항체가 종양 맥관형성에 대해 억제 효과를 갖는다는 것을 나타내며, 이는 적어도 부분적으로는 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하기 때문이다. 59R1을 사용한 치료는 유방 종양에서 추가의 유전자를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 세포 주기 유전자 경로, myc-활성화 유전자 및 여러 줄기 세포 유전자 세트가 59R1에 의해 하향-조절되는 것으로 밝혀졌다 (실시예 22).
추가의 인간 항체 59R5가 또한 개발되었다. 59R5는 59R1에 대해 유사한 특성, 예컨대 Notch2 및 Notch3에 대한 유사한 결합 친화도, 및 이들의 에피토프에서의 유사성 또는 중복성을 갖는다 (실시예 13 및 도 15b). 항체 59R5는 Notch2 및 Notch3 신호전달의 차단에서 59R1과 유사한 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다 (실시예 13 및 도 15a). 59R5 항체는 또한 여러 이종이식 모델에서 단독으로 또는 제2 항암제와 함께 생체내에서 종양 성장을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 14 및 15 및 도 16a-c 및 17a-b). 또한, 59R5를 사용한 치료는 59R1과 마찬가지로 여러 종양의 기질에서 RGS5, Notch3, 및 HeyL의 발현을 하향조절하는 것으로 밝혀졌으며, 59R5는 또한 종양 세포에서 인간 유전자 ID4, EDNRA, 및 EGLN3의 발현을 59R1과 유사한 정도로 조절하는 것으로 밝혀졌다 (실시예 16). 59R5는 또한 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켜 이종이식 모델에서 생체내 종양형성 가능성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다 (실시예 23 및 19D).
정의
Notch 수용체의 "길항제"는 Notch 경로의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 무력화시키는 임의의 분자를 포함하는 용어이다. 적합한 길항제 분자는 특히 길항제 항체 또는 항체 단편을 포함한다.
용어 "항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합 등을 인식하고 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미하도록 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 돌연변이체, 다중특이적 항체, 예컨대 이중특이적 항체 (2개 이상의 무손상 항체로부터 생성됨), 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 아이덴티티에 기초하여 면역글로불린의 5 가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 이들의 아부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 어느 하나일 수 있다. 다른 면역글로불린 부류는 상이하며 잘 알려진 서브유닛 구조 및 3차원 배열을 갖는다. 항체는 네이키드(naked) 상태이거나 또는 다른 분자, 예컨대 독소, 방사성동위원소 등에 접합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 부분을 나타내고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 나타낸다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 다중특이적 항체 (항체 단편으로부터 형성됨) 등을 포함한다.
"Fv 항체"는 2-쇄 (하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 비-공유 이량체를 형성함) 또는 단일-쇄 (scFv) (하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인이 가요성 펩티드 링커로 공유결합에 의해 연결되어 2개의 쇄가 유사한 이량체 구조로 연관됨)로서 완전한 항원-인식 및 -결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편을 나타낸다. 이러한 배열에서, 각각의 가변 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)은 상호작용하여 Fv 이량체의 항원-결합 특이성을 지정한다. 다르게는, 단일 가변 도메인 (또는 Fv의 절반)은 일반적으로 보다 낮은 친화도를 갖기는 하지만 항원을 인식하여 결합하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도의 특이적인 인식 및 결합과 관련된 동종 항체 집단을 나타낸다. 이는 전형적으로 상이한 항원 결정기에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 모두 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 하이브리도마, 파지 선별, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물 등을 비롯한 임의의 수의 방식으로 제조된 상기 항체를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간화 항체"는 특이적인 면역글로불린 쇄, 키메라 면역글로불린 또는 그의 단편 (최소 비-인간 서열 함유)인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 나타낸다. 전형적으로, 인간화 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가의 잔기의 치환에 의해 변형되어 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선 및 최적화시킬 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역을 모두 또는 실질적으로 모두 함유하는 하나 이상, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이나, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 적어도 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 부분, 전형적으로 인간 면역글로불린의 부분을 포함할 수 있다. 인간화 항체를 생성하는데 사용되는 방법의 예는 미국 특허 제5,225,539호 (본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
항체의 "가변 영역"은 단독으로 또는 함께 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 또한 초가변 영역으로 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄에서의 CDR은 FR에 의해 함께 매우 가까이 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 2가지 이상의 CDR 결정 기술이 있다: (1) 교차-종 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, 문헌 [Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)]); 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (문헌 [Al-lazikani et al 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948])). 또한, 이들 두 접근법이 함께 당업계에서 CDR 결정에 사용되기도 한다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 이용하여 제조되는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 이러한 인간 항체의 정의는 무손상 또는 전장 항체, 그의 단편 및/또는 하나 이상의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체, 예를 들어 뮤린 경쇄 및 인간 중쇄 폴리펩티드를 포함하는 항체를 포함한다.
"하이브리드 항체"는 상이한 항원 결정 영역을 갖는 항체로부터의 중쇄 및 경쇄 쌍들이 모여 2개의 상이한 에피토프 또는 2개의 상이한 항원이 생성된 사량체에 의해 인식되고 결합될 수 있는 면역글로불린 분자이다.
용어 "키메라 항체"는 면역글로불린 분자의 아미노산 서열이 2종 이상의 종으로부터 유래된 항체를 나타낸다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 둘 모두 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등) 중 하나의 종으로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 한편, 불변 영역은 또다른 종 (일반적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 그 종에서 면역 반응을 일으키는 것을 방지한다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 결정기"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 특정 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 부분을 나타낸다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병렬 배치된 비-근접 아미노산 및 근접 아미노산 둘 모두로부터 형성될 수 있다. 근접 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 유지되는 한편, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 단백질 변성시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 3개 이상, 보다 일반적으로 적어도 5 또는 8-10개의 아미노산을 독특한 공간적 배열로 포함한다.
항체간의 경쟁은 연구 중인 면역글로불린이 공통적인 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에 의해 결정된다. 다양한 유형의 경쟁적 결합 검정이 공지되어 있다: 예를 들어 고상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (문헌 [Stahli et al., 1983, Mehtods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (문헌 [Kirkland et al., J. Immunol. 1986, 137:3614-3619] 참조); 고상 직접 표지 검정, 고상 직접 표지 샌드위치 검정 (문헌 [Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA (문헌 [Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25(1):7-15] 참조); 고상 직접 바이오틴-아비딘 EIA (문헌 [Cheung et al., 1990, Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지 RIA (문헌 [Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82]). 전형적으로, 이러한 검정은 표지되지 않은 시험 면역글로불린 및 표지된 참조 면역글로불린 중 어느 하나를 보유하는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 포함한다. 경쟁적 억제는 시험 면역글로불린의 존재하에 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 결정하여 측정한다. 일반적으로, 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 경쟁 검정 (항체 경쟁)에 의해 동정된 항체는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 입체 장애를 일으키기에 충분히 가까이 인접한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 일반적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 공통적인 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 적어도 50 또는 75％ 억제할 것이다.
에피토프 또는 수용체에 "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는" 항체는 항체가 관련되지 않은 단백질을 비롯한 다른 물질보다 에피토프 또는 수용체에 대해, 보다 빈번하게, 보다 빠르게, 보다 오래, 보다 높은 친화도로, 또는 일부 이들이 조합되어 나타나면서, 반응하거나 연관된다는 것을 의미한다. "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 예를 들어 항체가 단백질에 약 0.1 mM 이하, 보다 일반적으로 약 1 μM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은 때로는 항체가 단백질에 약 0.1 mM 이하, 때로는 약 1 μM 이하, 때로는 약 0.1 μM 이하, 때로는 약 0.01 μM 이하, 때로는 약 1 nM 이하의 KD로 결합한다는 것을 의미한다. 상이한 종에서 상동 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 종에서 Notch 수용체를 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 이와 마찬가지로, 수용체의 폴리펩티드 서열의 특정 영역에서 상이한 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2 및 Notch3) 사이의 상동성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 Notch 수용체를 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 결합 모이어티는 제2 표적에 특이적으로 결합하거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합"은 독점적인 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있으나) 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 항체는 특정 실시양태에서 하나 초과의 표적 (예를 들어, 인간 Notch2 및 Notch3)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 다중 표적이 항체 상에서 동일한 항원-결합 부위에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 특정한 경우에 2개의 동일한 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 이들은 각각 둘 이상의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, 인간 Notch2 및 Notch3)에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 특이성이 다른 2개 이상의 항원-결합 부위를 포함한다. 비-제한적 예로, 이중특이적 항체는 하나의 Notch 수용체, 예컨대 인간 Notch2 상에서 에피토프를 인식하는 하나의 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 또한 제2 Notch 수용체, 예컨대 인간 Notch3 상에서 상이한 에피토프를 인식하는 제2 상이한 항원-결합 부위를 포함한다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 본원에서 "결합"에 대한 언급은 "특이적 결합"을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비-특이적 결합" 및 "백그라운드 결합"은 항체 및 단백질 또는 펩티드의 상호작용에 대해 사용된 경우에 특정 구조의 존재와 무관한 상호작용을 나타낸다 (즉, 항체는 일반적으로 특정 구조, 예컨대 에피토프 보다는 단백질에 결합함).
용어 "단리된" 또는 "정제된"은 보통 자연적인 상태에서 동반되는 성분들이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 물질을 나타낸다. 순도 및 균질성은 전형적으로 분석 화학 기술, 예컨대 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. 제조시 우세하게 존재하는 종인 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 핵산이 실질적으로 정제된다. 특히, 단리된 핵산은 유전자를 자연적으로 플랭킹시켜 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 아닌 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임으로부터 분리된다. 단리된 항체는 다른 비-면역글로불린 단백질 및 상이한 항원 결합 특이성을 갖는 다른 면역글로불린 단백질로부터 분리된다. 이는 또한 핵산 또는 단백질이 85％ 이상 순수하고, 95％ 이상 순수하고, 몇몇 실시양태에서, 99％ 이상 순수하다는 것을 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물에서의 병적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병 등이 포함된다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 샘암종, 폐의 편평세포 암종, 복막암, 간세포암, 위장관암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부 암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 여러 유형의 두경부암이 포함된다.
용어 "증식성 장애" 및 "증식성 질환"은 비정상적인 세포 증식과 연관된 장애, 예컨대 암을 나타낸다.
본원에 사용된 "종양" 및 "신생물"은 양성 (비암성) 또는 악성 (암성) (전-암성 병소 포함)의 과도한 세포 성장 또는 증식으로 인해 초래되는 임의의 종양 덩어리를 나타낸다.
본원에 사용된 "전이"는 원래 부위로부터 새로운 위치에서 유사한 암성 병소가 발생한 신체의 다른 영역으로 암이 확산되거나 이동하는 과정을 나타낸다. "전이성" 또는 "전이" 세포는 이웃하는 세포와 부착된 상태로 접촉하지 않고, 질환의 원발성 부위로부터 혈류 또는 림프를 통해 이동하여 이웃하는 신체 구조를 침범한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 인간, 비-인간 영장류, 설치류 등을 비롯한 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물) (이는 특징 치료의 수혜자가 됨)을 나타낸다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 인간 대상체에 대해 본원에서 교환가능하게 사용된다.
용어 "암 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포" 또는 "충실성 종양 줄기 세포"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, (1) 대규모 증식 용량을 갖고; 2) 비대칭 세포 분열이 가능하여 감소된 증식 또는 발생 잠재성을 갖는 하나 이상의 종류의 분화된 자손을 생성하고; (3) 자가-재생 또는 자가-유지를 위해 대칭적 세포 분열이 가능한 충실성 종양으로부터의 세포의 집단을 나타낸다. "암 줄기 세포" 또는 "종양 줄기 세포" 또는 "충실성 종양 줄기 세포"의 이러한 특성은 상기 암 줄기 세포에, 종양 형성에 실패한 대부분의 종양 세포에 비해 면역손상된 마우스로의 일련의 이식시에 감지할 수 있는 종양을 형성하는 능력을 부여한다. 암 줄기 세포는 카오틱 방식으로 자가-재생 대 분화를 거쳐 돌연변이가 발생하는 시간에 따라 변화할 수 있는 비정상적인 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포" 또는 "종양 세포" 및 문법적 등가물은 비-종양형성 세포 (종양 세포 집단 덩어리를 포함) 및 종양형성 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 모두를 포함하는 종양으로부터 유래된 세포의 전체 집단을 나타낸다.
본원에 사용된 "종양형성"은 충실성 종양 줄기 세포가 종양을 형성하도록 하는, 자가-재생 (추가의 종양형성 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 모든 다른 종양 세포를 생성하는 증식 (분화가 발생하고, 이에 따라 비-종양형성 종양 세포를 발생시킴)의 특성을 비롯한, 충실성 종양 줄기 세포의 기능적 특성을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 종양의 "종양형성 가능성"은 종양으로부터의 세포의 무작위적인 샘플의, 면역손상된 마우스로의 일련의 이식시에 감지할 수 있는 종양을 형성하는 능력을 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포 암 마커" 또는 "암 줄기 세포 마커" 또는 "종양 줄기 세포 마커" 또는 "충실성 종양 줄기 세포 마커"는 발현 수준이 단독으로 또는 다른 유전자와 함께 비-종양형성 세포에 비해 종양형성 암 세포의 존재와 서로 관련된 유전자 또는 유전자들, 또는 이들 유전자 또는 유전자들에 의해 발현되는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 나타낸다. 이러한 관련성은 유전자의 증가 또는 감소된 발현 (예를 들어, 유전자에 의해 코딩되는 mRNA 또는 펩티드의 증가 또는 감소된 수준)과 관련될 수 있다.
용어 "암 줄기 세포 유전자 시그너쳐" 또는 "종양 줄기 세포 유전자 시그너쳐" 또는 "암 줄기 세포 시그너쳐"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 다른 세포 또는 세포 집단, 예를 들어 정상적인 유방 상피 조직에 비해 암 줄기 세포에서 차등적으로 발현되는 유전자를 포함하는 유전자 시그너쳐를 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 암 줄기 세포 유전자 시그너쳐는 정상적인 유방 상피에 비해 암 줄기 세포에서 배수 변화된 수준으로 차등적으로 발현 (예를 들어, 2배 감소된 및/또는 상승된 발현, 이는 또한 통계학적 분석, 예를 들어 다중 샘플에 대한 t-시험의 P 값을 이용하여 한정됨)되는 유전자를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 암 줄기 세포에서 차등적으로 발현되는 유전자는 발현 변화의 배수 또는 백분율과 함께 선택된 유전자와 이들의 발현 사이의 관련성에 기초하여 암 줄기 세포 유전자 시그너쳐로 분류된다. 암 줄기 세포 시그너쳐는 전이 및 사망 등을 비롯한 임상적 가변성의 측면을 과거 또는 장래 둘 모두에 대해 예측한다.
본원에 사용된 용어 "유전자 시험"은 환자 또는 환자 종양 샘플의 유전자 구성을 분석하는 절차를 나타낸다. 이 분석은 임상 목적에 있어서 유전성 또는 체성 질환-관련 유전자형 또는 핵형을 검출하기 위한 DNA, RNA, 염색체, 단백질 또는 대사물질의 검출을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "생검" 또는 "생검 조직"은 샘플이 암성 조직을 함유하는지 결정하기 위한 목적으로 대상체로부터 분리되는 조직 또는 체액의 샘플을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 생검 조직 또는 체액은 대상체가 암에 걸린 것으로 의심되기 때문에 수득한다. 이후에, 생검 조직 또는 체액을 암의 존재 또는 부재에 대해 시험한다.
본원에 사용된 "허용되는 제약 담체"는 제약 조성물의 활성 성분, 예컨대 항체와 함께 사용된 경우에 항체가 예를 들어 그의 생물학적 활성을 유지하도록 하는 임의의 물질을 나타낸다. 또한, "허용되는 제약 담체"는 수용 대상체에서 면역 반응을 촉진하지 않는다. 그 예로는 임의의 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 및 다양한 유성/수성 에멀젼 등이 포함된다. 에어로졸 또는 비경구 투여를 위한 일부 희석제는 포스페이트 완충 염수 또는 정상 (0.9％) 염수이다.
용어 "치료적 유효량"은 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 효과적인 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자, 또는 다른 약물의 양을 나타낸다. 암의 경우, 약물의 치료적 유효량은 암 세포의 수를 감소시키거나, 종양 크기를 감소시키거나, 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제 또는 중단시키거나, 종양 전이를 억제 또는 중단시키거나, 암과 연관된 하나 이상의 증상을 어느 정도 완화시키거나, 또는 암 세포에 대한 이러한 효과를 함께 나타낼 수 있다. 약물이 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/거나 기존의 암 세포를 사멸시킨다면, 이는 세포증식 억제성 및/또는 세포독성으로 나타낼 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화하는" 또는 "완화하기 위한"과 같은 용어는 1) 진단된 병적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 지연시키고/거나, 증상을 경감시키고/거나 진행을 중단시키는 치료적 수단 및 2) 목적하는 병적 상태 또는 장애의 발생을 예방하거나 지연시키는 예방 또는 방지적 수단을 모두 나타낸다. 따라서, 치료가 필요한 대상은 이미 장애를 앓고 있는 대상; 장애를 갖기 쉬운 대상; 및 장애를 예방해야 하는 대상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 대상체는 환자가 다음 중 하나 이상을 보일 경우 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료"된다: 암 세포의 수의 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연조직 및 뼈로의 확산을 비롯한 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환률 및 사망률; 및 삶의 질 개선. 따라서, 특정 실시양태에서, 암의 치료는 대상체에서 종양 성장의 억제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 DNA 또는 RNA 등을 비롯한, 포스포디에스테르 결합을 통해 연결된 다수의 뉴클레오티드 유닛 (리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 관련 구조적 변이체)으로 구성된 중합체를 나타낸다. 이 용어는 하기 등을 비롯한 DNA 및 RNA의 공지된 염기 유사체 중 어느 하나를 포함하는 서열을 포함한다: 4-아세틸시토신, 8-히드록시-N6-메틸아데닌, 아지리디닐시토신, 슈도이소시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸, 2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸 2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5'-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 옥시부톡소신, 슈도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 및 2,6-디아미노퓨린.
용어 "유전자"는 폴리펩티드, 전구체 또는 RNA (예를 들어, rRNA, tRNA)의 생성에 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예를 들어, DNA) 서열을 나타낸다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열에 의해 또는 전장 폴리펩티드 또는 단편의 원하는 활성 또는 기능적 특성 (예를 들어, 효소 활성, 리간드 결합, 신호 전달, 면역원성 등)이 유지되는 한 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다. 이 용어는 또한 유전자가 전장 mRNA의 길이에 상응하도록, 어느 한쪽 말단 상에서 약 1 kb 이상의 거리에 대해 5' 및 3' 말단 둘 모두 상에서 코딩 영역에 인접하여 위치하는 서열 및 구조적 유전자의 코딩 영역을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열을 5' 비-번역된 서열로 지칭한다. 코딩 영역의 3' 또는 하류에 위치하고 mRNA 상에 존재하는 서열을 3' 비-번역된 서열로 지칭한다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA 및 게놈 형태 둘 모두를 포함한다. 유전자의 게놈 형태 또는 클론은 "인트론" 또는 "개재 영역" 또는 "개재 서열"로 지칭되는 비-코딩 서열이 개재된 코딩 영역을 함유한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 세그먼트이고; 인트론은 조절 요소, 예컨대 인핸서를 함유할 수 있다. 인트론은 핵 또는 일차적 전사체로부터 제거되거나 또는 "스플라이싱 아웃(spliced out)"되고, 따라서 인트론은 전령 RNA (mRNA) 전사체에 존재하지 않는다. mRNA는 번역 동안 초기 폴리펩티드에서 서열 또는 아미노산의 순서를 특정화하는 기능을 한다. 인트론을 함유하는 것 이외에도, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사체에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 둘 모두에 위치하는 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹" 서열 또는 영역으로 지칭된다 (이들 플랭킹 서열은 mRNA 전사체에 존재하는 비-번역된 서열에 대해 5' 또는 3'에 위치함). 5' 플랭킹 영역은 유전자의 전사를 제어하거나 이에 영향을 미치는 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서를 함유할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사 종결, 전사후 절단, 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 함유할 수 있다.
용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 대한 언급에 사용되는 경우 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해 변형되거나, 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되거나, 또는 세포가 그와 같이 변형된 세포로부터 유래된 것인 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터를 나타낸다. 따라서, 예를 들어 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 과다발현되거나 또는 다르게 비정상적으로 발현되는, 예를 들어 비-천연 발생 단편 또는 스플라이싱 변이체로 발현되는 천연 유전자를 발현한다. 본원에서 용어 "재조합 핵산"은 일반적으로 예를 들어 폴리머라제 및 엔도뉴클레아제를 사용하여 핵산을 조작함으로써 자연에서 정상적으로 발견되지 않는 형태로 본래 시험관내에서 형성되는 핵산을 의미한다. 이러한 방식으로, 상이한 서열의 작동가능한 연결이 달성된다. 따라서, 선형 형태로 단리된 핵산 또는 정상적으로는 연결되지 않는 DNA 분자를 라이게이션시켜 시험관내에서 형성된 발현 벡터는 둘 모두 본 발명의 목적에 있어 재조합된 것으로 여겨진다. 재조합 핵산이 제조되어 숙주 세포 또는 유기체에 도입되면, 이는 비-재조합적으로, 즉 시험관내 조작보다는 숙주 세포의 생체내 세포 기작을 이용하여 복제될 것이나, 이러한 핵산은 재조합적으로 생성되면 이후에 비-재조합적으로 복제된다고 하더라도 여전히 본 발명의 목적에 있어 재조합된 것으로 여기는 것으로 이해된다. 이와 유사하게, "재조합 단백질"은 재조합 기술을 이용하여, 즉 상기 설명된 바와 같은 재조합 핵산의 발현을 통해 제조된 단백질이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 하나의 세포로부터 또다른 세포로 DNA 세그먼트(들)을 전달하는 핵산 분자를 나타내는데 사용된다. 용어 "비히클"은 "벡터"와 교환가능하게 사용되기도 한다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파지, 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유전자 발현"은 유전자의 "전사"를 통해 (예를 들어, RNA 폴리머라제의 효소 작용을 통해) RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로, 및 단백질 코딩 유전자의 경우 mRNA의 "번역"을 통해 단백질로, 유전자에 코딩된 유전 정보를 전환시키는 과정을 나타낸다. 유전자 발현은 이 과정의 다수의 단계에서 조절될 수 있다. "상향-조절" 또는 "활성화"는 유전자 발현 생성물(예를 들어, RNA 또는 단백질)의 생성을 증가시키는 조절을 나타내는 한편, "하향-조절" 또는 "저해"는 생성을 감소시키는 조절을 나타낸다. 상향-조절 또는 하향-조절에 연관되는 분자 (예를 들어, 전사 인자)는 각각 "활성화제" 및 "저해제"로 지칭되기도 한다.
용어 "폴리펩티드" 또는 "펩티드" 또는 "단백질" 또는 "단백질 단편"은 본원에서 교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 나탄내다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산 중합체 및 비-천연 발생 아미노산 중합체에 적용된다.
용어 "아미노산"은 천연 발생 및 합성 아미노산 뿐만 아니라, 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 천연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩된 것 뿐만 아니라, 이후에 변형된 아미노산, 예를 들어 히드록시프롤린, 감마-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 예를 들어 수소에 결합된 알파 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 및 R 기를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 나타낸다. 이러한 유사체는 변형된 R 기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가질 수 있으나, 천연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 천연 발생 아미노산과 유사하게 기능하는 화학적 화합물을 나타낸다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. "아미노산 변이체"는 아미노산 서열을 지칭한다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는, 본질적으로 동일한 또는 연관된 (예를 들어, 천연적으로 인접한) 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 대부분의 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 코돈에 의해 알라닌이 명시된 모든 위치에서, 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서도, 코돈을 기재된 상응하는 코돈 중 또다른 것으로 변경할 수 있다. 이러한 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이 중 한 종류인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에서의 모든 핵산 서열은 또한 핵산의 침묵 변이를 기술한다. 특정 문맥에서 핵산 내 각각의 코돈을 변형시켜 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외) 기능적으로 동일한 분자를 획득할 수 있음을 인식한다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 침묵 변이는 발현 생성물과 관련하여 기재된 서열 내에 내재되어 있지만, 실제 프로브 서열에 관련해서는 그렇지 않다. 아미노산 서열과 관련하여, 코딩된 서열 내에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변형, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 서열에 대한 개개의 치환, 결실 또는 부가가, 상기 변형이 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환시키는 경우를 포함한 "보존적으로 변형된 변이체"임을 인식할 것이다. 이러한 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동성 및 대립유전자에 부가적인 것이고 이들을 제외하지는 않는다. 보존적 아미노산 치환에 유용한 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 표는 당업계에 공지되어 있다. 전형적인 보존적 치환은: 1) 알라닌 (A), 글리신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조). (또한 본원의 표 1 참조).
본 개시내용 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수형 ("a", "an" 및 "the")은 문맥에서 달리 명확히 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다.
실시양태가 본원에서 용어 "포함하는"과 함께 기재되는 어떠한 경우에든, 다르게는 "~로 이루어진(구성된)" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진(구성된)"의 용어가 기재된 유사한 실시양태가 또한 제공된다는 점을 이해한다.
본 발명의 특정 실시양태
본 발명은 암을 연구하고 진단하고 특징규명하고 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특히, 특정 실시양태에서, 본 발명은 Notch 수용체에 결합하는 길항제를 비롯한 작용제, 및 인간 환자에서 종양 성장을 억제하고 암 또는 기타 질환을 치료하기 위한 작용제 또는 길항제를 사용하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 하나 이상의 인간 Notch 수용체를 특이적으로 인식하는 항체이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체는 종양 성장을 억제한다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는, 2개 이상의 Notch 수용체 족 구성원의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch2 및/또는 Notch3 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch2의 비-리간드 결합 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch2 및 Notch3의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 인간 Notch3의 비-리간드 결합 영역에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 Notch1 및/또는 Notch4에 결합한다.
특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 단일특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 생성하는 하이브리도마를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF 반복부 1-10을 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF 반복부 10 (또는 등가물)을 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF 반복부 13-36을 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF 반복부 4를 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF 반복부 13을 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 LNR-HD 도메인을 포함하는 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 대상체에서 인간 Notch 수용체 단백질의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 암 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 2개 이상의 Notch 수용체 족 구성원에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료가 필요한 대상체에서의 암 치료 방법은 Notch2 및/또는 Notch3 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 모노클로날 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 키메라 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 인간화 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 인간 항체를 투여하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 단일특이적 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다.
특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 EGF 반복부 1-10을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 EGF 반복부 10 (또는 Notch3의 경우 등가물)을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 EGF 반복부 13-36을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 EGF 반복부 4를 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 EGF 반복부 4를 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 투여되는 항체는 인간 Notch 수용체의 LNR-HD 도메인에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 세포독성 잔기 접합 항체를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 방사선 요법과 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 화학요법과 조합으로 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 유방 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 전립선 종양 또는 두경부 종양으로부터의 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 유전 시험을 이용하여 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체로 치료하기 위한 환자를 확인하는 단계; 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 암 치료 방법은 암 줄기 세포 시그너쳐를 검출하는 유전 시험을 이용하여 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체로 치료하기 위한 환자를 확인하는 단계; 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 치료적 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) 분자가 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 EGF 반복부 1-10을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) 분자가 EGF 반복부 1-10을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인 비-리간드 결합 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 EGF 반복부 10 (또는 Notch3의 경우 등가물)을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) 분자가 EGF 반복부 10 (또는 Notch3의 경우 등가물)을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인 비-리간드 결합 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 i) 분자를 EGF 반복부 13-36을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인과 함께 인큐베이션하는 단계; ii) EGF 반복부 13-36을 포함하는 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인 비-리간드 결합 영역에 결합하는지 측정하는 단계; 및 iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지 측정하는 단계를 포함하는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하여 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하여 종양 성장을 억제하는 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 Notch 수용체의 EGF10 도메인 (또는 Notch3의 경우 EGF10 도메인의 등가물)에 특이적으로 결합하는 작용제 (예를 들어, 항체)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2의 EGF10 및/또는 인간 Notch3의 EGF9에 특이적으로 결합한다. EGF9는 기타 인간 Notch 수용체 Notch1, Notch2 및 Notch4에서의 EGF10과 등가물인 인간 Notch3 내의 EGF이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch2 및 Notch3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다.
한 측면에서, 본 발명은 각각 서열 16 및 18로 제공되는 중쇄 및 경쇄 서열 (신호 서열 포함 또는 불포함)을 포함하거나 또는 2008년 10월 15일자로 ATCC에 기탁된 DNA (지정 번호 PTA-9547이 부여됨)에 의해 코딩되는 59R1 항체를 제공한다. 본 발명은 이러한 59R1 항체의 중쇄 가변 영역 (예를 들어, 서열 14) 및/또는 경쇄 가변 영역 (예를 들어, 서열 13)을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 59R1 항체의 하나 이상 (예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 중쇄 CDR 및/또는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 대한 특이적 결합에 대해 59R1 항체와 경쟁하는, 59R1 항체(들)와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 각각 서열 49 및 18 (신호 서열 포함 또는 불포함)로 제공되는 중쇄 및 경쇄 서열을 포함하거나 또는 2009년 7월 6일자로 ATCC에 기탁된 DNA (지정 번호가 부여됨)에 의해 코딩되는 59R5 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 서열인 서열 50 및/또는 서열 13을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로 59R5 항체의 하나 이상 (예를 들어, 1, 2 또는 3개)의 중쇄 CDR 및/또는 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 또는 항체를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 대한 특이적 결합에 대해 59R5 항체와 경쟁하는, 59R5 항체(들)와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다.
추가의 특정 실시양태에서, 본 발명은 2개 이상 (즉, 2개 이상, 또는 2, 3 또는 4개)의 인간 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 2개 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 2개 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 단일특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 Notch1, Notch2 또는 Notch4의 EGF10 및/또는 Notch3의 EGF9에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체가 결합하는 비-리간드 결합 영역은 EGF4가 아니거나, 또는 EGF4를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 인간 Notch 수용체는 Notch2 및/또는 Notch3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2개 이상의 인간 Notch 수용체는 Notch2 및 Notch3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 2개 이상의 인간 Notch 수용체의 길항제이다.
본 발명은 추가로 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 유효량의 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다.
본 발명은 추가로 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하는 유효량의 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 맥관형성을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 작용제는 항체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 길항제이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch2의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch3의 길항제이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch2 및 Notch3의 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 맥관형성 억제 방법은 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 맥관형성은 종양 맥관형성이다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제는 이것이 특이적으로 결합하는 인간 Notch 수용체(들)의 길항제이다. 몇몇 별도의 실시양태에서, Notch-결합제는 이것이 특이적으로 결합하는 인간 Notch 수용체(들)의 효능제이다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 Notch 수용체(들)에 특이적으로 결합하고 하나 이상의 Notch 수용체(들)의 길항제인 작용제는 결합 Notch 수용체(들)의 하나 이상의 활성을 약 10％ 이상, 약 20％ 이상, 약 30％ 이상, 약 50％ 이상, 약 75％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 100％ 억제한다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 인간 Notch 수용체(들) (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3)의 길항제는 다음 효과 중 하나 이상을 갖는다: 하나 이상의 인간 Notch 수용체에 대한 리간드 결합 억제, 하나 이상의 Notch 수용체에 의한 리간드-유도성 신호전달 억제; 종양 세포의 증식 억제; 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켜 종양의 종양형성 가능성 감소; 종양 성장 억제; 생존 증가, 종양 세포의 세포 사멸 유발; 맥관형성 억제; 또는 종양 세포의 전이 방지.
특정 실시양태에서, 길항제는 다음 효과 중 하나 이상을 갖는다: Notch 수용체의 발현 방해; 예를 들어, Notch 수용체 및 하나 이상의 그의 리간드 사이의 상호작용의 입체적 억제, 또는 인간 Notch 수용체로의 결합 및 세포 사멸 유발 또는 세포 증식 억제에 의한 Notch 수용체 신호 전달 경로의 활성화 방해.
특정 실시양태에서, Notch 수용체, 예컨대 Notch2 또는 Notch3에 대한 길항제는 세포외로 작용하여, Notch 수용체의 기능에 작용하거나 또는 Notch 수용체의 기능을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 소분자이다. 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 단백질성이다. 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체의 단백질성 길항제는 Notch 수용체의 세포외 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다. Notch 수용체에 대한 길항제의 세포외 결합은 Notch 수용체의 내인성 활성화 (예를 들어, 키나제 활성)의 억제에 의해 및/또는, 예를 들어, Notch 수용체와 그의 리간드 중 하나의 상호작용의 입체적 억제에 의해 Notch 수용체 단백질의 신호전달을 억제할 수 있다. 게다가, Notch 수용체에 대한 길항제의 세포외 결합은, 예를 들어, Notch 수용체의 내재화 및/또는 Notch 수용체의 세포 표면 트래피킹 감소에 의한 것과 같이, Notch 수용체의 세포-표면 발현을 하향-조절할 수 있다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제 (예를 들어, 항체)는 1개 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하고, 여기서 상기 비-리간드 결합 영역은 EGF 반복부 10 (또는 Notch3의 경우 등가물)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 Notch3에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 인간 Notch2 및 인간 Notch3 둘다에 특이적으로 결합한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제 (예를 들어, 항체)는 인간 Notch2의 EGF10 도메인에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 EGF10 도메인 이외의 인간 Notch2의 임의의 영역에 결합하지 않는다. 다른 특정 실시양태에서, 인간 Notch2의 EGF10 도메인에 특이적으로 결합하는 Notch-결합제 또는 길항제는 또한 추가로 인간 Notch2의 또다른 영역에 결합한다. 다시 말하면, 몇몇 실시양태에서, 작용제 또는 길항제의 전체 에피토프는 EGF10에 포함된다. 기타 특정 실시양태에서, 인간 Notch2에 결합하는 작용제 또는 길항제의 에피토프는 EGF10과 부분적으로 겹친다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 인간 Notch2 EGF10 내의 서열 HKGAL (서열 28)의 적어도 일부에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 또한 인간 Notch2 EGF10 내의 다른 아미노산에 결합한다 (예를 들어, 항-Notch2 항체의 전체 에피토프는 서열 HKGAL 내에 반드시 전체적으로 함유되지는 않음). 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 추가로 1개 이상의 추가의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch1, Notch3 또는 Notch4)에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch2의 EGF10에 결합하는 Notch-결합제 또는 길항제는 추가로 인간 Notch1의 EGF10 도메인, 인간 Notch3의 EGF9 도메인 및/또는 인간 Notch4의 EGF10 도메인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 추가의 인간 Notch 수용체는 인간 Notch3이다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제 (예를 들어, 항체)는 인간 Notch3의 EGF9 도메인에 결합한다. 인간 Notch2 및 인간 Notch3의 세포외 도메인의 서열 간의 상동성으로부터 명백한 바와 같이, EGF9는 인간 Notch3에서 Notch2 EGF10의 기능적/구조적 등가물인 EGF이다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 EGF9 이외의 인간 Notch3의 임의의 영역에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 인간 Notch3 EGF9 도메인 내에 있는 서열 HEDAI (서열 29)의 적어도 일부에 결합한다. HEDAI (서열 29)는 인간 Notch2 EGF10 내에 있는 서열 HKGAL (서열 28)에 상응하는 Notch3 EGF9 도메인 내에 있는 서열이다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 또한 인간 Notch3 EGF9 내에 있는 다른 아미노산에 결합한다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 1개 이상의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch1, Notch2 및/또는 Notch4)의 EGF10 도메인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 추가의 인간 Notch 수용체는 인간 Notch2, 예컨대 인간 Notch2의 EGF10 도메인에 결합하는 작용제 또는 길항제이다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 EGF10 이외의 인간 Notch2의 임의의 영역에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 인간 Notch2 EGF10 내에 있는 서열 HKGAL (서열 28)의 적어도 일부에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 Notch2에서 서열 HKGAL (서열 28)의 적어도 일부에 결합하고 또한 Notch3에서 서열 HEDAI (서열 29)의 적어도 일부에 결합하는 단일특이적 항체이다.
다른 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 EGF10 이외의 영역에서의 Notch1, Notch2 또는 Notch4 수용체 또는 EGF9 이외의 영역에서의 Notch3 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역의 부분에 결합한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 하나 이상의 Notch 수용체의 LNR-HD 도메인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 하나 이상의 Notch 수용체의 세포외 도메인의 EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5, EGF6, EGF7, EGF9, EGF10, EGF13, EGF14, EGF15, EGF16, EGF17, EGF18, EGF19, EGF20, EGF21, EGF22, EGF23, EGF24, EGF25, EGF26, EGF27, EGF28, EGF29, EGF30, EGF31, EGF32, EGF33, EGF34, EGF35 및/또는 EGF36에 결합한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 하나 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 리간드 결합 영역에 결합한다. 따라서, 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 Notch 1, 2 또는 4의 EGF11 및/또는 EGF12에 결합할 수 있거나 (문헌 [Rebay et al., 1991, Cell 67:687]; [Lei et al., 2003, Dev. 130:6411]; [Hambleton et al., 2004, Structure 12:2173]), 또는 Notch3의 EGF10 및/또는 EGF11에 결합할 수 있다 (문헌 [Peters et al., 2004, Experimental Cell Research, 299:454-464]).
특정 실시양태에서, Notch-결합제 (예를 들어, 항체)는 2개 이상의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch1, Notch2, Notch3 및/또는 Notch4)에 특이적으로 결합한다. 다시 말하면, 특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 2개 이상의 인간 Notch 수용체 (즉, 2, 3 또는 4개의 인간 Notch 수용체)에 결합한다. 2개의 인간 Notch 족 수용체 (예를 들어, Notch2와 Notch3, Notch1과 Notch2, Notch1과 Notch3, Notch1과 Notch4, Notch2와 Notch4, 또는 Notch3과 Notch4)에 특이적으로 결합하는 작용제 및 항체를 포함한다. 3개의 인간 Notch 수용체 족 구성원에 특이적으로 결합하는 작용제 및 항체가 또한 포함되며 (예를 들어, Notch1, Notch2 및 Notch3, Notch1, Notch2 및 Notch4, 또는 Notch2, Notch3 및 Notch4에 특이적으로 결합하는 작용제 및 항체), 4개의 인간 Notch 수용체 족 구성원에 특이적으로 결합하는 작용제 및 항체 (예를 들어, Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4에 특이적으로 결합하는 작용제 및 항체)가 포함된다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 인간 Notch2 및 Notch3 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 다른 특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 인간 Notch1 및 Notch2 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 인간 Notch1 및 Notch3 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 추가의 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 인간 Notch1 및 Notch4 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 항체는 2개 이상의 인간 Notch 수용체의 길항제이다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 약 1 μM 이하, 약 100 nM 이하, 약 40 nM 이하, 약 20 nM 이하, 또는 약 10 nM 이하의 해리 상수를 갖는 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3)에 결합한다. 특정 실시양태에서, 작용제 또는 길항제는 KD 1 nM 이하로 하나 이상의 인간 Notch 수용체, 예컨대 인간 Notch2 및/또는 인간 Notch3에 결합한다. 몇몇 실시양태에서, Notch 결합제는 KD 약 1 nM 이하로 Notch2에 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, Notch 결합제는 KD 약 1 nM 이하로 Notch3에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 특정 Notch 수용체와 관련된 작용제 또는 길항제의 해리 상수는 Notch 세포외 도메인을 포함하는 Notch-Fc 융합 단백질 및/또는 비아코어(Biacore) 칩에 고정된 EGF10을 포함하는 세포외 도메인의 부분을 사용하여 측정된 해리 상수이다.
특정 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch3에 특이적으로 결합하여, 리간드 (예를 들어, DLL4, JAG1 및/또는 JAG2)의 인간 Notch3으로의 결합을 억제하고/하거나 인간 Notch3의 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 인간 Notch2에 특이적으로 결합하여, 리간드 (예를 들어, DLL4, JAG1 및/또는 JAG2)의 인간 Notch2로의 결합을 억제하고/하거나 인간 Notch2의 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 DLL4-유도된 Notch2 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 DLL4-유도된 Notch3 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 JAG2-유도된 Notch2 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 길항제는 JAG2-유도된 Notch3 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, Notch2 및/또는 Notch3에 의한 신호전달은 약 10％ 이상, 약 25％ 이상, 약 50％ 이상, 약 75％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상까지 감소된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 리간드의 Notch2 및/또는 Notch3으로의 결합은 약 10％ 이상, 약 25％ 이상, 약 50％ 이상, 약 75％ 이상, 약 90％ 이상, 또는 약 95％ 이상까지 감소된다.
몇몇 실시양태에서, Notch 수용체에 대한 길항제는 Notch 수용체에 결합하여, 종양 세포 증식 억제, 종양 세포에서 직접적으로 세포사 유발, 또는 종양 세포의 전이 예방이라는 효과 중 하나 이상을 갖는다. 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 접합된 독소, 화학요법제, 방사성동위원소, 또는 여타의 그와 같은 작용제를 통해 세포사를 유발한다. 예를 들어, Notch 수용체에 대한 항체는 단백질 내재화에 의해 Notch 수용체를 발현하는 종양 세포에서 활성화되는 독소에 접합된다. 다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 항체-의존적 세포독성 (ADCC)을 통해 Notch 수용체를 발현하는 세포의 세포사를 매개한다. ADCC는 항체의 Fc 부분을 인식하는 이펙터 세포에 의한 세포 용해를 수반한다. 예를 들어, 다수의 림프구, 단핵구, 조직 대식세포, 과립구 및 호산구는 Fc 수용체를 갖고 있어, 세포용해를 매개할 수 있다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]). 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 활성화함으로써 Notch 수용체를 발현하는 세포의 세포사를 유발하는 항체이다. CDC는 혈청 보체가 항체의 Fc 부분에 결합하고 이어서 보체 단백질 캐스케이드를 활성화하는 과정을 수반하는데, 이는 세포막 손상 및, 종국에는 세포사를 일으킨다. 항체의 생물학적 활성은 항체 분자의 불변 도메인 또는 Fc 영역에 의해 대부분 결정되는 것으로 알려져 있다 (문헌 [Uananue and Benacerraf, Textbook of Immunology, 2nd Edition, Williams ＆ Wilkins, p. 218 (1984)]). 상이한 부류 및 아부류의 항체는 이러한 점에서 상이하며, 상이한 종으로부터의 동일한 아부류의 항체도 마찬가지이다. 인간 항체 중, IgM은 보체의 결합시킴에 있어 가장 효율적인 항체 부류이며, 이어서 IgG1, IgG3, 및 IgG2이고, IgG4는 보체 캐스케이드의 활성화에 있어 다소 부족한 것으로 보인다 (문헌 [Dillman, 1994, J. Clin. Oncol. 12:1497]; [Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76]). 본 발명에 따르면, 목적하는 생물학적 활성을 가진 항체 부류가 제조된다.
Notch 수용체에 대한 임의의 특정 항체에 있어서 보체 활성화 및/또는 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 능력을 분석할 수 있다. 관심 세포를 성장시키고, 시험관내 표지하고; 항체를 항원 항체 복합체에 의해 활성화될 수 있는 혈청 보체 또는 면역 세포와 조합하여 세포 배양물에 첨가한다. 표적 세포의 세포용해는, 예를 들어, 용해된 세포로부터의 표지 방출에 의해 검출한다. 실제로는, 환자 자신의 혈청을 보체 및/또는 면역 세포의 공급원으로 사용하여 항체를 스크리닝할 수 있다. 그런 다음, 시험관내 시험에서 보체를 활성화하거나 또는 ADCC를 매개할 수 있는 항체를 상기 특정 환자에서 치료적으로 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는 항체이다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 이 항체는 항체-의존적 세포독성 (ADCC) 활성 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 갖고 있지 않다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 이펙터 기능을 갖고 있지 않다.
다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 맥관형성을 억제함으로써 세포사를 간접적으로 유발할 수 있다. 맥관형성은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로서, 정상적인 성장 (예를 들어, 배아 발달 동안), 창상 치유에 필요하며, 배란에 반응하여 나타나는 기본적인 과정이다. 1 내지 2 mm2를 초과하는 충실성 종양 성장 또한 영양분 및 산소의 공급을 위해 맥관형성을 필요로 하는데, 영양분 및 산소가 없으면 종양 세포는 사멸한다. 따라서, 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는, 예를 들어, 혈관 형성에 필요한 내피 세포, 평활근 세포 또는 세포외 매트릭스 구성요소를 비롯한 Notch 수용체를 발현하는 혈관 세포를 표적으로 한다. 특정 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3)은 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포를 표적으로 한다. 다른 실시양태에서, Notch 수용체의 길항제는 혈관 세포 소집, 형성, 유지 또는 생존에 필요한 성장 인자 신호전달을 억제한다. 특정 실시양태에서, 이 길항제는 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제 (예를 들어, 항체)는, 단독으로 또는 제2 치료제와 조합시, 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 생체내에서 (예를 들어, 이종이식 마우스 모델에서 및/또는 암을 가진 인간에서) 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 이종이식 모델에서 주어진 시점에서 종양 성장을 약 10％ 이상, 약 25％ 이상, 약 50％ 이상, 약 75％ 이상, 약 90％ 이상 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 종양 성장을 예방한다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 종양 재발을 억제한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제는 종양의 종양형성 가능성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 이 결합제 또는 항체는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식 모델에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 발생 빈도는 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배, 또는 약 1000배 (예를 들어, 이종이식 모델에서) 감소된다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 발생 빈도의 감소는 동물 모델을 이용한 한계 희석 검정으로 측정한다. 항-Notch 항체의 효능을 시험하기 위해 사용되는 한계 희석 검정의 예는 하기 실시예 8에 제시되어 있다. 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 발생 빈도의 감소를 측정하기 위해 한계 희석 검정을 사용하는 것에 대한 추가적인 예 및 지침은, 예를 들어, 국제 공개공보 제WO 2008/042236호, 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0064049호, 및 제2008/0178305호에서 찾아볼 수 있으며, 이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 발명은 항체 및 항체 단편 (이들에 제한되는 것은 아님)을 비롯한 다양한 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 단리된 것이다. 다른 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 서열을 포함하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드, 또는 합성 폴리펩티드 (나타낸 신호 서열을 갖거나 또는 갖지 않음), 이뿐 아니라 서열 1, 3, 15, 17, 47, 48, 58, 59 또는 60의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (나타낸 신호 서열을 갖거나 또는 갖지 않음)일 수 있다.
본 발명은 각각 서열 16 및/또는 서열 18에 제시된 59R1의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및 Notch3에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 각각 서열 49 및/또는 서열 18에 제시된 59R5의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및 Notch3에 특이적으로 결합한다.
본 발명은 추가로 서열 13 및/또는 서열 14를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 14를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열 14를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 50을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및 서열 50을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 52를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 53을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 54를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 55를 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 56을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 서열 13을 포함하는 가변 경쇄 서열 및/또는 서열 57을 포함하는 가변 중쇄 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 항체이다. 특정 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 Notch2 및 Notch3에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 인간 Notch2에 특이적으로 결합한다. 몇몇 실시양태에서, 이 폴리펩티드는 인간 Notch3에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일부 아미노산 서열이 해당 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 주지 않고 달라질 수 있음은 당업계에 인식되어 있을 것이다. 그러한 서열의 차이를 고려한다면, 단백질 상에 활성을 결정짓는 매우 중요한 영역이 존재할 것이라는 점이 상기되어야 한다. 따라서, 본 발명에는 실질적인 활성을 나타내는 폴리펩티드의 변이가 또한 포함된다. 그러한 돌연변이체는 결실, 삽입, 역위, 반복, 및 유형 치환을 포함한다. 어떤 아미노산 변화가 표현형적으로 나타나지 않을 가능성이 있는지에 대한 지침은 문헌 [Bowie et al., Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions, 1990, Science 247:1306-1310]에서 찾아볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 단편, 유도체 또는 유사체는, (i) 그의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 보존 또는 비-보존 아미노산 잔기 (보통은 보존 아미노산 잔기)로 치환되고 그러한 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 코딩되는 것이거나 또는 아닐 수 있는 것; 또는 (ii) 그의 아미노산 잔기 중 하나 이상이 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 그의 성숙한 폴리펩티드가 또다른 화합물, 예컨대 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되어 있는 것; 또는 (iv) 추가적인 아미노산, 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩티드의 정제에 이용되는 서열 또는 전구단백질 (proprotein) 서열이 성숙한 폴리펩티드에 융합되어 있는 것일 수 있다. 그러한 단편, 유도체, 및 유사체는 본원에 교시된 내용의 범주 내에 속하는 것으로 간주된다.
하전된 아미노산을 또다른 하전된 아미노산 및 중성 또는 음으로 하전된 아미노산으로 치환하는 것은 특히 흥미롭다. 후자는 양전하가 감소된 단백질을 산출한다. 단백질 상에서의 양전하의 감소는 단백질 응집 감소로 이어질 수 있으며, 응집 방지는 매우 바람직한 것이다. 단백질의 응집은 활성의 소실을 일으킬 수 있을 뿐 아니라, 응집체가 면역원성일 수 있기 때문에 제약 제형물의 제조시 문제가 될 수 있다. (문헌 [Pinckard et al., 1967, Clin. Exp. Immunol. 2:331-340]; [Robbins et al., 1987, Diabetes 36:838-845]; [Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377]).
명시한 바와 같이, 단백질의 접힘 또는 활성에 유의하게 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환과 같은 아미노산 변화는, 전형적으로는 본질상 중대하지 않다 (하기 표 1 참조).
[표 1]
Figure pct00001
물론, 일어난 아미노산 치환의 수는 상기 기재된 것을 비롯한 다수의 인자에 좌우된다. 특정 실시양태에서, 주어진 임의의 폴리펩티드에 대한 치환의 수는 50 이하, 40 이하, 30 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 또는 3 이하일 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 단리된 형태로 제공되며, 때로는 균질화되도록 정제된다.
본 발명의 폴리펩티드에는, 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57의 폴리펩티드, 이뿐 아니라 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57의 폴리펩티드에 대해 90％ 이상의 유사성 (때로는 90％ 이상의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57의 폴리펩티드에 대해 95％ 이상의 유사성 (때로는 95％ 이상의 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드, 및 또 다른 실시양태에서는, 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 또는 57의 폴리펩티드에 대해 적어도 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 유사성 (때로는 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 서열 동일성)을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 두 폴리펩티드 간의 "유사성"은 하나의 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 그의 보존적 아미노산 치환체를 제2 폴리펩티드의 서열과 비교함으로써 결정된다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편 또는 부분은 상응하는 전장 폴리펩티드를 펩티드 합성에 의해 생성하는데 이용될 수 있으며, 따라서, 이 단편은 전장 폴리펩티드의 생성에 있어서 중간체로서 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편 또는 부분은 본 발명의 전장 폴리뉴클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 단백질의 단편은 Notch 수용체 단백질에 결합할 수 있는 단백질의 부분 또는 전부이다. 이 단편은 Notch 수용체 또는 Notch 수용체의 리간드에 대해 높은 친화도를 갖는다. 특정 융합 단백질의 단편은 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 융합된 폴리펩티드 작용제 또는 길항제의 Notch 결합 도메인의 적어도 일부를 포함하는 단백질 단편이다. 이 친화도는 전형적으로 약 10-11 내지 10-12 M 범위이지만, 이 친화도는 크기가 상이한 단편에 따라 10-7 내지 10-13 M 범위로 상당히 달라질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 이 단편은 길이가 약 10 내지 110개 아미노산이며, 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부에 연결된 폴리펩티드 작용제 또는 길항제의 Notch 결합 도메인을 포함한다.
이들 폴리펩티드 및 유사체는 정상적으로는 해당 단백질의 일부가 아닌 추가적인 화학적 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 이들 유도체화된 부분은 단백질의 용해도, 생물학적 반감기 또는 흡수를 향상시킬 수 있다. 이들 부분은 또한 단백질의 임의의 비바람직한 부작용 등을 감소 또는 제거할 수 있다. 이들 부분에 대한 개관은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 단리된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 제조가능하다. 그러한 방법은 직접적인 단백질 합성 방법에서부터, 단리된 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열을 구축하고 이 서열을 적합한 형질전환된 숙주에서 발현시키는 방법까지 다양하다.
재조합 방법의 몇몇 실시양태에서, DNA 서열은 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 단리 또는 합성하여 구축한다. 임의로는, 이 서열에 대해 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 돌연변이를 일으켜, 그의 기능적 유사체를 생성할 수 있다. 예를 들어 문헌 [Zoeller et al., 1984, Proc. Nat Acad. Sci. USA 81:5662-5066] 및 미국 특허 제4,588,585호를 참조하라. 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 구축하는 또다른 방법은 올리고뉴클레오티드 합성 장치를 이용하는 화학적 합성에 의한 방법일 것이다. 그러한 올리고뉴클레오티드의 설계는, 목적하는 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하고 관심 재조합 폴리펩티드를 생성하도록 할 숙주 세포에서 선호되는 코돈을 선택하여 할 수 있다.
단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하기 위해서 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 나아가, 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부분을 코딩하는 여러 개의 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 후 이들을 결찰할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립을 위한 5' 또는 3' 돌출부를 함유한다.
일단 (합성, 부위 지정 돌연변이유발, 또는 또다른 방법에 의해) 조립되면, 관심 대상의 특정 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 돌연변이체 DNA 서열을 발현 벡터 내로 삽입하고, 목적하는 숙주에서의 단백질 발현에 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시킬 것이다. 조립의 적절성에 대해서는 뉴클레오티드 서열분석, 제한 맵핑, 및 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인가능하다. 당업계에 익히 공지된 바와 같이, 숙주에서 형질감염된 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위해서, 이 유전자를, 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결시킨다.
폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시키기 위해 재조합 발현 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자에서 유래한 적합한 전사 또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된 Notch 수용체 융합체 또는 생물학적으로 동등한 유사체를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물이다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전자 요소 또는 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 요소, 예를 들어, 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열 (이하에서 상세히 기재됨)의 조립물을 포함한다. 상기와 같은 조절 요소에는 전사를 제어하는 오퍼레이터 서열이 포함될 수 있다. 부가적으로, 보통 숙주에서 복제될 수 있는 능력을 부여하는 복제 원점 및 형질전환체에 대한 인식을 용이하게 하는 선별 유전자가 편입될 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로에 대해 기능적으로 관련될 때 작동가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로 발현될 경우 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어할 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 또는 리보솜 결합 부위는 번역이 이루어지도록 위치된 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이란, 인접한 것을 의미하며, 분비 리더의 경우, 이는 리딩 프레임으로 인접한 것을 의미한다. 효모 발현 시스템에서 사용하도록 의도된 구조 요소에는 숙주 세포에 의한 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 별법으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열없이 발현되는 경우, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로는 그 후에 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 생성할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터에 대한 선택은 숙주에 대한 선택에 좌우될 것이다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 이용될 수 있다. 진핵 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 예를 들어, SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 거대세포바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터가 있다. 박테리아 숙주용으로 유용한 발현 벡터로는, 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체를 비롯한 에스케리키아 콜리로부터의 플라스미드, 및 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 섬유상 단일-가닥 DNA 파지가 있다.
폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포로는 적절한 프로모터의 제어 하에 있는 원핵생물, 효모, 곤충 또는 보다 고등한 진핵 세포가 있다. 원핵생물로는, 그램 음성 또는 그램 양성 유기체, 예를 들어 이. 콜리 또는 바실러스가 있다. 보다 고등한 진핵 세포로는 본원에 기재된 포유동물 기원의 확립된 세포주가 있다. 또한, 무세포 번역 시스템이 이용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모, 및 포유동물 세포 숙주에서 사용하기에 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)]에 기재되어 있으며, 상기 문헌에서의 관련된 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 단백질의 발현에 유리하게 이용된다. 포유동물 세포에서 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는데, 그 이유는, 그러한 단백질이 일반적으로 올바르게 접혀지고, 적절히 변형되고, 완전히 기능적이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예로는, 문헌 [Gluzman 1981, Cell 23:175]에 기재된 COS-7 계통의 원숭이 신장 세포 및, 예를 들어, L 세포, C127, 3T3, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO), HeLa 및 BHK 세포주를 비롯한, 적절한 벡터를 발현시킬 수 있는 여타의 세포주가 있다. 포유동물 발현 벡터는 발현시킬 유전자에 연결된 비-전사 요소, 예컨대 복제 원점, 적합한 프로모터 및 인핸서, 및 여타의 5' 또는 3' 플랭킹 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필수적인 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이싱 제공 및 수용 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서 이종 단백질을 생성하기 위한 배큘로바이러스 시스템은 문헌 [Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology 6:47]에 개관되어 있다.
형질전환된 숙주에 의해 생성된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 그러한 표준 방법에는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 사이징(sizing) 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 차별적 용해도, 또는 단백질 정제에 대한 여타 임의의 표준 기술이 있다. 친화도 태그, 예컨대 헥사히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트(coat) 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착하여, 적절한 친화도 컬럼을 통과시킴으로써 정제를 용이하게 할 수도 있다. 단리된 단백질에 대해서는 또한 단백질분해, 핵 자기 공명 및 x-선 결정학과 같은 기술을 이용하여 물리적으로 특징분석할 수도 있다.
예를 들어, 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어(Millipore) 펠리콘(Pellicon) 한외여과 장치를 이용하여, 배양 배지 내로 재조합 단백질을 분비하는 시스템으로부터의 상층액을 먼저 농축할 수 있다. 이 농축 단계 후, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 별법으로, 음이온 교환 수지, 예를 들어, 디에틸아미노에틸 (DEAE) 측쇄기를 갖는 매트릭스 또는 기판을 이용할 수 있다. 이 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 또는 단백질 정제에 통상 이용되는 여타의 유형일 수 있다. 별법으로, 양이온 교환 단계를 이용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체로는 술포프로필 또는 카르복시메틸기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스가 있다. 마지막으로, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어, 메틸 또는 여타의 지방족 측쇄기를 갖는 실리카 겔을 이용하는 하나 이상의 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC) 단계를 이용하여 암 줄기 세포 단백질-Fc 조성물을 추가로 정제할 수 있다. 또한, 균질한 재조합 단백질의 생성을 위해 상기한 정제 단계의 일부 또는 전부의 다양한 조합을 이용할 수도 있다.
박테리아 배양물에서 생성된 재조합 단백질은 보통 세포 펠렛으로부터의 최초 추출, 이어서 하나 이상의 농도, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리된다. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 최종 정제 단계에 이용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 이용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 초음파처리, 기계적 파쇄, 또는 세포 용해제 이용을 비롯한 임의의 편리한 방법으로 파쇄할 수 있다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 단리된 것이다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 실질적으로 순수한 것이다.
본 발명은 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 대한 특이적 결합에 있어 서열 14를 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 대한 특이적 결합에 있어, 서열 16의 중쇄 및 서열 18의 경쇄를 포함하는 59R1 IgG2 항체 (신호 서열을 갖거나 갖지 않음)를 포함하거나, 이 항체로 이루어지거나 또는 본질적으로 이 항체로 이루어진 항체, 또는 2008년 10월 15일에 ATCC에 기탁되된 DNA (지정 번호 PTA-9547이 부여됨)로 코딩되는 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다.
본 발명은 나아가, 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 서열 5 내지 10, 22 내지 27, 30 또는 51의 CDR을 포함하고 CDR당 4개 이하의 (즉, 0, 1, 2, 3, 또는 4개의) 보존적 아미노산 치환 (예를 들어, 표 1 참조)을 갖는, 하나 이상의 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 본 발명은 또한, 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 59R1 (즉, 서열 5 내지 10)의 CDR을 포함하고 CDR당 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는, 하나 이상의 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 따라서, 본 발명은, 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 59R1의 CDR을 포함하는, 하나 이상의 인간 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 59R1의 중쇄 CDR3을 포함하고/거나, 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 59R1의 경쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 항체는 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한, 1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6개의 59R5 (즉, 서열 5, 6, 8 내지 10, 51)의 CDR을 포함하고, CDR당 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는, 하나 이상의 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 59R5의 중쇄 CDR3, 및/또는 4개 이하의 보존적 아미노산 치환을 갖는 59R5의 경쇄 CDR3을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이 항체는 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다.
또한, SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 (G/I)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N) (서열 30)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 중쇄 CDR3은 SIFYPT (서열 22), SSFFAS (서열 23), SSFYAS (서열 24), SSFFAT (서열 25), SIFYPS (서열 26), 및 SSFFAN (서열 27)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및/또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 중쇄 CDR(들)은 항체 중쇄의 가변 영역 내에 함유되어 있다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 나아가 RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 경쇄 CDR(들)은 항체 경쇄의 가변 영역 내에 함유되어 있다. 특정 실시양태에서, 이 중쇄 CDR(들) 및/또는 경쇄 CDR(들)은 1, 2, 3, 또는 4개의 보존적 아미노산 치환으로 변형되어 있다. 특정 실시양태에서, 각각의 CDR(들)은 1 내지 2개 이하의 보존적 아미노산 치환으로 변형되어 있다.
예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명은, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체로서 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 이 항체는 나타낸 경쇄 및 중쇄 CDR을 모두 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체로서 (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는 (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 나타낸 경쇄 및 중쇄 CDR을 모두 포함한다.
본 발명은 나아가 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체로서 RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및/또는 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체로서 (a) 서열 14 또는 서열 20에 대해 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 13 또는 서열 19에 대해 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 이 항체는 (a) 서열 14에 대해 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 13에 대해 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 (a) 서열 14 또는 서열 20을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 가변 영역); 및/또는 (b) 서열 13 또는 서열 19를 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 경쇄 가변 영역)를 포함한다.
본 발명은 또한, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체로서 (a) 서열 50에 대해 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드; 및/또는 (b) 서열 13에 대해 약 80％ 이상, 약 85％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상, 또는 약 98％ 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 항체를 제공한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 이 항체는 (a) 서열 50에 대해 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 서열 13에 대해 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 (a) 서열 50을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 중쇄 가변 영역); 및/또는 (b) 서열 13을 포함하는 폴리펩티드 (예를 들어, 경쇄 가변 영역)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 길항제는 표적 항원을 발현하는 종양을 사멸시키는 보체-의존적 세포독성 또는 항체-의존적 세포독성을 매개할 수 있는 항체이다. 다른 특정 실시양태에서, 이 항체는 독소 또는 방사성동위원소에 직접 접합되어 종양 세포 사멸을 매개한다. 나아가, 종양 생존은 신생혈관형성에 의존하며, 특정 실시양태에서, 항체는 항-맥관형성 효과를 갖고 있다.
본 발명은 Notch 수용체, 예컨대 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 대한 단리된 항체를 제공한다. 이 항체, 또는 항체 단편은 기재된 Notch 수용체를 특이적으로 인식하는 임의의 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 또는 그의 단편을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 이 모노클로날 항체, 또는 그의 단편은 본원에 기재된 Notch 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 키메라 또는 인간화 항체이다. 다른 실시양태에서, 이 모노클로날 항체, 또는 그의 단편은 본원에 기재된 Notch 수용체의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 IgG1 또는 IgG2 항체이다.
이 Notch 수용체에 대한 항체는 본원에 기재된 실험, 진단 및 치료 방법에서 용도가 발견된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어, 환자 조직 생검, 흉막 삼출물, 또는 혈액 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 Notch 수용체의 발현을 검출하는데 사용된다. 조직 생검을 절편화한 후, 예를 들어, 면역형광법 또는 면역조직화학을 이용하여, 단백질을 검출할 수 있다. 별법으로는, 샘플로부터의 개별 세포를 단리 후, 고정된 세포 또는 살아있는 세포에 대해 FACS 분석으로 단백질 발현을 검출한다. 나아가, 상기 항체를 단백질 어레이 상에서 사용하여, 예를 들어, 종양 세포 상에서, 세포 용해물에서, 또는 여타의 단백질 샘플에서의 Notch 수용체의 발현을 검출할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 종양 세포를 시험관내 세포 기반 검정 또는 생체내 동물 모델 중 하나에서 상기 항체와 접촉시켜 종양 세포의 성장을 억제하는데 사용된다. 또 다른 실시양태에서는, 상기 항체는, 치료적 유효량의 Notch 수용체에 대한 항체를 투여함으로써 인간 환자에서 암을 치료하는데 사용된다.
폴리클로날 항체는 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 임의로는 멸균 염수 중에 희석 후 항원보강제 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 항원보강제)와 조합시켜 안정한 에멀젼을 형성하게 한 키홀 림펫 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin; KLH), 혈청 알부민 등에 접합시킨 관련 항원 (정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질, 융합 단백질 등)을 피하 또는 복강내로 다수회 주사하여 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 당나귀, 염소 등)을 면역화하여 폴리클로날 항체를 일으킨다. 그런 다음, 그렇게 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 상기 폴리클로날 항체를 회수한다. 수집된 혈액을 응고시키고, 혈청을 따라버린 후, 원심분리로 맑게 하고, 항체 역가에 대해 분석한다. 상기 폴리클로날 항체는, 친화도 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 등을 비롯한 당업계의 표준 방법에 따라 혈청 또는 복수로부터 정제할 수 있다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 예컨대 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있디. 하이브리도마 방법을 이용하여, 마우스, 햄스터, 또는 여타의 적절한 숙주 동물을 상기 기재한 바와 같이 면역화하여, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 림프구에 의한 생성을 이끌어낸다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화할 수 있다. 면역화 후, 림프구를 단리하고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여, 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시키고, 그런 다음 이 세포를 비-융합 림프구 및 골수종 세포로부터 선별할 수 있다. 그런 다음, 면역침전 또는 면역블로팅에 의해, 또는 방사선면역검정 (RIA) 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 검정에 의해 측정되는 바 선택된 항원에 대항하여 특이적으로 유도되는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 표준 방법 (문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986])을 이용한 시험관내 배양으로 또는 동물의 복수 종양으로서 생체내에서 증식시킬 수 있다. 그런 다음, 상기에서 폴리클로날 항체에 대해 기재된 바와 같이 배양 배지 또는 복수액으로부터 모노클로날 항체를 정제할 수 있다.
다르게는, 또한 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 RT-PCR에 의해, 성숙한 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리시키고, 통상적인 절차를 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서, 상기 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝하고, 이를, 다르게는 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜리 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염시키면, 이는 숙주 세포 내에서 모노클로날 항체를 발현시킨다. 또한, 파지 디스플레이 라이브러리 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 것)로부터 목적하는 종의 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 단리시킬 수도 있다.
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 이용하여 수많은 상이한 방식으로 추가로 변형시켜, 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 예를 들어, 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을, 예를 들어, 1) 인간 항체의 그러한 영역으로 대체시켜 키메라 항체를 생성하거나 또는 2) 비-면역글로불린 폴리펩티드로 대체시켜 융합 항체를 생성할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 상기 불변 영역을 절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 나아가, 가변 영역에 대한 부위 지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 이용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
보다 일반적으로는, 임의의 항체로부터 본 발명에 유용한 변형된 항체를 수득 또는 유도시킬 수 있다. 나아가, 개시된 변형 항체를 생성하는데 사용되는 부모 또는 전구체 항체, 또는 그의 단편은 뮤린, 인간, 키메라, 인간화, 비-인간 영장류 또는 영장류화된 것일 수 있다. 다른 실시양태에서 본 발명의 변형된 항체는 본원에 기재된 바와 같이 변화된 불변 도메인을 갖는 단일 쇄 항체 구축물 (예컨대 미국 특허 제5,892,019호 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것)을 포함할 수 있다. 따라서, 본원의 교시내용에 따라 변형된 이들 유형의 항체 중 임의의 항체는 본 발명에서 상용성 있다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 단일-쇄 항체의 생성을 위해 기술들을 적합하게 개조할 수 있다 (미국 특허 제4,946,778호 참조). 또한, Notch, 또는 이의 유도체, 단편, 유사체 또는 동족체에 대해 목적하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 동정할 수 있게 하는 Fab 발현 라이브러리의 구축을 위해 방법들을 적합하게 개조할 수 있다(문헌 [Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281]). 당업계의 기술을 이용하여, (a) 항체 분자의 펩신 소화로 제조된 F(ab')2 단편; (b) F(ab')2 단편의 디술파이드 가교를 환원시켜 생성한 Fab 단편, (c) 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리하여 생성한 Fab 단편, 및 (d) Fv 단편을 비롯한 (이에 제한되는 것은 아님) 본 발명의 폴리펩티드에 대한 이디오타입(idiotype)을 함유하는 항체 단편을 제조할 수 있다.
이중특이적 항체 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원 (또는, 특정 실시양태에서는, 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프)에 대한 결합 특이성을 갖는, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체인 모노클로날 항체이다. 본 발명의 경우에서, 이 결합 특이성 중 하나는 본 발명의 항원성 폴리펩티드 (Notch, 또는 그의 단편)에 대한 것이고, 제2 결합 표적은 임의의 여타의 항원으로서, 유리하게는 세포 표면 단백질, 또는 수용체 또는 수용체 서브유닛이다. 하나의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2)에 특이적으로 결합하는 하나의 항원-결합 부위를 포함하고 제2 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch3)에 특이적으로 결합하는 제2의 상이한 항원-결합 부위를 추가로 포함하는 이중특이적 항체가 제공된다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로 이중특이적 항체의 재조합적 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기반으로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Milstein and Cuello, 1983, Nature 305:537-539]). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 임의 배열(random assortment)로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마(quadroma))는 가능성 있는 10개의 상이한 항체 분자의 혼합물을 생성하며, 이 중 오로지 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 이 올바른 분자는 보통 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.
별법으로, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 단일특이적일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 하나 이상의 항원-결합 부위 각각은 동일한 하나 이상의 인간 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2, Notch3, 또는 Notch2 및 Notch3 둘 모두에 존재하는 상동 에피토프)에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 단일특이적 항체의 항원-결합 부위는 인간 Notch3의 EGF 반복부 9 및 Notch2의 EGF 반복부 10에 결합할 수 있다 (또는 결합한다).
목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킬 수 있다. 이 융합체는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 융합체 중 적어도 하나에는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 존재할 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질감염시킨다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 더욱 상세한 것은 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210]에서 찾아볼 수 있다.
이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성하는 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 화학적 연결을 이용하여 이중특이적 항체를 제조할 수 있다. 또한, 문헌 [Brennan et al., 1985, Science 229:81]에는 무손상 항체를 단백질 분해 방법으로 절단하여 F(ab')2 단편을 생성하는 절차가 기재되어 있다.
부가적으로, Fab' 단편을 이. 콜리로부터 직접 회수하여 화학적으로 연결시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다 (문헌 [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225]). 이러한 방법은 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')2 분자의 생성에 사용될 수 있다.
또한, 2개 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (문헌 [Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60]).
예시적인 이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있고, 이들 중 적어도 하나는 본 발명의 폴리펩티드에서 유래한다. 다르게는, 면역글로불린 분자의 항-항원 아암(arm)을 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대 T 세포 수용체 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28 또는 B7), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체와 결합하는 아암과 조합하여 세포 방어 메카니즘을 특정 항원을 발현하는 세포에 집중시킬 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 특정 항원을 발현하는 세포로 지정하는 데 사용될 수 있다. 상기 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이터, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA를 결합하는 아암을 보유한다.
이형접합 항체도 또한 본 발명의 범주에 속한다. 이형접합 항체는 2개의 공유 결합 항체로 이루어져 있다. 상기 항체는, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 표적 면역 세포로 제안된 바 있다 (미국 특허 제4,676,980호). 항체는, 가교제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 항체와 Notch의 폴리펩티드의 결합을 제공하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있다는 것을 알아야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은, 체액 반응 개시 및 목적하는 종양-연관 항원에 대한 면역글로불린 생성을 유도할 수 있는 임의 유형의 포유동물을 포함하거나 이로부터 유래할 수 있다. 따라서, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 사이노몰구스 원숭이, 마카크(macaque) 등) 또는 늑대 기원의 것일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 면역글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간이다. 다른 실시양태에서, 적합한 항체 (통상 비-인간 공급원으로부터 유래됨)의 가변 영역은 결합 특성을 개선시키거나 분자의 면역원성을 감소시키기 위해 조작되거나 또는 특이적으로 맞추어질 수 있다. 이런 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나, 또는 다르게는 개입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
본 발명의 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 가변 영역 내부에 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체로부터의 최소 서열을 함유한 항체이다. 상기 항체를 치료적으로 사용하여 인간 대상체에게 투여하는 경우 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킬 수 있다. 사실상, 인간화 항체는 통상 비-인간 서열이 최소이거나 없는 인간 항체이다. 인간 항체는 인간에 의해 생성된 항체, 또는 인간에 의해 생성된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다.
인간화 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 항체는 인간 항체의 CDR 대신 목적하는 특이성, 친화도 및/또는 능력을 갖는 비-인간 항체 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR을 사용하여 인간화할 수 있다 (Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536). 인간화 항체를 Fv 프레임워크 영역에서 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내에서 추가 잔기의 치환에 의해 추가로 변형시켜, 항체 특이성, 친화도 및/또는 능력을 개선 및 최적화할 수 있다.
인간화와 다르게, 인간 항체를 생성할 수 있다. 인간 항체는 트랜스제닉 동물, 파지 라이브러리 및 시험관내 활성화된 인간 B 세포로부터 비롯하여 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다.
예를 들어, 면역화 후에 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에 인간 항체의 충분한 레퍼토리를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 좌위를 함유하는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 본 발명에 와서야 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이체 마우스 내 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동형접합성 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제시킨다는 것이 기술된 바 있다. 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 상기 생식-계열 돌연변이체 마우스로의 이동은 항원 투여 후 인간 항체를 생산할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551]; [Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258]; [Bruggemann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33]; 미국 특허 제5,545,806; 5,569,825; 5,591,669; 5,545,807; 5,545,807; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016호; 및 WO 97/17852호를 참조한다.
다르게는, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산할 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로서 디스플레이한다. 사상 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하므로, 항체의 기능 특성에 기초한 선별은 또한 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 야기한다. 따라서, 파지는 B-세포의 특성 중 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 수행될 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이가 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 단리되었다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리를 구축할 수 있고, 항원 (자가-항원 포함)의 다양한 어레이에 대한 항체를 단리할 수 있다. 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 인간 항체를 선별하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (문헌 [Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology 14:309-314]; [Sheets et al., 1998, PNAS 95:6157-6162]; [Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227:381]; [McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554]; [Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628]; 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597]). 항체 파지 라이브러리의 생성 및 이용 기술도 또한 미국 특허 제5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963호; 및 문헌 [Rothe et al., 2008, J. Mol. Bio. 376:1182-1200] (이들 각각은 그의 전문이 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 친화도 성숙 전략, 예컨대 체인 셔플링 (문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783] (그의 전문이 참조로 포함됨))이 당업계에 공지되어 있고, 이를 이용하여 고 친화도 인간 항체를 생성할 수 있다.
인간 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 직접 제조될 수 있다. 시험관내에서 면역화되거나, 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구를 생성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77]; [Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95]; 미국 특허 제5,750,373; 5,567,610; 및 5,229,275호 참조).
전체 비-인간 가변 도메인을 인간 불변 영역 상에 그래프팅하는 것이 "클래식" 키메라 항체를 생산할 것임을 알 것이다. 본 출원의 맥락에서, 용어 "키메라 항체"는 면역반응성 영역 또는 부위가 제1 종으로부터 수득 또는 유도되고 불변 영역 (본 발명에 따라 무손상, 일부 또는 변형될 수 있음)이 제2 종으로부터 수득되는 임의의 항체를 의미하는 것으로 여겨질 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항원 결합 영역 또는 부위는 비-인간 공급원 (예를 들어, 마우스)으로부터일 것이며, 불변 영역은 인간이다. 가변 영역의 면역원성 특이성은 통상 그의 공급원에 의해 영향을 받지 않지만, 인간 불변 영역은 비-인간 공급원으로부터의 불변 영역보다는 인간 대상체로부터 면역 반응을 덜 유발하는 경향이 있다.
중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 일부 대체에 의해서, 및 필요한 경우, 일부 프레임워크 영역 대체 및 서열 변형에 의해서 변경된다. CDR이 프레임워크 영역을 유도하는 항체로서 동일한 부류 또는 심지어는 아부류의 항체로부터 유도될 수 있지만, CDR은 다양한 부류의 항체로부터, 및 바람직하게는 다양한 종의 항체로부터 유도될 것으로 예상된다. 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 완전 CDR로 대체하여 한 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또다른 가변 도메인으로 이동시키는 것이 필요하지 않을 수 있다는 것이 강조되어야 한다. 오히려, 항원 결합 부위의 활성을 유지하기 위해 필요한 이들 잔기를 이동시키는 것만이 필요할 수 있다. 미국 특허 제5,585,089; 5,693,761; 및 5,693,762호에 설명이 제시되어 있음을 고려하여, 면역원성이 감소된 기능성 항체를 수득하는 것은 통상적인 실험 수행 또는 시행 착오 시험에 의해 당업계에서 정통할 것이다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 본 발명의 변형된 항체는, 적어도 불변 영역 도메인의 하나 이상의 부분이 결실되거나 또는 다르게는 변경되어 목적하는 생화학적 및/또는 생물학적 특성 (예컨대, 천연의 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 항체에 비해 증가된 종양 편재화 또는 감소된 혈청 반감기)을 제공하는 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함할 것임을 알 것이다. 몇몇 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 불변 영역에 대한 변형은 하나 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 즉, 본원에 개시된 변형된 항체는 3종의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 하나 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인 (CL)에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 도메인이 일부 또는 전부 결실된 변형된 불변 영역이 고려된다. 다른 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 또다른 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재한 불변 영역에 의해 통상 제공되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개의 잔기)에 의해 대체될 것이다.
이들의 배열 외에도, 불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 항체에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체 시스템을 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용균에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증성 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 추가로, 항체는, 세포 상의 Fc 수용체 (FcR)와 결합하는 항체 Fc 영역 상의 Fc 수용체 부위를 이용하여, Fc 영역을 통해 세포와 결합한다. IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (mu 수용체)를 비롯한 다양한 부류의 항체에 대해 특이적인 Fc 수용체가 다수 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 제거, 킬러 세포 (항체-의존적 세포-매개된 세포독성, 또는 ADCC라 칭함)에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용리, 염증 매개자의 방출, 태반 통과, 및 면역글로불린 생산의 제어를 포함한 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응을 촉발한다. 다양한 Fc 수용체 및 수용체 부위가 특정 범위로 연구되었지만, 그의 위치, 구조 및 기능에 관한 알려지지 않은 것들이 여전히 많이 존재한다.
본 발명의 범주를 제한하지는 않지만, 본원에 기재된 바와 같이 변형된 불변 영역을 포함하는 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하고, 이에 따라 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다는 것을 안다. 예를 들어, (점 돌연변이 또는 다른 방법을 통한) 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜 종양 편재화를 증가시킬 수 있다. 다른 경우, 본 발명과 일치하는 불변 영역 변형은 보체 결합을 완화시켜 혈청 반감기 및 접합된 세포독소의 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다. 불변 영역의 또다른 변형을 이용하여, 항원 특이성 또는 항체 가요성 증가로 인한 편재성 증진을 가능하게 하는 디술파이드 연결 또는 올리고당 잔기를 제거할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 널리 공지된 생화학 또는 분자 공학 기술을 이용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
변형된 항체를 조작하여 CH3 도메인을 각각의 변형된 항체의 힌지 영역에 직접 융합시킬 수 있다는 것을 주목할 것이다. 다른 구축물에서, 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 펩티드 스페이서를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고, 남은 CH3 도메인 (변형되거나 변형되지 않음)이 5 내지 20개의 아미노산 스페이서를 이용하여 힌지 영역에 결합한 적합한 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 예를 들어 불변 도메인의 조절 요소를 자유롭고 접근가능하게 하거나, 또는 힌지 영역을 가요성이게 할 수 있다. 그러나, 아미노산 스페이서는 일부 경우에 면역원성으로 판명되며, 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유발할 수 있음을 알아야 한다. 따라서, 구축물에 첨가되는 임의의 스페이서는 비교적 비-면역원성이거나, 또는 심지어 변형된 항체의 목적하는 생화학적 및/또는 생물학적 양이 유지되어야 하는 경우에는 완전히 생략되어야 한다.
전체 불변 영역 도메인의 결실 이외에, 본 발명의 항체는 소수의 또는 심지어는 단일 아미노산의 부분 결실 또는 치환에 의해 제공될 수 있다는 것을 알 것이다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 실질적으로 Fc 결합을 감소시키기에 충분할 수 있고, 이에 따라 종양 편재화가 증가한다. 유사하게, 조절되어야 할 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 Clq 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부를 간단히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능을 남기면서 항체의 선택된 특성 (혈청 반감기)을 개선시킬 수 있다. 게다가, 상술한 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역을 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 배열 및 면역원성 프로파일을 실질적으로 유지하면서 보존된 결합 부위 (예를 들어, Fc 결합)에 의해 제공되는 활성을 파괴하는 것이 가능할 수 있다. 다른 실시양태는 불변 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가하여 바람직한 특성, 예컨대 이펙터 기능을 증진시키거나, 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착을 제공할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 선택된 불변 영역 도메인으로부터 유래된 특정 서열을 삽입 또는 복제하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명은 또한 Notch 수용체를 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식 및 결합할 수 있는 항체이다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 (예를 들어, 동일한 Notch 수용체 폴리펩티드) 내에 또는 상이한 분자 상에 있을 수 있다. 예를 들어, 항체는 Notch 수용체, 및 또한 예를 들어 1) 백혈구 상의 이펙터 분자, 예컨대 T-세포 수용체 (예를 들어, CD3) 또는 Fc 수용체 (예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 2) 본원에 자세히 기재된 세포독성제를 특이적으로 인식 및 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 당업계에서 보편적이다 (문헌 [Millstein et al., 1983, Nature 305:537-539]; [Brennan et al., 1985, Science 229:81]; [Suresh et al, 1986, Methods in Enzymol. 121:120]; [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659]; [Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med. 175:217-225]; [Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]; [Gruber et al., 1994, J. Immunol. 152:5368]; 및 미국 특허 제5,731,168호).
본 발명의 특정 실시양태에서, 예를 들어 종양 침투를 증가시키 위해서는 무손상 항체보다는 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술이 공지되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질가수분해 소화를 통해 유래된다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117] 및 [Brennan et al., 1985, Science, 229:81]). 그러나, 이들 단편은 오늘날 통상적으로 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 세포에 의해 바로 생산된다. 따라서, Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli) 또는 다른 숙주 세포에서 발현되어 이들로부터 분비될 수 있고, 따라서 이들 단편의 대량 생산이 가능하다. 별법으로, 상기 항체 단편은 본원에 개시된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 항체 단편은 또한 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수 있고, 예를 들어 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술이 명백할 것이다.
특히 항체 단편의 경우, 항체를 변형시켜 그의 혈청 반감기를 증가시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 재이용 수용체 결합 에피토프의 항체 단편으로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그로의 혼입, 및 이어서 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 이루어질 수 있다
본 발명은 본원에 기재된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 이들의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또다른 아미노산으로 치환하는 것, 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환이 의미하는 것이 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명은 또한 세포독성제에 접합시킨 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다. 세포독성제로는 화학요법제, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체) 등을 들 수 있다. 상기 면역접합체의 생성에 유용한 화학요법 작용제로는, 예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 독소루비신, 멜파란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 개재 작용제를 들 수 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 체인 (디프테리아 독소의 비결합 활성 단편), 외독소 A 체인, 리신 A 체인, 아브린 A 체인, 모데신 A 체인, 알파-사르신, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안신 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 들 수 있다. 항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 생성된다. 항체, 및 하나 이상의 소분자 독소 (예컨대, 칼리키마이신, 마이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065) 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다.
접합 항체는 2개의 공유 결합된 항체로 이루어져 있다. 상기 항체는, 예를 들어 원치 않는 세포에 대한 표적 면역 세포로 제안된 바 있다 (미국 특허 제4,676,980호). 항체는, 가교제를 포함하는 방법을 비롯하여 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 이용해 시험관내 제조될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술파이드 교환 반응을 이용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 들 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 항체는 이펙터 기능, 예를 들어 항원-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체-의존적 세포독성 (CDC)을 증진시키기 위해 변형된 인간 Fc 영역을 함유한다. 이는 항체의 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 치환체를 투입하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, Fc 영역에서 사슬간 디술파이드 결합 형성을 가능하게 하는 시스테인 잔기(들)을 상기 영역에 도입하여 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC)을 개선시킬 수 있다 (문헌 [Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195]; [Shopes, 1992, Immunol. 148:2918-2922]). 또한, 항-종양 활성이 증진된 동종이량체 항체를 문헌 [Wolff et al., 1993, Cancer Research 53:2560-2565]에 기재된 바와 같이 이형이중기능 교차-링커를 사용하여 제조할 수 있다. 다르게는, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 처리할 수 있다 (문헌 [Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230]).
얼마나 유용한 양이 얻어지는 지에 상관없이, 본 발명의 항체는 다수의 접합된 (즉, 면역접합) 또는 접합되지 않은 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체를 접합되지 않은 또는 "네이키드" 형태로 사용하여, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포 독성 (ADCC)을 포함한 대상체의 자연 방어 메카니즘을 이용해 악성 세포를 제거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 항체를, 다수의 널리 공지된 킬레이터 또는 직접 표지 중 어느 하나를 이용하여 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 212Bi, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re 및 188Re (이들로 한정되지는 않음)를 비롯한 방사성동위원소와 접합시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 개시된 조성물은 약물, 전구약물 또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 및 림포카인, 예컨대 인터페론에 커플링된 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 또다른 실시양태는 특정 생물독소, 예컨대 리신 또는 디프테리아 독소에 접합시킨 항체의 사용을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 변형된 항체는 다른 면역학적 활성 리간드 (예를 들어, 항체 또는 그의 단편)와 복합체를 형성할 수 있고, 여기서 생성된 분자는 신생물 세포 및 이펙터 세포 (예컨대, T 세포) 둘 모두와 결합한다. 사용시 접합되거나 접합되지 않은 변형된 항체의 선별은 암의 유형 및 단계, 보조 요법의 사용 (예를 들어, 화학요법 또는 외부 방사선), 및 환자 상태에 따라 달라질 것이다. 본원에 교시된 내용을 고려하여 이러한 선별이 용이하게 이루어질 수 있음을 알 것이다.
항-Notch 항체의 제법 및 특성은 또한, 예를 들어 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0131434호 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 교시되어 있다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 항체가 아닌 폴리펩티드이다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 확인 및 생산하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304]; [Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27]; [Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658]; [Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76]; 및 [Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83] (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 특정 실시양태에서, 파지 디스플레이 기술을 이용하여 Notch-결합 폴리펩티드를 확인/생산한 바 있다. 특정 실시양태에서, 상기 폴리펩티드는 단백질 A, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 작용제는 비-단백질 분자이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 소분자이다. 비-단백질 Notch-결합제의 확인에 유용한 조합 화학 라이브러리 및 기술이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kennedy et al., 2008, J. Comb. Chem, 10:345-354]; [Dolle et al, 2007, J. Comb. Chem., 9:855-902]; 및 [Bhattacharyya, 2001, Curr. Med. Chem., 8:1383-404] (이들 각각은 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 추가의 특정 실시양태에서, 작용제는 탄수화물, 글리코아미노글리칸, 당단백질 또는 프로테오글리칸이다.
특정 실시양태에서, 작용제는 핵산 앱타머이다. 앱타머는 또다른 분자와의 결합 능력에 기초하여 (예를 들어, 무작위 또는 돌연변이된 풀로부터) 선택된 폴리뉴클레오티드 분자이다. 몇몇 실시양태에서, 앱타머는 DNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 특정 실시양태에서, 앱타머는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 앱타머는 하나 이상의 변형된 핵산 잔기를 포함한다. 단백질과의 결합에 대해 핵산 앱타머를 생성 및 스크리닝하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,270,163; 5,683,867; 5,763,595; 6,344,321; 7,368,236; 5,582,981; 5,756,291; 5,840,867; 7,312,325; 및 7,329,742호; 국제 특허 공개공보 제WO 02/077262; WO 03/070984호; 미국 특허 출원 공개공보 제2005/0239134; 2005/0124565; 및 2008/0227735호 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 면역특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 이용될 수 있는 면역검정으로는, 이들로 한정되지는 않지만, 비아코어 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블럿(Western blot) 분석, 방사선면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침강 반응, 겔 확산 침강 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-고정 검정, 면역방사능 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 이용한 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 들 수 있다. 이러한 검정은 통상적이며, 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York] (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조).
본 발명의 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체에 대한 항체의 면역특이성은 ELISA를 이용하여 측정된다. ELISA 검정은 항원을 제조하고, 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 또는 알칼린 포스파타제)에 접합시킨 Notch 수용체에 대한 항체를 웰에 첨가하고, 소정의 기간 동안 인큐베이션하고, 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 다르게는, Notch 수용체에 대한 항체를 검출가능한 화합물에 접합시키지 않고, 대신에 Notch 수용체에 대한 항체를 인식하는 제2 접합된 항체를 웰에 첨가한다. 추가로, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에 Notch 수용체에 대한 항체를 웰에 코팅할 수 있고, 검출가능한 화합물에 접합시킨 제2 항체를 코팅된 웰에 첨가한 후, 항원을 첨가할 수 있다. 검출된 신호를 증가시키기 위해 변형시킬 수 있는 파라미터 뿐만 아니라, ELISA의 기타 변수도 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley ＆ Sons, Inc., New York at 11.2.1] 참조).
Notch 수용체에 대한 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 오프-레이트(off-rate)를 경쟁적 결합 검정으로 측정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예로는, 표지된 항원 (예를 들어, 3H 또는 125I), 또는 그의 단편 또는 변이체를 표지되지 않은 항원의 증가량의 존재하에 관심 항체와 함께 인큐베이션한 후, 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사선면역검정이다. Notch-수용체에 대한 항체의 친화도 및 결합 오프-레이트를 스캐차드 플롯(Scatchard plot) 분석에 의해 데이터로부터 측정할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 비아코어 역학 분석을 이용하여 Notch 수용체에 대한 항체의 결합 온 및 오프 레이트를 측정한다. 비아코어 역학 분석은 그의 표면 상에서 고정된 Notch 항원을 갖는 칩으로부터 항체의 결합 및 분리를 분석하는 것을 포함한다.
본 발명은 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 또한 서열 1, 3, 15, 17, 47 또는 48의 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있으며, 여기서 DNA에는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA가 포함된다. DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있으며, 단일-가닥인 경우에 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다. 따라서, 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명은 서열 2, 4, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 39, 40, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56 또는 57의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 혼성화한 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 1, 3, 15, 17, 47, 48, 58, 59 또는 60의 폴리뉴클레오티드와 혼성화한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다.
본원에 사용된 어구 "혼성화하다" 또는 "선별적으로 혼성화하다" 또는 "특이적으로 혼성화하다"는, 서열이 복잡한 혼합물 (예를 들어, DNA 또는 RNA의 라이브러리)로 존재하는 경우에 엄격한 혼성화 조건 하에 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자가 결합 또는 이중화되는 것을 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Andersen (1998) Nucleic Acid Hybridization Springer-Verlag; Ross (ed. 1997) Nucleic Acid Hybridization Wiley]을 참조한다.
본원에 사용된 어구 "엄격한 혼성화 조건"은, 프로브 또는 다른 폴리뉴클레오티드가 통상 핵산의 복잡한 혼합물 중에서 그의 표적 하위서열 또는 다른 상보성 서열과 혼성화하지만, 일반적으로 다른 서열과는 혼성화하지 않을 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 이는 여러 환경에서 다양할 것이다. 보다 긴 서열이 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에서 발견된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도에서 특정 서열에 대한 열융점 (Tm) 보다 약 5-10℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적과 상보적인 프로브의 50％가 평형 상태에서 표적 서열과 혼성화하는 (규정된 이온 강도, pH 및 핵 농도 하에서의) 온도이다 (Tm에서 표적 서열이 과량 존재하는 경우, 프로브의 50％가 평형 상태에서 사용됨). 엄격한 조건은, 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.0 M 나트륨 이온 농도 미만, 통상 약 0.01 내지 1.0 M 나트륨 이온 농도 (또는 기타 염)이고, 온도가 짧은 프로브 (예를 들어, 10 내지 50개의 뉴클레오티드)에 대해서는 약 30℃ 이상이고, 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드)에 대해서는 약 60℃ 이상인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다. 고 엄격 혼성화의 경우, 양성 신호는 적어도 2회의 백그라운드 또는 10회의 백그라운드 혼성화이다. 예시적인 고 엄격 또는 엄격한 혼성화 조건은 다음을 포함한다: 50％ 포름아미드, 5x SSC 및 1％ SDS, 42℃에서 인큐베이션됨, 또는 5x SSC 및 1％ SDS, 65℃에서 인큐베이션됨, 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1％ SDS 내 세척. PCR의 경우, 어닐링 온도는 프라이머 길이에 따라 약 32℃ 내지 약 48℃로 다양할 수 있지만, 저 엄격 증폭에 대해서는 약 36℃의 온도가 통상적이다. 고 엄격 어닐링 온도는 프라이머 길이 및 특이성에 따라 약 50℃ 내지 약 65℃의 범위일 수 있지만, 고 엄격 PCR 증폭에 대해서는 약 62℃의 온도가 통상적이다. 고 및 저 엄격 증폭 둘 모두에 대한 통상적인 주기 조건은 30-120초 동안 90℃ 내지 95℃의 변성 단계, 30-120초 지속되는 어닐링 단계, 및 1-2분 동안 약 72℃의 연장 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명은 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드의 변이체는 폴리뉴클레오티드의 천연 발생 대립유전자 변이체이거나 또는 폴리뉴클레오티드의 비-천연 발생 변이체일 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 개시된 폴리펩티드의 코딩 서열의 천연 발생 대립유전자 변이체인 코딩 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립유전자 변이체는 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 부가를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열의 또다른 형태이다.
본 발명은 또한, 성숙한 폴리펩티드에 대한 코딩 서열이 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 상기 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 기능하는 리더 서열과 동일한 리딩 프레임에서 융합될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 전구단백질이며, 리더 서열은 숙주 세포에 의해 절단되어 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질 및 추가 5' 아미노산 잔기인 전구단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질이 전구단백질이며, 이는 단백질의 불활성화 형태이다. 프로서열이 절단된 직후, 활성의 성숙한 단백질이 남는다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 성숙한 단백질, 또는 프로서열을 갖는 단백질, 또는 프로서열 및 프리서열 (리더 서열) 둘 다를 갖는 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열과 인-프레임 융합된 코딩 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에 마커와 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하는 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있다. 또는, 예를 들어, 마커 서열은 포유동물 숙주, 예를 들어 COS-7 세포가 사용된 경우에 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다. HA 태그는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다 (Wilson et al., 1984, Cell 37:767).
본 발명의 추가 실시양태는 서열 1, 3, 15, 17, 47, 48, 58, 59 또는 60과 적어도 90％ 동일한, 95％ 동일한, 및 몇몇 실시양태에서는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 90％ 동일한, 95％ 동일한, 및 몇몇 실시양태에서는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 서열 1, 3, 15, 17, 47, 48, 58, 59 또는 60의 폴리뉴클레오티드와 혼성화한다. 몇몇 실시양태에서, 적어도 90％ 동일한, 95％ 동일한, 및 몇몇 실시양태에서는 적어도 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 서열 58, 59 또는 60의 폴리뉴클레오티드와 혼성화한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화한다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 58, 59 또는 60의 폴리뉴클레오티드와 혼성화한다. 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95％ "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각각 100개의 뉴클레오티드 당 최대 5개의 점 돌연변이 포함할 수 있다는 점을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것이 의도된다. 다시 말하면, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95％ 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위해서는, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 5％ 이하가 결실되거나 또다른 뉴클레오티드와 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 내 총 뉴클레오티드의 최대 5％의 뉴클레오티드가 참조 서열로 삽입될 수 있다. 이러한 참조 서열의 돌연변이는 참조 뉴클레오티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치, 또는 이들 말단 위치 사이의 모든 곳 (참조 서열 또는 참조 서열 내 하나 이상의 연속 그룹의 뉴클레오티드 중에서 개별적으로 산재됨)에서 일어날 수 있다.
실질적인 문제로서, 임의의 특정 핵산 분자가 참조 서열과 어느 정도의 서열 동일성％를 갖는지 (예를 들어, 참조 서열과 약 80％ 이상, 약 90％ 이상, 약 95％ 이상 또는 약 97％ 이상의 서열 동일성을 갖는지, 또는 참조 서열과 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 동일한지) 여부는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대 베스트핏(Bestfit) 프로그램 (위스콘신 서열 분석 패키지, 유닉스(Unix)용 버젼 8, 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, 미국 53711 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 유니버시티 리서치 파크 소재))을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 베스트핏은 문헌 [Smith and Waterman, 1981, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489]의 국소 상동성 알고리즘을 이용하여 두 서열 간의 최고의 상동성 세그먼트를 찾는다. 특정 서열이 예를 들어 본 발명에 따른 참조 서열과 95％ 동일한지 여부를 결정하기 위해서 베스트핏 또는 임의의 다른 서열 정렬 프로그램을 사용하는 경우, 파라미터는 물론, 동일성 백분율이 참조 뉴클레오티드 서열의 전장에 걸쳐 계산되고 참조 서열 내 뉴클레오티드의 총 수의 5％ 이하의 상동성 차이가 허용되도록 설정된다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 변경을 함유할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 잠재적 치환, 부가 또는 결실을 생성하는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 활성을 변경하지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 동의성(degeneracy)으로 인한 잠재적 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로 생성되어, 예를 들어 인간 mRNA의 코돈을 이. 콜라이와 같은 박테리아 숙주에 의해 바람직한 코돈으로 변화시키는 것과 같이 특정 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화할 수 있다.
본 발명은 Notch 수용체를 표적화한 길항제 (예를 들어, 항체)를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 이들 제약 조성물은 종양 세포 성장을 억제하고, 인간 환자에서 암을 치료하는 데 사용되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 정제된 Notch-결합제 또는 길항제 (예를 들어, 항체)를 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 안정화제와 조합함으로써 저장 및 사용을 위한 제형을 멸균 동결건조된 산제, 수용액제 등으로 제조한다 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000]). 적합한 담체, 부형제 또는 안정화제는 다음을 포함한다: 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 염, 예컨대 나트륨 클로라이드; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 및 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 및 리신; 탄수화물, 예컨대 단당류, 이당류, 글루코스, 만노스 및 덱스트린; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 및 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체, 예컨대 Zn-단백질 착체; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 TWEEN 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG).
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료를 위해 임의의 수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는, 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌제, 스프레이, 액제 및 산제를 이용한 (예컨대, 질 및 직장 전달을 포함한 점막으로의) 국부 투여; 폐 투여 (예를 들어, 네뷸라이저에 의한 것을 포함한, 산제 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해서; 기관내, 비내, 상피 및 경피); 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내, 종양내, 또는 근육내 주사 또는 투입을 포함한 비경구 투여; 또는 두개내 (예를 들어, 경막내 또는 뇌실내) 투여일 수 있다.
치료 제형은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제형으로는 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 투여용 정제, 환제, 캡슐, 산제, 입제, 물 또는 비-수성 매질 내 액제 또는 현탁액제, 또는 좌제를 들 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주 활성 성분을 제약 담체와 혼합한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유한 고체 사전-제형화(preformulation) 조성물을 형성하는 통상적인 정제화 성분으로는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 기타 희석제 (예를 들어, 물)를 들 수 있다. 이어서, 상기 고체 사전-제형화 조성물을 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분화한다. 신규 조성물의 정제, 환제 등을 코팅하거나 다르게는 배합하여 지속 작용의 이점을 주는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 추가로, 상기 두 성분을, 붕해에 내성이 있어 내부 성분이 손상 없이 위를 통과하게 하거나, 또는 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층(enteric layer)에 의해 분리할 수 있다. 다양한 물질을 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용할 수 있고, 이러한 물질로는 다수의 중합체 산, 및 중합체 산과 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 들 수 있다.
제약 제형에는 리포솜과 복합체를 형성한 본 발명의 길항제 (예를 들어, 항체)가 포함된다 (문헌 [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; 및 미국 특허 제4,485,045 및 4,544,545호). 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 제 5,013,556호에 개시되어 있다. 몇몇 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 규정된 공극 크기의 필터를 통해 추출하여 목적하는 직경을 가진 리포솜을 생성한다.
길항제 (예를 들어, 항체)는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐은 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 문헌 [Remington's, The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., Mack Publishing (2000)]에 기재된 바와 같은 매크로에멀젼에서 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된다.
또한, 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예로는 항체를 함유한 고형 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 들 수 있고, 여기서 상기 매트릭스는 성형품의 형태 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐)이다. 지속-방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알코올), 폴리액티드 (미국 특허 제 3,773,919호), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(Lupron Depot) (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사용 미소구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 들 수 있다.
특정 실시양태에서, 제약 조성물은 Notch-결합제 또는 길항제, 및 제2 치료제 모두를 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 항암제 및/또는 항-혈관형성제이다.
본 발명은 본원에 기재된 Notch 수용체 길항제를 사용하여 Notch 수용체를 발현하는 종양형성 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 어느 한 항체 또는 폴리펩티드를 사용하여 Notch2 및/또는 Notch3 수용체를 발현하는 종양형성 세포의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Notch 수용체를 발현하는 종양형성 세포의 성장을 억제하는 방법은 상기 세포를 Notch 수용체에 대한 길항제와 시험관내에서 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, Notch 수용체를 발현하는 불멸화 세포주 또는 암 세포주를, Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하고 세포 성장을 억제하는 항체를 첨가한 배지에서 배양한다. 또는, 종양 세포 및/또는 종양 줄기 세포를 환자 샘플, 예를 들어 조직 생검, 흉수 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하고 세포 성장을 억제하는 항체를 첨가한 배지에서 배양한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch2 및/또는 Notch3 수용체의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체이다.
몇몇 실시양태에서, Notch 수용체를 발현하는 종양형성 세포의 성장 또는 증식을 억제하는 방법은 상기 세포를 Notch 수용체에 대한 길항제 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3의 길항제)와 생체내에서 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양형성 세포와 Notch 수용체를 접촉시키는 것은 동물 모델에서 착수된다. 예를 들어, Notch 수용체를 발현하는 이종이식편을 면역손상 마우스 (예를 들어, NOD/SCID 마우스)에서 성장시킨다. 상기 마우스에 Notch 수용체에 대한 길항제를 투여하여 종양 성장을 억제시킨다. 다르게는, Notch 수용체를 발현하는 암 줄기 세포를 환자 샘플, 예를 들어 조직 생검, 흉수 또는 혈액 샘플로부터 단리하여 면역손상 마우스에 주사한다. 이어서, 상기 마우스에 Notch 수용체에 대한 길항제를 투여하여 종양 성장을 억제시킨다. 몇몇 실시양태에서는, Notch 수용체의 길항제를 동물에게 종양형성 세포의 투입과 동시에 또는 투입 직후에 투여하여 종양 성장을 예방한다. 다른 실시양태에서는, 종양형성 세포가 특정 크기로 성장한 후에 Notch 수용체의 길항제를 치료제로서 투여한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch 수용체와 특이적으로 결합하는 Notch 수용체 단백질 융합체이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch 수용체의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 항체는 본원에 기재된 항체 또는 폴리펩티드 중 어느 하나이다.
특정 실시양태에서, 종양형성 세포를 Notch 수용체에 대한 길항제와 접촉시키는 것은 암으로 진단된 인간 환자에서 착수된다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch 수용체와 특이적으로 결합하는 항체이다. 다른 실시양태에서, 길항제는 Notch 수용체의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체이다. 예를 들어, 본 발명은 치료 유효량의 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch2와 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch3과 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 Notch2 및 Notch3과 결합하는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 앞서 언급된 측면 또는 실시양태, 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 측면 또는 실시양태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 항체 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 종양은 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 유전자 내 불활성화 결실 또는 돌연변이를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포와, 유효량의 Notch 길항제를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch 신호전달 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3)을 억제하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 생체내 또는 시험관내일 수 있다. 몇몇 실시양태에서, Notch 길항제는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 세포와, 앞서 언급된 측면 또는 실시양태 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 유효량의 임의의 항체 또는 폴리펩티드를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch2 신호전달을 억제하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, Notch 길항제는 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 세포와, 앞서 언급된 측면 또는 실시양태 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 측면 또는 실시양태의 유효량의 임의의 항체 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch3 신호전달을 억제하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 대상체에 유효량의 인간 Notch3 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 방법은 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절함으로써 맥관형성을 억제한다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 앞서 언급된 측면 또는 실시양태 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 측면 또는 실시양태에 기재된 항체 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 억제되는 혈관 발달은 비정상 혈관 발달이다. 특정 실시양태에서, 억제되는 혈관 발달은 종양에 존재한다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체에 VEGF 또는 VEGF 수용체의 길항제를 투여하는 것을 또한 포함한다.
추가로, 본 발명은 대상체에 유효량의 Notch 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 맥관형성 또는 혈관 발달을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 Notch3 길항제이다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 Notch2 길항제이다. 특정 실시양태에서, 길항제는 Notch2 및/또는 3의 길항제이다. 몇몇 실시양태에서, 길항제는 항-Notch2/3 항체이다. 몇몇 실시양태에서, 맥관형성을 억제하는 방법은 앞서 언급된 임의의 측면 또는 실시양태 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 실시양태 또는 측면의 항체 또는 폴리펩티드를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 맥관형성은 종양 맥관형성이다. 특정 실시양태에서, 혈관 발달은 종양 부위에 존재한다. 다른 특정 실시양태에서, 맥관형성은 종양 맥관형성이 아니다. 특정 실시양태에서, 맥관형성 또는 혈관 발달의 억제는, 적어도 일부 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능의 조절로 인한 것이다. 특정 실시양태에서, 방법은 대상체에 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF) 또는 VEGF 수용체의 길항제를 투여하는 것을 또한 포함한다.
종양 (예를 들어, 암 줄기 세포를 포함하는 종양)의 종양형성 가능성을 감소시키는 방법이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 치료적 유효량의 Notch 길항제를, 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 종양이 있는 대상체)에 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 Notch2를 결합시키는 항체이다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 Notch3을 결합시키는 항체이다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 Notch2 및 Notch3을 결합시키는 항체이다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 앞서 언급된 임의의 측면 또는 실시양태 및 또한 본원에 기재된 임의의 다른 실시양태 또는 측면의 항체 또는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도는 항체의 투여에 의해 감소된다. 몇몇 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 유방 종양, 췌장 종양 또는 흑색종이다.
또한, 본 발명의 작용제 및 길항제는 Notch 수용체에 대한 세포의 발현 및/또는 증가된 반응성을 특징으로 하는 다양한 상태를 치료하는데 사용될 수 있을 것이다. 본 발명은 증식성 질환, 예컨대 암, 맥관형성과 연관된 질환 (예를 들어, 맥관형성-의존적 질환), 및 Notch 신호전달을 상향조절 또는 하향조절하는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제로 치료하고자 하는 질환은 Notch-관련 질환이다. 특정 실시양태에서, 질환은 Notch 신호전달 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3 신호전달)의 상향조절 또는 하향조절을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 종양은 Notch2 및/또는 Notch3-의존적이다.
특히, Notch 수용체에 대한 길항제 (예를 들어, 항체)는 신장, 간, 방광, 유방, 위, 난소, 결장, 직장, 전립선, 폐, 외음부, 갑상선, 두경부, 뇌의 양성 및 악성 종양 (교모세포종, 성상세포종, 수모세포종 등), 혈액 및 림프의 양성 및 악성 종양 (백혈병 및 림프종)을 포함하나 이에 제한되지 않는 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 치료하기 위해 Notch-결합제 또는 길항제가 사용되는 증식성 장애는 결장직장암, 유방암, 췌장암 또는 흑색종이다. 특정 실시양태에서, 암은 암 줄기 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 치료되는 종양은 충실성 종양이다. 본 발명의 치료 조성물, 예를 들어 Notch를 결합시키는 항체를 사용하여 치료될 수 있는 충실성 종양의 예는, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 에윙(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 샘암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두상 암종, 유두상 샘암종, 낭샘암종, 수질성 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간종양, 간내 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스(Wilms) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종 및 망막모세포종과 같은 육종 및 암종을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 육종 및 상피 암, 예컨대 난소암 및 유방암에 적용 가능하다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 유방 종양, 췌장 종양 또는 흑색종이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 수모세포종이다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제로 치료하고자 하는 질환은 맥관형성과 연관된 질환이다. 특정 실시양태에서, 질환은 암이다. 다른 특정 실시양태에서, 질환은 암성 상태가 아니다. 예를 들어, 질환은 습성 황반 변성, 노년성 황반 변성, 당뇨 망막병증, 혈관종, 류마티스성 관절염, 건선, 신생혈관 녹내장, 다낭 난소 질환, 자궁내막증 및 염증성 창자 장애일 수 있다.
특정 실시양태에서, 종양은 Notch-결합제 또는 길항제가 표적으로 하는 Notch 수용체 또는 수용체들을 발현시킨다. 특정 실시양태에서, 종양은 Notch2 및/또는 Notch3을 발현시킨다. 특정 실시양태에서, 종양은 Notch2 및/또는 Notch3을 과다발현시킨다. 특정 실시양태에서, 종양은 투여된 항체가 특이적으로 결합시키는 하나 이상의 Notch 수용체에 의존적이다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, Notch2 (또는 Notch2 및 Notch3)을 특이적으로 결합시키는 항체는 Notch2-의존적 종양을 성장 억제하거나 달리 표적하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, Notch3 (또는 Notch2 및 Notch3)을 특이적으로 결합시키는 항체는 Notch3-의존적 종양을 성장 억제하거나 달리 표적하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 종양은 종양 저해자 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN)를 코딩하는 유전자에서의 불활성화 결실 또는 돌연변이에 대한 동형접합성 또는 이형접합성이다. 특정 실시양태에서, 결실 또는 돌연변이를 포함하는 종양은 유방 종양이다.
길항제는 적절한 제약 조성물로서 공지된 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다. 적합한 투여 방법은 볼루스로서 또는 일정 시간에 걸친 지속 주입에 의한 정맥내 투여, 및 근육내, 복강내, 정맥내, 종양내, 동맥내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 경막내, 경구, 국소 또는 흡입 경로를 포함한다.
특정 실시양태에서, Notch 길항제를 투여하는 것 이외에, 방법 또는 치료는 (Notch 길항제의 투여 전에, 그와 함께 및/또는 그 후에) 제2 치료제를 투여하는 것을 또한 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 항암제 및/또는 항맥관형성제이다. Notch 길항제 및 제2 치료제를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다.
Notch 길항제 (예를 들어, 항체) 및 제2 치료제의 조합을 임의의 순서로 또는 함께 투여할 수 있음은 명백할 것이다. 선택된 실시양태에서, Notch 길항제는 사전에 제2 항암제로 처리 받은 환자에게 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, Notch 길항제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제로의 처리 과정 (예를 들어, 화학요법)을 진행하면서 Notch 길항제를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 제2 치료제로의 처리 후 1년 내에 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 제2 치료제로의 임의의 처리 후 10, 8, 6, 4 또는 2개월 내에 투여될 것이다. 다른 특정 실시양태에서, Notch 길항제는 제2 치료제로의 임의의 처리 후 4, 3, 2 또는 1주 내에 투여될 것이다. 몇몇 실시양태에서, Notch 길항제는 제2 치료제로의 임의의 처리 후 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에 투여될 것이다. 또한, 두 작용제 또는 치료제가 대상체에 수 시간 또는 수 분 내에 (즉, 실질적으로 동시에) 투여될 수 있음은 명백할 것이다.
유용한 항암제 부류는, 예를 들어 항튜불린제, 아우리스타틴, DNA 부홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착체, 예컨대 시스플라틴, 단핵(백금), 이핵(백금) 및 삼핵 백금 착체 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴산염, 항대사물질, 화학요법 민감제, 듀오카르마이신, 에토포시드, 불소화 피리미딘, 이온담체, 헥시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 기능성 화합물, 퓨린 항대사물질, 퓨로마이신, 방사선 민감제, 스테로이드, 택산, 토포이소머라제 억제제 또는 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 항대사물질, 토포이소머라제 억제제 또는 맥관형성 억제제이다.
Notch 길항제와 조합으로 투여될 수 있는 항암제는 화학요법제를 포함한다. 이에 따라, 몇몇 실시양태에서, 치료는 본 발명의 길항제 및 화학요법제 또는 다수의 상이한 화학요법제들의 칵테일의 조합 투여를 포함한다. 길항제로의 치료는 화학요법제의 투여 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 일어날 수 있다. 본 발명에 의해 고려되는 화학요법제는 당업계에 공지되고 상업적으로 입수가능한 화학 물질 및 약물, 예컨대 독소루비신, 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노시드 (Ara-C), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 사이톡신, 탁솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜파란, 빈블라스틴 및 카르보플라틴을 포함한다. 조합 투여는 단일 제약 제형물로의 또는 별도의 제형물들을 사용하는 공투여, 또는 임의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성 작용제들이 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있는 시간 내인 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제를 위한 제제 및 투여 스케줄은 제조업자의 지시 또는 경험적으로 결정된 바에 따라 사용될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법을 위한 제제 및 투여 스케줄은 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, Md. (1992)]에 기재되어 있다.
또한, 본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (사이톡산); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 질소 머스터드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜파란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리키아마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트렉세이트; 데포프아민; 데모콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK.; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 (탁솔) 및 독세탁셀 (탁소테르, 론(Rhone) 제조); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플로오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 화학요법제는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케톡시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤)을 비롯한 항-에스트로겐; 및 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린을 비롯한 항-안드로겐; 및 임의의 상기의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCL, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCL, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCL, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 이리노테칸이다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 결장직장 종양이며, 제2 항암제는 토포이소머라제 억제제, 예컨대 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물질이다. 항대사물질은 정상적인 생화학 반응에 요구되는 대사물질과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물질은 젬시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 나트륨, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 사이토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 및 또한 임의의 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 젬시타빈이다. 특정 실시양태에서, 치료하고자 하는 종양은 췌장 종양이며, 제2 항암제는 항대사물질 (예를 들어, 젬시타빈)이다.
다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 길항제 및 방사선 요법의 조합 적용을 포함한다. 길항제로의 치료는 방사선 요법의 적용 전에, 그와 함께, 또는 그 후에 일어날 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대해 임의의 투여 스케줄이 사용될 수 있다.
다른 실시양태에서, 치료는 본 발명의 항체와, EGF 수용체 (EGFR) (예를 들어, 에르비툭스®), erbB2 수용체 (HER2) (예를 들어, 헤르셉틴®) 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) (예를 들어, 아바스틴®)에 결합하는 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 종양 연관 항원에 대한 다른 항체의 조합 투여를 포함할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 인간 DLL4 또는 Notch 수용체의 다른 리간드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 추가의 인간 Notch 수용체에 특이적으로 결합하는 항체를 포함한다. 예시적인 항-DLL4 항체는, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개공보 US 2008/0187532에 기재되어 있다. 추가의 항-DLL4 항체는, 예를 들어 각각 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개공보 WO 2008/091222 및 WO 2008/0793326, 및 미국 특허 출원 공개공보 US 2008/0014196, US 2008/0175847, US 2008/0181899 및 US 2008/0107648에 기재되어 있다. 예시적인 항-Notch 항체는, 예를 들어 그의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개공보 US 2008/0131434에 기재되어 있다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 Notch 신호전달의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 제2 항암제는 맥관형성 억제제인 항체 (예를 들어, 항-VEGF 항체)이다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 VEGF 수용체에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 아바스틴 (베바시주마브), 헤르셉틴 (트라스투주마브), 벡티빅스 (판니투무맙) 또는 에르비툭스 (세툭시마브)이다. 조합 투여는 단일 제약 제형물로의 또는 별도의 제형물들을 사용하는 공투여, 또는 임의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성 작용제들이 그들의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있는 시간 내인 연속 투여를 포함할 수 있다.
또한, 치료는 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, 림포킨, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)의 투여를 포함할 수 있거나, 암 세포의 외과적 제거 또는 치료의에 의해 필요한 것으로 여겨지는 임의의 다른 치료법이 동반될 수 있다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 길항제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 종류, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, 길항제가 치료를 위해 투여되는지 아니면 예방 목적을 위해 투여되는지, 이전 요법 및 환자의 임상 이력 등에 따라 좌우되지만, 이들 모두는 치료의의 판단에 따른다. 길항제는 한번에, 또는 수 일 내지 수 개월 동안 지속하는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유되거나 질환 상태의 축소(예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케줄은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있으며, 개별 길항제의 상대 역가에 따라 변화할 것이다. 투여의는 최적의 투여량, 투여 방법론 및 반복 속도를 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 kg당 0.01 μg 내지 100 mg이며, 매일, 매주, 매달 또는 매년 1회 이상 제공될 수 있다. 치료의는 체액 또는 체조직 내에서의 약물의 측정된 체류 시간 및 농도에 기초하여 투여를 위한 반복 속도를 추정할 수 있다.
특정 실시양태에서, Notch 길항제로의 치료가 고려중인 환자는 Notch 길항제로의 치료 전에 스크리닝된다. 특정 실시양태에서, 환자의 종양 또는 환자로부터 제거된 종양은 암 줄기 세포의 존재에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 종양은 길항제가 결합하는 하나 이상의 Notch 수용체 (예를 들어, Notch2 및/또는 Notch3)의 발현에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 종양은 종양 저해자 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN)의 유전자 코딩시의 불활성화 결실 또는 돌연변이의 존재에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서, 이렇게 시험되는 종양은 유방 종양이다.
예를 들어, 본 발명은 Notch2 및/또는 Notch3 길항제로 치료하기 위해, 종양이 있거나 종양이 제거된 대상체를 선별하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 (a) 종양이 PTEN 유전자에서 결실 또는 돌연변이를 포함하는지의 여부를 측정하고, (b) 종양이 결실 또는 돌연변이를 포함하는 경우, Notch3 길항제로 치료하기 위해 대상체를 선별하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 특정 실시양태에서, 결장 샘종 또는 폴립의 존재에 대해 스크리닝된 환자는 유전자 시험을 통해 대립유전자 손실 및 체세포 돌연변이에 대해 시험된다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 시험은 예를 들어 APC, Axin2 또는 베타-카테닌을 비롯한 Wnt 경로에서의 손실 또는 돌연변이에 대해 스크리닝한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 용기 내에 Notch 수용체에 대해 특이적인 항체 또는 항체들, 정제된 항체 또는 항체들을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는, 키트에 포함된 항체 또는 항체들과 특이적 면역반응성인 에피토프를 포함하는 실질적으로 단리된 Notch 수용체, Notch 수용체와 반응하지 않는 대조군 항체 및/또는 Notch 수용체에 대한 항체의 결합을 검출하기 위한 수단 (예를 들어, Notch 수용체에 대한 항체, 또는 Notch 수용체에 대한 항체를 인식하는 제2 항체와 접합된 형광 발색단, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광 화합물)을 더 포함한다. 다른 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 Notch 수용체의 mRNA 또는 cDNA의 검출에 대해 특이적인 시약 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 키트는, 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 분석 및 결과의 표시를 위한 임의의 분석용 소프트웨어를 비롯한, 검출 검정을 수행하기 위해 필수이고/이거나 충분한 성분을 함유한다.
컴파트먼트(compartment) 키트는 시약이 별도의 용기에 함유되어 있는 임의의 키트를 포함한다. 이러한 용기는 작은 유리 용기, 플라스틱 용기, 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립을 포함한다. 이러한 용기는 샘플 및 시약이 교차 오염되지 않고, 각각의 용기에 함유된 작용제 또는 용액이 하나의 컴파트먼트에서 또다른 컴파트먼트로 정량적인 방식으로 첨가될 수 있도록, 시약이 하나의 컴파트먼트에서 또다른 컴파트먼트로 효율적으로 전달되게 한다. 이러한 용기는, 시험 샘플이 허용할 수 있는 용기, 방법에 사용되는 항체 또는 프로브을 함유하는 용기, 세척 시약 (예컨대, 포스페이트 완충 염수, 트리스-완충제 등)을 함유하는 용기, 및 결합된 항체 또는 프로브를 검출하는데 사용되는 시약을 함유하는 용기를 포함할 것이다. 당업자는 개시되어 있는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 항체가 당업계에 잘 알려져 있는 설정된 키트 포맷들 중 하나 내에 용이하게 도입될 수 있음을 잘 알 것이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 Notch-결합제 또는 길항제, 및 제2 치료제를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, Notch-결합제 또는 길항제는 Notch2 및 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 항암제 및/또는 항맥관형성제이다.
한 측면에서, 본 발명은 i) 분자를 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 도메인과 함께 인큐베이션하고, ii) 분자가 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하고 있는지를 측정하고, iii) 분자가 종양 성장을 억제하는지를 측정하는 것을 포함하는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하고 종양 성장을 억제하는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자는, 작은 유기 분자, 폴리펩티드 및 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 스크리닝은 시험관내에서 수행된다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역을 발현하는 세포를 표지된 분자와 함께 인큐베이션하고, FACS 분석에 의해 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 대한 표지된 분자의 특이적 결합을 측정한다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역을 파지 디스플레이에 의해 발현시키고, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 확인한다. 인간 Notch 수용체의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 확인하는 다른 적합한 방법은, ELISA, 웨스턴 (또는 면역) 블로팅 및 효모 2 잡종법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이어서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 종양 세포 성장의 억제에 대해 시험된다. 시험은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 시험관내에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 몇몇 실시양태에서는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 배양물 중 종양 세포와 함께 인큐베이션하고, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자의 존재하의 종양 세포의 증식을 측정하고, 비-결합 대조군 분자와 인큐베이션한 종양 세포와 비교한다. 특정 실시양태에서, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자는 생체내에서 종양 성장을 억제하는 능력에 대해 시험된다. 특정 실시양태에서는, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자를 동물 이종이식 모델에 주사하고, 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 분자로 처리된 동물 내의 종양의 성장을 측정하고, 비-결합 대조군 분자로 처리된 동물과 비교한다.
[실시예]
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적인 목적을 위한 것이며 이를 알면 당업자에게 다양한 변형 또는 변화가 제기될 것이며 본원의 취지 및 범위 내에 포함하고자 하는 것으로 해석된다.
실시예 1
Notch2에 대한 인간 항체의 생성
Notch2 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 부분을 특이적으로 인식하는 인간 항체를, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 단리하였다. Notch2 수용체의 특이적이며 높은 친화도 인식을 위해, 인간 항체 가변 도메인을 함유하는 합성 항체 라이브러리를 스크리닝하였다.
간략하게는, 1 회차에 2x1013개의 Fab 디스플레이 파지 입자를, Notch2의 세포외 리간드 결합 부위 및 주변 EGF 반복부 (EGF1-12)를 포함하는 수동 고정화 재조합 Notch2 Fc 융합 단백질 (서열 21)과 함께 인큐베이션하였다. 비-특이적 파지는 세척 제거하고, 이어서 특이적 파지는 DTT로 용리시켰다. 용리된 방출물을 사용하여, TG1 F+ 박테리아를 감염시키고, 헬퍼 파지로 구제하고, 이어서 Fab 디스플레이를 IPTG (0.25 mM)로 유도하였다. 이러한 과정을 2번의 추가 회차 동안 반복하고, 이어서 3 회차는 수동 고정화 재조합 Notch2 (EGF1-12) Fc 융합 (5 μg/ml)에 대한 ELISA로 스크리닝하였다.
특정 Fab (59R1)가, 인간 Notch2 수용체를 결합시키고 인간 Notch2에 대한 Jagged1의 결합을 차단함을 확인하였다. 인간 Notch2 (hN2)를 과다발현하는 안정한 인간 세포주 HEK-293를 사용한 FACS 검정에 의해, 인간 Notch2에 대한 59R1 Fab의 결합을 증명하였다 (도 1a). Fab 결합은 피코에리트린 (PE) 접합된 염소 항-인간 Fab (잭슨 이뮤노케미컬스(Jackson Immunochemicals))에 의해 검출하였다. 59R1 Fab (도 1a에서 클론 1로서 언급됨)는 hN2에 대한 결합이 양호하였다. 또한, 동일한 안정한 세포주를 사용한 결합 검정에서, 59R1 Fab는 Notch 리간드 인간 Jagged1에 대해 양호한 차단 활성을 나타내었다 (도 1b). 리간드 결합 및 차단은, 인간 Fc 불변 영역에 융합된 hJagged1 세포외 도메인 (ECD)을 파지 라이브러리로부터 선별된 Fab 및 세포와 함께 인큐베이션하고, 검출을 위해 PE 접합된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체 (잭슨 이뮤노케미컬스)를 사용함으로써 측정하였다.
59R1 Fab의 VH 및 VL의 서열은 서열 11 및 서열 12 (분비시에 절단되는 N-말단 박테리아 신호 서열을 포함함)에 각각 제공하였다. 59R1 Fab의 CDR은 하기 표 2에 나타낸 바와 같았다.
[표 2]
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59R1 Fab의 것을 기재로 하는 가변 영역을, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 발현을 위해 인간 IgG2 중쇄 및 kappa 경쇄를 함유하는 Ig 발현 벡터 내로 이들 각각의 포유동물 신호 서열에 따라 클로닝하였다. 59R1 IgG 항체의 VH 및 VL을 각각 서열 13 및 서열 14로서 제공하였다. 59R1 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (신호 서열을 포함함)은 각각 서열 16 및 서열 18로서 제공하였다. 각각의 쇄의 아미노산 서열의 N-말단의 신호 서열은 분비시에 절단되었다. 59R1 IgG 항체의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열 코딩은 각각 서열 1 및 서열 3으로서 제공하였다. 단백질 A 정제를 사용하여, 항체를 정제하였다. 59R1 IgG2 항체 DNA의 중쇄 및 경쇄의 합성 DNA 삽입 코딩을 함유하는 박테리아 플라스미드 DNA는, 2008년 10월 15일자로 부다페스트 조약의 조건 하에 미국 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801 소재의 ATCC에 "59R1"로서 기탁되어, 지정 번호 PTA-9547이 부여되었다.
추가로, 59R1 IgG2 항체를, FACS 분석에 의해 인간 Notch2 수용체에 대한 DLL4의 결합을 차단하는 능력에 대해 검정하였다. 인간 Notch2를 안정하게 과다발현하는 HEK-293 세포를 항체와 다양한 농도로 인큐베이션하고, 이어서 PE 접합된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체에 의해 hNotch2 결합 (도 1c) 또는 리간드 차단 활성 (도 1d)에 대해 검출하였다. 리간드 차단은, 세포를 토끼 Fc 불변 영역으로 태그된 인간 DLL4 ECD 및 59R1 항체와 일정 범위의 농도로 인큐베이션하고, 이어서 PE 접합된 당나귀 항-토끼 항체에 의해 hDLL4를 검출함으로써 측정하였다. 이에 따라, 59R1 IgG2 항체에 대해 hNotch2의 결합 및 리간드 차단 활성을 확인하였다.
또한, 59R1의 배선 변이체 (본원에서 "59RGV"로서 언급됨)을 발현시키고, 정제하였다. 59RGV 항체의 VH 및 VL는 각각 서열 19 및 서열 20으로서 제공하였다. 59RGV 항체의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열 (신호 서열을 포함함)은 각각 서열 2 및 서열 4로서 제공하였다. 각각의 쇄의 아미노산 서열의 N-말단에서의 신호 서열은 분비시에 절단되었다. 59RGV 항체의 중쇄 및 경쇄의 핵산 서열 코딩은 각각 서열 15 및 서열 17로서 제공하였다.
고도로 소수성인 CDR는, 특정 예에서 항체에 의해 바람직하지 않은 비-특이적 결합을 허용할 가능성이 있다. 59R1의 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 통상적이지 않은 정도의 소수성을 갖기 때문에, 감소된 소수성을 갖는 중쇄 CDR3 서열이 함유된 59R1의 변이체가 생성되었다. 중쇄 CDR3 친화도 성숙은, 도 1e에 나타낸 바와 같이 모 서열 (GIFFAI; 서열 7)로부터의 제한된 변화를 허용함으로써 수행되었다. 각각의 위치에서 허용된 아미노산은 모 잔기로부터 도 1e에 나타낸 잔기로 변화되게 하였다. 개선된 변이체를, 도 1f에 나타낸 바와 같이 (화살표로 나타내었음) 개선된 JAG1 차단능에 대해 스크리닝함으로써 단리하였다. 간략하게는, Fab (1 및 10 μg/ml)를 hJAG1-rb Fc (사전군집된 5 μg/ml 내지 2 μl/ml PE 접합된 당나귀 항-토끼)와 혼합하고, 이어서 hNotch2 안정하게 형질감염된 293 세포에 첨가하였다. 이어서, 유세포분석을 사용하여, hJAG1 결합을 검정하였다. 6종의 개선된 변이체 (vs. 59R1 Fab)를 단리하였으며, 이의 HC CDR3 서열은 다음과 같았다: SIFYPT (서열 22), SSFFAS (서열 23), SSFYAS (서열 24), SSFFAT (서열 25), SIFYPS (서열 26) 및 SSFFAN (서열 27). 이들 변이체에 대한 중쇄 가변 영역의 서열은 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56 및 서열 57이다.
실시예 2
항-Notch2/3 59R1 항체의 교차반응성 및 결합 친화도
59R1 IgG2 항체의 다른 Notch 수용체와의 교차반응능은, 인간 Notch1, Notch2, Notch3 또는 Notch4 발현 플라스미드 및 형질감염 대조군으로서의 녹색 형광 단백질 (GFP)로 일과성으로 형질감염된 HEK-293 세포를 사용한 FACS 검정에 의해 측정하였다. GFP 양성 세포는 트랜스진의 발현을 나타내었다. 59R1 IgG2를 세포에 2 μg/ml으로 첨가하고, PE 접합된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체 (잭슨 이뮤노케미컬스)에 의해 검출하였다. 모든 Notch 구축물은 전장이었다. 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 59R1 IgG2 항체는 인간 Notch3 및 인간 Notch2 모두에 특이적으로 결합하지만, 전장 인간 Notch1 또는 인간 Notch4에는 유의하게 결합하지 않았다.
인간 및 마우스 Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4에 대한 친화도는, 비아코어(Biacore) 2000 기기를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 재조합 인간 및 마우스 Notch 단백질 (Notch1, 2 및 4에 대해서는 EGF10-15; Notch3에 대해서는 EGF9-14)을 표준 아민 기재 화학물질 (NHS/EDC)을 사용하여 CM5 칩 상에 고정화시켰다. 또한, hNotch2, EGF1-12를 결합에 대해 시험하였다. 상이한 항체 농도 (1 내지 100 nM)를 단백질 표면에 걸쳐 주사하고, 경시적으로 동적 데이터를 수집하였다. 데이터를 동시적 전반적 보정식을 사용하여 보정하여, 각각의 Notch에 대한 해리 상수 (KD, nM)를 수득하였다 (표 3).
[표 3]
Figure pct00003
실시예 3
항-Notch2/3 항체 59R1의 에피토프 맵핑
Notch 수용체 세포외 도메인의 특이적 비-리간드 결합 영역을 인식하는 항체를 확인하기 위해, 에피토프 맵핑을 수행하였다.
전장 인간 Notch2 단백질 또는 EGF 반복부의 다양한 결실을 함유하는 다양한 인간 Notch2 결실 구축물을 1 내지 12개 포함하는 서열 코딩 재조합 인간 Notch2 Fc 융합 단백질로 형질감염된 HEK 293 세포로부터의 상층액에 대한 항-Notch2/3 항체의 결합은, ELISA에 의해 시험하였다. 하기 표 4를 참조하기 바란다. HEK-293 세포를, 인간 IgG의 불변 영역 (hFc)에 융합된 나타낸 아미노산에 대한 hNotch2 cDNA의 코딩을 갖는 pcDNA 3.1 (인비트로겐(Invitrogen))로 일과성으로 형질감염시켰다. 상층액을 48시간 후에 수확하였다. hN2-hfc 단백질을 포착하기 위해, 먼저 96 웰 플레이트를 나트륨 비카르보네이트 완충제 중에서 웰당 100 ng의 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 IgG (잭슨 이뮤노케미컬스, #109-006-098)로 4°에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 5％ 소 혈청/PBS-트윈-20으로 세척 및 차단하였다. 상층액을 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하였다. 59R1 Fab를 5％ 혈청/PBS-T 중 10 μg/ml로 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS-T로 세척하였다. Fab 결합은, 실온에서 1 시간 동안 5％ 혈청/PBS-T 중 1:5000으로 희석된 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-인간 Fab 특이적 항체 (써모(Thermo), # 31414)에 의해 검출하였다. 플레이트를 세척하고, 1 스텝 울트라(Step Ultra) TMB (써모, # 34028)로 현상하였다. 플레이트를 퍼킨 엘머 빅터(Perkin Elmer Victor) 1420 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 항-Notch2/3 59R1 항체는, 인간 Notch2의 아미노산 375-417로 이루어진 EGF10를 포함하는 재조합 Notch2 단백질을 발현하는 세포로부터의 상층액에만 결합되었다 (도 3a).
[표 4]
Figure pct00004
또한, FACS 분석은 EGF11 또는 EGF12가 HEK 293 세포에 의해 발현되는 전장 Notch2 재조합 단백질로부터 결실되었을 때 59R1 Fab 항체 결합이 유지됨을 나타내었다 (도 3b). 점돌연변이를 Notch2 융합 단백질의 EGF10 내에서 만들고, 각각의 EGF10 돌연변이체에 대한 59R1의 결합을 FACS 분석에 의해 측정하였다. HEK-293 세포를 나타낸 Notch 발현 플라스미드 및 형질감염 대조군으로서의 GFP로 일과성으로 형질감염시켰다. GFP 양성 세포는 트랜스진의 발현을 나타내었다. 59R1 Fab 항체를 세포에 10 μg/ml로 첨가하고, PE 접합된 염소 항-인간 (잭슨 이뮤노케미컬스)에 의해 검출하였다.
EGF 반복부 10의 손실이 리간드 결합을 방해하지 않음을 증명하기 위해, 아미노산 375-412가 없는 돌연변이체 hNotch2를 생성하고, 59R1, EGF 1-4에 대해 유도된 hNotch2 모노클로날 59M70에 대한 결합 및 리간드 인간 DLL4에 대한 결합을 시험하였다 (도 3c). HEK-293 세포의 FACS 분석은 나타낸 Notch 발현 플라스미드 및 형질감염 대조군으로서의 GFP으로 일과성으로 형질감염시켰다. GFP 양성 세포는 트랜스진의 발현을 나타내었다. 항-Notch2 (59M70)을 20 μg/ml로 첨가하고, PE 접합된 염소 항-마우스 (칼태그(Caltag), #3004-4)에 의해 검출하였다. 59R1 (IgG2)를 세포에 2 μg/ml로 첨가하고, PE 접합된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체 (잭슨 이뮤노케미컬스)에 의해 검출하였다. 리간드 결합은 세포를 5 μg/ml의 토끼 IgG 불변 영역에 융합된 인간 DLL4 세포외 도메인 (ECD)과 함께 인큐베이션하여 측정하고, PE 접합된 당나귀 항-토끼에 의해 검출하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, 리간드 및 59M70은 둘 다 EGF 10의 부재하에 hNotch2에 결합하였으나, 59R1은 결합하지 않았다.
마찬가지로 59R1의 결합 부위를 측정하기 위해, 인간 Notch1, Notch2, 및 Notch4의 EGF 10 영역 및 인간 Notch3의 EGF 9 영역 (다른 Notch 수용체의 EGF 10의 등가물)의 비교 분석을 수행하였다 (도 14a). 분석 결과, 인간 Notch1에서 EGF10 내의 잔기를 상응하는 아미노산으로 변환하는 중증의 점돌연변이체가 전장 Notch2 내에 생성되었다. 또한, 역으로, hNotch1 EGF 10에서 잔기를 상응하는 hN2 잔기로 변환하는 점돌연변이를 만들었다. 전장 Notch 서열의 돌연변이체를 퀵체인지(QuikChange)® 돌연변이유발 (스트라타진(Stratagene))에 의해 생성하고, 서열분석에 의해 평가하였다. 돌연변이체에 대한 결합은 FACS 분석에 의해 측정하였다 (도 14b 및 14c). 59R1은 PE 접합된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체 (잭슨 이뮤노케미칼스, #109-116-170)에 의해 검출하였다. 이에 따라, hNotch2에 대한 59R1 결합에 필수인 아미노산은 히스티딘 385, 알라닌 388 및 류신 389인 것으로 측정되었다 (도 14a에 나타낸, 박스 표시된 hNotch2 서열 내의 잔기). hNotch3의 상응하는 잔기는 히스티딘 361, 알라닌 364 및 이소류신 365이었다.
실시예 4
항-Notch2/3 항체 59R1은 Notch2 신호전달을 억제함
hDLL4-, hJAG1- 및 hJAG2-유도된 Notch2 신호전달 차단능에 대해 59R1 항체를 검정하기 위해, 루시페라제 리포터 검정을 사용하였다.
인간 Notch2를 안정하게 과다발현하는 헬라(Hela) 세포에, 합성 8X CBS 프로모터, pSPORT6 MAML-1 (문헌 [Ong et al., 2006, J. of Biological Chemistry, 281:5106-5119]) 및 레닐라(Renilla) 루시페라제-CMV (형질감염 대조군)를 사용하여 개똥벌레 루시페라제를 일과성 형질감염시켰다. 세포를 나타낸 항체를 갖는 고정화된 hDLL4 (알앤디 시스템즈(R＆D systems)) 100 ng과 함께 16시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 제조업자의 지시에 따라 듀얼-글로(Dual-Glo) (프로메가(Promega))를 사용하여 검정하였다. 대조군 항체는 농도가 40 μg/ml였다. 59R1 IgG2 항체를 40 μg/ml에서 시작하여 적정하고, 이어서 1/4로 희석하였다. 대조군으로서, 감마 세크레타제 억제제 (GSI) 디벤자제핀 (DBZ)을 1 μM로 사용하였다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 59R1 항체는 hDLL4-유도된 Notch2 리포터 활성을 억제하는 것으로 발견되었다.
인간 Notch2를 안정하게 과다발현하는 헬라 세포를, 합성 8X CBS 프로모터, pSPORT6 MAML-1를 갖는 개똥벌레 루시페라제, 및 형질감염 대조군으로서의 레닐라 루시페라제-CMV로 일과성으로 형질감염시켰다. 세포를 고정화된 hJAG1 (알앤디 시스템즈) 또는 hJAG2 (알앤디 시스템즈) 200 ng과 함께 16 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 제조업자의 지시에 따라 듀얼-글로 (프로메가)를 사용하여 검정하였다. 59R1 IgG2 항체는 농도가 40 μg/ml였다. 대조군으로서, 감마 세크레타제 억제제 (GSI) 디벤자제핀 (DBZ)을 1 μM으로 사용하였다. 도 4b 및 4c에 나타낸 바와 같이, 59R1 항체는 각각 hJAG1 및 hJAG2-유도된 Notch2 리포터 활성을 둘 다 억제하는 것으로 발견되었다.
실시예 5
항-Notch2/3 항체 59R1은 생체내 종양 성장을 방지함
본 실시예는 이종이식 모델에서 종양 성장을 방지하기 위한, Notch 수용체의 비-리간드 결합 영역 (Notch2의 EGF10 및 Notch3의 EGF10)을 결합시키는 항-Notch2/3 수용체 항체 (59R1)의 사용을 기재한다.
특정 실시양태에서, 50,000 PE13 또는 T3 유방 종양 세포를 주사한 NOD/SCID 마우스를 세포 주사 2일 후에 항-Notch2/3 항체 59R1 또는 대조군 항체 1B7.11로 처리하였다. 항체를 주 2회 10 mg/kg로 투여하였다. 항-Notch2/3 항체 59R1은 대조군에 비해 PE13 (도 5a) 및 T3 (도 5b) 종양 성장을 둘 다 유의하게 감소시켰다.
실시예 6
항-Notch 2/3 항체 59R1을 사용한 생체내 종양 처치
본 실시예는 이종이식 모델에서 암을 치료하기 위한 항-Notch 2/3 항체의 사용을 기재한다.
한 실험에서, 1x107 개의 생존가능한 Colo-205 결장 종양 세포를 스위스 CD-1 백그라운드에서 6-8 주령 면역결핍 bg/nu XID 암컷 마우스에 주사하였다. 종양을 65 내지 200 mm3의 크기로 성장시키고, 그 후 마우스를 랜덤화하고 (실험군 당 n=10), 항체 투여를 시작하였다. 동물을 대조군 1B7.11 항체 또는 항-Notch2/3 59R1 항체 15 mg/kg로 주 1회 처리하였다. 종양 크기를 주 2회 측정하고, 종양 부피를 기재된 바와 같이 계산하였다 (문헌 [Michieli et al., 2004, Cancer Cell, 6:61-73] 참조). 항-Notch2/3 항체 59R1은 대조군에 비해 Colo-205 종양 성장을 유의하게 감소시켰다 (도 5c).
또다른 실험에서, 항-Notch2/3 항체를 췌장 종양 성장에 대한 효과에 대하여 시험하였다. NOD/SCID 마우스를 우측 옆구리의 피하에 30,000 PN4 췌장 종양 세포로 주사하고, 종양을 평균 부피가 100 mm3에 도달할 때까지 성장시켰다. 동물을 랜덤화하고, 항-Notch2/3 항체 59R1 또는 대조군 항체 1B711의 투여를 시작하였다. 항체를 주 1회 15 mg/kg로 투여하였다. 항-Notch2/3 항체 59R1은 대조군에 비해 PN4 종양 성장을 유의하게 감소시켰다 (도 5d).
추가의 실험에서, 항-Notch2/3 항체를 유방 종양 성장에 대한 효과에 대하여 시험하였다. NOD/SCID 마우스를 50,000 PE13 또는 T3 유방 종양 세포로 주사하고, 종양을 65 내지 200 mm3의 크기로 성장시키고, 그 후 마우스를 랜덤화하고 (실험군 당 n=10), 항체 투여를 시작하였다. 동물을 대조군 1B7.11 항체 또는 항-Notch2/3 59R1 항체 15 mg/kg으로 주 2회 처리하였다. 종양 크기를 주 2회 측정하고, 종양 부피를 기재된 바와 같이 계산하였다 (문헌 [Michieli et al., 2004] 참조). 항-Notch2/3 항체 59R1은 대조군에 비해 PE13 (도 5e) 및 TE (도 5f) 종양의 성장을 둘 다 유의하게 감소시켰다.
항체 처리의 마지막 시점에서, 추가의 분석을 위해 종양을 수거할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 종양의 일부를 면역형광법에 의해 분석하여 종양으로의 항체 침투 및 종양 반응을 평가하였다. 항-Notch2/3 항체 처리된 마우스 및 대조군 항체 처리된 마우스로부터 수거된 각 종양의 일부를 액체 질소 중에서 새롭게 동결시키고, O.C.T.에 침지시키고, 저온유지장치에서 10 μm 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 다르게는, 각 종양의 일부를 포르말린-고정시키고, 파라핀-침지시키고, 마이크로톰에서 10 μm 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 단편을 후-고정시키고, 주사된 항체를 특이적으로 인식하여 종양 생검에 존재하는 항-Notch2/3 항체 또는 대조군 항체를 검출하는 발색단 표지된 항체와 함께 인큐베이션하였다. 또한, 상이한 종양 및 종양 모집 세포 유형을 검출하는 항체, 예를 들어, 혈관 내피 세포를 검출하는 항-VE 카드헤린 (CD144) 또는 항-PECAM-1 (CD31) 항체, 혈관 평활근 세포를 검출하는 항-평활근 알파-액틴 항체, 증식 세포를 검출하는 항-Ki67 항체, 사멸한 세포를 검출하는 튜넬(TUNEL) 검정, 및 Notch 신호전달을 검출하는 항-세포내 도메인 (ICD) Notch 단편 항체를 사용하여 맥관형성, 종양 성장, 및 종양 형태에 대한 항체 처리의 효과를 평가할 수 있다.
종양 세포 유전자 발현에 대한 항-Notch2/3 항체 처리의 효과를 또한 평가할 수 있다. Notch2/3 항체 처리된 마우스 및 대조군 항체 처리된 마우스로부터의 수거된 각 종양의 일부로부터 총 RNA를 추출하고, 정량적 RT-PCR을 위하여 사용하였다. Notch2 및/또는 Notch3 신호전달 경로의 성분인 Notch2/3 뿐만 아니라 예컨대 CD44를 비롯한 암 줄기 세포 마커의 발현 수준을, 내부 대조군으로서 하우스-키핑 유전자 GAPDH에 대하여 분석하였다. 이로써 Notch2/3 항체 처리시 종양 세포 유전자 발현에서의 변화를 결정하였다.
또한, 종양에서의 암 줄기 세포의 존재에 대한 항-Notch2/3 항체 처리의 효과를 평가할 수 있다. Notch 2/3 항체 대 대조군 항체 처리된 마우스로부터의 종양 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 단일 세포 현탁액을 효소 소화 및 기계적 파괴로 수득하였다. 이어서, 분리된 종양 세포를 상기 상세히 기재한 바와 같이 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- 표면 세포 마커 발현을 바탕으로 하는 종양형성 암 줄기 세포의 존재에 대하여 FACS 분석으로 분석하였다.
이어서, 항-Notch2/3 항체 처리 후 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- 발현을 바탕으로 단리된 세포의 종양형성 가능성을 평가할 수 있다. 한 예에서, Notch 2/3 항체 처리된 마우스 대 대조군 항체 처리된 마우스로부터의 5,000, 1,000, 500, 및 100개 단리된 ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- 암 줄기 세포를 NOD/SCID 마우스의 유두 지방 패드로 피하 재주사하였다. 이로써 꾸준한 종양 형성에 요구되는 주사되는 세포의 수를 바탕으로 암 줄기 세포의 종양형성 가능성을 결정하였다.
실시예 7
항-Notch 2/3 항체 59R1은 파클리탁셀 처리 후 생체내 종양 재발을 지연시킴
B51 유방 종양 세포 (마우스 당 50,000개 세포)를 NOD-SCID 마우스의 유두 지방 패드로 피하 주사하였다. 종양을 평균 부피가 약 100 mm3에 도달할 때까지 50일 동안 성장시켰다. 동물을 랜덤화하고 (n = 10/군), 처리를 시작하였다. 한 군에는 대조군 항체 (1B711) 10 mg/kg을 주 2회, 파클리탁셀 (탁솔) 15 mg/kg을 주 2회 투여하고, 다른 군에는 59R1 10 mg/kg을 주 2회, 파클리탁셀 15 mg/kg을 주 2회 투여하였다. 종양 부피를 지정된 날짜에 측정하였다. 종양 부피가 약 50 mm3로 퇴보할 때까지 처리를 38일 동안 수행하고, 그 후 파클리탁셀 처리를 중지하고, 항체 처리를 실험 기간 동안 계속하였다.
결과를 도 6에 나타내었다. 종양은 59R1로 처리된 군에 비해 대조군에서 보다 빠르게 재발되는 것으로 관찰되었다.
실시예 8
항-Notch 2/3 항체 59R1은 생체내 종양에서 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴
제한 희석 검정법 (LDA)을 이용하여 충실성 종양 암 줄기 세포 및 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양형성 가능성에 대한 Notch-결합제의 효과를 평가할 수 있다. 상기 검정법을 사용하여 Notch-결합제 또는 다른 작용제로 처리된 동물로부터의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 결정하고, 이 빈도를 대조군 동물로부터의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도와 비교할 수 있다.
LDA를 사용하여 상기 실시예 7에서 기재한 바와 같이 대조군 항체 (1B711) 및 파클리탁셀 (탁솔)의 조합으로 처리하거나 59R1 및 파클리탁셀의 조합으로 처리한 B51 유방 종양의 종양형성 가능성에 대한 효과를 평가하였다. 또한, B51 유방 종양을 대조군 항체 단독 또는 59R1 단독으로 처리하는 것의 효과를 LDA로 결정하였다. 항체 및 파클리탁셀의 투여량 및 대조군 항체 군 및 59R1 군에 대한 투여 스케쥴은 다른 두 처리 군에 대해 상기 실시예 7에서 기재한 바와 동일하였다. 항체 및/또는 파클리탁셀의 3회 투여 후, 종양을 수거하고, 처리하고, 단일 세포로 분리하였다. 얼음상에서 30분 동안 바이오티닐화 마우스 항체 (α-마우스 CD45-바이오틴 1:200 희석 및 래트 α-마우스 H2Kd-바이오틴 1:100 희석, 바이오레전드(BioLegend), 미국 캘리포니아주 샌 디에고)와 함께 인큐베이션한 후, 스트렙타비딘-표지된 자기 비드를 첨가하고 자석의 도움으로 마우스 세포를 제거함으로써 인간 종양 세포를 이종이식 종양 세포로부터 단리하였다. 현탁액 중의 인간 세포를 수거하고 계수하였다.
4개의 처리 군 각각으로부터의 세포의 연속 적정물 (30, 90, 270, 및 810개 세포)을 FACS 완충액 및 마트리겔(Matrigel)의 1:1 (v/v) 혼합물 중에서 새로운 세트의 NOD-SCID 마우스 (n=10/군)에 주사하였다. 종양을 72일 동안 성장시켰다. 검출가능한 종양을 가진 마우스의 백분율을 모든 군에서 결정하였다. 이어서, 암 줄기 세포 빈도를 L-CalcTM 소프트웨어 (스템셀 테크놀로지스 인크.(StemCell Technologies Inc.); www.stemcell.com/search/default.asp에서 다운로드 가능)를 사용하여 계산하였다.
결과를 도 7에 나타내었다. 대조군-처리된 마우스 ("대조군")에서의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도는 1:66인 것으로 결정되었다. 파클리탁셀-처리된 마우스 ("탁솔")에서의 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도는 1:25인 것으로 나타났고, 이는 파클리탁셀로의 처리가 대조군에 비해 2배 초과로 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 사실상 증가시켰음을 나타낸다. 반면, 59R1 항체로의 처리는, 단독으로든 ("59R1") 또는 파클리탁셀과 조합으로든 ("탁솔+59R1"), 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켰다. 59R1 항체 단독은 대조군에 비해 2배 초과로 유방 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켰다. 59R1 항체 및 파클리탁셀의 조합으로의 처리는 59R1 단독으로의 처리에 비해 약 2배 (p<0.0001), 대조군 항체로의 처리에 비해 약 4.5배, 및 파클리탁셀 단독으로의 처리에 비해 약 12배 초과로 종양에서의 암 줄기 세포의 빈도를 감소시켰다. 상기 결과는 59R1 항체로의 처리가, 파클리탁셀 단독으로의 처리가 반대 효과를 가짐에도 불구하고, 단독으로든 파클리탁셀과의 조합으로든 유방 종양의 종양형성 가능성을 감소시키는 데에 효과적임을 나타낸다.
실시예 9
항-Notch 2/3 항체 59R1을 사용한 추가의 생체내 종양 처치
PN4 췌장 종양 세포 (마우스 당 50,000개 세포)를 Nod-Scid 마우스의 옆구리 영역에 피하 주사하였다. 종양을 평균 부피가 약 120 mm3에 도달할 때까지 27일 동안 성장시켰다. 동물을 4개의 처리 군 (n = 10/군)으로 랜덤화하고, 처리를 시작하였다. 한 군에는 대조군 항체 (1B711) 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 한 군에는 젬시타빈 40 mg/kg을 주 1회 그리고 대조군 항체 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 한 군에는 59R1 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 제4 군에는 59R1 10 mg/kg 주 2회 및 젬시타빈 40 mg/kg 주 1회의 조합을 투여하였다. 종양 부피를 지정된 날짜에 측정하였다. 결과를 도 8에 나타내었다. 종양 성장은 59R1 및 젬시타빈의 조합에 의해 억제된 것으로 밝혀졌다 (p < 0.001).
M4 흑색종 종양 세포 (마우스 당 10,000개 세포)를 NOD-SCID 마우스의 옆구리 영역에 피하 주사하였다. 종양을 평균 부피가 약 80 mm3에 도달할 때까지 25일 동안 성장시켰다. 동물을 처리 군 (n = 10/군)으로 랜덤화하고, 처리를 시작하였다. 한 군에는 대조군 항체 (1B711) 10 mg/kg을 주 2회 투여하고, 한 군에는 59R1 10 mg/kg을 주 2회 투여하였다. 종양 부피를 지정된 날짜에 측정하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 종양 성장은 59R1에 의해 억제된 것으로 밝혀졌다.
C28 결장 종양 세포 (마우스 당 10,000개 세포)를 NOD-SCID 마우스의 옆구리 영역에 피하 주사하였다. 종양을 평균 부피가 약 130 mm3에 도달할 때까지 24일 동안 성장시켰다. 동물을 4개의 처리 군 (n = 10/군)으로 랜덤화하고, 처리를 시작하였다. 한 군에는 대조군 항체 (1B711) 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 한 군에는 이리노테칸 7.5 mg/kg을 주 1회 그리고 대조군 항체 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 한 군에는 59R1 10 mg/kg을 주 2회 투여하고; 제4 군에는 59R1 10 mg/kg 주 2회 및 이리노테칸 7.5 mg/kg 주 1회의 조합을 투여하였다. 종양 부피를 지정된 날짜에 측정하였다. 결과를 도 10에 나타내었다. 종양 성장은 대조군 항체 군에 비해서는 59R1 단독에 의해 억제되고, 이리노테칸 군에 비해서는 59R1 및 이리노테칸의 조합에 의해 억제된 것으로 밝혀졌다.
59R1 IgG2 항체를 또한 유방 종양 이종이식 라인 OMP-B34, OMP-B39, OMP-B44, PE13, 및 UM-T1, 췌장 종양 이종이식 라인 OMP-PN8, 및 결장 종양 이종이식 라인 OMP-C8에서 생체내 시험하였다. 상기 종양 이종이식 라인은 문헌 [Al-Hajj et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:3983-3988]에 기재된 절차에 따라 확립하였다. 암컷 NOD/SCID 면역손상 마우스 (7-10 주령)를 유방 종양 이종이식편의 확립을 위하여 사용하고, 수컷 NOD/SCID 마우스를 OMP-Pn8 및 OMP-C8 종양-모델 (할란(Harlan), 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 위하여 사용하였다. 59R1 IgG2 항체를 또한 생체내 Colo-205 결장 종양 이종이식 모델에서 시험하였다. 스위스 CD-1 백그라운드에서 암컷 면역결핍 bg/nu XID 마우스를 Colo-205 이종이식 종양 모델을 위하여 사용하였다. 유방암 모델의 경우, 서방성 에스트로겐 펠렛 (0.36 mg)을 이식해야 한다. 마우스를 PBS (마그네슘 또는 칼슘 비함유) 및 마트리겔의 1:1 비율 혼합물 중의 50,000개 (OMP-B34, OMP-B39, OMP-B44, PE13, 및 UM-T1) 또는 1x107개 (Colo-205) 생존가능한 세포로 각각 우측 옆구리상에 피하 주사하였다. 마우스 당 주사된 총 부피는 200 ㎕이었다 (50％는 마트리겔임). 종양이 일단 65 내지 200 mm3의 크기에 도달하면, 마우스를 랜덤화하였다. 항체를 매주 투여하고, 종양을 주 2회 측정하였다. LZ1 (리소자임을 인식하는 인간 항체) 또는 1B711 (합텐 트리니트로페놀을 인식하는 뮤린 IgG1 항체)을 각 종양 유형의 처리를 위한 대조군 항체로서 사용하였다. 종양 부피를 문헌 [Al-Hajj et al. (2003)]에 기재된 바와 같이 계산하였다. 데이터를 평균 및 평균±S.E.M.으로 표현하였다. 군 평균을 스튜던트 양측검정 독립표본 t-시험(Student's two-tailed, unpaired t-test)을 사용하여 비교하였다. 0.05 미만의 확률 (P) 값이 유의하게 상이한 것이라고 해석되었다. 마이크로소프트 엑셀 및 그래프 패드 프리즘(PRISM)을 사용하여 모든 통계학적 분석을 수행하였다.
Colo205, C8, PNA, B34, B39, B44, PE13, 및 T1 이종이식 모델에서의 추가의 생체내 실험의 결과를 각각 도 11a-11h에 나타내었다. 도 11a에 나타낸 바와 같이, 59R1 항체로의 단일요법은 대조군 항체 (LZ1)에 비해 Colo205 종양의 성장을 유의하게 억제하였다 (p<0.01). 59R1과 항-VEGF 항체 베바시주마브 (아바스틴)의 조합 요법은 59R1 또는 베바시주마브 단독보다 훨씬 큰 종양 성장 억제 (p<0.001)를 제공하였다. 또다른 결장직장 이종이식 모델인 C8에서, 59R1은 마찬가지로 LZ1 대조군 항체에 비해 종양 성장을 억제한다고 나타났다 (도 11b). 유사하게, 59R1은 PN8 이종이식 모델에서 (대조군 항체에 비해) 췌장 종양 성장을 억제한다고 나타났다 (도 11c). 59R1은 또한 5개의 유방암 이종이식 모델 B34 (도 11d), B39 (도 11e), B44 (도 11f), 및 PE13 (도 11g) 각각에서 대조군 항체에 비해 유방암 성장을 억제한다고 나타났다. 마찬가지로, 59R1 항체가 에스트로겐의 존재하에만 효과적이지만, T1이 에스트로겐 수용체 음성 종양임에도 불구하고, 59R1 항체는 T1 유방암 모델에서 종양 성장을 억제하는 데에 효과적이라고 밝혀졌다 (도 11h).
실시예 10
이종이식 종양 모델에서 유전자 조절에 대한 항-Notch2/3 항체 59R1 처리의 효과
59R1 IgG2 항체로 처리된 다양한 이종이식 종양 모델에서의 유전자 발현 수준을 마이크로어레이 분석으로 분석하였다. 아피메트릭스(Affymetrix) HG-U133 플러스 2.0 마이크로어레이 (아피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라) 상에서 세계적인 유전자 발현 프로파일링 분석을 수행하였다. 대조군 및 처리 군으로부터의 이종이식 전체 종양의 3개의 독립적 RNA 샘플을 단리하고, 제조업자의 지시에 따라 마이크로어레이로 혼성화하였다. 스캔된 어레이 백그라운드 조정 및 신호 세기 정규화를 오픈-소스 바이오컨덕터 소프트웨어 (www.bioconductor.org)에서의 GCRMA 알고리즘으로 수행하였다. 각 유전자의 발현 수준을 대조군 (CTRL) 및 처리 (59R1) 군에서의 샘플을 가로지르는 z-점수 변환에 의해 정규화하였다. 두 군 사이에 차등 발현된 (p < 0.05 및 배수 변화 > 2.0) 유전자를 베이지안(Bayesian) t-시험으로 확인하였다 (Baldi et al., 2001, Bioinformatics, 17:509-519). 선택된 종양 이종이식 모델 (Colo205, B44, PE13, 및 T1)에서의 선택된 연관된 차등 조절된 유전자의 발현 패턴을 하기 표 5에 나타내었다. 각 유전자의 P-값 (PVal)은 베이지안 t-시험을 이용한, 우연히 59R1에 의하여 유전자가 유의하게 조절될 확률이다. G-단백질 신호전달 5의 조절자 (RGS5), Notch3, 및 YRPW 모티프-유사물과 관련된 모발/인핸서-오브-스플릿 (HEYL) 단백질을 코딩하는 유전자를 비롯한 다수의 유전자가 대조군 마우스에 비해 59R1-처리된 마우스의 기질에서 유의하게 하향-조절된 것으로 나타났다 (반대로, RGS5, Notch3, 및 HEYL을 코딩하는 상기 특정 유전자는 종양의 인간 세포에서 유의하게 하향-조절된 것으로 나타나지 않았음).
[표 5]
Figure pct00005
마이크로어레이 분석에서 59R1로의 처리에 의해 조절된다고 확인된 선택된 유전자 (heyl, notch3, rgs5, angpt1, 및 angpt2)의 이종이식 모델 Colo205, B29, B34, B44, PE13, T1 (에스트로겐 처리 없음), T1 (에스트로겐 처리 있음), C8, 및 PN8로부터의 기질에서의 발현 수준을 타크만(TaqMan)® 분석에 의해 추가로 분석하였다. 결과를 도 12a (heyl), 12b (notch3), 12c (rgs5), 12d (angpt1) 및 12e (angpt2)에 나타내었다.
타크만® 분석의 결과로부터, notch3 및 rgs5는 (대조군에 비해) 59R1로의 처리에 반응하는 다양한 종양 유형 각각의 기질에서 하향-조절됨을 확인하였다 (도 12b 및 c). RGS5는 혈관주위세포 및 혈관 평활근 세포의 공지된 마커이다 (문헌 [Berger et al., 2005, Blood, 105:1094-1101]; [Lovschall et al., 2007, Int. J. Dev. Biol., 51: 715-721]; [Cho et al., 2003, FASEB J., 17:440-2]). Notch3은 맥관형성 동안 혈관주위세포에서 RGS5와 공동발현되고 혈관주위세포 및 혈관 평활근 세포의 운명의 조절에 중요한 역할을 한다고 확인되었다 (문헌 [Lovschall et al., 2007, Int. J. Dev. Biol., 51: 715-721]; [Domenga et al., 2004, Genes ＆ Dev., 18:2730-2735]; [Sweeney et al., 2004, FASEB J., 18:1421-3]; [Morrow et al., 2005, Am. J. Physiol. Cell Physiol., 289:C1188-C1196]).
또한, heyl은 B34를 제외한 이종이식 모델 각각의 기질에서 하향조절된다고도 확인되었다 (도 12a). HeyL은 Notch 신호전달의 하류 전사 인자의 Hey 족 (Hey1, Hey2, 및 HeyL)에 속한다. 59R1에 의한 heyl의 하향조절은 59R1 항체가 heyl을 하향조절함으로써 Notch 신호전달에 직접 영향을 준다는 것을 시사한다.
안지오포이에틴-1 (angpt1) 및 안지오포이에틴-2 (angpt2)는 또한 다수의 유방암 모델의 기질에서 하향-조절된다고 결정되었다 (도 12d 및 e). ANGPT1 및 2 (안지오포이에틴-1 및 -2)는 TIE 1 및 2 수용체에 대한 리간드이다. VEGF와 같은 TIE 수용체는 신혈관형성 과정에서 중요한 신호전달 분자이다 (문헌 [Jones et al., 2001, Nature Reviews, 2:257-267]).
그러나, 특히, angpt1 및 angpt2는, 59R1로의 처리가 종양 성장에 효과적인 조건하에서 에스트로겐 처리를 사용하였을 때 T1 모델의 기질에서 하향-조절되지만 ("T1 e"), 59R1로의 처리가 종양 성장에 효과적이지 않은 조건하에서 (상기 실시예 9 참조) 에스트로겐 처리의 부재하에 동일한 모델의 기질에서는 하향조절되지 않았다 ("T1 ne"). 따라서, T1 종양의 기질에서 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2의 하향-조절에 대한 59R1의 효과는 에스트로겐 처리의 부재하에서 상실된다. 상기 효과의 한가지 가능한 설명은 에스트로겐 처리의 부재하에서, T1 기질에서의 성장 인자 안지오포이에틴-1 및 안지오포이에틴-2의 수준은 59R1 항체로의 처리시 발현 수준에서 측정가능한 감소를 제공하도록 충분히 상승되지 않는다는 것이다. 에스트로겐은 종양 미세환경에 상당한 영향을 준다고 나타났다 (문헌 [Banka et al., 2006, Cancer Res. 66:3667-3672]). 상기 데이터에 대한 한가지 가능한 설명은 에스트로겐이 ANGPT2 신호전달에 대한 종양의 의존성을 야기하고, 그 다음 이것이 59R1 처리에 대한 민감성을 야기한다는 것이다.
실시예 11
항-Notch2/3 항체 59R1은 결장 및 유방 종양에서 저산소증을 유의하게 유도함
59R1 IgG2 항체 또는 1B711 대조군 항체 중 하나로 처리된 Colo-205 결장 종양 및 PE-13 유방 종양에서 저산소 영역에 대한 염색을 수행하였다. 상기 염색은 문헌 [Ridgway et al., 2006, Nature 444:1083-1087]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히는, 저산소증을 측정하기 위하여, 대략 10 mm Hg 미만의 산소 분압에서 장기-생존 단백질 부가물을 형성하는 피모니다졸-히드로클로라이드 (하이폭시프로브(HypoxyProbe), NPI, 미국 매사추세츠주 벌링톤)를 희생 1시간 전에 60 mg/kg로 복강내 주사하였다. 이어서, 종양을 조직학적 분석을 위해 처리하고, 종양 단편을 제조사 프로토콜 (NPI)에 따라 항-피모니다졸 항체를 이용하여 염색하였다. BX51 현미경 (올림푸스(Olympus), 미국 팬실배니아주 센터 밸리)을 이용하여 사진을 찍었다.
생존가능한 종양 세포는 상대적으로 균일하고 치밀한 DAPI 염색으로 표시되는 바와 같이, 1B711 및 59R1-처리된 종양에 동일하게 존재하는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 나타내지 않음). CD31-양성 세포의 수는 또한 변함없이 유지되었으며, 이는 내피 세포 수가 59R1 처리에 의해 영향받지 않음을 시사한다. 그러나, 59R1-처리된 Colo-205 및 PE13 종양에서는, 저산소 영역 (항-피모니다졸 항체에 의해 검출되는 바와 같음)이 1B711 처리된 종양에서보다 유의하게 더욱 두드러졌다 (데이터는 나타내지 않음). AF594-컨쥬게이션된 염소 항-래트 F(ab')2를 사용하여 항-CD31 항체를 검출하고, FITC-컨쥬게이션된 염소 항-토끼 항체를 사용하여 항-피모니다졸 항체를 검출하였다.
실시예 12
PTEN 종양 저해자 유전자에서의 결실을 포함하는 유방 종양은 59R1 처리에 반응함
DNA 샘플을 이종이식 유방암의 종양 세포로부터 제조하였다. DNA 단리 전, 이종이식 종양에서의 마우스 기질 세포를 마우스 세포 특이적 항체와 컨쥬게이션된 자기 비드를 사용하여 격감시켰다. 정제된 DNA 샘플을 제조업자의 지시에 따라, 복제 수 변이 (CNV)의 검출을 위한 946,000개가 넘는 프로브를 보유한 아피메트릭스 게놈-와이드 인간 SNP 어레이 6.0 유전자칩 (아피메트릭스, 미국 캘리포니아주 산타 클라라)과 혼성화하였다. 복제 수 상태 변화를 히든 마르코브 모델(Hidden Markov Model) (HMM)에 의해 추정하고, 각 샘플의 복제 수 변이 (CNV)를 기저선으로서 해프맵(Hapmap)270을 사용하여 서열 분할 분석에 의해 수득하였다. 상기 어레이에 내재하는 소음 때문에, 1.0×10-6 미만의 유의성 역치 및 세그먼트 당 프로브의 최소수 = 5 하에서 -0.5 및 -1.0 log2 비율을 이형접합 결실 및 동형접합 결실에 대한 컷오프로서 사용하였다.
도 13은 엑손, 아피메트릭스 프로브 분포, 및 염색체 10에서 종양 저해자 포스파타제 텐신 동족체 (PTEN)의 유전자에서의 결실을 나타낸다. B29, B34, B37, B40, B51, T2, T3, 및 T6 유방 종양은 그들의 게놈에 무손상 PTEN 유전자를 갖는다고 밝혀졌다. PTEN 유전자는 B39 종양에 동형접합 결실을 보유한다고 결정된 반면, B44, PE13, 및 T1 종양은 상기 유전자의 이형접합 결실을 갖는다고 결정되었다. 상기 논의한 바와 같이, 59R1은 PTEN의 동형접합 또는 이형접합 결실을 포함하는 상기 4개의 유방 종양 각각에서 항-종양 효능을 갖는다고 결정되었다. 상기 결과는 동형접합 또는 이형접합 PTEN 결실을 갖는 종양, 특히 유방 종양이 항-Notch2/3 항체, 예컨대 59R1로의 처리에 특히 적합할 수 있음을 시사한다.
실시예 13
59R5 항체의 특성규명
인간 Notch 2 및 인간 Notch 3에 특이적으로 결합하는 추가의 인간 항체 59R5를 확인하였다. 중쇄 및 경쇄의 서열을 각각 서열 49 및 서열 18에 제시하였다. 중쇄 가변 영역을 서열 50에 제시하고, 경쇄 가변 영역을 서열 13에 제시하였다. 59R5의 중쇄 CDR3 서열은 SIFYTT (서열 51)을 포함한다. 59R5의 다른 CDR 서열은 59R1과 동일하다. 59R1 및 59R5 결합 친화도의 비아코어(Biacore) 분석은 59R5가 Notch2 및 Notch3 모두에 대해 59R1과 유사한 결합 특성을 가짐을 나타내었다. 두 항체 모두 인간 및 뮤린 Notch2 및 Notch3 수용체와 나노몰 이하의 친화도로 결합하였다 (표 6 참조).
[표 6]
Figure pct00006
59R5는 Notch2 및 Notch3 신호전달을 차단함에 있어 59R1과 유사한 활성을 갖는다고 결정되었다. 수용체 활성화를 루시페라제-기반의 검정으로 결정하였다. PC3 종양 세포를 인간 또는 마우스 Notch 수용체 (인간 Notch2, 뮤린 Notch2, 인간 Notch3, 또는 뮤린 Notch3) 및 GFP 유도성 리포터 구조체로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 수동적으로 부동화된 DLL4-Fc 단백질의 존재하에 상이한 농도의 59R1 또는 59R5 항체와 인큐베이션하였다. Notch 수용체 활성화를 루시페라제 활성을 측정함으로써 결정하였다. 도 15a에 나타낸 바와 같이, 59R5는 59R1과 유사한 수준으로 인간 Notch2, 뮤린 Notch2, 인간 Notch3 및 뮤린 Notch3 수용체 신호전달의 리간드-유도된 활성화를 차단시켰다.
59R5의 결합 에피토프를 결정하였다. 항체 59R1의 분석에 대해 실시예 3에 기재한 바와 같이, 몇몇 점 돌연변이체를 전장 Notch1 내에 생성하여, EGF10 내의 잔기를 인간 Notch 2에서의 상응하는 아미노산으로 전환시켰다. 전장 Notch 서열에서의 돌연변이체를 퀵체인지(QuikChange)® 돌연변이유발 (스트라타진(Stratagene))로 발생시키고, 서열분석으로 입증하였다. HEK 293 세포를 인간 Notch2, 인간 Notch1, 또는 잔기 382-386이 상응하는 인간 Notch2 잔기로 돌연변이되어 있는 인간 Notch1을 코딩하는 발형 벡터로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 또한 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 플라스미드로 공동-형질감염시켜 형질감염된 플라스미드를 받은 이들 세포를 표지하였다. 세포를 59R1 또는 59R5 및 형광 2차 항체와 인큐베이션한 후, FACS로 검사하였다. 59R1 및 59R5를 PE-컨쥬게이션된 염소 항-인간 Fc 감마 특이적 항체로 검출하였다 (Jackson Immunochemicals, #109-116-170). 도 15b에 나타낸 바와 같이, 59R5는 Notch2에 결합하고, Notch1에 결합하지 않았다. 그러나, Notch2 아미노산 385-389에 상응하는 아미노산이 Notch1로 치환되었을 때, 59R5는 돌연변이된 Notch1에 결합할 수 있었다. 이는 59R5가 인간 Notch 2에 결합하기 위해 필수적인 하나 이상의 아미노산이 아미노산 385-389 (도 14a에 나타낸 네모친 hNotch2 서열 내의 잔기) 내에 위치함을 시사하며, 59R5가 59R1과 동일한 에피토프, 또는 59R1의 에피토프와 유사하거나 59R1의 에피토프와 오버랩되는 에피토프와 결합함을 시사한다.
실시예 14
Notch2/3 항체 59R5를 사용한 생체내 종양 처치
한 실시양태에서, NOD/SCID 마우스를 PE13 유방 종양 세포로 주사하였다. 마우스를 항-Notch2/3 항체 59R1, 항-Notch2/3 항체 59R5, 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체를 "예방적" 모드로 15 mg/kg 주 1회 투여하였고, 여기서 투여는 세포 주사 2일 후에 시작하였다. 도 16a는 59R5 처리가 59R1에서 나타난 효과와 유사하게, 80％ 초과로 종양 성장을 억제하였음을 나타낸다.
또다른 실시양태에서, NOD/SCID 마우스를 C28 결장 종양 세포로 주사하였다. 마우스를 항-Notch2/3 항체 59R1, 항-Notch2/3 항체 59R5 또는 대조군 항체로 처리하였다. 항체를 "예방적" 모드로 15 mg/kg 주 1회 투여하였고, 여기서 투여는 세포 주사 2일 후에 시작하였다. 도 16b는 59R1 및 59R5 모두가 C28 결장 종양의 성장을 억제하였음을 나타낸다.
또다른 실시양태에서, NOD/SCID 마우스를 Colo205 결장 종양 세포로 주사하였다. 마우스를 항-Notch2/3 항체 59R1, 항-Notch2/3 항체 59R5 또는 대조군 항체로 처리하였다. 종양을 확립한 후, 항체를 15 mg/kg로 주 1회 투여하였다. 도 16c는 59R1 및 59R5 모두가 Colo208 결장 종양의 성장을 유사한 수준으로 억제하였음을 나타낸다.
실시예 15
조합 처리에 Notch2/3 항체 59R5를 사용한 생체내 종양 처치 (조합 처치)
한 실시양태에서, NOD/SCID 마우스를 PN8 췌장 종양 세포로 주사하였다. 종양을 평균 종양 부피가 150mm3에 도달할 때까지 대략 33일 동안 성장시켰다. 마우스를 대조군 항체, 항-Notch2/3 항체 59R1, 또는 항-Notch2/3 항체 59R5와의 조합으로 4주 동안 주 1회 젬시타빈 20 mg/kg로 처리하였다. 도 17a에 나타낸 바와 같이, 항체 59R5는 항체 59R1과 유사한 수준으로 종양 성장을 억제하였고, 상기 조합 처리는 젬시타빈 단독보다 더 오래 종양 재발을 연장시켰다.
한 실시양태에서, 암 줄기 세포에 대한 59R5의 효과를 평가하기 위하여, PE13 유방 종양 모델에서 종양 재발 연구를 수행하였다. NOD/SCID 마우스를 PE13 유방 종양 세포로 주사하였다. 처리를 시작하기 전 40일 동안 종양을 성장시켰다. 마우스를 대조군 항체 또는 항-Notch 2/3 항체 59R5와의 조합으로, 5주 동안 주 2회 탁솔 15 mg/kg로 처리하였다. 5주 후, 탁솔 처리를 중지하고, 항체 처리를 계속하였다. 59R5는 고용량 탁솔 처리 후에 종양 재발을 유의하게 지연시키는 것으로 관찰되었다 (도 17b). 상기 결과는 59R5 처리가 암 줄기 세포 빈도를 감소시킴을 시사하였다.
상기 실시양태에 기재된 바와 같은 59R1 및 59R5의 생체내 활성의 요약을 표 7에 나타낸다. 각 실험에 대한 종양 부피 및 p 값을 대조군과 대비하여 나타내었다. PE13, C28 및 Colo205 연구를 실시예 14에 기재한 바와 같이 수행하였다. PN8 연구를 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. PN8 실험의 경우, 대조군은 젬시타빈 단독이었고, 59R1 및 59R5에 대한 값은 젬시타빈과의 조합이었다. 항체는 모든 실험에 대해 주 1회 15 mg/kg로 투여하였다.
[표 7]
Figure pct00007
실시예 16
59R5 처리 후 종양에서의 유전자 발현 조절
59R5 및 59R1이 생체내 동일한 메카니즘에 의해 기능화되는 지를 결정하기 위하여, 종양 세포 및 종양 기질에서의 중요 표적 유전자의 발현을 조사하였다. 유전자 발현을 PE13 종양 세포 및 기질 세포에서의 정량적 PCR에 의해 검정하였다. 대조군 항체 처리군에 대한 유전자 발현 수준을 도 18에 나타내었다. 59R1 및 59R5는 유사한 정도로 기질 세포에서 뮤린 HeyL, Notch3, 및 RGS5의 발현을 조절하였다 (좌측 패널). 동일한 조절 패턴이 C28 종양에서 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서, 종양 맥관구조 및 혈관주위세포의 기능에 결정적인 종양 기질 내의 유전자를 조절하는 데에 있어 59R1에 대해 기존에 확인된 작용 메카니즘은 59R5에 의해 유지되었다. 유사하게, 59R5 및 59R1은 동일한 정도로 종양 세포 내의 인간 유전자 ID4, EDNRA, 및 EGLN3의 발현을 조절하였다 (우측 패널).
상기 유전자 족의 다른 구성원과 달리, ID4는 종양에서 일반적으로 하향발현되고, ID4는 메틸화에 의해 종종 침묵되는 유방암에서의 종양 저해자인 것으로 나타났다. ID4 발현의 손실은 유방암 환자에서의 보다 나쁜 예후와 상관된다 (Noetzel et al., 2008, BMC Cancer 8:154). 따라서, PE13 유방 종양 세포에서 ID4의 상향-조절은 항-Notch2/3의 항-종양 메카니즘의 일부일 수 있다. EDNRA는 내피 및 종양 세포 모두의 성장을 촉진하고 종양 세포의 전이성 활성을 자극하는 엔도텔린 수용체를 코딩하는 유전자이다 (Bagnato and Rosano 2008, Int. J. Biochem. Cell. Biol. 40:1443-51). EGLN3 (HIF-3α라고도 알려져 있음)은 저산소증 유도성 유전자이다. 항-Notch2/3에 의한 EGLN3의 유도는 처리된 종양에서 기능적 맥관구조의 파괴와 상관된다. 상기 데이터는 59R1 및 59R5의 생물학적 활성 및 작용 메카니즘이 매우 유사함을 나타내었다.
표 8은 59R1 및 59R5 처리된 PE13 종양의 미세검정 분석으로부터의 결과를 나타낸다. 숫자는 군 당 3마리의 동물을 이용한 처리군 대 대조군 동물에 대한 평균 차등 발현 값이다.
[표 8]
Figure pct00008
마이크로어레이 분석은 유전자 발현 (예를 들어, Foxc2, Hey2, Heyl, Notch3)에 의해 측정시 59R5가 Notch 경로를 유의하게 억제함 (p<0.01)을 나타낸다. 상기 결과는 59R1과 대등하였다. Foxc2는 헷지호그(Hedgehog) 경로의 하류 표적이며, 세포 분화에 관여한다. 아팝토시스에 관여된 추가의 유전자 (예를 들어, 그랜자임 A) 및 종양-연관 조직 리모델링에 관여된 추가의 유전자 (MMP-9)도 59R1과 59R5 사이에서 유사하게 발현되었다. 상기 데이터는 59R1 및 59R5의 생물학적 활성 및 작용 메카니즘이 매우 유사함을 시사하였다.
실시예 17
추가의 Notch2 및/또는 Notch3 항체의 생성
항원 생성
특정 실시양태에서, 인간 Notch2 또는 인간 Notch3 세포외 도메인의 재조합 폴리펩티드 단편을 항체 생성을 위한 항원으로서 생성하였다. 예를 들어, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 EGF 1-12를 포함하는 Notch2의 아미노산 1-493을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (서열 33)를 단리할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 인-프레임 N-말단이 인간 Fc-tag 또는 히스티딘-tag 중 하나에 라이게이션되고, 곤충 세포에서의 배큘로바이러스 중재 발현을 위해 전달 플라스미드 벡터로 클로닝될 수 있다. 표준 형질감염, 감염 및 세포 배양 프로토콜을 이용하여 상응하는 Notch2 폴리펩티드 (서열 34)를 발현하는 재조합 곤충 세포를 생성할 수 있다 (문헌 [O'Reilly et al., 1994, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press]).
인간 Notch2의 내생적 신호 서열의 절단은 절단 예측 소프트웨어 시그널피(SignalP) 3.0을 이용하여 근사계산하였으나, 실제 생체내 절단 점은 두 아미노산의 양쪽 방향이 상이할 수 있다. Notch2의 예측된 절단은 아미노산 1 내지 26이고, 따라서 Notch2 항원 단백질은 대략 아미노산 27 내지 아미노산 493을 포함한다. 항원 단백질은 단백질 A 및 Ni++-킬레이트 친화도 크로마토그래피를 사용하여 곤충 세포 조건화된 매질로부터 정제할 수 있다. 이어서, 정제된 항원 단백질을 PBS (pH=7)에 대하여 투석하고, 대략 1 mg/ml로 농축하고, 면역화의 준비로 멸균 여과하였다.
면역화
마우스를 표준 기술을 이용하여 정제된 Notch2 또는 Notch3 항원 단백질로 면역화할 수 있다. 개별 마우스로부터의 혈액을 ELISA 및 FACS 분석 (하기 상세히 기재함)을 이용하여 항원 인식을 위한 최초 면역화 이후 대략 70일 동안 스크리닝할 수 있다. 이어서, 최고 항체 역가를 갖는 동물을 최종 항원 부스트를 위해 선별하고, 그 후, 비장 세포를 하이브리도마 생성을 위하여 단리하였다. 하이브리도마 세포를 96 웰 플레이트에서 웰 당 1개 세포로 플레이팅하고, 각 웰로부터의 상층액을 항원 단백질에 대한 ELISA 및 FACS 분석에 의해 스크리닝하였다. 고 항체 역가를 갖는 몇몇 하이브리도마를 선별하고, 정적 플라스크 배양으로 규모를 증대하였다. 항체를 단백질 A 또는 단백질 G 아가로스 크로마토그래피를 사용하여 하이브리도마 상층액으로부터 정제하고, 항체를 하기 기재한 바와 같은 FACS에 의해 시험하였다.
FACS 분석
무손상 세포-표면 Notch2 (및/또는 Notch3) 단백질을 인식하는 클론, 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체를 선별하기 위하여, FACs 분석을 사용하였다. HEK293 세포를 Notch2의 전장 cDNA 클론을 코딩하는 발현 벡터 및 형질감염 마커 GFP와 공동-형질감염시켰다. 형질감염 후 24 내지 28 시간에, 세포를 현탁액 중에 수집하고, 항-Notch2 (또는 항-Notch3 또는 항-Notch2/3) 항체 또는 대조군 IgG과 얼음 상에서 인큐베이션하여 백그라운드 항체 결합을 검출하였다. 세포를 세척하고, 1차 항체를 형광 발색단에 컨쥬게이션된 항-마우스 2차 항체로 검출하였다. 이어서, 표지된 세포를 FACS로 분류하여 무손상 세포-표면 Notch2 및/또는 Notch3 단백질의 세포 표면 발현을 특이적으로 인식하는 항-Notch2, 항-Notch3, 또는 항-Notch2/3 항체를 확인하였다.
키메라 항체
Notch 수용체의 비-리간드 결합 도메인을 특이적으로 인식하는 모노클로날 항체를 확인한 후, 상기 항체를 설치류 항체가 치료제로서 사용되는 경우의 인간 항-마우스 항체 (HAMA) 면역 반응을 극복하기 위하여 변경하였다. 선택된 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 하이브리도마 세포로부터 RT-PCR에 의해 단리하고, 포유동물 발현 벡터에서 각각 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역에 인-프레임 라이게이션하였다. 다르게는, 동일한 플라스미드 상에 인간 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역 유전자를 함유하는 인간 Ig 발현 벡터, 예컨대 TCAE 5.3을 사용하였다 (Preston et al., 1998, Infection ＆ Immunity 66:4137-42). 이어서, 키메라 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터를 키메라 항체 생성을 위하여 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포로 공동-형질감염시켰다. 키메라 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 부모의 뮤린 항체와 비교하였다.
인간화 항체
키메라 항체 치료제가 여전히 빈번히 항원성이어서 인간 항-키메라 항체 (HACA) 면역 반응을 생성하기 때문에, Notch2 또는 Notch3 수용체에 대한 키메라 항체는 추가의 인간화를 요구할 수 있다. 인간화 항체를 생성하기 위하여, 상기 기재된 키메라 항체 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 3개의 짧은 초가변 서열 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각 인간 중쇄 및 경쇄 서열의 가변 도메인 프레임워크로 조작한 후, CHO 세포에서의 발현를 위한 포유동물 발현 벡터로 클로닝하였다. 인간화 항체의 면역반응성 및 친화도를 ELISA 및 FACS에 의해 부모의 키메라 항체와 비교하였다. 추가로, 인간화 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화하기 위하여 가변 영역의 위치-지정 또는 고-밀도 돌연변이유발을 이용할 수 있다.
실시예 18
Notch 수용체에 대한 항체를 평가하기 위한 추가의 시험관내 검정
본 실시예는 세포 증식 및 세포독성에 대한 Notch2 및/또는 Notch3 수용체에 대항하여 발생되는 항체의 활성을 시험하기 위한 시험관내 검정 방법을 기재한다.
증식 검정
Notch2 및/또는 Notch3에 대항하는 항체를 BrdU 기반의 검정을 이용하여 시험관내 종양 세포 성장에 대한 상기 항체의 효과에 대해 시험하였다. 새롭게 분리된, Lin-고갈된 유방 종양 세포를 2 내지 5일 동안 저산소 중에서 배양하였다. 이어서, 세포를 20,000개 세포/웰로 2.5 μg/mL 또는 5.0 μg/mL 항-Notch 항체와 함께, 대조군 비-특이적 뮤린 IgG와 함께, 또는 항체 없이 3일 동안 배양한 후, 18시간 BrdU 표지화하였다. 모든 실험은 다수 중복으로 수행하였다. 이어서, 대조군 항체에 비해 세포 증식을 억제하는 항-Notch 항체의 능력을 결정하였다.
보체-의존적 세포독성 검정
Notch2 수용체 및/또는 Notch3 수용체를 발현하는 암 세포주, 다르게는, 면역손상 마우스에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터 단리된 암 줄기 세포를 사용하여, Notch 2 및/또는 Notch3 수용체에 대한 항체에 의해 중재된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 측정하였다. 세포를 항생제 및 5％ FBS로 보충된 200 ㎕ RPMI 1640 배양 배지에서 106개 세포/ml로 현탁하였다. 이어서, 현탁된 세포를 Notch2 및/또는 Notch3 수용체에 대한 항체 또는 대조군 항체를 함유하는 200 ㎕ 혈청 또는 열-불활성화된 혈청과 혼합하였다 (3벌). 세포 혼합물을 1 내지 4시간 동안 37℃에서 5％ CO2에서 인큐베이션하였다. 이어서, 처리된 세포를 수집하고, 배양 배지에서 희석된 100 ㎕ FITC-표지된 아넥신 V에 재현탁시키고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. HBSS 중에 희석된 프로피디움 요오다이드 용액 (25 μg/ml) 100 ㎕를 첨가하고, 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세포를 수집하고, 배양 배지에 재현탁하고, 유세포분석으로 분석하였다. FITC 염색된 세포의 유세포분석으로 총 세포수를 수득하고, 죽은 세포에 의한 프로피디움 요오다이드 업테이크 (총 세포수 중의 백분율로서)를 이용하여, 열-불활성화된 혈청 및 대조군 항체와 비교한 혈청 및 Notch2 및/또는 Notch3 수용체에 대한 항체의 존재하의 세포 사멸을 측정하였다. 이로써 보체-의존적 세포독성을 중재하는 항-Notch2/3 항체의 능력을 결정하였다.
항체-의존적 세포성 세포독성 검정
Notch2 수용체 및/또는 Notch3 수용체를 발현하는 암 세포주, 또는 다르게는, 면역손상 마우스에서 이종이식으로서 계대배양된 환자 샘플로부터 단리된 암 줄기 세포 (하기 상세히 기재함)를 사용하여, Notch 2 및/또는 Notch3 수용체에 대한 항체에 의해 중재된 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 측정하였다. 세포를 항생제 및 5％ FBS로 보충된 200 ㎕ 페놀 레드-비함유 RPMI 1640 배양 배지에 106개 세포/ml로 현탁하였다. 말초혈 단핵 세포 (PBMC)를 이펙터 세포로서 사용하기 위하여 피콜-파크(Ficoll-Paque) 밀도 구배 원심분리에 의하여 헤파린처리된 말초혈로부터 단리하였다. 이어서, 표적 세포 (T)를 Notch2 또는 Notch3 수용체 또는 대조군 항체의 존재하에 96-웰 플레이트에서 25:1, 10:1 및 5:1의 E/T 비율로 PBMC 이펙터 세포 (E)와 혼합하였다. 대조군은 항체의 존재하에 표적 세포 단독 및 이펙터 세포 단독의 인큐베이션을 포함하였다. 세포 혼합물을 37℃에서 5％ CO2에서 1 내지 6시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 방출된 락테이트 데히드로게나제 (LDH), 세포 용균시 방출된 안정한 세포질 효소를 비색 검정 (예를 들어, 사이토톡스(CytoTox)96 논-라디오액티브 사이토톡시시티 어세이; 프로메가(Promega); 미국 위스콘신주 매디슨)에 의해 측정하였다. 490 nm에서의 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 판독기로 수집하고, 백그라운드를 보정하였다. 특이적 세포독성의 백분율을 하기 화학식으로 계산하였다: 세포독성 (％) = 100 x (실험적 LDH 방출 - 이펙터 자발적 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출) / (표적 최대 LDH 방출 - 표적 자발적 LDH 방출). 이로써 항체 의존성 세포성 세포독성을 중재하는 Notch2 및/또는 Notch3 수용체에 대한 항체의 능력을 결정하였다.
실시예 19
Notch 수용체의 EGF10 (또는 등가 EGF)에 대한 항체의 생성
동물에서 종양 성장을 감소시키는 Notch2의 제10 EGF 반복부 및 Notch3의 상응하는 EGF 반복부 (제9 EGF 반복부)에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는 것은, 효과적인 암 요법을 위한 비-리간드 결합 도메인 및 특히 제10 EGF 반복부 (또는 그의 등가물)의 중요성을 시사한다. Notch 수용체 족 구성원에서의 EGF 반복부 10 (또는 등가 EGF)을 표적화하기 위하여, Notch1, Notch2, 또는 Notch4의 EGF10 또는 Notch3의 EGF9에 대한 항체를 생성하고 분석하였다. 특히, 마우스를 Notch1의 제10 EGF 반복부 (서열 35); Notch2의 제10 EGF 반복부 (서열 36), 또는 Notch4의 제10 EGF 반복부 (서열 38) 또는 Notch3의 제9 EGF 반복부 (서열 37)를 포함하는 항원으로 면역화하였다. 특이적 Notch 수용체를 인식하는 항체 뿐만 아니라 4개 Notch 수용체의 상이한 조합을 인식하는 항체는, 상기 상세히 기재한 바와 같이 각 Notch 수용체로 형질감염된 HEK 293 세포의 FACS 분석을 이용하여 확인하였다. 2개 Notch 수용체 족 구성원의 제10 EGF 반복부 (또는 등가 EGF)를 인식하는 항체를 생각하였다 (예를 들어, Notch1 EGF10 및 Notch2 EGF10; Notch1 EGF10 및 Notch3 EGF9; Notch1 EGF10 및 Notch4 EGF10; Notch2 EGF10 및 Notch3 EGF9; Notch2 EGF10 및 Notch4 EGF10; 또는 Notch3 EGF9 및 Notch4 EGF10을 인식하는 항체). 3개 Notch 수용체 족 구성원의 제10 EGF 반복부 (또는 등가 EGF)를 인식하는 항체를 마찬가지로 고려하였다 (예를 들어, Notch1 EGF10, Notch2 EGF10, 및 Notch3 EGF9; Notch1 EGF10, Notch2 EGF10, 및 Notch4 EGF10; 또는 Notch2 EGF10, Notch3 EGF9, 및 Notch4 EGF10을 인식하는 항체). 4개 Notch 수용체 족 구성원의 제10 EGF 반복부 (또는 등가 EGF)를 인식하는 항체를 생각하였다 (예를 들어, Notch1 EGF10, Notch2 EGF10, Notch3 EGF9 및 Notch4 EGF10을 인식하는 항체).
실시예 20
항-Notch 수용체 항체를 사용한 인간 암의 치료
본 실시예는 Notch 수용체 발현이 검출된 암 줄기 세포 및/또는 종양 세포를 포함하는 종양을 표적화하기 위하여 Notch 수용체에 대한 항체를 이용하여 암을 치료하는 방법을 기재한다.
먼저 암 줄기 세포 마커 발현의 존재를 종양 생검으로부터 결정할 수 있다. 암으로 진단된 환자의 생검으로부터의 종양 세포를 멸균 조건하에서 제거하였다. 몇몇 실시양태에서, 조직 생검을 액체 질소 중에서 새롭게 동결하고, O.C.T.에 침지하고, 저온유지장치에서 10 μm 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 다르게는, 조직 생검을 포르말린-고정시키고, 파라핀-침지시키고, 마이크로톰에서 10 μm 단편으로서 유리 슬라이드로 절단하였다. 단편을 Notch 수용체에 대한 항체와 인큐베이션하여 단백질 발현을 검출하였다. 추가로, 암 줄기 세포의 존재를 결정할 수 있다. 조직 생검 샘플을 작은 조각으로 절단하고, 멸균 블레이드를 사용하여 완전히 갈고, 세포를 효소 소화 및 기계적 파괴시켜 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이어서, 분리된 종양 세포를 항-ESA, -CD44, -CD24, 및 -Lin, 항체와 함께 인큐베이션하여 암 줄기 세포를 검출하고, ESA+, CD44+, CD24-/low, Lin- 종양 줄기 세포의 존재를 상기 상세히 기재한 바와 같이 유세포분석에 의해 결정하였다.
종양이 Notch 수용체를 발현하는 것으로 진단된 암 환자를 항-Notch 수용체 항체로 처리하였다. 상기 기재한 바와 같이 생성된 인간화 또는 인간 모노클로날 항-Notch 수용체 항체를 정제하고, 주사용 PBS 중에서 적합한 제약 담체와 제제화하였다. 환자를 적어도 10 주 동안 1주 1회 Notch 항체로 처리하였으나, 특정 경우에는 적어도 약 14 주 동안 1주 1회 처리하였다. 각각의 항체 투여는 제약상 유효한 용량인 약 2 내지 약 100 mg/ml이고, 특정 경우에는 약 5 내지 약 40 mg/ml이어야 한다. 항체는 표준 방사능요법 레지멘 또는 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 파클리탁셀, 젬시타빈, 이리노테칸, 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 류코보린, 또는 스트렙토조신을 사용하는 화학요법 레지멘 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 투여할 수 있다. 환자를 모니터링하여, 이러한 처리가 예컨대 종양 퇴행을 바탕으로 하는 항-종양 반응, 신생 종양 발생의 감소, 종양 항원 발현 감소, 암 줄기 세포 수의 감소, 또는 질환 예후를 평가하는 다른 수단을 야기했는지를 결정한다.
실시예 21
Notch1, Notch2, Notch3 및/또는 Notch4 EGF 반복부 4에 대한 항체의 생성
Notch 수용체 족 구성원에서의 EGF 반복부 4를 표적화하기 위하여, Notch1, Notch2, Notch3 및/또는 NOTCH4 EGF 반복부 4에 대한 항체를 생성하고 분석하였다. 특히, 마우스를 Notch1의 제4 EGF 반복부 (서열 41), Notch2의 제4 EGF 반복부 (서열 42), Notch3의 제4 EGF 반복부 (서열 43), 또는 Notch4의 제4 EGF 반복부 (서열 44)를 포함하는 항원으로 면역화하였다. 특이적 Notch 수용체를 인식하는 항체 뿐만 아니라 4개 Notch 수용체의 상이한 조합을 인식하는 항체는, 상기 상세히 기재한 바와 같이 각 Notch 수용체로 형질감염된 HEK 293 세포의 FACS 분석을 이용하여 확인하였다. 2개 Notch 수용체 족 구성원의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체를 생각하였다 (예를 들어, Notch1 및 Notch2; Notch1 및 Notch3; Notch1 및 Notch4; Notch2 및 Notch3; Notch2 및 Notch4; 또는 Notch3 및 Notch4의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체). 3개 Notch 수용체 족 구성원의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체를 생각하였다 (예를 들어, Notch1, Notch2, 및 Notch3; Notch1, Notch2, 및 Notch4; 또는 Notch2, Notch3, 및 Notch4의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체). 그리고, 4개 Notch 수용체 족 구성원의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체를 생각하였다 (예를 들어, Notch1, Notch2, Notch3 및 Notch4의 제4 EGF 반복부를 인식하는 항체).
Notch1의 EGF4에 결합하는 모노클로날 항체, 13M57의 예시적인 생성 및 특성규명의 기재는 미국 특허 출원 공개공보 제2008/0131434호에서 찾을 수 있으며, 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예 22
59R1로 처리된 종양 세포에서 추가의 유전자 발현 검정
이종이식 모델에서 종양 세포에서 59R1 처리에 반응하는 유전자 발현상의 변화를 확인하였다.
종양 세포에서 항체 59R1에 의해 조절되는 몇몇 경로/유전자 세트를 유방 종양 T1, PE13, 및 B51에서 유전자 세트 농축 분석 (문헌 [Mootha et al., 2003, Nature Genetics 34:267-73]; [Subramanian et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:15545-50])을 이용하여 확인하였다 (표 9). 특히, 세포 주기 유전자 경로, myc-활성화 유전자 및 몇몇 줄기 세포 유전자 세트는 상기 분석에서 59R1에 의해 하향-조절되었다. cMyc는 Notch 경로의 직접적 표적이라고 나타났다 (문헌 [Weng et al., 2006, Genes Dev. 20:2096-109]). 59R1에 의해 하향-조절된 줄기 세포 유전자는 5개의 별개의 집단: 인간 태아 조혈 줄기 세포 (HCS), 뮤린 태아 및 성인 HSC, 신경 줄기 세포 (NSC), 및 배아 줄기 세포 (ESC) (문헌 [Ivanova et al., 2002, Science 298:601-604]), 및 최근 기재된 코어 ESC 유전자 세트 (문헌 [Ben-Porath et al., 2008, Nature Genetics 40:499-507]) 및 하향-조절이 분화를 유발하는 ESC 자가-재생 유전자 세트 (문헌 [Hu et al., 2009, Genes Dev. 23:837-48])로부터 유래된 분자 시그너쳐로부터 유래되었다.
[표 9]
Figure pct00009
실시예 23
Notch2/3 항체에 의한 암 줄기 세포 빈도의 감소
실시예 8에 기재된 것과 유사한 실험 연구를 이용하여, PE13 유방암 세포에서 제한 희석 분석에 의한 암 줄기 세포 빈도의 분석을 수행하였다. PE13 유방 종양을 보유한 동물을 대조군 항체, 탁솔 및 대조군 항체, 59R1, 또는 탁솔 및 59R1로 3주 동안 처리하였다. 종양을 3주 후 수거하고, 처리된 종양에서의 CSC 빈도를 분석하였다. 4개 처리 군 각각으로부터의 인간 세포의 연속 적정물을 새로운 세트의 마우스에 이식하였다 (세포 투여량 당 n = 10). 성장 75일 후의 종양 성장률 (도 19a)을 이용하여 L-calc 프로그램 (스템 셀 테크놀로지스, 인크.(Stem Cell Technologies, Inc.))을 사용하여 CSC 빈도를 계산하였다. 대조군 항체 처리된 종양은 1:74의 종양 개시 세포 빈도를 갖는 것으로 결정되었다. 탁솔 단독으로의 처리는 CSC 빈도를 1:30까지 상승시켰다. 반대로, 59R1로의 처리는 CSC 빈도를 1:179까지 감소시키고, 59R1 및 탁솔의 조합은 CSC 빈도를 1:319까지 감소시켰다 (도 19b). 별표 하나는 대조군 항체 처리된 군에 대한 통계적으로 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타내고, 별표 두개는 탁솔 및 대조군 항체 처리된 군에 대한 유의한 차이를 나타낸다. 상기 실험은 PE13 유방 종양의 59R1 처리가 단일 작용제로서, 보다 극적으로는 탁솔 처리와의 조합으로 CSC 빈도를 감소시켰음을 나타내었다. 반대로, 탁솔 단독으로의 처리는 종양 부피 감소에 효과적이지만 처리된 종양의 CSC 빈도를 증가시켰고, 이는 종양 개시 세포가 상기 화학요법제의 효과에 우선적으로 내성임을 나타낸다.
또한, 종양에서 59R1의 효과 및 CSC 빈도에 대한 효과를 조사하기 위하여, 탁솔과 조합된 59R1 처리 후 유전자 변화를 연구하였다. 59R1 단독 처리 또는 59R1 및 탁솔 처리 후 CSC 빈도의 감소가 이전에 관찰된 (그리고 본원에 기재된) PE13 유방 종양에서 상기 실험을 수행하였다. CSC 정량화를 위해 PE13의 제한 희석 분석을 수행한 동일한 실험으로부터 종양 상에서 마이크로어레이 분석을 수행하였다 (도 19). PE13 유방 종양을 보유하는 동물을 59R1 및 탁솔, 대조군 및 탁솔로 3주 처리한 후, 마이크로어레이 분석을 위해 수거하였다. 탁솔 대 대조군, 및 59R1 및 탁솔 대 탁솔 처리된 동물 (군 당 3마리 동물)에 대한 평균 차등 발현 값을 계산하였다. 두드러지게는, 유전자 발현 마이크로어레이 데이터에서, 탁솔과 조합된 59R1은 탁솔 단독 처리 후 관찰된 유전자 변화보다 반대 배수 방향으로 아팝토시스, 저산소증, 분화, 및 줄기-세포 관련 유전자에 영향을 준다는 것이 밝혀졌고 (표 10), 이는 CSC 빈도에 대한 상기 화합물의 효과와 일치하였다.
[표 10]
Figure pct00010
상기 데이터세트에서 조절된 아팝토시스-관련 유전자로는 BNIP3, NDRG1 HSPB6, 및 XAF1이 포함된다. BNIP3 (Bcl-2/E1B 19 kDa 상호작용 단백질)은 종양의 저산소 영역에서 발현된 Bcl-2 족의 아팝토시스-전 구성원이다 (문헌 [Kothari et al., 2003, Oncogene 22:4734-44]). BNIP3은 탁솔 단독으로 하향-조절되고, 조합 요법으로 상향-조절되는데, 이는 59R1 및 탁솔이 아팝토시스를 촉진할 수 있음을 시사한다. HSPB6이 탁솔 처리된 종양에서 하향-조절되고, HSPB6 과다발현이 몇몇 생물학적 시스템에서 아팝토시스에 대항하여 보호할 수 있다는 관찰은 상기 생각과 일치된다 (문헌 [Fan et al., 2005, Trends Cardiovasc. Med. 15:138-41]). 조합 처리에서 상향-조절되는 NDRG1 (N-myc 하류 조절된 유전자1)은 p53-의존적 아팝토시스를 위해 필수적이다 (문헌 [Stein et al., 2004, J. Biol. Chem. 279:48930-40]). 흥미롭게도, NDRG1은 또한 결장직장 암 전이의 추정적 저해자이다. 이의 발현 증가는 전립선 및 유방암에서의 생존 증가과 연관된다 (문헌 [Shah et al., 2005, Clin. Cancer Res. 11:3296-302]). 추가로, NDRG1은 분화 촉진과 연관된다. NDRG1의 발현은 잘 분화된 췌장암 세포에서 고도로 발현되고, 덜 분화된 종양 세포에서 발현되지 않는 것으로 나타났다 (문헌 [Angst et al., 2006, Br. J. Cancer 95:307-13]). 또한, 다른 줄기 세포-관련 유전자, 예를 들어 BMPR1B 및 호메오박스 함유 유전자인 LHX8은 탁솔 단독에 의해 상향-조절된 후, 탁솔과 조합된 59R1 처리에 의해 하향-조절됨이 관찰되었다.
추정적 줄기 세포 마커인 ALDH1a1과 기능적으로 유사한 레티노이드의 대사와 관련된 몇몇 유전자 (RARRES1, RARRES3, RBP2)는 탁솔에 의해 상향-조절된 후, 탁솔 및 59R1 처리에 의해 하향-조절된다. 레티노산 신호전달은 세포성 분화와 연결된다고 나타났다 (문헌 [Appel and Eisen, 2003, Neuron 40:461-4]). 합하여 보면, 상기 데이터는, 59R1은 PE13 유방 종양 세포에서의 유전자 발현에 유의한 효과를 주며, 59R1 및 탁솔 조합 요법으로의 처리 후 상기 종양에서의 암 줄기 세포 빈도 감소가 관찰된 것의 기저를 이루는 메카니즘의 일부를 설명하기 시작할 수 있음을 보여준다.
또다른 실시양태에서, PN4 췌장 종양 모델을 이용하여 59R1로의 처리 후 암 줄기 세포 빈도 감소에 대해 시험하였다. PN4 췌장 종양을 대조군 항체, 항-Notch2/3 59R1, 젬시타빈, 또는 59R1 및 젬시타빈의 조합으로 3주의 기간 동안 처리하였다. 항체를 10 mg/kg로 주 2회 투여하고, 젬시타빈을 50 mg/kg로 주 2회 투여하였다. 각 군으로부터의 종양을 수거하고, 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이종이식에서의 인간 종양 세포를 단리하고, 계수하였다. 세포의 적정물 (30, 90 또는 210개 세포)을 NOD-SCID 마우스로 재주사하였다 (군 당 n=10). 종양 성장을 84일째에 검정하고, 종양 흡수율로부터 종양 개시 세포 빈도를 계산하였다. 대조군 항체 처리된 종양은 1:137의 종양 개시 세포 빈도를 갖는 것으로 결정되었다. 젬시타빈 단독으로의 처리는 CSC 빈도를 1:61로 증가시켰다. 반대로, 59R1로의 처리는 CSC 빈도를 1:281로 감소시키고, 59R1 및 젬시타빈의 조합은 CSC 빈도를 1:675로 감소시켰다 (도 19c). 별표 하나는 대조군 항체 처리된 군에 대한 통계적으로 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타내고, 별표 두개는 젬시타빈 및 대조군 항체 처리된 군에 대한 유의한 차이를 나타낸다.
또다른 실시양태에서, PE13 유방 종양 모델을 이용하여 59R5로의 처리 후 암 줄기 세포 빈도 감소에 대해 시험하였다. PE13 유방 종양을 대조군 항체, 항-Notch2/3 59R5, 탁솔, 또는 59R5 및 탁솔의 조합으로 3주의 기간 동안 처리하였다. 항체를 20 mg/kg로 주 1회 투여하고, 탁솔을 15 mg/kg로 주 2회 투여하였다. 각 군으로부터의 종양을 수거하고, 처리하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 이종이식에서의 인간 종양 세포를 단리하고, 계수하였다. 세포 적정물 (50, 150 또는 450개 세포)을 NOD-SCID 마우스로 재주사하였다 (군 당 n=10). 종양 성장을 39일째에 검정하고, 종양 흡수율로부터 종양 개시 세포 빈도를 계산하였다. 대조군 항체 처리된 종양은 1:70의 종양 개시 세포 빈도를 갖는 것으로 결정되었다. 탁솔 단독으로의 처리는 CSC 빈도를 1:30으로 증가시켰다. 반대로, 59R5로의 처리는 CSC 빈도를 1:202로 감소시키고, 59R5 및 탁솔의 조합은 CSC 빈도를 1:382로 감소시켰다 (도 19d). 별표 하나는 대조군 항체 처리된 군에 대한 통계적으로 유의한 차이 (p < 0.05)를 나타내고, 별표 두개는 탁솔 및 대조군 항체 처리된 군에 대한 유의한 차이를 나타낸다.
다른 실험에서 관찰된 바와 같이, 상기 결과는 PN4 췌장 종양의 59R1 처리 및 PE13 유방 종양의 59R5 처리가 각각 단일 작용제로서, 보다 극적으로는 젬시타빈 또는 탁솔 처리와의 조합으로 CSC 빈도를 감소시킴을 나타내었다. 반대로, 탁솔 또는 젬시타빈 단독으로의 처리는 종양 부피 감소에 효과적이지만, 처리된 종양의 CSC 빈도를 증가시켰고, 이는 종양 개시 세포가 상기 화학요법제의 효과에 우선적으로 내성임을 나타낸다.
상기 설명에서 언급된 모든 공개공보 및 특허는 본원에 참조로 포함된다. 본 발명의 범위 및 취지를 벗어나지 않는 한, 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변경 및 변화가 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명은 특정 실시양태와 관련되어 기재되었지만, 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정 실시양태에 지나치게 제한되어서는 안됨을 이해해야 한다. 사실상, 관련 업계의 당업자에게 명백한, 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 하기 청구항의 범위 내에 포함된다고 의도된다.
[서열]
인간 항-Notch2/3 항체 서열
서열 1: 항-Notch2/3 IgG2 59R1 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 신호 서열. 신호 서열을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00011
서열 16: 항-Notch2/3 59R1 IgG2 중쇄의 예상되는 단백질 서열 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00012
서열 3: 항-Notch2/3 59R1 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 신호 서열. 신호 서열을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00013
서열 18: 항-Notch2/3 59R1 경쇄의 예상되는 단백질 서열 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00014
서열 5: 59R1중쇄 CDR1
Figure pct00015
서열 6: 59R1중쇄 CDR2
Figure pct00016
서열 7: 59R1중쇄 CDR3
Figure pct00017
서열 8: 59R1 경쇄 CDR1
Figure pct00018
서열 9: 59R1 경쇄 CDR2
Figure pct00019
서열 10: 59R1 경쇄 CDR3
Figure pct00020
서열 11: 59R1 Fab의 59R1 경쇄 VL 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00021
서열 12: 59R1 Fab의 59R1 중쇄 VH 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00022
서열 13: 59R1 IgG 항체의 59R1 경쇄 VL
Figure pct00023
서열 14: 59R1 IgG 항체의 59R1 중쇄 VH
Figure pct00024
서열 39: 59R1 경쇄 VL 및 포유동물 신호 서열 (밑줄)
Figure pct00025
서열 40: 59R1 중쇄 VH 및 포유동물 신호 서열 (밑줄)
Figure pct00026
서열 15: 항-Notch2/3 59RGV IgG2 항체 (59R1의 생식계열 변이체)의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 신호 서열. 신호 서열을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00027
서열 2: 항-Notch2/3 59RGV (59R1의 생식계열 변이체)의 중쇄의 예상되는 단백질 서열 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00028
서열 17: 항-Notch2/3 59RGV 항체 (59R1의 생식계열 변이체)의 뉴클레오티드 서열 및 신호 서열. 신호 서열을 코딩하는 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00029
서열 4: 항-Notch2/3 59RGV 항체 (59R1의 생식계열 변이체)의 경쇄의 예상되는 단백질 서열 및 신호 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시하였다.
Figure pct00030
서열 19: 59RGV 항체 (59R1의 생식계열 변이체)의 59R1 경쇄 VL
Figure pct00031
서열 20: 59RGV 항체 (59R1의 생식계열 변이체)의 59R1 중쇄 VH
Figure pct00032
서열 22 (대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00033
서열 23 (대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00034
서열 24 (대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00035
서열 25 (대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00036
서열 26 (대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00037
서열 27(대안적 중쇄 CDR3)
Figure pct00038
서열 30 (중쇄 CDR3 컨센서스 서열):
Figure pct00039
서열 47: 59R5 경쇄 뉴클레오티드 서열 (신호 서열 없음)
Figure pct00040
서열 48: 59R5 중쇄 뉴클레오티드 서열 (신호 서열 없음)
Figure pct00041
서열 49: 59R5 중쇄
Figure pct00042
서열 50: 59R5 중쇄 가변 영역
Figure pct00043
서열 51: 59R5 중쇄 CDR3
Figure pct00044
서열 52: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00045
서열 53: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00046
서열 54: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00047
서열 55: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00048
서열 56: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00049
서열 57: 변이체 59R1 중쇄 가변 영역
Figure pct00050
서열 58: 59R5 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (신호 서열 없음)
Figure pct00051
서열 59: 59R1 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (신호 서열 없음)
Figure pct00052
서열 60: 59R1 중쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열 (신호 서열 없음)
Figure pct00053
인간 Notch-관련 서열:
서열 21: Notch2(EGF1-12) Fc 융합 단백질 아미노산 서열
Figure pct00054
서열 28 (인간 Notch2의 EGF10 내의 59R1 결합 부위의 잠재적 성분): HKGAL
서열 29 (인간 Notch2 EGF10 내의 59R1 결합 부위의 잠재적 성분에 상응하는 인간 Notch3 EGF9 내의 부위): HEDAI
서열 45: hNotch1
아미노산 1-1732 세포외 도메인. (밑줄)
아미노산 372-414 EGF 반복부 10 (이중 밑줄 및 이탤릭체)
Figure pct00055
서열 31: 인간 Notch2
아미노산 1-1677: 세포외 도메인 (밑줄)
아미노산 375-417: EGF 반복부 10 (이중 밑줄 및 이탤릭체)
Figure pct00056
서열 32: 인간 Notch3
아미노산 1-1640: 세포외 도메인 (밑줄)
아미노산 351-393: EGF 반복부 9 (이중 밑줄 및 이탤릭체)
Figure pct00057
서열 46: hNotch4
아미노산 1-1444 세포외 도메인 (밑줄)
아미노산 392-434 EGF 반복부 10 (이중 밑줄 및 이탤릭체)
Figure pct00058
서열 33: 인간 Notch2 EGF 1-12를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00059
서열 34: 인간 Notch2 EGF 1-12 폴리펩티드 서열
Figure pct00060
서열 35: 인간 Notch1 EGF10
Figure pct00061
서열 36: 인간 Notch2 EGF10
Figure pct00062
서열 37: 인간 Notch3 EGF9 (EGF9는 Notch2를 비롯한 다른 Notch 수용체의 EGF10에 상응하는 인간 Notch3의 EGF이다.)
Figure pct00063
서열 38: 인간 Notch4 EGF10
Figure pct00064
서열 41: Notch1 EGF 반복부 4
Figure pct00065
서열 42: Notch2 EGF 반복부 4
Figure pct00066
서열 43: Notch3 EGF 반복부 4
Figure pct00067
서열 44: Notch4 EGF 반복부 4
Figure pct00068
Figure pct00069
호주
이로써 본 출원인은, 미생물 샘플의 제공은 특허의 허여 전 또는 출원의 소 멸, 거절 또는 취하 전에 본 발명에 관심이 없는 숙련된 수취인에게 행해질 뿐임을 명시한다 (호주 특허 규정 제3.25(3)호 규정).
캐나다
이로써 본 출원인은, 본 출원을 기반으로 캐나다 특허가 발행될 때까지 또는 본 출원이 거절되거나 포기되거나 더이상 회복대상이 아니거나 취하될 때까지, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플의 제공은 특허청장이 임명한 독립된 전문가에게만 행해질 것을 요구한다.
크로아티아
이로써 본 출원인은, 본 출원에서 언급된 기탁된 생물학적 물질의 샘플의 제공은 출원 공개와 특허 허여 사이에 독립된 전문가에게만 행해져야 할 것을 요구한다. 샘플은, 특허의 출원인 또는 특허권자 (해당되는 경우)가 명시적으로 이러한 약속을 철회하지 않는 한, 샘플을 요구하는 사람이 특허가 유효한 기간 동안 샘플 또는 그로부터 유도된 어떠한 물질도 제3자에게 이용가능하게 되지 않고 샘플 또는 그로부터 유도된 어떠한 물질도 실험 또는 연구 목적을 제외하고는 사용되지 않도록 약속하는 경우에만 이용가능하게 될 것이다.
덴마크
이로써 본 출원인은, 본 출원이 (덴마크 특허청에 의하여) 공공 검사에 공개될 때까지 또는 공공 검사에 공개되지 않고 덴마크 특허청에 의해 최종 결정될 때까지, 샘플의 공급은 당업계의 전문가에게만 행해질 것을 요구한다. 샘플의 제공에 대한 제3자의 모든 요구는 사용될 전문가를 지정할 것이다. 상기 전문가는 덴마크 특허청에 의해 만들어진 확인된 전문가 리스트에 기재된 임의의 사람 또는 각 경우에 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있다.
핀란드
이로써 본 출원인은, 핀란드 특허 및 등록청에 의해 특허 허여 발표가 공개될 때까지 또는 출원일로부터 20년 동안 출원이 핀란드 특허 및 등록청에 의하여 특허 허여로 결론나지 않고 최종 결정된다면, 샘플의 제공은 당업계 전문가에게만 행해질 것을 요구한다. 샘플의 제공에 대한 제3자의 모든 요구는 사용될 전문가를 지정할 것이다. 상기 전문가는 핀란드 특허청에 의해 만들어진 확인된 전문가 리스트에 기재된 임의의 사람 또는 각 경우에 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있다.
독일
이로써 본 출원인은, 특허 허여가 거절되거나 취하될 때까지 또는 출원일로부터 20년 동안, 샘플은 오직 출원인이 임명한 독립적인 전문가에게만 제공될 것을 요구한다.
아이슬란드
이로써 본 출원인은, 특허가 허여되거나 아이슬란드 특허청이 특허로 귀결되지 않은 출원에 대하여 최종 결정을 할 때까지, 샘플의 제공은 오직 당업계 전문가에게만 행해질 것을 요구한다. 샘플의 제공에 대한 제3자의 모든 요구는 사용될 전문가를 지정할 것이다. 상기 전문가는 아이슬란드 특허청에 의해 만들어진 확인된 전문가 리스트에 기재된 임의의 사람 또는 각 경우에 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있다.
노르웨이
이로써 본 출원인은, 본 출원이 (노르웨이 특허청에 의해) 공공 검사에 공개될 때까지 또는 공공 검사에 공개되지 않고 노르웨이 특허청에 의해 최종 결정될 때까지, 샘플의 공급은 당업계 전문가에게만 행해질 것을 요구한다. 샘플의 제공에 대한 제3자의 모든 요구는 사용될 전문가를 지정할 것이다. 상기 전문가는 노르웨이 특허청에 의해 만들어진 확인된 전문가 리스트에 기재된 임의의 사람 또는 각 경우에 출원인에 의해 승인된 임의의 사람일 수 있다.
싱가포르
이로써 본 출원인은, 미생물 샘플의 제공이 전문가에게만 이용가능하게 될 것을 요구한다.
스페인
이로써 본 출원인은, 스페인 특허 허여의 발표가 공개될 때까지 또는 출원일로부터 20년 동안 출원이 거절되거나 취하된다면, 생물학적 물질은 독립된 전문가에게 샘플을 공급하는 것으로만 43조 SPL에 제시된 바와 같이 이용가능할 것을 요구한다.
스웨덴
이로써 본 출원인은, 스웨덴 특허 및 등록청에 의해 특허가 허여될 때까지 또는 출원이 특허 허여로 귀결되지 않고 최종 결정될 때까지, 샘플의 공급은 당업게의 전문가에게만 행해질 것을 요구한다. 이는 출원일로부터 20년의 기간 내에 거절되거나 취하된 출원에도 적용된다.
스위스
이로써 본 출원인은, 제3자에게 샘플을 공급하는 것이 제3자가 기탁자 정보의 목적상 그의 이름 및 주소를 기탁 기관에 표시하는 조건에 해당할 수 있으며, (a) 기탁된 배양물 또는 그로부터 유도된 배양물을 제3자에게 이용가능하도록 하지 않고; (b) 법의 범위 밖에서 배양물을 사용하지 않고; (c) 분쟁시, 항목 (a) 및 (b)의 의무를 위반하지 않았다는 증거를 제시할 것을 약속할 것을 요구한다.
구 유고슬라비아 마케도니아 공화국
이로써 본 출원인은, 샘플을 제3자에게 공급하는 것이 제3자가 (a) 생존가능한 생물 또는 미생물 물질의 샘플이 이용가능하도록 할 것을 요구할 권리를 가지며; (b) 출원인이 규정된 특허 유효 기간의 만료 전에 기탁된 생존가능한 생물 또는 미생물 물질의 샘플에의 접근을 임의의 제3자에게 허락하지 않음을 보증한다고 약속하는 조건에 해당할 수 있을 것을 요구한다.
영국
이로써 본 출원인은, 미생물 샘플의 제공이 오직 전문가에게만 이용가능하게 될 것을 요구한다.
유럽 특허청
이로써 본 출원인은, 유럽 특허 허여의 발표가 공개될 때까지 또는 출원일로부터 20년 동안 출원이 거절 또는 취하되거나 또는 취하된 것으로 간주된다면, 생물 물질은 본 요구자에 의해 임명된 전문가에게의 샘플 공급에 의해서만 규정 28(3) EPC에 제시된 바와 같이 이용가능해 질 것을 요구한다 (규정 28(4) EPC).
ATCC PTA-9547 20081015 ATCC PTA-9548 20081015 ATCC PTA-9549 20081015 ATCC PTA-10170 20090706
SEQUENCE LISTING <110> Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Gurney, Austin L. Hoey, Timothy Charles Htun Van Der Horst, Edward Thein Sato, Aaron Ken Liu, Yuan Ching Bruhns, Maureen Fitch Lewicki, John A. <120> Notch-Binding Agents and Antagonists and Methods of Use Thereof <130> 2293.049PC03 <140> PCT/US2009/003994 <141> 2009-07-08 <150> US 61/112,701 <151> 2008-11-07 <150> US 61/112,699 <151> 2008-11-07 <150> US 61/079,095 <151> 2008-07-08 <160> 60 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1383 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtgcaattgg tggaaagcgg cggcggcctg gtgcaaccgg gcggcagcct gcgtctgagc 120 tgcgcggcct ccggatttac cttttcttct tctggtatgt cttgggtgcg ccaagcccct 180 gggaagggtc tcgagtgggt gagcgttatc gcttcttctg gtagcaatac ctattatgcg 240 gatagcgtga aaggccgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacac cctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tggtattttt 360 tttgctattt ggggccaagg caccctggtg acggttagct cagccagcac aaagggccct 420 agcgtcttcc ctctggctcc ctgcagcagg agcaccagcg 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atgctccgtg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380 tga 1383 <210> 2 <211> 460 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Ser Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Phe Phe Ala Ile Trp Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 130 135 140 Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 145 150 155 160 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 165 170 175 Ser Gly Ala Leu Thr Ser 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Arg Glu Ala Gly Pro Phe Pro Arg Ala Arg Thr Val Ser Val 1835 1840 1845 Ser Val Pro Pro His Gly Gly Gly Ala Leu Pro Arg Cys Arg Thr 1850 1855 1860 Leu Ser Ala Gly Ala Gly Pro Arg Gly Gly Gly Ala Cys Leu Gln 1865 1870 1875 Ala Arg Thr Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Arg Gly Gly Gly Ala 1880 1885 1890 Tyr Ser His Cys Arg Ser Leu Ser Gly Val Gly Ala Gly Gly Gly 1895 1900 1905 Pro Thr Pro Arg Gly Arg Arg Phe Ser Ala Gly Met Arg Gly Pro 1910 1915 1920 Arg Pro Asn Pro Ala Ile Met Arg Gly Arg Tyr Gly Val Ala Ala 1925 1930 1935 Gly Arg Gly Gly Arg Val Ser Thr Asp Asp Trp Pro Cys Asp Trp 1940 1945 1950 Val Ala Leu Gly Ala Cys Gly Ser Ala Ser Asn Ile Pro Ile Pro 1955 1960 1965 Pro Pro Cys Leu Thr Pro Ser Pro Glu Arg Gly Ser Pro Gln Leu 1970 1975 1980 Asp Cys Gly Pro Pro Ala Leu Gln Glu Met Pro Ile Asn Gln Gly 1985 1990 1995 Gly Glu Gly Lys Lys 2000 <210> 47 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 47 gacatcgtgc tgacccagtc ccccgccaca ctgtccctgt ctcccggcga gagagccacc 60 ctgagctgtc gggcctccca gtccgtgcgg tccaactacc tggcctggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccctcggct gctgatctac ggcgcctcct ccagggctac cggcgtgcct 180 gcccggttct ccggctccgg ctctggcacc gacttcaccc tgaccatctc cagcctggag 240 cctgaggact tcgccgtgta ctactgccag cagtactcca acttccctat caccttcggc 300 cagggcacca aggtggagat caagcggacc gtggccgctc cttccgtgtt catcttcccc 360 ccttccgacg agcagctgaa gtccggcacc gcctccgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 taccctcggg aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagtc cggcaactcc 480 caggagtccg tcaccgagca ggactccaag gactctacct actccctgtc ctccaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgtcct ctcccgtgac caagtccttc aaccggggcg agtgc 645 <210> 48 <211> 1323 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cttccggctt caccttctcc tccagcggca tgtcctgggt gcgccaggca 120 cctggcaaag gactcgagtg ggtgtccgtg atcgcctcct ccggctccaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggtccatc 300 ttctacacca cctggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgcctc caccaagggc 360 ccctccgtgt tccctctggc cccttgctcc cggtccacct ctgagtctac cgccgctctg 420 ggctgcctgg tgaaggacta cttccctgag cctgtgaccg tgtcctggaa ctctggcgcc 480 ctgacctctg gcgtgcacac cttccctgcc gtgctgcagt cctccggcct gtactccctg 540 tcctccgtgg tgaccgtgcc ttcctccaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgtg 600 gaccacaagc cttccaacac caaggtggac aagaccgtgg agcggaagtg ctgcgtggag 660 tgccctcctt gtcctgctcc tcctgtggct ggcccttctg tgttcctgtt ccctcctaag 720 cctaaggaca ccctgatgat ctcccggacc cctgaagtga cctgcgtggt ggtggacgtg 780 tcccacgagg accctgaggt gcagttcaat tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac 840 gccaagacca agcctcggga ggaacagttc aactccacct tccgggtggt gtctgtgctg 900 accgtggtgc accaggactg gctgaacggc aaagaataca agtgcaaggt gtccaacaag 960 ggcctgcctg cccctatcga aaagaccatc tctaagacca agggccagcc tcgcgagcct 1020 caggtctaca ccctgcctcc tagccgggag gaaatgacca agaaccaggt gtccctgacc 1080 tgtctggtga agggcttcta cccttccgat atcgccgtgg agtgggagtc taacggccag 1140 cctgagaaca actacaagac cacccctcct atgctggact ccgacggctc cttcttcctg 1200 tactccaagc tgacagtgga caagtcccgg tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc 1260 gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtctcctggc 1320 aag 1323 <210> 49 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Thr Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 50 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Thr Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Ser Ile Phe Tyr Thr Thr 1 5 <210> 52 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Pro Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 53 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Phe Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 54 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Phe Tyr Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 55 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Phe Phe Ala Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 56 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ile Phe Tyr Pro Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 57 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ala Ser Ser Gly Ser Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Phe Phe Ala Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala 115 <210> 58 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggctc cctgagactg 60 tcctgcgccg cttccggctt caccttctcc tccagcggca tgtcctgggt gcgccaggca 120 cctggcaaag gactcgagtg ggtgtccgtg atcgcctcct ccggctccaa cacctactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca actccaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc ccggtccatc 300 ttctacacca cctggggcca gggcaccctg gtgaccgtgt cctccgcctc cacc 354 <210> 59 <211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gtctgttcgt tctaattatc tggcttggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggtgcttctt ctcgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcggttta ttattgccag cagtattcta attttcctat tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgt 327 <210> 60 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 caggtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60 agctgcgcgg cctccggatt taccttttct tcttctggta tgtcttgggt gcgccaagcc 120 cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgtt atcgcttctt ctggtagcaa tacctattat 180 gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtatt 300 ttttttgcta tttggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctcagcc 348

Claims (89)

  1. 인간 Notch2의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하되, 인간 Notch2의 EGF 반복부 10에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 인간 Notch2의 길항제인 항체.
  3. 제2항에 있어서, 리간드와 인간 Notch2의 결합을 억제하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 리간드가 DLL4, JAG1 및/또는 JAG2인 항체.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2의 신호전달을 억제하는 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 nM 이하의 KD로 인간 Notch2에 결합하는 항체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, EGF 반복부 10의 외부에 있는 인간 Notch2의 임의의 영역에 결합하지 않는 항체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2의 EGF 반복부 10 내에 있는 서열 HKGAL (서열 28)의 적어도 일부에 결합하는 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인간 Notch 수용체에 추가로 특이적으로 결합하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 인간 Notch2 및 추가의 인간 Notch 수용체(들) 둘 다의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  11. 제10항에 있어서, 추가의 인간 Notch 수용체가 인간 Notch3인 항체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch3의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 추가로 특이적으로 결합하되, 인간 Notch3의 EGF 반복부 9에 특이적으로 결합하는 항체.
  13. 제12항에 있어서, 인간 Notch3의 EGF 반복부 9 및 Notch2의 EGF 반복부 10 둘 다에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 인간 Notch3의 길항제인 항체.
  15. 제14항에 있어서, 리간드와 인간 Notch3의 결합을 억제하는 항체.
  16. 제15항에 있어서, 리간드가 DLL4, JAG1 및/또는 JAG2인 항체.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch3의 신호전달을 억제하는 항체.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 nM 이하의 KD로 인간 Notch3에 결합하는 항체.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, EGF 반복부 9의 외부에 있는 인간 Notch3의 임의의 영역에 결합하지 않는 항체.
  20. 인간 Notch3의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하되, 인간 Notch3의 EGF 반복부 9에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  21. 제20항에 있어서, 인간 Notch3의 길항제인 항체.
  22. 제21항에 있어서, 리간드와 인간 Notch3의 결합을 억제하는 항체.
  23. 제22항에 있어서, 리간드가 DLL4, JAG1 및/또는 JAG2인 항체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch3의 신호전달을 억제하는 항체.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1 nM 이하의 KD로 인간 Notch3에 결합하는 항체.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, EGF 반복부 9의 외부에 있는 인간 Notch3의 임의의 영역에 결합하지 않는 항체.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, Notch3의 EGF 반복부 9 내에 있는 서열 HEDAI (서열 29)의 적어도 일부에 결합하는 항체.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가의 인간 Notch 수용체의 EGF 반복부 10에 추가로 특이적으로 결합하는 항체.
  29. 제28항에 있어서, 인간 Notch3 및 추가의 인간 Notch 수용체(들) 둘 다의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 항체.
  30. ATCC에 59R1 또는 PTA-9547로 기탁된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체.
  31. (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체;
    (b) VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및
    (c) SIFYTT (서열 51) 또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체
    를 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체.
  32. 제31항에 있어서, 중쇄 CDR1이 SSSGMS (서열 5)를 포함하고, 중쇄 CDR2가 VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하고, 중쇄 CDR3이 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 것인 항체.
  33. SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 (G/S)(I/S)F(F/Y)(A/P)(I/T/S/N) (서열 30)을 포함하는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체.
  34. 제33항에 있어서, 중쇄 CDR3이 GIFFAI (서열 7), SIFYPT (서열 22), SSFFAS (서열 23), SSFYAS (서열 24), SSFFAT (서열 25), SIFYPS (서열 26) 및 SSFFAN (서열 27)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 항체.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체;
    (b) GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체; 및
    (c) QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3, 또는 1, 2, 3 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체
    를 추가로 포함하는 항체.
  36. 제35항에 있어서, 경쇄 CDR1이 RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하고/거나, 경쇄 CDR2가 GASSRAT (서열 9)를 포함하고/거나, 경쇄 CDR3이 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 것인 항체.
  37. (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 51) 또는 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및/또는
    (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 항체.
  38. 제37항에 있어서,
    (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 SIFYTT (서열 51)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 항체.
  39. 제37항에 있어서,
    (a) SSSGMS (서열 5)를 포함하는 중쇄 CDR1, VIASSGSNTYYADSVKG (서열 6)를 포함하는 중쇄 CDR2, 및 GIFFAI (서열 7)를 포함하는 중쇄 CDR3; 및
    (b) RASQSVRSNYLA (서열 8)를 포함하는 경쇄 CDR1, GASSRAT (서열 9)를 포함하는 경쇄 CDR2, 및 QQYSNFPI (서열 10)를 포함하는 경쇄 CDR3
    을 포함하는 항체.
  40. (a) 서열 50, 서열 14 또는 서열 20에 대한 약 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열 13 또는 서열 19에 대한 약 90％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역
    을 포함하는, 인간 Notch2 및/또는 Notch3에 특이적으로 결합하는 항체.
  41. 제40항에 있어서,
    (a) 서열 50 또는 서열 14에 대한 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열 13에 대한 약 95％ 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  42. 제41항에 있어서,
    (a) 서열 50을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (b) 서열 13을 포함하는 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 항체.
  43. 제41항에 있어서,
    (a) 서열 14를 포함하는 폴리펩티드; 및/또는
    (b) 서열 13을 포함하는 폴리펩티드
    를 포함하는 항체.
  44. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2에 특이적으로 결합하는 항체.
  45. 제44항에 있어서, 인간 Notch3에 추가로 특이적으로 결합하는 항체.
  46. 제31항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2의 EGF 반복부 10 및/또는 인간 Notch3의 EGF 반복부 9에 결합하는 항체.
  47. 인간 Notch2 및/또는 Notch3과의 특이적 결합에 대해 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  48. 제30항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 길항제인 항체.
  49. 둘 이상의 인간 Notch 수용체가 Notch2, Notch1 또는 Notch4를 포함하는 경우에 항체가 Notch2, Notch1 또는 Notch4의 EGF10에 특이적으로 결합하고, 둘 이상의 인간 Notch 수용체가 Notch3을 포함하는 경우에 항체가 Notch3의 EGF9에 결합하는 것인, 둘 이상의 인간 Notch 수용체의 세포외 도메인의 비-리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  50. 제49항에 있어서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체의 길항제인 항체.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 둘 이상의 인간 Notch 수용체가 Notch1 및 Notch4 둘 다를 포함하는 것인 항체.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 성장을 억제하는 항체.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 항체 단편인 항체.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  55. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이적 항체인 항체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 또는 IgG2 항체인 항체.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 포함하거나 생성하는 세포.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
  59. 세포를 유효량의 제11항 내지 제43항, 제45항 내지 제48항 및 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch3 신호전달을 억제하는 방법.
  60. 세포를 유효량의 제1항 내지 제19항, 제30항 내지 제48항 및 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 Notch2 신호전달을 억제하는 방법.
  61. 유효량의 제1항 내지 제48항 및 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 맥관형성을 억제하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절함으로써 맥관형성을 억제하는 방법인 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 맥관형성이 종양 맥관형성인 방법.
  64. 유효량의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 성장을 억제하는 방법.
  65. 유효량의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 종양형성 가능성 (tumorigenicity)을 감소시키는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 종양에서의 암 줄기 세포 빈도가 감소되는 것인 방법.
  67. 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 결장직장 종양, 유방 종양, 췌장 종양 또는 흑색종인 방법.
  68. 유효량의 제1항 내지 제48항 및 제52항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 맥관형성-연관 질환을 치료하는 방법.
  69. 유효량의 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 암이 결장직장암, 유방암, 췌장암 또는 흑색종인 방법.
  71. 제61항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 치료적 유효량의 제2 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하며,
    상기 제2 작용제는 항암제 및/또는 항-맥관형성제인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 제2 작용제가 화학요법제인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 화학요법제가 파클리탁셀, 젬시타빈 또는 이리노테칸인 방법.
  74. 제71항에 있어서, 제2 작용제가 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF) 또는 VEGF 수용체의 길항제인 방법.
  75. 제71항에 있어서, 제2 작용제가 항-DLL4 항체인 방법.
  76. 제61항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  77. 서열 50, 서열 2, 서열 4, 서열 16, 서열 18, 서열 13, 서열 14, 서열 19, 서열 20 및 서열 49로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드.
  78. 제77항의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  79. 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 48, 서열 47, 서열 1, 서열 3, 서열 15 및 서열 17로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  80. 엄격한 혼성화 조건 하에서 서열 58, 서열 59 또는 서열 60의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  82. 유효량의 인간 Notch2 및/또는 Notch3의 길항제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 맥관형성을 억제하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 혈관주위세포 및/또는 혈관 평활근 세포의 기능을 조절함으로써 맥관형성을 억제하는 방법인 방법.
  84. 제82항 또는 제83항에 있어서, 맥관형성이 종양 맥관형성인 방법.
  85. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 항체인 방법.
  86. 제82항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 항체가 아닌 것인 방법.
  87. 제82항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 길항제가 인간 Notch3의 길항제인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 길항제가 또한, 인간 Notch2의 길항제인 방법.
  89. 제82항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 혈관 내피 세포 성장 인자 (VEGF) 또는 VEGF 수용체의 길항제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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